一种快速测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种复合微生物菌剂的检测方法，具体设及一种快速测定复合微生物 菌剂中多粘类芽抱杆菌含量的方法，属于微生物检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 微生物肥料俗称细菌剂料，简称菌剂，是指一类含有活微生物的特定肥料，应用于 农业生产中，能够获得特定的肥料效应。施用后通过菌剂中微生物的生命活动，借助其代谢 过程或代谢产物，W改善植物生长条件，尤其是营养环境。为了提高肥效，常在菌剂中混合 几种活微生物。
[0003]多粘类芽抱杆菌、枯草芽抱杆菌及胶冻芽抱杆菌等微生物不仅具有农药的杀菌作 用，而且还能改善±壤环境，促进植物生长，具有肥料的作用。为了最大限度的利用复合微 生物菌剂的功效，目前常将枯草芽抱杆菌、多粘类芽抱杆菌及胶冻芽抱杆菌混合制成复合 菌剂。胶冻样芽胞杆菌，又称娃酸盐细菌，尽管其对营养条件要求不高，对环境条件适应性 强，但通常情况下，添加在复合菌剂中的胶冻样芽抱杆菌的量只有枯草芽抱杆菌或多粘类 芽抱杆菌量几十分之一甚至百分之一，因此，将复合菌剂稀释到相应倍数测定枯草芽抱杆 菌和多粘类芽抱杆菌含量时，即便胶冻样芽抱杆菌能在该培养条件下生长，但其生长的菌 量对枯草芽抱杆菌和多粘类芽抱杆菌统计结果也不会造成显著性影响，故此测定时，常不 考虑胶冻样芽抱杆菌的量；同时胶冻样芽抱杆菌的测定相对较容易，由于其在选择性（无 氮或无有效憐钟养分）固体培养基上有其独特菌落和细胞形态特征，因而不需生化特性检 测或基因序列分析也很容易与其他细菌区分。但枯草芽抱杆菌与多粘类芽抱杆菌所使用的 培养基相同，在常规的培养条件下，枯草芽抱杆菌生长速度较快，而多粘类芽抱杆菌生长速 度相对较慢，培养基中快速长出的枯草芽抱杆菌覆盖了多粘类芽抱杆菌，从而使得无法准 确统计多粘类芽抱杆菌的含量，而且枯草芽抱杆菌的适应性较多粘类芽抱杆菌更强，通过 控制培养溫度等简单方法难W准确统计多粘类芽抱杆菌的含量。随著近年来此类菌剂的生 产和应用越来越广泛，我们急需建立一种简易、快速、能准确测定多粘类芽抱杆菌含量的方 法。
[0004]氨节西林钢（AmpicillinSodium,CAS号：69-52-3)。化学结构式： 阳0化]
[0006]化学式而化8吨化〇45。氨节西林钢属于青霉素类抗生素，可W用于肌内注射或者 静脉注射，主要用W治疗敏感细菌所致的上、下呼吸道感染、胃肠道感染、尿路感染、皮肤、 软组织感染、脑膜炎、败血症、屯、内膜炎等。目前还没有氨节西林钢抑制枯草芽抱杆菌或多 粘类芽抱杆菌的文献报导。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种快速测定复合微生物菌剂中多粘类芽抱杆菌含量的方 法，W简化操作，获得更为准确的检测结果。为达到上述发明目的，本发明采用了W下技术 方案：
[0008] 一种快速测定复合微生物菌剂中多粘类芽抱杆菌含量的方法，所述复合微生物 菌剂的活性成分为枯草芽抱杆菌、多粘类芽抱杆菌和胶冻样芽抱杆菌，该方法包括W下步 骤：
[0009] 1)在微生物培养基中加入氨节西林钢，使其浓度达到0. 05~0. 3 y g/mU混匀后 制成平板；
[0010] 2)将待测复合微生物菌剂在含重量百分比为0. 05~0. 5%Tween-80的生理盐水 中溶解后，置于磁力揽拌器上，在室溫下揽拌20~40min，转速为100~20化pm，然后再将 该溶液置于超声水浴锅中，超声20~40min，制得待测样品溶液；
[0011] 3)将待测样品溶液均匀涂布在步骤（1)制得的平板上，涂布完成后，将其放入 32°C恒溫培养箱中，24~4化后统计各平板菌落数并计算含量。 阳〇1引优选地，所述氨节西林钢的浓度为0.1yg/mL。
[0013] 所述微生物培养基为PDA培养基。
[0014] 优选地，步骤。中，将待测复合微生物菌剂在含重量百分比为0.1 %Tween-80的 生理盐水中溶解后，置于磁力揽拌器上，在室溫下揽拌30min，转速为15化pm，然后再将该 溶液置于超声水浴锅中，超声30min，制得待测样品溶液。
[0015] 本发明的有益效果是：
[0016] 本发明通过向培养基中加入一定浓度的氨节西林钢，抑制枯草芽抱杆菌的生长， 但不抑制多粘类芽抱杆菌的生长，从而避免了快速长出的枯草芽抱杆菌对多粘类芽抱杆菌 统计数据的影响。该方法通过计数菌落的数量并换算成活芽抱含量，可W快速、简便、准确 地测定复合微生物菌剂中多粘类芽抱杆菌的含量。
【附图说明】
[0017] 图1是本发明实施例中测定方法流程图。
[0018] 图2是不同浓度氨节西林钢对枯草芽抱杆菌和多粘类芽抱杆菌的抑菌圈试验化1 为枯草芽抱杆菌、K3为多粘类芽抱杆菌）。
[0019] 图3是多粘类芽抱杆菌在含不同浓度氨节西林钢平板上生长情况照片。
[0020]图4是枯草芽抱杆菌、多粘类芽抱杆菌和胶冻样芽抱杆菌的混合菌在含不同浓度 氨节西林钢平板上生长情况照片。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合附图及实施例对本发明作进一步详细描述：
[0022] 实施例：采用图1所示方法流程，分别对枯草芽抱杆菌颗粒菌剂、多粘类芽抱杆菌 液体菌剂、枯草芽抱杆菌+多粘类芽抱杆菌+胶冻样芽抱杆菌复合颗粒菌剂、枯草芽抱杆菌 +多粘类芽抱杆菌+胶冻样芽抱杆菌复合液体菌剂的含量进行测定，依次作为实施例1~ 4。
[0023] 测定步骤如下：
[0024] 1)取PDA培养基，装入500血的立角瓶内，高压蒸汽灭菌后，待冷却至55~65°C 后加入氨节西林钢，使其浓度分别达到0. 1yg/mL、0. 2yg/mL、0. 3yg/mL、0. 4yg/mL、 0. 5yg/mU混匀后制成PDA平板。
[00巧]。在无菌操作条件下，将样品揽拌均匀，准确称取10.0 g样品，加入90血含0.1% (重量百分比）Tween-80的的灭菌生理盐水中，充分溶解后，置于磁力揽拌器上揽拌30min， 然后再将该溶液置于超声水浴锅中，超声30min，得到稀释10倍的样品溶液，标记为0号，然 后依次进行10倍梯度稀释，每个稀释度设3个重复样品。
[00%] 3)将上述各梯度稀释液分别吸取100y以用L形玻棒均匀涂布在步骤（1)所得平 板上，32°C恒溫培养箱中2地，选择适宜的稀释度，菌落数在30~300的平板为有效计数平 板。
[0027] 4)计算加入不同浓度氨节西林钢后的活芽抱含量为N=一xtxlQ,式中N是活芽 m 抱数，单位为C化/g;c是同一稀释倍数的多个有效计数平板上的平均菌落数；m是称取的菌 剂样品质量，单位为g;t是统计平板对应的稀释倍数。 阳0測结果比较：
[0029] 将0yg/mL含量的氨节西林钢PDA平板作为各实施例的对照组，对各实施例中含 不同浓度氨节西林钢的PDA平板的测定结果进行比较，结果如表1所示。
[0030] 从表1可W看出，实施例1义用本发明的方法，在含较低浓度氨节西林钢的PDA 平板上未能检测出活芽抱，说明氨节西林钢对枯草芽抱杆菌有很好的抑制作用。运一结论 我们从图2所示的抑菌圈试验中也能看出：即在含0. 1yg/血氨节西林钢的平板上，K1所 表示的枯草芽抱杆菌都有抑菌圈出现，而K3所表示的多粘类芽抱杆菌则在较低氨节西林 钢浓度下没有抑菌圈出现或是抑菌圈不明显，只有在较高浓度下，才出现了明显的抑菌圈； 实施例2采用本发明的方法均能检测出活芽抱，但随着氨节西林钢含量的增大，活芽抱数 有所减少，说明选择适当含量的氨节西林钢对本发明的检测结果至关重要。运一结论在 图3中也能看出：即在图示的3个氨节西林钢浓度梯度下，都有多粘类芽抱杆菌的生长，且 0. 1 y g/mL-0. 2 y g/mL浓度下，其生长菌量与空白对照平板上生长的菌量几乎没有差异，当 浓度升到0. 5 y g/mL时，多粘类芽抱杆菌生长的量出现了明显减少；实施例3和实施例4测 定结果显示：在含低浓度氨节西林钢的PDA平板上，检测出的活芽抱数与添加在复合菌剂 中的多粘类芽抱杆菌含量相当，而在不含氨节西林钢的对照组PDA平板上，检测出的活芽 抱数与添加在复合菌剂中的枯草芽抱杆菌含量相当，运说明适当含量的氨节西林钢同样对 复合微生物菌剂中的枯草芽抱杆菌有抑制作用，而对多粘类芽抱杆菌没有影响。同样，运一 结论在图4中也能看出：即复合菌剂在不加氨节西林钢的平板上生长的菌的菌落形态及菌 量都与枯草芽抱杆菌一样，而在含不同浓度氨节西林钢的平板上生长的菌的菌落形态与不 加氨节西林钢的平板上生长的菌的菌落形态则完全不同，再结合生长的菌量，不难看出该 菌应为多粘类芽抱杆菌。
[0031]综合表1及图2-4的结果，采用本发明的方法测定复合微生物菌剂中多粘类芽抱 杆菌含量不仅操作简单，而且快速、准确，是一个较理想的检测方法。
【主权项】
1. 一种快速测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌含量的方法，所述复合微生物菌剂 的活性成分为枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌，其特征在于包括以下步 骤： 1) 在微生物培养基中加入氨苄西林钠，使其浓度达到0. 05~0. 3yg/mL，混匀后制成 平板； 2) 将待测复合微生物菌剂在含重量百分比为0. 05~0. 5%Tween-80的生理盐水中溶 解后，置于磁力搅拌器上，在室温下搅拌20~40min，转速为100~200rpm，然后再将该溶 液置于超声水浴锅中，超声20~40min，制得待测样品溶液； 3) 将待测样品溶液均匀涂布在步骤（1)制得的平板上，涂布完成后，将其放入32°C恒 温培养箱中，24~48h后统计各平板菌落数并计算含量。2. 如权利要求1所述快速测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌含量的方法，其特征 在于：步骤1)中，在微生物培养基中加入氨苄西林钠，使其浓度达到0.Iyg/mL，混匀后制 成平板。3. 如权利要求1所述快速测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌含量的方法，其特征 在于：所述微生物培养基为PDA培养基。4. 如权利要求1所述快速测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌含量的方法，其特征 在于：步骤2)中，将待测复合微生物菌剂在含重量百分比为0. 1%Tween-80的生理盐水中 溶解后，置于磁力搅拌器上，在室温下搅拌30min，转速为150rpm，然后再将该溶液置于超 声水浴锅中，超声30min，制得待测样品溶液。
【专利摘要】本发明公开了一种快速测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌含量的方法，所述复合微生物菌剂的活性成分为枯草芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌和胶冻样芽孢杆菌，本发明通过向培养基中加入一定浓度的氨苄西林钠，抑制枯草芽孢杆菌的生长，但不抑制多粘类芽孢杆菌的生长，从而避免了快速长出的枯草芽孢杆菌对多粘类芽孢杆菌统计数据的影响。该方法可以快速、简便、准确地测定复合微生物菌剂中多粘类芽孢杆菌的含量。
【IPC分类】C12R1/12, C12Q1/06
【公开号】CN105200116
【申请号】CN201510622375
【发明人】潘渝, 周莉, 袁善奎, 万俊, 马朋, 邹维, 唐纬坤, 刘荷梅, 胡承勇, 孙刚忠
【申请人】武汉科诺生物科技股份有限公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月25日