在放疗中更好地存活下来，可能是肿瘤进展、复发及转移 的根源。
[0122]4.SP细胞和NSP细胞ABCG2、ABCC2 和P53 与EGFR的表达
[0123] 研究发现一些肿瘤细胞的放化疗敏感因子及其产物的表达水平异常与肿瘤细胞 的化疗及放射治疗敏感性有关。
[0124] 肿瘤干细胞细胞膜上多数表达ABC转运体家族膜蛋白，尤其是ABCG2,它能运输并 排出代谢产物、药物等物质，使得许多抗肿瘤的化疗药物在肿瘤干细胞上发挥不了杀伤作 用，或作用明显减弱。化enZ等研究则显示出ABCG-2除转运功能外，在调节SP细胞的增 殖、分化及保护细胞方面也具有重要作用。随着对ABC转运蛋白家族其他分子如ABCB1、 ABCC2研究的日益深入，研究者们认为，其他的ABC转运蛋白也可能是形成SP表型的原因， 因而也是SP细胞多药耐药的分子基础。本发明结果显示SP和NSP细胞在无外界因素影响 下，SP细胞的ABCG2、ABCC2基因表达量高于NSP细胞，但比值没有统计学意义。DDP化疗后 发现SP细胞中ABCG2、ABCC2基因的表达均高于NSP细胞，有统计学差异（p= 0.013、P= 0. 024)。说明SP细胞中ABCG2、ABCC2的高表达对化疗药DDP具有一定的抵抗作用。本发 明孤P治疗前的基因表达结果与国外报道一致，但与祁文娟研究报告显示的化La和Si化 细胞分选后的SP细胞中ABCG2呈高表达，而NSP细胞中则几乎不表达不一致。本文分析认 为SP和NSP细胞在分子分型未见明显差异，说明两株细胞同根同源，可能是DDP药物的作 用下运两者之间细微的差异导致两株细胞产生了截然相反的现象。之前我们发现SP细胞 的生长速度快于NSP细胞，而细胞调亡水平低于NSP细胞，在DDP药物作用下，细胞不断的 死亡，ABCG2和ABCC2表达量的差异导致了SP细胞中ABCG2和ABCC2的相对表达量逐渐高 于NSP细胞，最终导致了质变发生，从而导致了耐药细胞株的产生。我们大胆猜想，随着患 者化疗疗程的不断进行，ABCG2和ABCC2表达量高的SP细胞在肿瘤组织内不断的积累，最终 量变导致了质变，从而耐药细胞株的产生，运也许是肿瘤患者对化疗药物耐受的原因之一。
[0125]目前，对于抑癌基因P53的研究较为广泛及深入，显示野生型p53基因抑制肿瘤 细胞放射损伤后的修复，促进肿瘤细胞的调亡，具有放疗增敏作用。但是，一旦P53基因发 生突变，则有利于肿瘤细胞增殖、癌变、进展，并产生放射抵抗性。EGFR(上皮生长因子受 体）过表达导致肿瘤放射抵抗的原因可能有通过刺激异常生长，抑制调亡W及对放疗损伤 的DNA的修复作用。Myllynen等的研究发现，EGFR对双链断裂值SB)的修复调节既设及到 非同源末端联接（NHEJ)和同源重组修复（HRR)，当EGFR被激活后，整个DSB的修复功能明 显提高，从而产生放射抵抗。本研究结果显示SP和NSP细胞在无外界因素影响下，SP细胞 的P53、VEGF基因表达量高于NSP细胞，但比值没有统计学意义。2Gy照射后发现SP细胞 中P53、VEGF的表达与NSP表达相比有显著差异。我们分析认为放疗前SP和NSP细胞在分 子分型未见明显差异，说明两种细胞同根同源，2GyX线照射后基因水平发生了明显的变化， 可W推论放疗后P53、EGFR基因表达的差异与SP细胞的放疗抵抗有一定关系，SP细胞对放 射线更为耐受，从而导致了肿瘤治疗的失败及复发。
[0126] 综上所述，本发明采用Goodell等所报道的经典的化echst33342染色方法与流 式细胞仪相结合，对宫颈癌Hela细胞中的SP细胞及NSP细胞进行分选，观察细胞生长及 体外克隆形成情况，进一步进行化疗及放疗敏感性实验，所分选出的SP细胞在体外具有较 强的增殖活性和克隆形成能力，符合肿瘤干细胞的生物学特性；不同药物浓度下SP细胞的 调亡率显著均低于NSP细胞，随着药物浓度的增加，细胞的调亡率逐渐升高，但是NSP细胞 的调亡增速较SP细胞更快；给予较低剂量的放疗后SP细胞的调亡率显著低于NSP细胞， 而高剂量的放疗会导致两种细胞均无法耐受，调亡增加；宫颈癌SP细胞中放化疗敏感因子 ABCG2、ABCC2P53、EGFR在无外界因素的影响下稍微高于NSP细胞，但无显著差异，分别经过 孤P化疗及放射线照射后，SP细胞中上述相关因子的基因表达明显高于NSP细胞，结果导致 肿瘤细胞对化疗及放疗均产生了抗拒，SP细胞对放化疗的敏感性不及NSP细胞。
[0127] W上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术 人员应该了解，本发明不受上述实例的限制，上述实例和说明书中描述的只是说明本发明 的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，运些变化和 改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同 物界定。
【主权项】
1. 一种应用宫颈癌侧群细胞预测放化疗敏感性的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 通过手术来源获得患者宫颈癌组织； (2) 制备原代宫颈癌细胞悬液： 取手术切除的新鲜宫颈癌肿瘤组织，无菌生理盐水冲洗干净，剪成Imm3大小的碎块，加 入终浓度为0. 1 %的胶原酶，0.Ol%透明质酸酶，0. 002%的DNA酶，37°C消化2小时，100目 尼龙网过滤，500rpm离心lOmin，弃上清，加入适量Hanks液，混勾后行不连续密度梯度离 心，2000rpm20min，收集富含肿瘤细胞的悬液，洗涤2次后，用含10%血清的DMEM培养液调 整细胞数至试验备用； (3) 将宫颈癌细胞在DMEM培养基中，于37°C、5%C02、95%湿度条件下的孵箱中常规贴 壁培养； (4) 收集对数生长期的宫颈癌细胞，调整细胞数至IXIO6个/mL，将细胞分成两组，一 组加入Hoechst33342至终浓度为5mg/L，另一组同时加入50ymol/L利舍平作为对照；混 匀细胞重悬于冰冷的含2%FBS的DMEM培养基，用超速流式细胞分选系统分选SP细胞，分 选后得到的SP细胞和NSP细胞用于进一步的实验研究； (5) 收集对数生长期的SP和NSP细胞，消化后制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为 2XIO5个/mL，接种于培养板，培养24h后换液，NSP细胞和SP细胞分别加入不同浓度的顺 铂，培养24h后消化，PBS洗涤，AnnexinVFITC细胞凋亡检测试剂盒染色，流式细胞仪检 测，细胞凋亡率=UR% +LR% ; (6) 收集对数生长期的SP和NSP细胞，消化后制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为 2XIO5个/mL，接种于培养板，培养24h后换液，SP细胞和NSP细胞给予不同剂量的放疗照 射，培养24h后消化，PBS洗涤1次；AnnexinVFITC细胞凋亡检测试剂盒染色，流式细胞仪 检测，细胞凋亡率=UR%+LR%。2. 根据权利要求1所述的一种应用宫颈癌侧群细胞预测放化疗敏感性的方法，其特征 在于，所述的步骤（5)可以和步骤（6)前后顺序互换。3. 根据权利要求1所述的一种应用宫颈癌侧群细胞预测放化疗敏感性的方法，其特征 在于，所述步骤（5)中，NSP细胞和SP细胞分别加入不同浓度的顺铂0yg/mL、0. 475yg/ mL、0. 95yg/mL和I. 9yg/mL。4. 根据权利要求1所述的一种应用宫颈癌侧群细胞预测放化疗敏感性的方法，其特征 在于，所述步骤（6)中，NSP细胞和SP细胞分别给予不同剂量0,2,4,8Gy照射的放疗照射。5. 根据权利要求1所述的一种应用宫颈癌侧群细胞预测放化疗敏感性的方法，其特征 在于，所述步骤（3)中DMEM培养基含有10%FBS、lOOU/mL青霉素和100yg/mL链霉素。
【专利摘要】本发明公开了一种应用宫颈癌侧群细胞预测放化疗敏感性的方法，包括步骤：制备得到宫颈癌细胞，宫颈癌细胞的体外贴壁培养；收集对数生长期的宫颈癌细胞，将细胞加入Hoechst33342；用超速流式细胞分选系统分选SP细胞，分选后得到的SP细胞和NSP细胞用于进一步的实验研究；然后将NSP细胞和SP细胞分别加入不同浓度的顺铂，Annexin？V？FITC细胞凋亡检测试剂盒染色，流式细胞仪检测，SP细胞和NSP细胞给予不同剂量的放疗照射，Annexin？V？FITC细胞凋亡检测试剂盒染色，流式细胞仪检测，细胞凋亡率＝UR％+LR％。本发明以SP细胞作为切入点来进行宫颈癌干细胞筛选，分析放化疗敏感性的差异及其可能的机制，为研制出抗肿瘤干细胞药物、阻断信号通路的一些细胞因子及化学物质提供理论依据。
【IPC分类】C12Q1/02
【公开号】CN105200114
【申请号】CN201510703204
【发明人】何爱琴, 章伟玲, 刘蓉, 陈曾燕, 何陈云, 吴霞, 贾美群, 季瑞, 徐海波
【申请人】南通市肿瘤医院
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年10月26日