一种宫颈癌细胞检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于硼掺杂石墨烯量子点的宫颈癌细胞检测试剂盒，属于生物检测领域。所述宫颈癌细胞检测试剂盒包括试剂A、B和C，试剂A为硼掺杂石墨烯量子点溶液，试剂B为硝酸铈溶液，试剂C为腺苷三磷酸溶液。所述试剂盒选择碱性磷酸酶作为检测的靶向目标，采用硼掺杂石墨烯量子点为荧光探针，通过量子点荧光分析方法实现了宫颈癌细胞表面碱性磷酸酶快速、高效的检测，可以用在医药领域检测宫颈癌细胞的及其浓度，具有易操作、检测结果准确率高、灵敏度高、成本低廉等优点。
【专利说明】
一种宫颈癌细胞检测试剂盒
技术领域
[0001]本发明涉及一种检测试剂盒，特别是涉及一种宫颈癌细胞检测试剂盒，属于生物检测技术领域。
【背景技术】
[0002]宫颈癌是目前严重威胁女性健康的恶性肿瘤疾病，其发病率呈逐年上升的趋势。根据数据统计，全世界每年约有宫颈癌新发病例50万，约有26万妇女死于该病。85%的新发病例发生在发展中国家，其中我国每年宫颈癌新发病例约占全世界发病总数的1/3。因此，发展高效便捷、高灵敏的宫颈癌细胞检测方法对于宫颈癌的早期诊断具有重要意义。
[0003]传统的宫颈癌诊断方法包括宫颈碘试验、阴道镜检查、宫颈摄影、子宫颈脱落细胞学检查、HPV检测、宫颈锥形切除术和宫颈管活体组织检查等(佟丽等，宫颈癌的预防及早期诊断.Chinese and Foreign Medical Research(中外医学研究)，2011,09(I)，112-113)。传统检查方法固然有其实用性，但也存在弊端，如操作复杂、检测结果准确率低、需要大型仪器、检测成本高。而光谱技术由于其具有灵敏度高的特点被广泛用于疾病的检测领域。其中，荧光光谱法具有信息量大、响应速度快、灵敏度高、操作简单、成本低廉、光学抗干扰能力强等优点，而备受人们关注。传统的荧光发光试剂是染料分子，如异硫氰酸荧光素FITC(Xiuhan Yang，Xiaochuan Wang,Xiaomin Zhang.CapilIary zone electrophoresisseparat1n of low concentrat1n stimulants in human urine with laser-1nducedfluorescence detect1n.Analytica Chimica Acta，2005，549( 1-2) ,81-87.)、花菁染料Cy3、Cy5等，它们有着一些不可避免的缺点，例如:光化学稳定性差，易发生光漂白与光降解，从而不利于较长时间的观察。另外，传统染料分子激发光谱窄，发射光谱宽，易受到复杂生命体系中生物大分子自发荧光的干扰。因此，设计并开发新的荧光检测试剂成为目前人们研究的热点。
[0004]随着量子点研究的深入，量子点优异的光学性能(如带宽窄、量子产率高、荧光信号稳定、荧光寿命长等)使其越来越多的应用于细胞及蛋白质成像的研究，而且取得了很好的成果。其中碳材料量子点因其具有优异的光学性能、良好的生物相容性及发射波长易调控等特点，成为在细胞检测中常用的荧光检测材料。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种基于硼掺杂石墨烯量子点(B-GQDs)的宫颈癌细胞检测试剂盒，可通过B-GQDs荧光信号的变化实现宫颈癌细胞及其浓度的快速、灵敏、高效检测。
[0006]为了实现上述发明的目的，本发明采用如下技术方案:
[0007]—种宫颈癌细胞检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括试剂A、B和C，其中试剂A为硼掺杂石墨烯量子点(B-GQDs)溶液，试剂B为硝酸铈溶液，试剂C为腺苷三磷酸(ATP)溶液。
[0008]本发明提出的基于硼掺杂石墨烯量子点的宫颈癌细胞检测试剂盒，该试剂盒的检测对象为宫颈癌细胞膜表面的碱性磷酸酶，这是一种广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织的一种酶，它的异常表达与肿瘤的发生、发展有着密切的关系。例如，碱性磷酸酶在宫颈癌细胞中呈高水平表达，且其表达水平随着宫颈癌病情的发生发展而呈现逐渐升高的趋势，但在正常宫颈细胞表面则呈低表达。
【申请人】研究发现，Ce(NO3)3诱发B-GQDs的荧光信号淬灭，但将B-GQDs与Ce(NO3)3的混合体系与宫颈癌细胞作用，在ATP存在时B-GQDs的荧光信号恢复，且荧光信号恢复的程度与宫颈癌细胞的浓度呈正比，从而实现宫颈癌细胞的检测。
[0009]因此，本发明选择碱性磷酸酶作为宫颈癌细胞检测的靶向目标，采用硼掺杂石墨烯量子点为荧光探针，通过构建硼掺杂石墨烯量子点-淬灭剂-腺苷三磷酸复合试剂，实现宫颈癌细胞的高灵敏检测。与石墨烯量子点相比，硼掺杂石墨烯量子点(B-GQDs)具有更高的量子广率，有利于检测灵敏度的提尚。
[0010]本发明所述的试剂盒的检测原理是:硼掺杂石墨烯量子点(B-GQDs)具有强的荧光信号，在铈离子Ce3+存在时，由于Ce3+和B-GQDs量子点表面的羧基(-COOHMt用而导致荧光信号淬灭;在宫颈癌细胞体系中，加入腺苷三磷酸(ATP)刺激细胞表面的碱性磷酸酶水解释放出磷酸根(P043—)，游离出的P043—取代-COOH与Ce3+离子结合从而导致B-GQDs的荧光恢复。根据B-GQDs荧光信号恢复检测宫颈癌细胞，并可根据荧光强度实现宫颈癌细胞浓度的检测。
[0011]所述的试剂A内还包括三羟基氨基甲烷-盐酸(TBS)缓冲液(优选地，浓度为0.lmol/L,pH 7.4)。
[0012]所述的硼掺杂石墨烯量子点，其粒径大小为3?8nm。可以采用现有技术中已知的方法合成，如实施例采用恒电位计时电流法合成。有关硼掺杂石墨烯量子点的合成，可参见文南犬(Zetan Fan,Yunchao Li,Xiaohong Li,Louzhen Fan,Shixin Zhou,Decai Fang,andShihe Yang Surrounding media sensitive photoluminescence of boron-dopedgrapheme quantum dots for highly fluorescent dyed crystals，chemical sensingand b1imaging.Carron 2014,70,149-156.)0
[0013]优选地，所述的检测试剂盒中，所述的试剂A为B-GQDs分散在三羟基氨基甲烷-盐酸(TBS)缓冲液中得到量子点溶液，浓度为15yg/mL，TBS缓冲液浓度为0.1moI/L，pH 7.4;所述试剂B中硝酸铈的浓度为20mmol/L;试剂C中腺苷三磷酸浓度为20mmol/L。
[0014]采用所述的检测试剂盒检测宫颈癌细胞(HeLa)，检测步骤具体如下:
[0015]1、配制试剂A:将硼掺杂的石墨烯量子点(B-GQDs)分散在TBS缓冲液中得到量子点溶液；
[0016]2、配制试剂B:将一定量Ce(NO3)3溶解在二次水中，制成溶液；
[0017]3、配制试剂C:将一定量ATP溶解在二次水中，制成溶液；
[0018]4、向试剂A中加入试剂B，记录B-GQDs的荧光信号F0;
[0019]5、取试剂A、试剂B，混合均匀后加入试剂C制成混合试剂，将混合试剂与宫颈癌细胞HeLa(浓度1-1OVmL)在37°C、5%C02培养箱内孵育2h;用TBS缓冲液洗去剩余的试剂后用胰酶消解HeLa细胞，记录该体系的荧光信号Fi;
[0020]6、建立B-GQDs检测HeLa细胞浓度的工作曲线:在步骤5中，改变HeLa细胞的浓度，记录不同已知HeLa细胞浓度下的荧光响应信号通Fi;计算出响应信号的差值AF( AF = F1-Fo);将所述的AF与HeLa细胞的浓度绘制成AF-c工作曲线，建立了基于B-GQDs的荧光响应的HeLa细胞浓度检测工作曲线；
[0021 ] 7、检测待测样品中HeLa的浓度:取待测的HeLa细胞，按照与步骤6)相同的方法与试剂盒中的试剂作用并检测其荧光信号，根据荧光信号强度，由步骤6)中得到的标准曲线计算得到待测HeLa细胞的浓度。
[0022]上述HeLa细胞的检测方法，其线性范围为10-106cell/mL;检测限为10cell/mL。
[0023]进一步地，上述方法中，
[0024]步骤I)配制的试剂A，硼掺杂的石墨烯量子点的浓度为15yg/mL;
[0025 ] 步骤2)配制的试剂B，Ce (N03) 3的摩尔浓度为20mmo I/L ；
[0026]步骤3)配制的试剂C，ATP的摩尔浓度为20mmo 1/L。
[0027]上述方法中，荧光光谱仪的激发波长为380nm，发射波长为530nmo
[0028]采用本发明技术方案具有如下有益效果:
[0029]本发明的宫颈癌细胞检测试剂盒，选择碱性磷酸酶作为检测的靶向目标，采用硼掺杂石墨烯量子点为荧光探针，通过构建硼掺杂石墨烯量子点-淬灭剂-腺苷三磷酸复合试剂，实现宫颈癌细胞的高灵敏检测。与石墨烯量子点相比，硼掺杂石墨烯量子点(B-GQDs)具有更高的量子产率，有利于检测灵敏度的提高。所述的检测试剂盒克服了传统的宫颈癌检测方法以及荧光发光试剂的缺陷，通过量子点荧光分析方法实现了细胞表面碱性磷酸酶快速、高效的检测，具有信息量大、响应速度快、灵敏度高、成本低廉、光学抗干扰能力强等优点。采用的硼掺杂石墨烯量子点无需进行额外修饰，不需要使用价格比较昂贵、连接步骤繁琐的有机或生化材料进行前处理，因此操作简单。
【附图说明】
[0030]图1.本发明中试剂A硼掺杂石墨烯量子点B-GQDs的透射电镜图。
[0031 ]图2.本发明中试剂A硼掺杂石墨烯量子点B-GQDs的XPS谱图。
[0032]图3.本发明中试剂盒的检测原理图。其中:曲线a是B-GQDs的荧光信号响应;b是加入试剂Ce(NO3)3后B-GQDs的荧光信号响应;c是将试剂盒中的混合溶液A、B及C与HeLa细胞作用后的荧光响应信号。
[0033]图4.本发明中B-GQDs的荧光强度随HeLa细胞浓度(O-1O6CelVmL)变化的荧光光谱图。
[0034]图5.本发明中HeLa细胞浓度检测的工作曲线。
【具体实施方式】
[0035]实施例1试剂盒的配制
[0036](I)B-GQDs 的制备
[0037]通过电化学工作站(CHI660B)采用恒电位计时电流法合成硼掺杂石墨烯量子点(B-GQDs) ο具体方法是:配制0.1moI/L的硼砂水溶液，取20mL作为电解液。以高纯石墨棒作为工作电极，铂丝电极作为对电极，甘汞电极作为参比电极，工作电位为3V。反应2小时后，将溶液通过0.22μηι的滤膜过滤，除去石墨稀片层。将上述溶液通过3500Da透析袋透析24h，除去溶液中Na+和B4O72—，得到B-GQDs。所得的B-GQDS分布均匀，其粒径大小在3_8nm(图1);对其元素分析发现其中含有B元素，含量为3.2 % (图2)。
[0038](2)试剂A的配制:将上述合成B-GQDs分散在TBS缓冲液(浓度为0.lmol/L，pH值为7.4)中，得到量子点溶液，其中B-GQDs浓度为15yg/mL;
[0039](3)试剂B的配制:将一定量Ce(NO3)3溶解在二次水中，制得浓度为20mmol/L硝酸铈溶液；
[0040](4)试剂C的配制:将一定量ATP溶解在二次水中，制得浓度为20mmol/L ATP溶液。实施例2荧光性能评价
[0041 ]通过荧光光谱仪检测B-GQDs溶液研究其荧光性能;其中激发波长为380nm，发射波长为530nm。
[0042]B-GQDs荧光性能评价:将实施例1配制的量子点溶液分散到TBS缓冲液(浓度为
0.1mol/L，pH值为7.4)中，其中B-GQDS浓度为15μg/mL，检测该溶液的荧光光谱(图3中曲线a)，将焚光信号记为Fo。
[0043]试剂B对B-GQDs的荧光淬灭作用:向B-GQDs(15yg/mL)中加入20yL的Ce(NO3)3(20mmol/L)，记录B-GQDs的荧光信号F(图3中曲线b)，结果表明该信号发生大幅淬灭。.
[0044]HeLa细胞对B-GQDs荧光信号的恢复:取试剂A l.0mL、试剂B 20.0yL，混合均匀后加入试剂C 10.0yL制成混合试剂，将混合试剂与宫颈癌细胞HeLa(16CelVmL)在37°C、5%CO2培养箱内孵育2h;，用TBS缓冲液冲洗3次洗去剩余的试剂后用胰酶消解HeLa细胞，记录该体系的荧光信号(图3中曲线C)，结果表明B-GQDS的荧光信号大幅的增强，可根据该增强的信号对HeLa细进行检测。
[0045]实施例3建立检测HeLa细胞浓度的工作曲线
[0046]取试剂A l.0mL、试剂B 20.0yL，混合均匀后加入试剂C 10.0yL制成混合试剂，将混合试剂与不同浓度的宫颈癌细胞HeLa(1-1O6ceIVmL)在37°C、5%C02培养箱内分别孵育2h;通过荧光光谱仪记录B-GQDs的荧光信号Fi(图4)，图4中a-g分别表示细胞浓度为0、10、102、103、104、105、1060611/111匕计算出响应信号的差值六？(六？ = ?广?())；将所述的六？与HeLa细胞的浓度绘制成AF-C工作曲线(图5);从而建立了基于B-GQDs的荧光响应的HeLa细胞浓度检测工作曲线;其线性范围为10-106cell/mL。
[0047]实施例4待测样品中HeLa细胞的检测
[0048]取待测的HeLa细胞，按照与实施例3中相同的方法与试剂盒中的试剂作用并检测其荧光信号，实验结果表明当HeLa细胞存在时，量子点的荧光信号明显恢复;根据HeLa细胞荧光变化程度，由实施例3中得到的标准曲线，可进一步得到待测HeLa细胞的浓度。取人胚肾上皮HEK 293T细胞为检测对象，当其与试剂盒作用时，量子点的荧光信号无明显变化。说明该试剂盒可用于碱性磷酸酶正表达的细胞(如HeLa细胞)的特异性检测。
【主权项】
1.一种宫颈癌细胞检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括试剂A、B和C，试剂A为硼掺杂石墨烯量子点溶液，试剂B为硝酸铈溶液，试剂C为腺苷三磷酸溶液。2.根据权利要求1所述的宫颈癌细胞检测试剂盒，其特征在于:试剂A中硼掺杂石墨烯量子点的粒径大小为3?8nm ο3.根据权利要求1或2所述的宫颈癌细胞检测试剂盒，其特征在于:试剂A中还包括三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液。4.根据权利要求3所述的宫颈癌细胞检测试剂盒，其特征在于:三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液的浓度为0.lmol/L，pH为7.4。5.根据权利要求1或2所述的宫颈癌细胞检测试剂盒，其特征在于:所述的试剂A为硼掺杂石墨烯量子分散在三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液中得到量子点溶液，浓度为15yg/mL，缓冲液浓度为0.lmol/L,pH 7.4;试剂B中硝酸铈溶液的浓度为20mmol/L;试剂C中腺苷三磷酸溶液的浓度为20mmol/L。
【文档编号】C12Q1/04GK105886596SQ201610266982
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月26日
【发明人】吴萍, 陈力, 蔡称心
【申请人】南京师范大学