为切入点来进行宫颈癌干细胞筛选，分析放化疗敏感性的 差异及其可能的机制，为研制出抗肿瘤干细胞药物、阻断信号通路的一些细胞因子及化学 物质提供理论依据。为复发和转移性宫颈癌患者的个体化治疗指明新的方向。
【附图说明】
[0026] 图1为宫颈癌化la细胞中SP细胞流式检测图。
[0027] 图2为SP及NSP细胞体外增殖能力对比图。
[002引图3为SP及NSP细胞的体外克隆试验图。
[0029] 图4为SP及NSP细胞的体外克隆形成能力柱状图。
[0030] 图5为SP及NSP细胞加入0. 95yg/ml浓度的DDP流式细胞仪检测图。
[0031] 图6为SP及NSP细胞加入不同浓度的顺销后细胞调亡率。
[0032] 图7为SP及NSP细胞给予2Gy剂量照射后流式细胞仪检测图。
[0033] 图8为SP及NSP细胞给予不同的放射剂量后细胞调亡率。
[0034] 图9为干预前SP和NSP细胞中ABCG2、ABCC2基因的表达。
[003引 图10为干预前SP和NSP细胞中P53、EGFR基因的表达。
[0036] 图11为SP和NSP细胞化疗后ABCG2、ABCC2基因的表达。
[0037] 图12为SP和NSP细胞放疗后P53、EGFR基因的表达对比柱状图。
【具体实施方式】
[0038]W下结合附图描述本发明【具体实施方式】。
[0039] -、材料及设备
[0040] 1.实验动物或材料来源及处理
[0041] 人宫颈癌化la细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（上海生命科 学研究院细胞资源中屯、）。
[004引2.主要仪器：C02恒溫细胞培养箱，96孔板，FACS流式细胞仪，倒置显微镜，生物 安全柜，超纯水系统，离屯、机，水浴箱，分光光度计，细胞计数盒-8 (CCK-8)，全自动巧光定量PCR诊断系统，直线加速器。
[0043] 3.主要试剂：10%胎牛血清（FB巧，DMEM/F121 :1培养基，青链霉素混合液，膜蛋 白酶，化chest33342,PI(舰化丙晚），憐酸盐缓冲液，姬姆萨染液，Trizol试剂，RNA酶抑制 剂，MMLV反转录酶。
[0044] 二、实验方法
[0045] 1.宫颈癌化la细胞体外培养
[0046]HeLa细胞在含10%FBS、lOOU/mL青霉素和100yg/mL链霉素的DMEM培养基中， 于37°C、5%C〇2、95%湿度条件下的解箱中常规贴壁培养。
[0047] 2.流式细胞仪分选出SP细胞及NSP细胞
[004引收集对数生长期的化La细胞，消化后制备成单细胞悬液，离心PBS洗两次，用 含2 %FBS的DMEM培养基重悬，调整细胞数至1X106个/mL。将细胞分成两组，一组加入 化echst33342至终浓度为5mg/L另一组同时加入50ymol/L利舍平作为对照；混匀细胞， 37°C恒溫水浴摇床中避光解育90min。用含2%FBS的PBS洗1次，重悬于冰冷的含2%FBS 的DMEM培养基。按照细胞调亡检测试剂盒说明书操作，用超速流式细胞分选系统分选化La 细胞。分选后得到的SP细胞和NSP细胞用于进一步的实验研究。
[004引3.比较SP及NSP细胞的增殖能力、体外克隆形成能力
[0050] 3. 1比较SP及NSP细胞的增殖能力（ATP-TCP法）：
[0051] 收集对数生长期的SP和NSP细胞，消化后制备成单细胞悬液，每种细胞均按照每 孔100yL含细胞1000个接种至96孔板，每种细胞做4个平行孔，共做8组，DMEM(10 % FB巧作为空白对照组。按照ATP检测剂盒说明书操作，获得检测数值。根据各组细胞每一 天的读取值计算细胞的增殖率，第n天细胞的增殖率=第n天的读取值/第1天的读取值 *100%。W增殖率为纵坐标，时间为横坐标绘制细胞增殖曲线。
[0052] 3. 2比较SP及NSP细胞的体外克隆形成能力（平板细胞克隆形成法）：
[0053] 收集对数生长期的SP和NSP细胞，消化后制备成单细胞悬液，每种细胞均按照每 孔5mL含细胞100个接种至6孔板，每种细胞做3个平行孔。当出现肉眼可见的克隆时，终 止培养。弃液后PBS洗2次。1血4%多聚甲醒固定细胞，15分钟。弃液后加1血giemsa 染色，30分钟后流水缓慢洗去，37°C干燥30分钟。在显微镜下计数大于50个细胞的克隆 数。Ig克隆形成率=lg(克隆数/接种细胞数）X100%。
[0054] 4.检测SP细胞及NSP细胞中相关基因的表达差异
[00巧]4. 1RNA提取
[0056] 收集SP及NSP细胞约107个，放入研磨管，加Biozol1血，吹打混匀，室溫解育 7min后，加200yL氯仿抽提。4°C，12000g离屯、15min，吸取上清入新巧管，加等体积预冷 异丙醇，吹匀，室溫解育20111111。4°(：，12000旨离屯、10111111，去上清，加1血75%预冷乙醇，重悬 洗涂。4°C，lOOOOg离屯、5min，去上清。加50yLDEPC水溶解，测定浓度后-80°C保存。
[0057] 4. 2c DNA合成
[0058]取干净ep管中加1 y L random 6mers，1 y L dNTP，7 y L RNase打ee地2〇, 1 y L Temp RNA，吹匀，放入PCR仪中，设定程序：65°C，5min。再加4yL 5*buffer，0. 5yL RNase inhibitor，lyL RTase，4. 5yL RNase free地20,吹匀，放入PCR仪中，设定程序：30°C， lOmin-42°C，50min-95°C，5min。反转结束，测定浓度后-80°C保存。
[0059] 4. 3RT-QPCR反应
[0060] 30 y L体系：15 y LSYBR MIX+0. 6 y Lprimer-F+O. 6 y Lprimer-R+ll. 8 y Ld地20巧 yL cDNA。标准两步法反应程序为：95°C预变性lOmin - 40巧cles 95°C 15s-60°C Imin。 见表1引物序列
[0061]
[0063]表达差异倍数=ACT (S巧/ ACT (NSP) ; ACT = CT(目的基因）-CT (GAPDH)
[0064] 5.放化疗敏感性实验
[0065] 5. 1化疗敏感性实验
[0066] 收集对数生长期的SP和NSP细胞，消化后制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为 2X105个/mU接种于6孔培养板。培养24h后换液，NSP细胞和SP细胞分别加入不同浓度 的顺销0yg/mL、0. 475yg/mL、0. 95yg/mL和1. 9yg/mL。培养2地后消化，PBS洗涂1次。 AnnexinVFITC细胞调亡检测试剂盒染色，流式细胞仪检测。细胞调亡率=UR%+LR%。
[0067] 5. 2放疗敏感性实验
[0068] 收集对数生长期的SP和NSP细胞，消化后制备成单细胞悬液，调整细胞浓度为 2X105个/mU接种于6孔培养板。培养24h后换液，SP细胞和NSP细胞分别给予0, 2,4， 8Gy照射。培养24h后消化，PBS洗涂1次。AnnexinVFITC细胞调亡检测试剂盒染色，流 式细胞仪检测。细胞调亡率=UR% +LR%
[0069] 6统计学处理
[0070] 采用SPSS17. 0软件处理数据。数据采用X±S表示，剂量之间采用t检验，计数资 料采用x2检验，P<0. 05具有统计学意义。
[00川 S、实验结果
[0072](一）宫颈癌化la细胞系中SP细胞的分选结果
[0073] 培养好的细胞经化echest33342巧光染色，经流式细胞仪分析检测结果显示，在 人宫颈癌化la细胞系中含有少量的SP细胞存在，其分选比例为1. 47 + 0. 85%，维拉帕米括 抗后SP细胞的含量降至0.02%。（见图1)。
[0074](二）比较SP及NSP细胞的增殖能力结果
[00巧]经化la分离出的两株细胞株，分别经8天的培养，发现第5天、第6天时细胞之间 的增殖差异具有统计学意义，分别为P= 0. 0057,P= 0. 0163,但是随着培养时间的延长， 细胞之间的差异没有统计学差异。SP细胞在第5天细胞增殖速度明显较NSP增快，说明SP 细胞的细胞活性明显优于NSP细胞。但随着培养时间的延长，在培养皿中剩余生存空间的 不断缩小及营养液的不断消耗，细胞增殖的速度明显放缓。二者之间的差异明显缩小，见图 2。
[0076] (S)比较SP及NSP细胞的体外克隆形成能力
[0077] 收集