专利名称：基于zn(ii)的比色检测剂和其制备方法
基于ZN(II)的比色检测剂和其制备方法本发明的领域
本发明涉及式IA的化合物,其用作活细胞的可行的染色剂(staining agent)。
权利要求
1.式IA的化合物
2.权利要求I所要求的化合物，其中它在性质上是非亲脂性的。
3.权利要求I所要求的化合物，其中所述化合物是比色检测剂，并且用作活细胞的可 行的染色剂。
4.权利要求3所要求的化合物，其中所述活细胞选自原核和真核细胞。
5.权利要求3所要求的化合物，其中使用的原核细胞是杆菌物种和假单胞菌物种。
6.权利要求3所要求的化合物，其中使用的真核细胞是酵母(酿酒酵母)。
7.制备式IA的化合物的方法，包括下列步骤 i.在速率为300至600rpm(每分钟旋转)的温和搅拌下，在25_30°C范围内的温度下，将1，4，8，11-四氮杂环十四烷溶解在溶剂中； ii.将步骤(i)所获得的溶液在冰中、在2至5°C范围内的温度下保持； iii.在300至600rpm速率的温和搅拌下，以0. 5至I. 0 mL/分钟的速率向步骤(ii)所获得溶液中加入三乙胺碱； iv.在0至5°C范围内的温度下，以15至60mL/小时范围内的速率向步骤(iii)所获得溶液中加入单独制备的4-(4’ -二甲基氨基-苯基偶氮)苯磺酰氯的四氢呋喃溶液； V.在25至30°C的温度范围内，将步骤(iv)所得到的混合物搅拌5至10小时； vi.在65至70°C范围内的温度下，将步骤(V)所获得的混合物回流20至60分钟； vii.将步骤(vi)所获得的混合物过滤，以分离配体的沉淀； vi ii.将步骤(vii)所获得配体的沉淀洗漆并干燥； ix.在20至25°C范围内的温度下，将步骤(viii)所获得的配体溶解在醇中； X.在20至25°C范围内的温度下，将硝酸锌溶液(配体的0. 3至0. 8摩尔当量)加入到步骤(ix)所获得的配体溶液中； xi.在25至30°C的温度范围内，将步骤(X)所获得的溶液搅拌12至24小时； xii.在10至20°C的温度范围内，将步骤(xi)所获得的溶液搅拌2至5小时； xiii.过滤步骤(xii)所获得的沉淀，并用氯仿洗涤，获得式IA的化合物。
8.权利要求7的步骤(i)所要求的方法，其中使用的溶剂选自氯仿、甲醇、二氯甲烷和四氢呋喃(THF)。
9.权利要求7的步骤(ix)所要求的方法，其中使用的醇选自甲醇和乙醇。
10.使用权利要求I所要求的化合物将活细胞染色的方法，其中所述步骤包含 a在30至40°C范围内的温度下，在葡萄糖酵母提取物琼脂(GYE)培养基中培养(i)酵母物种(MTCC 5548)，在营养肉汁中培养(ii)杆菌物种(MTCC 5549)，在King’s B培养基中培养(iii)假单胞菌物种(MTCC 5550)，培养时间在6至36小时范围内； b在28至38°C的温度范围内，用0. 6xl0_4至I. 2x1 O^4 M的式IA化合物将步骤(a)的细胞培养5至20分钟； c在pH值为7.4至7.6范围内的缓冲剂中，在28至38°C范围内的温度下，将步骤(b)获得的培养的样品用戊二醛固定10至12小时； d将步骤(c)所获得的样品用所述缓冲剂洗涤0. 5至I. 0小时；e用四氧化锇和缓冲剂后固定步骤(d)所获得的样品，并用所述缓冲剂洗涤；f利用梯度水_乙醇系列，从步骤(e)所获得的样品中除去水；g用所述缓冲剂冲洗步骤(f)所获得的样品，并在喷射涂布机中用金涂溃，获得在单式显微镜下观察的染色样品； h用染色细胞的不同颜色强度和形状来辨别活细胞。
11.权利要求10所要求的方法，其中使用的缓冲剂是磷酸盐缓冲剂。
12.权利要求10所要求的方法，其中用扫描电子显微(SEM)分析来证明检测剂与活细胞的结合。
13.权利要求10所要求的方法，其中用染料染色之后细胞的活力是如下证明的用悬滴法在凹载玻片中观察试验微生物中的二分体，其显示细胞分裂的出现。
14.权利要求10所要求的方法，其中用枸橼酸钠20%(w/v)溶液使细胞褪色、通过光学显微镜和紫外-可见光谱来检测式IA化合物的可逆性结合。
15.权利要求10所要求的方法，其中用式IA化合物进行活细胞的染色，这是由于检测剂与存在于活细胞的细胞壁上的ATP形成七配位的物种，其中三个磷酸基与Zn配位，并且所有三个磷原子都获得31P NMR位移。
16.权利要求10所要求的方法，其中加入ATP之后，式IA化合物的吸收光谱滴定曲线显示了 40 nm的谱移，并且化合物与ATP的结合常数是(978±4)M'
17.权利要求I所要求的式IA的化合物，其中在a-CD (环糊精)的存在下，式IA化合物在水中的溶解度提高大约7至7. 5倍。
18.权利要求I所要求的式IA的化合物，其中在a-CD (环糊精)的存在下，式IA化合物的染色强度提高，显示出加入a-CD(环糊精)的水溶液时，基于锌(II)的比色检测剂L. Zn的最大吸收倾向于移动5 nm。
19.权利要求10所要求的方法，其中利用式IA化合物的染色在10-20分钟发生，而在a-CD(环糊精)的存在下，在I秒钟至2分钟发生，说明在a-CD(环糊精)的存在下，式IA化合物的染色速度提高。
20.权利要求10所要求的方法，其中发现没有染料的酵母物种细胞表面的SEM成像是光滑的，而在染料存在下的酵母物种细胞表面发现是粗糙的。
21.权利要求10所要求的方法，其中发现没有染料的Gram+M细菌的SEM成像是光滑的，而带有染料的是粗糙的。
22.权利要求10所要求的方法，其中发现没有染料的Gram细菌的SEM成像是光滑的，而带有染料的是粗糙的。
23.权利要求10所要求的方法,其中与染色的Gram~ve细菌的染色细胞相比较,Gram+ve细菌的染色细胞显得更长。
全文摘要
本发明描述了具有氮杂-大环Zn(II)-配合物(L.Zn)(反应路线1，式1A)的新的比色化学检测剂分子，其可以在水介质(pH7.4)中选择性和有效地辨别ATP(三磷酸腺苷)(生物学重要的三磷酸酯)。由于ATP是活性有机体的能源，所以，通过与代谢过程期间原位形成的ATP结合，L.Zn(反应路线1，式1A)还可以用作活细胞的染色剂。发现L.Zn(反应路线1，式1A)对活细胞是无毒的，并且可以监测微生物细胞的生长研究。由此，L.Zn(反应路线1，式1A)可以用作可行的染色剂。进一步的，在α-CD(环糊精)的存在下(反应路线2)，L.Zn(反应路线1，式1A)在水中的溶解度提高。这有助于实现活细胞的更快和更强烈的染色。由此，通过使用α-CD，还可以进一步提高染色效果。
文档编号C07D257/02GK102971303SQ201180022839
公开日2013年3月13日 申请日期2011年3月21日 优先权日2010年5月31日
发明者P.马哈托, A.戈什, S.K.米什拉, A.什里瓦斯塔瓦, S.米什拉, A.达斯 申请人:科学及工业研究委员会