多色高危hpv荧光检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了多色高危HPV荧光检测试剂盒，包括热启动Taq酶系统、通用引物、荧光探针、阴性对照和阳性对照，荧光探针为HPV特异性MGB探针。本发明的试剂盒适用于定性检测宫颈脱落细胞和生殖泌尿道分泌物样本中18种可引起宫颈癌的高风险HPV基因型。本试剂盒应用多重荧光PCR技术实现了在同一管扩增体系中检测18种HPV基因型，同时本试剂盒在同时检测15种常见高风险HPV基因型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82）时，还可检测三种少见高风险HPV基因型（26、53、73）。本发明的检测试剂盒，检测通量高，大大降低了筛查成本。
【专利说明】多色高危HPV荧光检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种HPV荧光检测试剂盒，特别涉及一种多色高危HPV荧光检测试剂 盒。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。原位癌高发年龄为30?35岁，浸润癌为45? 55岁，近年来其发病有年轻化的趋势。宫颈癌的早期发现和治疗是有效治疗宫颈癌的关键。
[0003] 现有研究表明，宫颈癌的主要病因是由高危型人乳头瘤病毒（Human papillomavirus，HPV)的持续感染或反复感染所致。90%以上的宫颈癌伴有高危型HPV感 染，高危型HPV持续感染是宫颈癌的主要危险因素。因此，HPV DNA检测在世界范围内多个 国家已经成为宫颈癌筛查和健康管理的一个重要部分。人乳头瘤病毒有多种基因型，依据 不同型别与宫颈癌发生危险性的高低可将其分为低危型和中高危型HPV。HPV DNA检测的 主要意义在于：1)基于液基细胞学结果决定患者是否需要进一步进行阴道镜检查；2)液基 细胞学异常而阴道镜检或活检阴性患者随访；3)高级别宫颈上皮内病变患者临床处理后治 疗结果预测；4)年龄> 30岁女性联合巴氏涂片针对宫颈癌早期筛查。
[0004] 现有的运用荧光PCR方法进行高危型人乳头瘤病毒基因分型检测的技术的缺点 主要是扩增灵敏度低，耗时长。前期一般都需要经过步骤繁琐的核酸提取，然后运用普通 Taqman探针的方法进行多重PCR扩增，而且一般都是FAM和HEX两通道检测，无法具体分区 高危HPV型别，难以满足实际使用的需要。
[0005] 开发出可以快速、高效的HPV高危型检测试剂盒，具有非常实际的意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种多色高危HPV荧光检测试剂盒。
[0007] 本发明所采取的技术方案是： 多色高危HPV荧光检测试剂盒，包括热启动Taq酶系统、通用引物、荧光探针、阴性对照 和阳性对照，荧光探针为HPV特异性MGB探针，HPV特异性MGB探针的序列如下： 探针 1 TTGGCATAATCAATTAITT 探针 2 TGGGGCAATCAGTTRTTTGT 探针 3 CTGATTGTTCCARCARATG 探针 4 AATCAGTTGTTTGTTACTGT 探针 5 TTTRTTACCTGTGTTGATAC 探针 6 TAACTGTTGTGGATACCAC 探针 7 TATATGTTGGCACAATCAA 探针 8 TGGTTACCCCAACAAATG 探针 9 TAATTGATTATGCCAGCAAACA 探针 10 TTACCTGTGTTGATACYAC 探针 11 CTGATTGCCCCAACAAAT 探针 12 TATWTGTTGGCATAATCAATTA 探针 13 ACAAAYAACTGATTGCCCCA 探针 14 ACTACAGTAACAAAYAATTG 探针 15 ACAAACAACTGATTATGCCAAC 探针 16 CTCATTTGGCTACTGTAAATGCAGACAC 探针 17 TTCAGGATACTGCCCCGGACAGTAGG 探针 18 CTCCTAAATACATTGCTGGACAAAATAC ； 上述探针的3'端连接有MGB，5'端连接有荧光基团，其中，三色高危HPV荧光检测试剂 盒探针1?15分别用于检测15种常见高风险HPV基因型16、18、31、33、35、39、45、51、52、 56、58、59、66、68、82 ;探针16?18分别用于检测三种少见高风险HPV基因型26、53、73。四 色高危HPV荧光检测试剂盒探针1用于检测常见高风险HPV基因型16型；探针2用于检测 常见高风险HPV基因型18型；探针3?18分别用于检测另外13种常见高风险HPV基因型 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82 和三种少见高风险 HPV 基因型 26、53、73。
[0008] 优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的通用引物为： 引物 1 GCMCAGGGWCATAAYAATGG 引物 2 GCTCAGGGITTAAACAATGG 引物 3 GCCCAGGGCCACAATAATGG 引物 4 GCNCAGGGNCACAATAATGG 引物 5 GCNCAGGGNCATAACAATGG 引物 6 GCNCAGGGNCATAATAATGG 引物 7 CGTCCMARRGGAWACTGATC 引物 8 TGAAAAATAAACTGTAAATCATATTC 引物 9 CCTATTCTTCACCATGCCTTA 引物 10 TGGTATTGATATTATGAATGTATGAC ; 引物中的N指肌苷。
[0009] 优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒设有内标引物及内标探针，内标引物 如下： 引物 11 CAACTTCATCCACGTTCACC 引物 12 GAAGAGCCAAGGACAGGTAC 内标探针的序列如下： 探针 19，TCTCCCTGCAGAGGGTTAAGGCGC。
[0010] 优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的热启动Taq酶系统中添加 有UDG酶。
[0011] 优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的热启动Taq酶系统含有经 过化学修饰的热启动Taq酶、dNTPs和UDG酶，其中每人份体系中热启动Taq酶为5U，dNTPs 为 0· 2mmol/L，UDG 酶为 0· 3U。
[0012] 优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒还设有DNA提取液，DNA提取液的组成 为EDTA的浓度为0. 25mol/L、乙酸钠的浓度为25mmol/L和DTT的浓度为lmmol/L。
[0013] 优选的，上述三色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的探针16?18连接的荧光 基团不同于探针1?15连接的荧光基团。
[0014] 优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒为三色高危HPV荧光检测试剂盒，其中 所使用的内标探针上连接的荧光基团不同于探针1?18的。
[0015] 优选的，上述多色高危HPV荧光检测试剂盒为四色高危HPV荧光检测试剂盒，其中 所使用的探针1连接的荧光基团不同于探针2, 3?18连接的荧光基团。
[0016] 优选的，上述四色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的探针2连接的荧光基团不 同于探针1，3?18连接的荧光基团。
[0017] 优选的，上述四色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的内标探针上连接的荧光基 团不同于探针1?18的。
[0018] 本发明的有益效果是： 本发明的试剂盒适用于定性检测宫颈脱落细胞和生殖泌尿道分泌物样本中18种可引 起宫颈癌的高风险HPV基因型。本发明应用多重荧光PCR技术实现了在同一管扩增体系中 检测18种HPV基因型，同时三色高危HPV荧光检测试剂盒在同时检测15种常见高风险HPV 基因型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82)时，还可检测三种少见高风险 HPV基因型（26、53、73)。四色高危即￥荧光检测试剂盒在同时检测13种常见高风险即￥ 基因型（31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82)和三种少见高风险册￥基因型（26、 53、73)，同时还能具体分型高风险HPV基因型16型和18型，本发明的检测试剂盒，检测通 量高，大大降低了筛查成本。
[0019] 通过加入m)G酶防污染，使得本发明试剂盒的灵敏度更高，最低检出量为1.0E+03 拷贝/反应。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1?6是本试剂盒检测范围内的检测结果示意图。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合实施例，进一步说明本发明。
[0022] 三色高危HPV荧光检测试剂盒，包括DNA提取液、热启动Taq酶系统、通用引物、荧 光探针、阴性对照和阳性对照，荧光探针为HPV特异性MGB探针，HPV特异性MGB探针的序 列如下： 探针 1 TTGGCATAATCAATTATTT (SEQ ID N0:1) 探针 2 TGGGGCAATCAGTTRTTTGT (SEQ ID N0:2) 探针 3 CTGATTGTTCCARCARATG (SEQ ID N0:3) 探针 4 AATCAGTTGTTTGTTACTGT (SEQ ID N0:4) 探针 5 TTTRTTACCTGTGTTGATAC (SEQ ID N0:5) 探针 6 TAACTGTTGTGGATACCAC (SEQ ID N0:6) 探针 7 TATATGTTGGCACAATCAA (SEQ ID N0:7) 探针 8 TGGTTACCCCAACAAATG (SEQ ID NO ：8) 探针 9 TAATTGATTATGCCAGCAAACA (SEQ ID NO ：9) 探针 10 TTACCTGTGTTGATACYAC (SEQ ID NO： 10) 探针 11 CTGATTGCCCCAACAAAT (SEQ ID NO： 11) 探针 12 TATWTGTTGGCATAATCAATTA (SEQ ID NO： 12) 探针 13 ACAAAYAACTGATTGCCCCA (SEQ ID NO： 13) 探针 14 ACTACAGTAACAAAYAATTG (SEQ ID NO： 14) 探针 15 ACAAACAACTGATTATGCCAAC (SEQ ID NO： 15) 探针 16 CTCATTTGGCTACTGTAAATGCAGACAC (SEQ ID NO： 16) 探针 17 TTCAGGATACTGCCCCGGACAGTAGG (SEQ ID NO： 17) 探针 18 CTCCTAAATACATTGCTGGACAAAATAC (SEQ ID NO： 18)； 上述探针的3'端连接有MGB，5'端连接有荧光基团，其中，探针1?15连接的荧光基 团为FAM，探针16?18连接的荧光基团为R0X。
[0023] 四色高危HPV荧光检测试剂盒，包括DNA提取液、热启动Taq酶系统、通用引物、荧 光探针、阴性对照和阳性对照，荧光探针为HPV特异性MGB探针，HPV特异性MGB探针的序 列如下： 探针 1 TTGGCATAATCAATTATTT (SEQ ID N0:1) 探针 2 TGGGGCAATCAGTTRTTTGT (SEQ ID N0:2) 探针 3 CTGATTGTTCCARCARATG (SEQ ID N0:3) 探针 4 AATCAGTTGTTTGTTACTGT (SEQ ID N0:4) 探针 5 TTTRTTACCTGTGTTGATAC (SEQ ID N0:5) 探针 6 TAACTGTTGTGGATACCAC (SEQ ID N0:6) 探针 7 TATATGTTGGCACAATCAA (SEQ ID N0:7) 探针 8 TGGTTACCCCAACAAATG (SEQ ID N0:8) 探针 9 TAATTGATTATGCCAGCAAACA (SEQ ID NO ：9) 探针 10 TTACCTGTGTTGATACYAC (SEQ ID NO :10) 探针 11 CTGATTGCCCCAACAAAT (SEQ ID NO :11) 探针 12 TATWTGTTGGCATAATCAATTA (SEQ ID NO :12) 探针 13 ACAAAYAACTGATTGCCCCA (SEQ ID NO :13) 探针 14 ACTACAGTAACAAAYAATTG (SEQ ID NO :14) 探针 15 ACAAACAACTGATTATGCCAAC (SEQ ID NO :15) 探针 16 CTCATTTGGCTACTGTAAATGCAGACAC (SEQ ID NO :16) 探针 17 TTCAGGATACTGCCCCGGACAGTAGG (SEQ ID NO :17) 探针 18 CTCCTAAATACATTGCTGGACAAAATAC (SEQ ID NO :18); 上述探针1?18的3'端连接有MGB，5'端连接有荧光基团，其中，探针1连接的荧光 基团为HEX，探针2连接的荧光基团为R0X，3?18连接的荧光基团为FAM。
[0024] 上述多色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的通用引物为： 引物 1 GCMCAGGGWCATAAYAATGG (SEQ ID N0:19) 引物 2 GCTCAGGGTTTAAACAATGG (SEQ ID N0:20) 引物 3 GCCCAGGGCCACAATAATGG (SEQ ID N0:21) 引物 4 GCNCAGGGNCACAATAATGG (SEQ ID N0:22) 引物 5 GCNCAGGGNCATAACAATGG (SEQ ID N0:23) 引物 6 GCNCAGGGNCATAATAATGG (SEQ ID N0:24) 引物 7 CGTCCMARRGGAWACTGATC (SEQ ID N0:25) 引物 8 TGAAAAATAAACTGTAAATCATATTC (SEQ ID N0:26) 引物 9 CCTATTCTTCACCATGCCTTA (SEQ ID N0:27) 引物 10 TGGTATTGATATTATGAATGTATGAC (SEQ ID N0:28); 引物中的N指肌苷，可与A、T、C、G中的任一种配对。
[0025] 上述多色高危HPV荧光检测试剂盒设有内标引物及内标探针，内标引物如下： 引物 11 CAACTTCATCCACGTTCACC (SEQ ID N0:29) 引物 12 GAAGAGCCAAGGACAGGTAC (SEQ ID N0:30) 内标探针的序列如下： 探针 19，TCTCCCTGCAGAGGGTTAAGGCGC (SEQ ID N0:31)，三色高危 HPV 荧光检测试剂 盒探针的5'端连接荧光基团HEX，3'端连接有MGB ;四色高危HPV荧光检测试剂盒探针的 5'端连接荧光基团CY5,3'端连接有MGB。
[0026] 上述多色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的热启动Taq酶系统含有经过化学 修饰的热启动Taq酶、dNTPs和UDG酶，其中每人份体系中热启动Taq酶为5U，dNTPs为 0· 2mmol/L，UDG 酶为 0· 3U。
[0027] 上述多色高危HPV荧光检测试剂盒中所使用的DNA提取液的组成为EDTA的浓度 为0. 25mol/L、乙酸钠的浓度为25mmol/L和DTT的浓度为lmmol/L，120〇μ1 /管。
[0028] 阴性质控品：灭菌纯化水，ιοομ? /管； HPV阳性质控品：HPV-18型样本，10〇μ1 /管。
[0029] 检测操作如下： 1.样本处理与DNA提取 1.1向宫颈刷保存管中加入2ml灭菌生理盐水(务必使拭子头完全浸入液体中)，震荡 60秒(使细胞充分落入液体，灭菌生理盐水变浑浊)，将全部洗涤液转至相应编号的2ml离 心管； 1. 2编好号的样品10, OOOrpm离心3分钟，弃上清； 1. 3样品沉淀中加入lml灭菌生理盐水，洗漆沉淀，10, OOOrpm离心3分钟，弃上清； 1. 4样品沉淀中加入5〇μ1病毒提取液，震荡60秒，充分悬浮细胞沉淀，备用。
[0030] DNA的提取也可以使用其他公知的方法进行。
[0031] 2.质控品处理 取装有HPV阳性质控品、阴性质控品的离心管，10, OOOrpm离心30秒，然后按1. 3?1. 4 的提取步骤操作。
[0032] 3.核酸扩增试剂准备(试剂准备区，冰上操作） 1) 从试剂盒中取出HR HPV PCR反应管，瞬时离心备用； 2) 往上述反应管中分别加入提取后的待测样本核酸2〇μ1 (如样本不足2〇μ1，请用灭菌 纯化水补足2〇μ1后加样)、阴性质控品、阳性质控品各2〇μ1。盖紧管盖，5000rpm离心30秒 后转移至扩增检测区。
[0033] 4. PCR 扩增 PCR参数为： 50〇C,3 min ；95〇C,5min ； 95°C，5 s，58°C，31 s，循环 45 次。
[0034] 在58°C时测定荧光值。
[0035] 根据荧光值变化曲线，确定检测结果。
[0036] 质量控制
【权利要求】
1. 多色高危HPV荧光检测试剂盒，包括热启动Taq酶系统、通用引物、荧光探针、阴性对 照和阳性对照，其特征在于：所述荧光探针为HPV特异性MGB探针，HPV特异性MGB探针的 序列如下： 探针 1 TTGGCATAATCAATTAITT 探针 2 TGGGGCAATCAGTTRTTTGT 探针 3 CTGATTGTTCCARCARATG 探针 4 AATCAGTTGTTTGTTACTGT 探针 5 TTTRTTACCTGTGTTGATAC 探针 6 TAACTGTTGTGGATACCAC 探针 7 TATATGTTGGCACAATCAA 探针 8 TGGTTACCCCAACAAATG 探针 9 TAATTGATTATGCCAGCAAACA 探针 10 TTACCTGTGTTGATACYAC 探针 11 CTGATTGCCCCAACAAAT 探针 12 TATWTGTTGGCATAATCAATTA 探针 13 ACAAAYAACTGATTGCCCCA 探针 14 ACTACAGTAACAAAYAATTG 探针 15 ACAAACAACTGATTATGCCAAC 探针 16 CTCATTTGGCTACTGTAAATGCAGACAC 探针 17 TTCAGGATACTGCCCCGGACAGTAGG 探针 18 CTCCTAAATACATTGCTGGACAAAATAC ; 上述探针的3'端连接有MGB，5'端连接有荧光基团。
2. 根据权利要求1所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于：所述通用引物 为： 引物 1 GCMCAGGGWCATAAYAATGG 引物 2 GCTCAGGGITTAAACAATGG 引物 3 GCCCAGGGCCACAATAATGG 引物 4 GCNCAGGGNCACAATAATGG 引物 5 GCNCAGGGNCATAACAATGG 引物 6 GCNCAGGGNCATAATAATGG 引物 7 CGTCCMARRGGAWACTGATC 引物 8 TGAAAAATAAACTGTAAATCATATTC 引物 9 CCTATTCTTCACCATGCCTTA 引物 10 TGGTATTGATATTATGAATGTATGAC ; 引物中的N指肌苷。
3. 根据权利要求1或2所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于：所述试剂 盒设有内标引物及内标探针，内标引物如下： 引物 11 CAACTTCATCCACGTTCACC 引物 12 GAAGAGCCAAGGACAGGTAC 内标探针的序列如下： 探针 19 TCTCCCTGCAGAGGGTTAAGGCGC。
4. 根据权利要求1或2所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于：所述热启 动Taq酶系统中添加有UDG酶。
5. 根据权利要求1或2所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于：所述试 剂盒还设有DNA提取液，DNA提取液的组成为EDTA的浓度为0. 25mol/L、乙酸钠的浓度为 25mmol/L 和 DTT 的浓度为 lmmol/L。
6. 根据权利要求4所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于：所述热启动Taq 酶系统含有经过化学修饰的热启动Taq酶、dNTPs和UDG酶，其中每人份体系中热启动Taq 酶为 5U，dNTPs 为 0· 2mmol/L，UDG 酶为 0· 3U。
7. 根据权利要求1、2或6所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于：所述多 色高危HPV荧光检测试剂盒为三色高危HPV荧光检测试剂盒，其探针16?18连接的荧光 基团不同于探针1?15连接的荧光基团。
8. 根据权利要求1、2或6所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于：所述多 色高危HPV荧光检测试剂盒为四色高危HPV荧光检测试剂盒，其探针1?2连接的荧光基 团不同于探针3?18连接的荧光基团。
9. 根据权利要求3所述的多色高危HPV荧光检测试剂盒，其特征在于：内标探针连接 的荧光基团不同于探针1?18连接的荧光基团。
【文档编号】C12Q1/68GK104195247SQ201410431759
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月28日 优先权日:2014年8月28日
【发明者】陈华云, 肖湘文, 丁渭, 刘淑园, 陈嘉昌, 方凤银, 赵丽 申请人:广州和实生物技术有限公司