一种应用宫颈癌侧群细胞预测放化疗敏感性的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种医学技术领域，具体设及一种应用宫颈癌侧群细胞预测放化疗敏 感性的方法。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌的发病率占全球妇女恶性肿瘤的第二位，仅次于乳腺癌。我国每年有新发 病例10万左右，约占全世界宫颈癌新发病例的1/5。在发展中国家，妇女宫颈癌的死亡率超 过了乳腺癌，居女性恶性肿瘤死因之首。今年来我国局部地区子宫颈癌的发病率和死亡率 有增长趋势，部分地区还出现患病的年轻化趋势。宫颈癌的治疗采用W手术和放疗为主，化 疗为辅的综合治疗方案。早期宫颈癌的治疗效果较好，但IV期和复发性宫颈癌的5年生存 率仅为3. 2%~13%，复发大多数发生在诊断后2年内，预后差，中位存活期是7个月。因 此宫颈癌是严重威胁全球妇女健康和生命的疾病之一。
[0003] 肿瘤干细胞（cancerstemcell,CSC)理论是当前肿瘤学领域里的研究热点，该理 论认为：肿瘤中的细胞具有异质性，大多数肿瘤细胞不具有无限增殖力，仅有少数肿瘤细胞 具有与干细胞相似的无限增殖潜能和多项分化性特征，所有肿瘤细胞均来源于运些肿瘤干 细胞，运些占肿瘤细胞数量0. 1% -1 %的肿瘤干细胞是所有肿瘤细胞的祖细胞，对化疗药 物及放疗耐受，是导致肿瘤耐药、复发及转移的根源。因此，探寻宫颈癌的细胞起源，研究它 们的生物学特性，可W为宫颈癌的预防、筛查提供新的思路，为复发和转移性宫颈癌患者的 治疗指明新的方向。
[0004] 肿瘤干细胞的分离及鉴定是肿瘤干细胞研究的首要步骤。通过CSC表面特异性 标志筛选法分离干细胞可信度高，是鉴定CSC最权威的方法，然而，迄今为止，只有部分 肿瘤的干细胞表面标记物被鉴定出来。1996年Goodell等在用DNA染料为造血干细胞 Hoechst33342 染色并进行巧光活化细胞分选（fluorescenceactivatedcellso;rting， FAC巧时发现有一群染色偏低、与其他大部分细胞不一样的细胞群体。利用该特性分离的运 部分细胞被称为侧群细胞（Sidepopulation,SP)，运种可W排除化echest33342的特性被 称为SP表型。随着对SP细胞研究的深入，发现SP细胞的功能与正常干细胞相似，可发 生不对称分裂、进行自我更新等等，所W目前SP表型已成为分选肿瘤干细胞的常用方法之 一。近年来已有研究提示宫颈癌SP表型具备肿瘤干细胞样细胞的生物学特性，可W考虑作 为分选宫颈癌干细胞的有效方法。2010年国内学者冯下庆等首次报道从19例不同临床分 期的宫颈癌组织中分离获得的单细胞悬液经过肿瘤细胞球培养液（TSM)培养后八例有悬 浮的肿瘤细胞球形成，实验证实运些细胞符合干细胞特征。但是相关实验不多，且目前近年 的研究也主要集中在分离及对其进行生物学功能的鉴定方面，而关于放化疗敏感性的相关 研究未见报道。
[0005] 现已公认，肿瘤干细胞的一大特性就是对化疗药物抵抗。ABCG2蛋白是ABC结合盒 (ATP-bindingcassette，ABC)超家族成员之一，是一种P糖蛋白，在维持细胞自身稳定及 机体正常生理功能等方面起着重要作用，由ABCG2表达与SP表型的直接相关性可知细胞对 药物敏感性的下降是ABCG2的表达造成的。随着对ABC转运蛋白家族其他分子如ABCBl、ABCC2研究的日益深入，研究者们认为，其他的ABC转运蛋白也可能是形成SP表型的原因， 因而也是SP细胞多药耐药的分子基础。
[0006] 放射治疗在宫颈癌的治疗中占有重要地位。据统计，大约有80%的宫颈癌患者 需要放射治疗作为单独治疗或综合治疗的手段之一。放疗已经用于各个临床期别的宫颈 癌，但近年来其疗效的提高并不理想，部分肿瘤细胞对放疗不甚敏感，临床I、II期患者放 疗后5年生存率为65%~85% ;111、IV期患者约20%~50%。肿瘤干细胞放射抗拒的机制 可能与损伤DNA的修复、影响细胞周期调控、细胞调亡、增殖等转导信号通路改变有关。已 有证据显示乳腺癌、胶质瘤等实体肿瘤对放疗的不敏感性与CSCs的存在有关，可W大胆 地推测，晚期或复发转移的宫颈癌放疗不敏感性与SP细胞的放射线抵抗有关。通过检测 放疗敏感相关因子可W了解肿瘤内在的放射敏感性，研究表明在恶性肿瘤中，抑癌基因 P53过表达是一普遍现象，可进行DNA修复或启动调亡程序令细胞死亡，在福射损伤修复中 起重要作用，并与细胞放射敏感性有一定关系。上皮生长因子受体（epiderma1growth factorrec巧tor,EGFR)是活化的原癌基因的表达产物，一种跨膜酪氨酸激酶生长因子的 受体，在很多肿瘤细胞中均有表达，与肿瘤的预后有密切的关系。研究还认为EGFR升高与 肿瘤放疗疗效相关，EGFR信号途径是影响肿瘤细胞放疗敏感性的重要因素，它的过度表达 会导致肿瘤细胞对放射线的抵抗，可W认为EGFR是预测放疗敏感性的重要指标之一。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是提供一种应用宫颈癌侧群细胞预测放化疗敏感性 的方法。
[0008] 为解决上述问题，本发明一种应用宫颈癌侧群细胞预测放化疗敏感性的方法，其 特征在于，包括如下步骤：
[0009] (1)通过手术来源获得患者宫颈癌组织；
[0010] (2)制备原代宫颈癌细胞悬液：
[0011] 取手术切除的新鲜宫颈癌肿瘤组织，无菌生理盐水冲洗干净，剪成1mm3大小的碎 块，加入终浓度为0. 1 %的胶原酶，0. 01 %透明质酸酶，0. 002%的DNA酶，37°C消化2小时， 100目尼龙网过滤，500巧m离屯、lOmin，弃上清，加入适量Hanks液，混匀后行不连续密度梯 度离屯、，200化pm20min，收集富含肿瘤细胞的悬液，洗涂2次后，用含10%血清的DMEM培养 液调整细胞数至试验备用；
[001引 做将宫颈癌细胞在DMEM培养基中，于37°C、5%C02、95%湿度条件下的解箱中常 规贴壁培养；
[001引 （4)收集对数生长期的宫颈癌细胞，调整细胞数至IX106个/mL，将细胞分成两 组，一组加入化echst33342至终浓度为5mg/l，另一组同时加入50ymol/L利舍平作为对 照；混匀细胞重悬于冰冷的含2 %FBS的DMEM培养基，用超速流式细胞分选系统分选SP细 胞，分选后得到的SP细胞和NSP细胞用于进一步的实验研究；
[0014] 妨收集对数生长期的SP和NSP细胞，消化后制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为 2X1〇5个/mU接种于培养板，培养24h后换液，NSP细胞和SP细胞分别加入不同浓度的顺 销，培养24h后消化，PBS洗涂，AnnexinVFITC细胞调亡检测试剂盒染色，流式细胞仪检 ，细胞调亡率=UR% +LR% ;
[001引 （6)收集对数生长期的SP和NSP细胞，消化后制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为 2X105个/mU接种于培养板，培养24h后换液，SP细胞和NSP细胞给予不同剂量的放疗照 射，培养24h后消化，PBS洗涂1次；AnnexinVFITC细胞调亡检测试剂盒染色，流式细胞仪 检测，细胞调亡率=UR% +LR%。
[0016] 本发明的优选技术方案中，所述的步骤（5)可W和步骤（6)前后顺序互换。
[0017] 本发明的优选技术方案中，所述步骤巧）中，NSP细胞和SP细胞分别加入不同浓 度的顺销 0yg/mL、0. 475yg/mL、0. 95yg/mL和 1. 9yg/mL。
[0018] 本发明的优选技术方案中，所述步骤化）中，NSP细胞和SP细胞分别给予不同剂 量0, 2,4,8Gy照射的放疗照射。
[001引所述步骤（3)中DMBl培养基含有10%FBS、100U/mL青霉素和100yg/mL链霉素。
[0020] 本发明的实施例方案中，所述的宫颈癌细胞选自化La细胞。
[0021] 本发明采用Goodell等所报道的经典的化echst33342染色方法与流式细胞仪相 结合，对宫颈癌Hela细胞中的SP细胞及NSP细胞进行分选，观察细胞生长及体外克隆形成 情况，进一步进行化疗及放疗敏感性实验，观察两者对化疗药物顺销及放射线的反应性差 异，同时探索了可能的相关机制，为深入研究宫颈癌干细胞提供研究模型和基础，为临床应 用提供了依据。
[0022] 本发明的优点包括如下：
[0023] 1、肿瘤干细胞与肿瘤发生，发展和转移的关系密切，受到越来越多的关注，运些研 究主要集中在分选宫颈癌干细胞及对其进行生物学功能的鉴定方面，但是目前为止关于放 化疗敏感性的相关研究未见报道。
[0024] 2、本发明研究了肿瘤干细胞与放化疗抵抗的相关性，将治疗的重屯、转向肿瘤干细 胞，力求根除肿瘤干细胞，使肿瘤整体的增殖能力下降，肿瘤逐渐退化萎缩，从而真正治愈 肿瘤。
[00巧]3、本发明WSP细胞作