猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-GF35的制作方法

专利名称：猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-GF35的制作方法
技术领域：
本发明涉及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组腺病毒rAd-GF35及疫苗，属于 生物技术高科技领域，专用于加强猪对猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫保护作用及减少 猪场的经济损失。
二背景技术：
重组腺病毒基因工程技术在人类的基因治疗方面已经得到了较为广泛的应用，很多 应用于人类基因治疗的重组腺病毒已经进入临床实验三期阶段。因为重组腺病毒具有宿 主范围广，感染细胞种类多，可以表达人源和非人源蛋白，而且不会插入宿主染色体， 回复突变率低，可以复制到很高的滴度等特点。而GP3GP5蛋白是由猪繁殖与呼吸综合 征病毒PRRSV的ORF3 ORF5编码的大约41kD和25kD的糖蛋白，由其诱导的抗体具有 中和活性。用杆状病毒表达的GP5蛋白可以对怀孕母猪提供50n/。的保护力，此外用杆状 病毒表达的GP5、 GP3免疫母猪产下的仔猪在断奶时PRRSV血清阴性。用巨细胞病毒启 动子控制下的GP5质粒免疫动物后，在猪和小鼠产生抗GP5的特异性中和抗体。单克隆 抗体试验证明针对GP5的单克隆抗体的中和活性要强于针对GP4的单克隆抗体，而且 GP5蛋白可以诱导细胞凋亡。GMCSF具有良好的佐剂作用，在抗病毒和抗肿瘤的研究 中被广泛应用，目前还没有将GMCSF应用到构建成猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV的 重组腺病毒报道。
三
发明内容
技术问题本发明的目的是研制一种能够有效控制猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的 PRRSV重组腺病毒疫苗，使在当前PRRS难以防治的情况下有新的突破。 技术方案本发明的实施方案如下
猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-GF35，其特征在于，重组腺病毒rAd-GF35在 分类上属于腺病毒科(Adenoviridae)，哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)，人腺病 毒种(Human adenovirus),分类命名腺病毒(重组)，该重组腺病毒可以对目的蛋白进 行有效的表达，用该重组腺病毒感染动物后不出现临床症状，因此可以用来表达抗原蛋 白。该重组腺病毒已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏 日期2008年3月4日，保藏号为CGMCC No.2391 。。
上述猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒，是通过以下方法构建而成的 (1 )GMCSF及PRRSV GP3 GP5基因的扩增、克隆根据猪GMCSF序列(GenBank 登录号为U67175)设计了可以扩增缺失终止密码子和插入口蹄疫2A基因的猪GMCSF 的三条引物，引物序列如下
GMCSF-P1: 5- GCT GGTACCATGGCTCCTACCCGCCCA-3
GMCSF-2AP2.1s:
GMCSF-2AP2.2s:以ConA刺激的猪外周血淋巴细胞总RNA反转录产物为模板，应用RT-PCR技术扩 增出了含有2A基因缺失了终止密码子的猪GMCSF基因。
根据登录号EU144079 PRRS高致病性毒株SY0608的基因设计了针对PRRSV国内 分离株SY0608毒株GP3、 GP5基因的特异性引物，引物序列如下
SY-GP3.1: 5-GACCTCGAGATGGCTAATAGCTGTACATT-3
SY-GP3.2: 5-ACAAAGCTTTCGCCGTGCGGCACT-3
SY-GP5.1: 5-ACGAAGCTTATGTTGGGGAAGTGCT-3
SYGP5.2: 5-CAGATATCCTAGAGACGACCCCATTG-3
应用RT-PCR技术扩增出了 PRRSV国内分离株SY0608毒株的去除了终止密码子的 GP3基因和GP5全基因，在引物上引入限制性内切酶酶切位点。通过酶切，把GMCSF、 GP3禾卩GP5基因克隆入穿梭载体pShuttle-CMV (购自STRATAGENE公司)中，然后通 过酶切和PCR鉴定，获得含有GMCSF 、 GP3和GP5基因的穿梭载体 pShuttle隱CMV-GMCSF-GP3-GP5 ，简称pSh-GF35;
(2) 含有GMCSF， PRRSVGP3和GP5基因的穿梭载体pSh-GF35与腺病毒骨架 载体pAdEasy-l同源重组鉴定好的含有GMCSF、 GP3和GP5基因的穿梭载体pSh -GF35经酶切线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-l(购自STRATAGENE公司)通过电转 化方法转化入大肠杆菌菌株BJ5183(购自STRATAGENE公司)中，在大肠杆菌重组酶的作 用下，在穿梭载体pSh-GF35和骨架载体pAdEasy-l之间发生同源重组，实现了把外源基 因GMCSF、 GP3和GP5基因转入腺病毒骨架载体，经50pg/ml卡那霉素筛选获得了含 有外源基因的重组腺病毒质粒；
(3) 重组腺病毒的获得鉴定好的重组腺病毒质粒通过阳离子脂质体法转染 HEK293A细胞(从invitrogen公司购买)，重组腺病毒质粒在HEK293A细胞内包装成完整 的病毒。
用上述猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒制成的疫苗
将纯化的重组腺病毒在HEK293A细胞上连续传代30次，检测目的基因的转录与表 达情况，证明目的蛋白表达稳定。重组腺病毒的毒价稳定在10877TCID5()/1.0ml。
在扩大培养过程中取用保存PRRSV的纯化重组腺病毒按1(^TCID5o接种长成单层的 HEK293A细胞。当细胞病变达70-90%时收毒，经反复冻融一次即可获得PRRSV重组腺 病毒疫苗。
有益效果
本发明首次提出了将GMCSF与PRRSV结构基因GP3和GP5串联用于腺病毒载体 构建，该重组腺病毒突破了PRRSV常规灭活疫苗和弱毒疫苗的局限性。该重组疫苗具有 弱毒疫苗的复制特性和灭活疫苗的安全性，而且使PRRSV GP3和GP5蛋白获得了提前 表达，并且增加了GMCSF生物活性佐剂的作用，改变了PRRSV感染猪后中和抗体产生 量少而且慢的特点。因为该重组腺病毒疫苗采用的是人腺病毒血清5型载体，对人、猪 等动物没有致病性，容易通过安全性评价。通过猪体免疫攻毒试验和中和试验证明了该 重组腺病毒能够对动物产生保护，诱导特异性PRRSV的中和抗体产生，其中和抗体效价 为1:32。试验证明，本发明构建的PRRSV重组腺病毒对外源蛋白表达稳定，而且其效价稳 定，种毒的毒价稳定在10877TCID5o/1.0ml。通过小鼠免疫试验和中和试验证明了该重组腺 病毒产生了针对PRRSV的中和抗体，其中和抗体效价为1:64。
重组腺病毒对动物不致病，具有高度的安全性。利用该重组腺病毒免疫小鼠获得了 针对PRRSV的特异性中和抗体，该抗体在体外可以中和PRRSV。
与现在应用的PRRSV的弱毒疫苗和灭活疫苗相比，该病毒能在猪体内复制增殖一次 并且不断表达PRRSV GP3和GP5蛋白，使机体持续受到GP3和GP5蛋白的刺激，不断 产生针对GP3和GP5蛋白的中和抗体，同时表达的GMCSF能够调节体内免疫反应，从 体液免疫和细胞免疫两个方面，调节机体免疫反应，这样就能对猪体提供持久的保护力， 因此在PRRS的防治方面具有广阔的应用前景。
四

图1猪GMCSF及PRRSV GP3和GP5基因克隆入穿梭载体示意图
图2含目的基因的穿梭载体与腺病毒的骨架载体的同源重组和获得重组腺病毒的示意图
图3 PRRSV-SY0608 GP3 GP5基因及猪GMCSF RT- PCR产物
M: DL15000 Marker1: SY-GP3 PCR产物；2: SY-GP5 PCR产物；3:缺少信号肽
GMCSFPCR产物
图4重组质粒Jf/m 1/五coR V酶切鉴定结果
M, 1 kb DNA Ladder Marker; 1，鉴定GMCSF-GP3-GP5.
图5重组质粒的Pad酶切鉴定
M: 1 kb plus DNA Marker; 1: pAd-GF35/Pac I,
图6重组腺病毒感染的HEK293A细胞的间接免疫荧光抗体染色结果 A:鉴定GMCSF B:鉴定GP3 C:鉴定GP5表达D:野毒对照 图7Western bLot鉴定目的蛋白的表达
1:未感染重组腺病毒的293-A细胞，没有条带2:鉴定GMCSF的表达3:鉴定GP3的表达4:鉴 定GP5的表达
五具体实施例方式
(一)基因工程体一PRRSV重组腺病毒(rAd-GF35)的构建 1目的基因的扩增、克隆、鉴定和测序分析 1.1引物设计
参照PRRSV SY0608株基因序列(GenBank Accession Number EU144079)及登录号 U67175的猪GMCSF基因序列设计七条引物 SY-GP3.1: 5陽GACCTCGAGATGGCTAATAGCTGTACATT-3; SY-GP3.2 : 5-ACAAAGCTTTCGCCGTGGGCACT-3; SY-GP5.1: 5-ACGAAGCTTATGTTGGGGAAGTGCT-3; SYGP5.2: 5-ACGAAGCTTATGTTGGGGAAGTGCT-3; GMCSF-P1: 5-ACGAAGCTTATGTTGGGGAAGTGCT-3;
GMCSF-2AP2.2s: 5-GCACTCGAGGGGCCCTGGGTTGGACTCGACGTCGCCGGCCAACTTGAG-3用刀豆素ConA(5ug/ml)刺激猪外周血单核细胞后，根据TRIzol (Invitrogen)试剂说明 书提取剌激后的外周血单核细胞总RNA进行反转录，根据Promage反转录酶mMLV说 明书将RNA反转录，以反转录产物为模板，应用RT-PCR技术扩增出了含有口蹄疫2A 基因(具有裂解活性，将表达产物分解为GM-CSF和GP3-GP5)缺失了终止密码子的猪 GMCSF基因。
根据PRRS毒株SY0608 (EU144079) GP3、 GP5基因序列设计两对特异性引物。 提取PRRS病毒SY0608毒株感染后的猴肾细胞MARC-145细胞的总RNA，以反转录后 的产物作模板，应用RT-PCR技术扩增出了 PRRSV国内分离株SY0608毒株的缺失了终 止密码子的GP3基因和GP5全基因。
1.2 PCR扩增PRRSV SY0608株GP3、 GP5基因及猪GMCSF基因
分别以ConA刺激的猪外周血淋巴细胞提取的mRNA反转录产物和以SY0608毒株感 染的MARC-145细胞提取的mRNA反转录产物cDNA为模板进行PCR扩增目的基因。 以cDNA产物为模板,以SY-GP3.1和SY-GP3.2为上下游引物扩增不含终止密码子的 GP3基因，扩增出大小约780 bp的GP3基因；以上下游引物SY-GP5.1和SYGP5.2扩增 含终止密码子的GP5基因，扩增出大小约620bp的GP5基因；以GMCSF-P1和 GMCSF-2AP2.1s为上下游引物扩增出448bp的目的片段，再以第一轮PCR产物448bp 做模板以GMCSF-P1和GMCSF-2AP2.2s为上下游引物扩增出475bp的GMCSF基因。 PCR反应体系如下取0.5pl质粒模板，加入PCR混合液24.5|al，包括2.5pl 10xPCR-Buffer， 1.5nl25mmoL/LMgCL2， 2.0|il 2.5腿oL/LdNTPs， 1.0nl 10mmoL/L上下游引物，l.OUTaq polymerase,加双蒸水至24.5|ul。
PCR反应参数如下94'C预变性3 min，再进行35个PCR循环(94°C 45 s， 62°C 45 s， 72°C 60 s)，最后72。C延伸10 min。
1.3目的基因的回收与纯化
用DNA胶回收试剂盒回收目的基因片段，具体操作按TaKaRa凝胶回收试剂盒的说 明书进行。酶切及连接酶均购自TaKaRa公司，使用方法根据说明书进行。 1.4重组穿梭载体的克隆
1.4.1 pcr产物及载体的酶切回收限制性酶均购自TaKaRa公司，使用方法根据说明 书进行。将GMCSF基因经Kpn I、 Xhol酶切与回收；GP3基因经Xho1、 Hind III 酶切与回收；GP5基因经Hind III、 EcoRV酶切与回收。同时将载体pShuttle-CMV (stratagene公司)经过Kpn I、 EcoRV酶切与回收。得到的产物用于以下的连接反 应。酶切体系如下
3.0plM Buffer, 20.0pl基因PCR回收产物或载体，限制性内切酶各10.0U,用无菌双 蒸水补至总体积30.0(il。
1.4.2目的基因片段与载体的连接连接酶均购自TaKaRa公司，使用方法根据说明书
6进行。
连接反应体积为10.0pl。体系如下1.0^1 10xLigase Buffer, 1.(^1酶切回收过的 pShuttle-CMV ，各1.0^1的酶切后回收的GMCSF ， GP3及GP5基因，100U T4 DNA Ligase ， 用无菌双蒸水补至总体积lO.O)nl。混匀后4'C连接8 10h。同时设定载体自身连接对照 (不加连接基因)。
1.4.3大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备与转化
在LB平板上挑取DH5a的单个菌落接种于3.0ml LB液体培养基中，200rpm过夜振 荡培养；次日按2。/。的体积接种于新的LB培养基中，200rpm震荡培养3-4h至OD600= 0.3 0.5;将细菌转移至1.5ml的灭菌离心管中，每管1.0ml，冰浴30min; 4°C 12000rpm 离心30s;完全弃去上清，用l.Oml 0.1moL/L冰冷的CaCL2重悬细菌，冰浴10min; 4°C 12000rpm离心30s;完全弃上清，用100pl O.lmoL/L冰冷的CaCL2重悬细菌，放置4°C 冰箱24h内备用。
取连接产物10.0W加入到10(Hil新鲜制备的大肠杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴 30min;然后置42。C水浴中热休克卯s，迅速置冰中冷却1 2min;每管加入预热的800pl LB培养基，37。C200rpm震荡培养45min; 12000rpm离心30s沉淀细菌，用100pl上清重 悬菌体，然后涂布于100)tig/ml卡那霉素抗性平板上，37。C培养16 24h。
1.4.4重组质粒的小量提取与鉴定
碱裂解法小量提取质粒后采用《p"I、 EcoRV双酶切鉴定方法进行鉴定。酶切反应体 系为30.0^1。体系如下3.0nl 10xM Buffer, 10nl质粒，10U《p"I、 EcoR V，用无菌双 蒸水补至总体积30.(^1。
37"C作用1.0 3.0h，然后进行琼脂糖凝胶电泳。
1.4.5重组质粒的获得及命名
将酶切电泳图谱正确的质粒命名为pShuttle-CMV-GMCSF-GP3-GP5 ，简称为 pSh-GF35。并将其送到宝生物工程(大连)有限公司进行测序。 1.5 cDNA序列分析
根据pShuttle-CMV载体测序引物序列由上海细胞生化所合成一对测序引物，引物序
列为
Adseql: 5-GGT ATA TAT AAG CAG AGC TG-3; Adseq2: 5-GTG GTA TGG CTG ATT ATG ATC AG-3 。
测序工作由宝生物工程(大连)有限公司协助完成。在DNA测序仪(ABI PRISMTM377XL DNA Sequencer)进行双向测序。并用NCBI BLAST将所测得的序列及其 推倒的氨基酸序列与GenBank数据库中的基因的核苷酸和蛋白质进行同源性比较，再用 Vector NTI和DNAStar软件进行基因的限制性内切酶和阅读框。证明了我们所克隆入的 基因正确，完全符合载体阅读框要求。
2穿梭载体pSh-GF35与腺病毒骨架载体pAdEasy-l同源重组
2.1 pSh-GF35 /toel线性化与纯化用10xNE buffer4 5.0^1， 100xBSA 0.5pl，pShuttle-CMV-GF35 30.0nl，1.0(^1，用双蒸水补加至总体积50.0^1。 37。C作用3.0h， 然后取2.0^1进行1% (g/ml)琼脂糖凝胶电泳。利用小量胶回收试剂盒进行回收纯化。 纯化方法同上。
2.2大肠杆菌BJ5183电转化感受态细菌的制备在链霉素(30|iig/ml)抗性平板上 挑取一个新鲜的BJ5183菌落接种于含30pg/ml链霉素的10ml LB培养基中，37°C 200rpm 过夜振荡培养；第二天按1/1000体积接种于一新的含链霉素的LB培养基中，振荡培养， 使其A550-0.8，培养物置冰浴上l.Oh; 4°C 3000rpm离心10min;用初始菌液体积的无菌 冰冷的WB液重悬细胞；(WB40。/。超纯甘油，90%蒸馏水v/v); 3000rpm离心30min; 再一次用初始体积的WB液重悬菌体后离心；3000rpm离心30min后倾去多余的上清， 剩余1/500体积的WB液重悬菌体，分装40^1每管，-70卩保存。
2. 3 pSh-GF35与pAdEasy-1共转化BJ5183细菌取出-7(TC保存的BJ5183电转化 感受态细菌两管，在冰浴上缓慢融化；取纯化的pAdEasy-1载体和线性化的 pShuttle-CMV-G35质粒在一灭菌500^1的离心管中混合；在两管BJ5183电转化感受态细 菌分别加入线性化的pShuttle-CMV-GF35质粒和pAdEasy-1载体的混合物及线性化 pShuttle-CMV-GF35作为对照；把加入质粒后的BJ5183细菌转入冰冷的电极杯中，使液 滴悬浮在电极杯金属板中央；立即进行电转化，电转化仪的参数设置为2.5kV， 25pF， 200Q;每转化完一管立即加入1.0ml的室温LB溶液，并把细菌充分重悬；重悬后的细 菌37。C振荡培养l.Oh;分别取重组菌涂布于三块卡那霉素抗性平板，对照菌体涂布一块 平板，过夜培养，获得重组细菌。
2.4重组细菌的挑选和重组腺病毒质粒提取经过至少24h培养，挑取卡那霉素抗 性平板上的最小重组细菌菌落接种于3.0ml含卡那霉素的LB培养基中，过夜培养；提取 重组腺病毒质粒rAd-GF35，溶于20nl无菌双蒸水中，然后进行0.8% (g/ml)的琼脂糖 凝胶电泳；可疑重组质粒转化DH5a感受态细菌，涂布卡那霉素平板；挑选菌落，提取 质粒，进行0.8% (g/ml)的琼脂糖凝胶电泳。
2. 5.重组腺病毒质粒rAd-GF35的鉴定
2. 5. 1琼脂糖凝胶电泳
从过夜培养平板上挑取较小的菌落接种于卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37'C振 荡培养15h左右，采用碱裂解法提取质粒；经0.8%的琼脂糖凝胶电泳，同时设定穿梭载
体和骨架载体对照；可以初步判定阳性重组质粒和自身连接的穿梭质粒。 2. 5. 2尸ac I酶切鉴定
将初步判定阳性的重组质粒转化DH5a感受态细胞，小量提取质粒后进行酶切鉴定。 酶切总体系为20.0|il。体系如下2.0nl 10xNE Buffer 1 ， 0.2pl 100xBSA， 5叫Plasmid DNA， 0.2^1 Pac I，用无菌双蒸水补至总体积20.0nl。
37。C作用1.0 3.0h，然后进行0.8。/。的琼脂糖凝胶电泳，如果得到两条带，一条为30kb， 另一条为4.5 kb或3.0kb则为阳性。
2. 6重组腺病毒rAd-GF35的包装
2. 6.1重组腺病毒质粒的线性化
2. 6. 1. 1重组腺病毒质粒的纯化用质粒纯化试剂盒纯化阳性重组腺病毒质粒。用分光光度计测定OD260和OD280， 计算其含量和纯度。DNA含量(ng/ml) z稀释倍数x50xOD260。 2. 6. 1. 2重组腺病毒质粒rAd-GF35的线性化与回收
酶切体系为lOO.Opl。体系如下lO.(Hil 10xNE Buffer 1， l.Opl 100xBSA， 30pg重组 腺病毒质粒DNA， l.Opl尸acI，用无菌双蒸水补至总体积至100.0^1。 37'C作用3.0h，然 后进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳，证实酶切完全后，回收DNA，方法同前。用紫外分光光 度计测定其OD260和OD280，计算其含量与纯度。
2. 6. 2转染
具体操作按TransFastTransfection Reagent (Promega)的操作手册进行。转染在24孔 细胞板上进行，转染后轻轻加入l.Oml 37。C预热的完全生长液(或使血清浓度降到2 6%)，把HEK293A细胞放入二氧化碳培养箱，37。C培养7 14d。 2.6.3重组腺病毒rAd-GF35的收获与增殖
当转染的细胞出现特征病变(局部细胞变圆，成网状)或细胞状态不足以维持时，一 2(TC冻存收获病毒。冻融后接种长满HEK293A细胞的6孔细胞板，37'C吸附l.Oh，每孔 加入2.0ml维持液(含2。/。血清的DMEM)，增殖病毒。
2. 7重组腺病毒的鉴定
2.7.1间接免疫荧光试验(IFA)
在一长满单层HEK293A细胞的96孔细胞板上接种重组腺病毒rAd-GF35 (1000 MOI)，重复6个孔；在37。C、 5。/。的C02培养箱中培养48 72h (未出现CPE);弃去营 养液，用PBS洗涤细胞1次，然后弃去PBS;于37'C温箱中45min，使水分挥发；然后 置一20。C冷冻45min;每孔加入4。C预冷的无水乙醇，置4。C固定45min;弃去乙醇， 用PBS洗涤细胞1次；分别加入小鼠抗GMCSF，小鼠抗PRRSV GP3和GP5的血清， 100nl/孔，每种单抗接种3个孔；在湿盒内37'C温育30min 60min;弃去抗体，用200-孔的PBS洗涤6次；加入1 : 100稀释的FITC—羊抗鼠IgG， 5(Hil/孔，在湿盒内37"C温 育30min;弃去孔内液体，用PBS洗涤4次；于荧光显微镜下观察。同时以野生型腺病 毒wtAd感染的细胞和未感染的293细胞作为对照。
重组腺病毒感染细胞在胞浆中出现明显的荧光，而对照细胞则未出现任何荧光。 2.7.2 Western bLot 2.7.2.1抗原的制备
接种重组腺病毒rAd-GF35于长满单层的293细胞，至完全病变后收获病毒液，一20'C
反复冻融3次；于4°C 、6000卬m离心30min，除去细胞碎片；缓慢加入PEG-6000和NaCL，
分别至终浓度为8%和3%， 4T:缓慢搅拌过夜；8000rpm离心沉淀30min，获得病毒粗提
物；加入相当于原始体积1/100 1/1000的PBS (0.1moL/L， pH7.2)，重悬沉淀，置4°C
过夜；1000rpm离心10min，收集上清即为浓縮的病毒液。同时浓縮野生型腺病毒wtAd
作为对照。
2.7.2.2 SDS-PAGE与Western bLot
9将样品中加入5xLoading Buffer, IO(TC煮沸5min;将样品加入到加样孔中，进行12%
的SDS-PAGE，分离蛋白。以同样方法处理的野生型腺病毒wtAd作为对照。 2.7.3.3转印
将SDS-PAGE胶切到合适的大小，置转印缓冲液中摇动15 20min;剪一片大小与胶
相同的NC膜，置转印缓冲液中浸泡15 20min;同时剪2片与胶大小相同的Whatman
滤纸，置转印缓冲液中浸润；按以下顺序制作"三明治"负极-Whatman滤纸-胶-NC膜
-Whatman滤纸-正极，注意膜与胶之间不要产生气泡；采用半干转印法进行转印，15V转
印20 30min;转印完毕，用5%的丽春红染色NC膜，以确定转印效果；用去离子水漂
洗，洗脱丽春红。
2.7.3.4 Western bLot
将NC膜(硝酸纤维素膜)置于10%的脱脂乳(PBST)中，摇动封闭过夜；用PBST 洗涤4次，每次10min;加入10%的脱脂乳稀释的一抗，37。C摇动孵育2h;用PBST洗 涤4次，每次10min;用10%的脱脂乳稀释羊抗小鼠IgG-HRP (1 : 10000， )， 37'C摇动 孵育2h;用PBST洗涤4次，每次10min;干燥NC膜，等量混匀化学发光底物ECL的 A液和B液，将混合液直接滴加到NC膜上，孵育2 10min;用保鲜膜包好，在X-光胶 片上暴光，经显影、定影后观察。在目的条带位置出现明显、清晰的条带，而对照则未 见任何条带，证明重组腺病毒能够对GP3和GP5蛋白进行特异性表达。
2.8重组腺病毒的滴度
于病毒滴度测定前48h左右将HEK293A细胞种植96孔细胞板，将重组腺病毒冻融3 次，用维持液(含2%血清的DMEM)将病毒作10倍比稀释；弃去长满单层HEK293A 的96孔细胞板中的营养液，接种稀释好的病毒液，每个稀释度接种4个孔，lOOpl/孔； 37°C 、5。/。C02饱和湿度下培养5d，观察CPE，记数每个稀释度的CPE孔数，按Reed-Muench 法计算病毒的TCIDso。重组腺病毒的滴度为10877TCID5()/1.0ml。
2.9集落细胞因子生物活性鉴定
集落细胞因子制备将rAd-GF35,接种到长面单层的PK-15 (猪的一种肾细胞系，由 本实验室保存)细胞上，在37。C含5%C02的温箱中培养24h后收获，反复冻融三，6000 转离心，去除细胞碎片后，用于以下实验。用野生型腺病毒wtAd接毒的PK-15细胞作 为对照
骨髓细胞制备取3-5周龄仔猪胫骨，用锯子锯开后，将骨髓细胞用Haiik's冲出， 放于10ml离心管中，2000转离心15min后，弃去上清，加Hank's，小心将测壁上细胞 冲下，再次离心，重复三次后，用含10% FCS的1640重悬，细胞计数后，将细胞密度 调整到5xl()S个/ml用于下面的实验。
2.9.1 MTT法测集落细胞因子，刺激指数(SI)
将lOOpl含5xl()S个/ml骨髓细胞和不同稀释度的rAd-GF35接种PK-15细胞上清和 10% FCS的DMEM加到96孔板中。培养5天，小心弃去上清，加入含0.5mg/ml的MTT 新鲜培养基200jal，再培养4h，弃去，加入50pl的二甲基亚砜(DMSO)， 37。C振荡10min,测OD57()。同时设立wtAd接种PK-15上清对照，SI=(集落细胞因子刺激细胞OD570) / (对照细胞OD57Q)。经rAd-GF35接种PK-15细胞上清刺激的骨髓细胞，能够增殖SI为 2.67，而wtAd接种PK-15上清孵育的骨髓细胞不能增殖SI为1.034。证明用重组腺病毒 表达的GMCSF具有生物活性，能够刺激细胞的增殖。 2. 9. 2骨髓细胞培养实验
在50ml细胞瓶中分别加入5ml收集好的骨髓细胞，再分别加入0.1%的rAd-GF35和 wtAd接种的PK-15细胞上清。每隔5天将细胞吹下后，离心换上新鲜的培养基。培养 20天，比较对照和实验组细胞数目。可以看出实验组细胞有明显多余对照组，证明重组 腺病毒表达的GMCSF具有生物活性，能够维持骨髓细胞的体外存活。
2. 10重组腺病毒的小白鼠免疫试验
取40只8周龄健康清洁级小白鼠随机分成四组，每组10只。 一组设定为对照，其余 3组分别采取口服、皮下和肌肉注射三种免疫方式。免疫剂量为104TCID5G/0.2ml，免疫间 隔时间2周，连续免疫四次后采集小白鼠血清做病毒中和试验。三种免疫方式的中和抗体 效价差异不显著，中和抗体效价为1:64。
2. 11重组腺病毒的猪体免疫与攻毒保护实验
取10头健康仔猪(PRRSV抗原抗体检测阴性)，随机分成两组。 一组设为对照，另 一组为重组腺病毒免疫组。分别于颈部肌肉注射DMEM和重组腺病毒。重组腺病毒接种 剂量为5X10877TCID5Q，免疫间隔3周，连续免疫两次。二免后两周，用PRRSV高致病 性毒株SY0608攻毒，攻毒剂量为100个TCIDso。细胞免疫和体液免疫检测结果显示，重 组腺病毒能诱导很强的特异性的细胞免疫和体液免疫的产生。其中尤为显著的是诱导 IFN-y产生，二免后两周血清IFN-y分泌量为500pg/ml，与对照组50 pg/ml相比差异极显 著。同时重组腺病毒能够诱导特异性中和抗体的产生，攻毒前中和抗体水平能够达到1:32。 攻毒结果显示，在病理变化上，免疫组与对照组综合评分结果差异显著(35:85);体温变 化差异不显著；血清中病毒含量差异极显著(104:102);宰杀后，组织中病毒含量差异显 著(1:100)。证明所构建的重组腺病毒具有良好的免疫作用，将减轻攻毒猪的临床症状， 降低组织器官的病理变化和降低病毒血症水平。
2. 11重组腺病毒的稳定性试验
把重组腺病毒rAd-GF35在293细胞上连续传代30代，每5代分别检测rAd-GF35 中GP5蛋白的转录与表达，同时测定其组织细胞半数感染量。结果表明，GP5蛋白在重 组腺病毒rAd-GF35连续传代过程中表达稳定，其组织细胞半数感染量也未发生变化。
综上所述，将纯化的重组腺病毒rAd-GF35在HEK293A细胞上连续传代30次，每5 代检查重组腺病毒对rAd-GF35蛋白基因的转录与表达情况，同时测定其TCID5()。结果 证明重组腺病毒对rAd-GF35蛋白基因表达稳定，而且组织细胞半数感染量稳定，接毒后 细胞病变出现规律。种毒的毒价稳定在10877TCID5Q/1.0ml。
用猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒制备疫苗，将纯化的重组腺病毒在HEK293A细胞 上连续传代30次，检测其猪繁殖与呼吸综合征GP5基因的转录与表达情况，证明PRRSV 目的蛋白表达稳定。重组腺病毒的毒价稳定在10877TCID50/1.0ml。
在扩大培养过程中取用纯化保存的PRRSV重组腺病毒按104 TCID50接种长成单层 的HEK293A细胞。当细胞病变达70-90%时收毒，经反复冻融一次即可获得PRRSV重
11组腺病毒疫苗。
本发明重组腺病毒对动物不致病，其可以通过多种途径进行传播，能够使同居猪发 生感染，这在重组苗中是非常重要的。这种特性可以使没有免疫或漏免的猪也获得免疫， 使群体的抗体水平较一致，能够较好的抵抗外源病毒的攻击。利用该重组腺病毒免疫小 鼠获得了针对PRRSV的特异性中和抗体，该抗体在体外可以中和PRRSV。
与现在应用的PRRSV的弱毒疫苗和灭活疫苗相比，该病毒能在猪体内复制增殖并且 不断表达PRRSVGP3和GP5蛋白，使机体持续受到GP3和GP5蛋白的刺激，不断产生 针对GP3和GP5蛋白的中和抗体，同时表达的GMCSF能够调节体内免疫反应，从体液 免疫和细胞免疫两个方面，调节机体免疫反应，这样就能对猪体提供持久的保护力，因 此在PRRS的防治方面具有广阔的应用前景。<120> <130> <140> <141> <160> <170> <210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <400>
序列表
南京农业大学 猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-GF35 说明书
00
2008-06-12 9
Patentln version 3.5
1
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DNA
人工合成
GMCSF-P1 (1)..(27) 1
gctggtacca tggctcctac ccgccca 27 <210> 2 49
DNA
人工合成
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GMCSF-2AP2.1s (1)..(49) 2
gacgtcgccg gccaacttga gaaggtcaaa gttctttttg actggcccc 49
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213>人工合成
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<221> GMCSF-2AP2.2s <222> (1)..(48) <400> 3
gcactcgagg ggccctgggt tggactcgac gtcgccggcc aacttgag 48 <210> 4 29
DNA
人工合成
<211> <212> <213> <220> <221> <222> <400>
SY-GP3.1 (1)..(29) 4
gacctcgaga tggctaatag ctgtacatt 29
<210> 5
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<212> DNA
<213>人工合成
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<221> SY-GP3.2 <222> (1).,(24) <400> 5
acaaagcttt cgccgtgcgg cact 24 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213>人工合成<formula>formula see original document page 14</formula>
权利要求
1. 猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-GF35，其特征在于重组腺病毒rAd-GF35在分类上属于腺病毒科(Adenoviridae)，哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)，人腺病毒种(Human adenovirus)，分类命名腺病毒(重组)，该重组腺病毒已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏日期2008年3月4日，保藏号为CGMCCNo.2391。
2. 根据权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒，是通过以下方法构建而成的(1) GMCSF及PRRSVGP3、 GP5基因的扩增、克隆根据猪粒细胞巨噬细胞集落剌激因子的GenBank登录号U67175序列设计三条引物GMCSF-P1: 5- GCT GGTACCATGGCTCCTACCCGCCCA-3以刀豆素ConA对分离的猪外周血淋巴细胞进行刺激，然后提取淋巴细胞的总RNA，以总RNA反转录后的产物为模板，应用RT-PCR技术扩增出包含口蹄疫病毒2A基因和缺失终止密码子的猪粒细胞巨噬细胞集落刺激因子GMCSF基因；设计针对PRRSV国内分离株SY0608毒株GP3蛋白和GP5蛋白基因的特异性引物SY-GP3.1: 5-GACCTCGAGATGGCTAATAGCTGTACATT-3SY-GP3.2: 5-ACAAAGCTTTCGCCGTGCGGCACT-3SY-GP5.1: 5-ACGAAGCTTATGTTGGGGAAGTGCT-3SYGP5.2: 5-CAGATATCCTAGAGACGACCCCATTG-3以SY0608毒株感染的猴肾细胞MARC-145细胞的cDNA产物为模板，应用RT-PCR技术扩增出 了国内PRRSV分离株SY0608病毒株缺失终止密码子的GP3基因和GP5全基因；在上下游引物5'端引入限制性内切酶酶切位点，通过酶切，把GMCSF、 GP3、 GP5基因克隆入 穿梭载体pShuttle-CMV中，然后通过酶切和PCR鉴定，获得含有GMCSF、 GP3和GP5基因的穿梭 载体pShuttle —CMV-GMCSF-GP3-GP5,简称pSh -GF35;(2) 穿梭载体pSh-GF35与腺病毒骨架载体pAdEasy-l同源重组鉴定好的含有GMCSF、 GP3 和GP5基因的穿梭载体pSh-GF35经酶切线性化后与腺病毒骨架载体pAdEasy-l通过电转化方法转化 入大肠杆菌菌株BJ5183中,在大肠杆菌重组酶的作用下，在穿梭载体pSh-GF35和骨架载体pAdEasy-l 之间发生同源重组，经50ng/ml卡那霉素筛选获得了含有GMCSF、 GP3和GP5基因的重组腺病毒质 粒；(3) 重组腺病毒的获得鉴定好的重组腺病毒质粒通过阳离子脂质体法转染HEK293A细胞，重 组腺病毒质粒在HEK293A细胞内包装成完整的重组腺病毒rAd-GF35。
3. 用权利要求1或2所述的猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒rAd-GF35制备的疫苗。
4. 用权利要求l或2所述的重组腺病毒rAd-GF35制备疫苗的方法，其特征在于 取用低温保存的PRRSV重组腺病毒按1(^TCID5o接种长成单层的HEK293A细胞，当细胞病变达70-卯％时收毒，经反复冻融一次即可获得PRRSV重组腺病毒rAd-GF35疫苗。
全文摘要
本发明猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组腺病毒rAd-GF35，属于高新生物技术领域。通过扩增高致病性PRRSV SY0608分离株GP3和GP5蛋白基因，及猪集落细胞刺激因子(GMCSF)全基因序列，并串联克隆入pShuttle-CMV中，与pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183获得重组质粒，转染HEK293A细胞获得了重组腺病毒，成功表达了PRRSV SY0608株GP3，GP5及GMCSF蛋白。该重组毒可以正确表达GMCSF，发挥佐剂作用，从而提高PRRSV GP3、GP5蛋白的免疫活性，能更有效的刺激机体的免疫保护反应。这种重组腺病毒疫苗具有亚单位疫苗的安全性和弱毒疫苗的抗原增殖能力，而具有广泛的开发和应用前景。
文档编号A61P31/00GK101423823SQ20081015524
公开日2009年5月6日 申请日期2008年10月29日 优先权日2008年10月29日
发明者平 姜, 李玉峰, 王兴龙 申请人:南京农业大学