多重等位基因检测的制作方法
【专利说明】多重等位基因检测
[0001] 本申请要求于2013年3月15日提交的美国临时专利申请序列号61/792, 202的 优先权，该临时专利申请通过引用以其整体结合到本文中。 发明领域
[0002] 本文提供了涉及核酸检测的技术并且特别地，但不排他地，涉及用于同时检测多 个核酸的方法和组合物的技术。
[0003] 发明背景 单核苷酸多态性（SNPs)的检测可用于生物医学领域例如人类遗传学、癌症诊断学、药 物遗传学和微生物基因分型。通常，许多常见的技术用等位基因特异性引物检测SNPs，所述 等位基因特异性引物设计为具有有效延伸特异性的SNP模板而非野生型模板或其它非靶 SNP序列。由于其特异性，相对于其它技术例如等位基因特异性探针，这类等位基因特异性 引物通常优选用于SNP检测。然而，使用等位基因特异性引物的PCR和实时PCR方法局限 于其多重性能力，这是因为扩增产物的检测基于与共有序列结合的探针，或基于不具有充 分区分小的核苷酸变更例如个别SNPs的能力的技术。
[0004] -些常规的解决方案使用在其:V末端包含SNP-检测核苷酸的等位基因特异性 引物和引物特异性杂交标签（美国专利号6, 794, 133)。然而，这项技术取决于固相技术， 并且具有危及其对于实时PCR的效用的引物特异性问题。其他常规的单体型分析解决方案 提供了使用在其3'末端包含SNP-检测核苷酸的等位基因特异性引物的多重检测，但SNPs 的检测通过大小而非通过实时PCR荧光信号完成（国际专利公布号W0 2008143367)。最 后，一些现存常规技术使用通用引物序列进行多重分析，但检测通过电泳进行，并且不提供 多重实时PCR(美国专利号6, 207, 372、5, 882, 856)。因此，在生物医学领域存在对使用等位 基因特异性引物的多重SNPs的多重PCR检测的需求。
[0005] 发明概述 本文提供了涉及使用等位基因特异性引物进行核酸序列多重检测的技术。例如，提供 了用于在一个检测反应（例如，PCR，如，实时PCR)中同时检测多个SNPs的方法的实施方 案。在一些实施方案中，所述技术在本文中被称为多重等位基因特异性引发检测（Masp)和 FRET-介导的多重等位基因特异性引发检测（F-Masp)。
[0006] 在一些实施方案中，并且随着该技术可用在一些应用中，F-Masp相对于Masp在其 探针的使用方面提供了一种或多种优势，在一些实施方案中，如果需要，所述探针为该技术 提供了额外的特异性。例如，在一些测定中，F-Masp减少或消除来自非特异性信号的干扰， 例如，来自非特异性引发、引物二聚体的形成和/或包含相同或相似靶序列的非靶向区（例 如，假基因）的存在。
[0007] 本文所提供的该技术允许从一个均一扩增反应检测、鉴定和/或报告多个SNPs或 基因型。因此，该技术为临床医生和患者更加有效提供信息、改善测定流程并提供一种所需 的技术。
[0008] 该技术，在一些实施方案中，提供用于检测样品中的核酸（例如，包含BRAF基因或 部分BRAF基因的核酸，如，包含BRAF突变的核酸，如，包含编码含有氨基酸置换的B-Raf蛋 白的BRAF突变的核酸，如，包含编码含有V600E、V600K和/或V600D氨基酸置换的B-Raf 蛋白的BRAF突变的核酸）的方法，所述方法包括使包含核酸的样品与猝灭状态的引物接 触；和如果引物与核酸杂交并产生扩增产物，则检测来自可检测状态的引物的信号，其中检 测到信号时，在样品中检测到核酸。在一些实施方案中，所述猝灭状态的引物包含双链的双 链体区域。在一些实施方案中，所述信号为荧光。在一些实施方案中，所述引物包含荧光团， 并且当引物在猝灭状态下时荧光团被猝灭剂猝灭。所述技术不限制与寡核苷酸连接的荧光 部分、猝灭剂部分和FRET对。例如，一些实施方案提供一种方法，其中荧光团为FAM、TET、 JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5 或 Cy5. 5 ;并且猝灭剂为 BHQ-1、BHQ-2 或 BHQ-3。
[0009] 在一些实施方案中，可检测状态的引物与核酸杂交；在一些实施方案中，猝灭状态 的引物通过聚合酶掺入到核酸链中。在一些实施方案中，猝灭状态的引物通过聚合酶掺入 核酸链中并且引物保留双链的双链体区域；然后，在一些实施方案中，当丧失双链的双链体 区域时，例如，当合成置换双链的双链体区域的互补链时引物处于可检测状态。
[0010] 所述技术的引物以多种形式提供。例如，在一些实施方案中猝灭状态的引物由包 含荧光团和猝灭剂的一个寡核苷酸组成。在一些实施方案中，猝灭状态的引物由包含荧光 团的第一寡核苷酸和包含猝灭剂的第二寡核苷酸组成，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸 杂交。在一些实施方案中，未激发状态的引物由包含荧光团的第一寡核苷酸和第二寡核苷 酸组成，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交。
[0011] 在一些实施方案中，所述技术的引物通过聚合酶（例如，在PCR期间）或另一合成 过程掺入到核酸中。在一些实施方案中，被掺入的引物处于可检测状态、猝灭状态或未激发 状态。因此，在一些实施方案中扩增子包含可检测状态的引物。所述技术的引物以多种形 式提供。例如，在一些实施方案中，所述引物为茎-环引物或双链线性引物。在一些实施方 案中，所述引物为等位基因特异性引物。
[0012] 在一些实施方案中，所述技术进一步包括用聚合酶和核苷酸延伸可检测状态的引 物，并且在一些实施方案中所述技术进一步包括进行聚合酶链反应，例如，在一些实施方案 中所述聚合酶链反应为实时聚合酶链反应。
[0013] 在一些实施方案中所述方法为用于检测超过一个核酸（例如，超过一个包含BRAF 基因或部分BRAF基因的核酸，如，包含BRAF突变的核酸，如，包含编码含有氨基酸置换的 B-Raf蛋白的BRAF突变的核酸，如，包含编码含有V600E、V600K和/或V600D氨基酸置换 的B-Raf蛋白的BRAF突变的核酸），例如，超过一个等位基因、SNP、基因、突变等的多重方 法。因此，在一些实施方案中所述方法包括使包含第二核酸的样品与猝灭状态的第二引物 接触；和如果第二引物与第二核酸杂交并产生扩增产物，则检测来自可检测状态的第二引 物的第二信号，其中当检测到第二信号时，在样品中检测到第二核酸。
[0014] 在一些实施方案中所述技术包括使用引物和探针。例如，在一些实施方案中提供 用于检测样品中核酸的方法，所述方法包括使包含核酸的样品与猝灭状态或未激发状态的 引物和探针接触；和如果探针与核酸杂交，则检测来自引物的信号，其中当检测到信号时， 在样品中检测到核酸。在一些实施方案中，所述探针包含双链的双链体区域。在一些实施 方案中，所述信号为荧光。在一些实施方案中，所述探针包含荧光团（例如，荧光共振能量 转移供体），并且引物包含荧光团（例如，荧光共振能量转移受体）。
[0015] 所述技术的探针以多种形式提供。例如，在一些实施方案中猝灭状态的探针由包 含荧光团和猝灭剂的一个寡核苷酸组成。在一些实施方案中，猝灭状态的探针由包含荧光 团的第一寡核苷酸和包含猝灭剂的第二寡核苷酸组成，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸 杂交。在一些实施方案中，未激发状态的探针由包含荧光团的第一寡核苷酸和第二寡核苷 酸组成，其中第一寡核苷酸与第二寡核苷酸杂交。在一些实施方案中，探针（例如，在其Y 末端）被修饰以使其不能提供通过聚合酶来延伸的底物（例如，聚合酶不能将核苷酸加到 探针中）。在一些实施方案中所述探针为如本文所述的茎-环探针或双链的线性探针。所 述技术可用于检测等位基因、SNPs、突变等，并且在一些实施方案中所述引物为等位基因特 异性引物。
[0016] 在一些实施方案中，当探针处于猝灭状态时，探针荧光团被猝灭剂猝灭。所述技术 不限制与所述技术的寡核苷酸连接的荧光团和猝灭剂。例如，在一些实施方案中荧光团为 FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5 或 Cy5. 5 ;并且猝灭剂为 BHQ-1、BHQ-2 或 BHQ-3。 在一些实施方案中，所述引物包含第二荧光团，其为与探针的荧光共振能量转移（FRET)供 体的荧光团相容的荧光共振能量转移（FRET)受体。
[0017] 在一些实施方案中，所述方法包括用聚合酶和核苷酸延伸引物，例如，如在进行聚 合酶链反应中的那样。在一些实施方案中，聚合酶链反应为实时聚合酶链反应。
[0018] 在一些实施方案中，所述方法为用于检测超过一个核酸（例如，超过一个包含 BRAF基因或部分BRAF基因的核酸，如，包含BRAF突变的核酸，如，包含编码含有氨基酸置 换的B-Raf蛋白的BRAF突变的核酸，如，包含编码含有V600E、V600K和/或V600D氨基酸 置换的B-Raf蛋白的BRAF突变的核酸），例如，超过一个等位基因、SNP、基因、突变等的多 重方法。在一些实施方案中包括使用FRET，同一供体部分与两个（或更多个）不同的受体 部分一起使用，并且在一些实施方案中两个（或更多个）不同的供体部分与两个（或更多 个）受体部分一起使用。因此，在一些实施方案中所述方法进一步包括使包含第二核酸的 样品与第二引物接触；和如果探针与第二核酸杂交，则检测来自第二引物的第二信号，其中 当检测到第二信号时，在样品中检测到第二核酸。
[0019] 所述技术提供可用于检测一个或多个等位基因、SNPs、基因、突变等的组合物的实 施方案。在一些实施方案中提供包含下列之一的组合物： 与可检测引物杂交的核酸，其中所述可检测的引物包含荧光团和猝灭剂； 包含可检测引物的核酸，其中所述可检测引物包含荧光团和猝灭剂； 与可检测引物杂交的核酸，其中所述可检测引物包含荧光团；和包含猝灭剂的猝灭剂 寡核苷酸； 包含可检测引物的核酸，其中所述可检测引物包含荧光团；和包含猝灭剂的猝灭剂寡 核苷酸； 包含引物并且与探针杂交的核酸，其中所述探针包含第一荧光团和猝灭剂，所述引物 包含第二荧光团，并且所述第一荧光团和第二荧光团为FRET对；或 包含引物并且与探针杂交的核酸，其中所述探针包含第一荧光团，所述引物包含第二 荧光团，并且所述第一荧光团和第二荧光团为FRET对；和包含猝灭剂的猝灭剂寡核苷酸。
[0020] 在一些实施方案中所述组合物为反应混合物。在一些实施方案中所述组合物进一 步包含聚合酶和/或核苷酸（例如，在PCR如实时PCR中）。在一些实施方案中荧光团为 FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5 或 Cy5. 5 ;并且猝灭剂为 BHQ-1、BHQ-2 或 BHQ-3。 一些实施方案包含超过一种焚光团和/或超过一种猝灭剂。
[0021] -些实施方案提供使用本文所提供的探针和引物，例如，多重引物（例如，等位基 因特异性引物）的组合进行两个或更多个等位基因、SNPs、突变、基因等的多重检测。因此， 在一些实施方案中提供用于两个（或更多个）等位基因、SNPs、突变、基因等的多重检测的 组合物、方法、系统和试剂盒。这些实施方案涉及如本文所述的两个或更多个引物（例如， 两个或更多个等位基因特异性引物）的使用，各引物用单独的可检测荧光团标记。在这些 实施方案中，与两个或更多个引物相关的猝灭剂可为相同的猝灭剂或与两个或更多个引物 相连的猝灭剂可为两个或更多个不同的猝灭剂。在包含探针和/或使用探针的实施方案 中，与两个或更多个引物相连的探针可为相同的探针或与两个或更多个引物相连的探针可 为两个或更多个不同的探针。因此，用于多重测定的探针可包含相同的序列或用于多重测 定的探针可包含两个或更多个不同的序列（例如，与相同的靶序列杂交或与两个或更多个 不同的靶序列杂交）。在一些实施方案中，与探针杂交的两个或更多个不同的序列可相差仅 单个核苷酸。对于包含猝灭剂的探针的实施方案，两个或更多个不同探针的每一个可包含 相同的猝灭剂或包含猝灭剂的两个或更多个不同的探针的每一个可包含两种或更多种不 同的猝灭剂。在一些实施方案中，两个或更多个引物用于多重检测并且一个探针用于所述 两个或更多个引物的检测。在一些实施方案中，两个或更多个引物用于多重检测并且两个 或更多个探针用于所述两个或更多个引物的检测。
[0022] -些实施方案与探针上的供体荧光团与两个或更多个引物上的两个或更多个受 体荧光团之间的荧光共振能量转移（例如，F-Masp)相关。在这些实施方案中，同一探针供 体荧光团与两个或更多个引物的受体荧光团一起使用。因此，在测定中至少存在三个荧光 团，例如，第一引物上的受体荧光团、第二引物上的不同的受体荧光团和探针上的与两个或 更多个引物荧光团的每个形成FRET对的供体荧光团。在一些实施方案中，两个或更多个引 物的每个使用两个或更多个不同的探针。在这些实施方案中，两个或更多个不同的探针供 体荧光团与两个或更多个引物受体荧光团一起使用。因此，在测定中至少存在四个荧光团， 例如，第一引物上的受体荧光团、第二引物上的不同的受体荧光团、探针上与第一引物相关 的供体荧光团和探针上与第二引物相关的不同的供体荧光团。每个相关的引物-探针对的 引物和探针荧光团为FRET对。在一些实施方案中，未杂交的探针包含双链的双链体区域； 在一些实施方案中未杂交的探针包含猝灭剂（例如，探针处于未激发状态）。
[0023] 因此，在一些实施方案中（例如，多重实施方案）所述组合物进一步包含下列之 与第二可检测引物杂交的第二核酸，其中所述第二可检测引物包含第二荧光团和猝灭 剂或第二猝灭剂； 包含第二可检测引物的第二核酸，其中所述第二可检测引物包含第二荧光团和猝灭剂 或第二猝灭剂； 与第二可检测引物杂交的第二核酸，其中所述第二可检测引物包含第二荧光团； 包含第二可检测引物的第二核酸，其中所述第二可检测引物包含第二荧光团； 包含第二引物并且与探针杂交的第二核酸，其中所述探针包含第一荧光团和猝灭剂， 所述第二引物包含第三荧光团，并且所述第一荧光团与第三荧光团为FRET对；或 包含第二引物并且与探针杂交的第二核酸，其中所述探针包含第一荧光团，所述第二 引物包含第三荧光团，并且所述第一荧光团与第三荧光团为FRET对。
[0024] 在一些包含猝灭剂寡核苷酸的实施方案中，所述猝灭剂寡核苷酸为包含猝灭剂或 第二猝灭剂的第二猝灭寡核苷酸。相关的实施方案提供如本文所提供的组合物用于检测一 个或多个等位基因、检测一个或多个单核苷酸多态性和/或在多重测定中检测同一样品中 的超过一个等位基因的用途。
[0025] 进一步的实施方案提供包含（例如，用于检测核酸（例如，包含BRAF基因或部分 BRAF基因的核酸，如，包含BRAF突变的核酸，如，包含编码含有氨基酸置换的B-Raf蛋白的 BRAF突变的核酸，例如，包含编码含有V600E、V600K和/或V600D氨基酸置换的B-Raf蛋 白的BRAF突变的核酸）的）检测试剂的试剂盒，其中所述检测试剂包含下列之一： 包含荧光团和猝灭剂的茎-环引物； 包含含有荧光团的等位基因特异性单链引物和互补的猝灭寡核苷酸的双链线性引 物； 包含含有荧光团的等位基因特异性单链引物和互补寡核苷酸的双链线性引物； 包含荧光团的等位基因特异性引物和包含含有第二荧光团的探针链和猝灭剂寡核苷 酸的双链探针； 包含荧光团的等位基因特异性引物和包含含有第二荧光团的探针链的双链探针；或 包含荧光团的等位基因特异性引物和包含第二荧光团和猝灭剂的茎-环探针。
[0026] 在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含对照核酸。
[0027] 在一些实施方案中，所述试剂盒提供超过一个等位基因、SNP、基因、突变等的多重 检测。因此，在一些实施方案中所述试剂盒进一步包含第二检测试剂，其中所述第二检测试 剂包含下列之一： 包含第二荧光团和猝灭剂或第二猝灭剂的第二茎-环引物； 包含含有第二荧光团的第二等位基因特异性单链引物和互补的猝灭寡核苷酸或第二 互补的猝灭寡核苷酸的第二双链线性引物；或 包含第三荧光团的第二等位基因特异性引物。
[0028] 试剂盒包含探针，在一些实施方案中，例如： 包含含有第四荧光团的第二探针链和猝灭剂寡核苷酸的第二双链探针； 包含含有第四荧光团的第二探针链和第二猝灭剂寡核苷酸的第二双链探针； 包含第四荧光团和猝灭剂的第二茎-环探针；或 包含第四荧光团和第二猝灭剂的第二茎-环探针。
[0029] 在一些实施方案中，包含第二等位基因特异性引物的试剂盒还包括：包含含有第 二荧光团的探针链和猝灭剂寡核苷酸的双链探针（例如，同样与第一等位基因特异性引物 一起使用的探针）。在一些实施方案中，包含第二等位基因特异性引物的试剂盒还包括：包 含含有第二荧光团的探针链的双链探针（例如，同样与第一等位基因特异性引物一起使用 的探针）。
[0030] 如上所述，在一些实施方案中，所有的探针均包含与每个引物受体荧光团的荧光 团形成FRET对的相同供体荧光团。在一些实施方案中，不同的引物-探针对使用不同的受 体-供体FRET对。因此，在一些实施方案中荧光团与第二荧光团为FRET对，第三荧光团与 第二荧光团为FRET对，或第三荧光团与第四荧光团为FRET对。
[0031] 因此，本文提供用于检测样品中核酸的方法的实施方案，所述方法包含使包含核 酸的样品与猝灭状态的探针接触；和如果引物与核酸杂交或引物与核酸杂交并且引物掺 入到扩增子中，则检测来自可检测状态的引物的信号，其中所述核酸包含BRAF基因或部分 BRAF基因并且当检测到信号时在样品中检测到核酸。在一些实施方案中，猝灭状态的引物 包含双链的双链体区域。在一些实施方案中，所述信号为荧光。在一些实施方案中，所述 引物包含荧光团，并且当引物处于猝灭状态时荧光团被猝灭剂猝灭。在一些实施方案中，荧 光团为 FAM、TET、JOE、HEX、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5