豌豆抗白粉病er1等位基因er1-9及其编码蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及植物病理学、遗传育种及分子生物学领域，具体地说，设及魏豆抗白粉 病erl新等位基因erl-9及其编码蛋白。
【背景技术】
[0002] 魏豆（PisumsativumL.)是世界上重要的冷季类食用豆作物。据最新数据统计， 我国已成为世界上第一大菜用魏豆和第Ξ大干魏豆生产国（FA0STAT数据）。魏豆白粉病 巧rysiphepisi化C.)是魏豆上的一种重要病害，可造成25%~50%的产量损失，严重感 染的魏豆品种损失可高达80%W上（化saretal.,2011;Fondevillaet曰1.,2012)。
[0003] 抗病品种的应用是防治魏豆白粉病最为经济、有效且环境安全的方法。目前，国 外已经鉴定了大量的抗白粉病魏豆资源，并在抗性资源中鉴定了 3个抗白粉病基因，包括 两个独立遗传的隐性基因（erl和er2)和一个独立遗传的显性基因巧r3)(Harlandet al., 1948 ;He;ringaetal., 1969;Fondevillaetal., 2007)。目前，鉴定的大多数魏豆抗 白粉病资源的抗性均由erl控制，并且生产中应用的抗白粉病魏豆资源的抗性也均由erl 控制灯iwarietal. , 1997;(}hafooretal., 2012;Liuetal. , 2003 ;化idetal., 1997)。 抗病基因erl对白粉菌表现抗病或免疫的机制是抑制病原菌对寄主的表皮细胞的入侵。抗 病基因erl具有抗病持久而且不受外界环境影响的特点，在欧洲国家已广泛应用于魏豆栽 培种中（Fondevillaet曰1.，2007)。随着魏豆分子标记的开发和遗传图谱的构建，抗病基 因erl被定位在魏豆遗传图谱的第6连锁群（LGVI)(Timmermanetal. , 1994)。最近， Hump虹yetal. (2011)和化vanetal. (2011)等研究表明erl基因是与大麦感白粉病 基因（ML0)序列同源的PsMLO功能丧失而产生的，由于魏豆PsMLO同源基因序列发生基因 插入、缺失、移位、替换等基因突变导致功能丧失而产生了多个erl等位基因。基于erl基 因PsMLOl突变的位置和方式不同，目前已鉴定了 8个erl等位基因，分别是erl-l、erl-2、 e;rl-3、e;rl-4、e;rl-5、e;rl-6、e;rl-7和erl-S，其中等位基因e;rl-2是由大片段的插入或缺失 产生的，等位基因erl-7是由一个lObp的小片段缺失造成，等位基因erl-8是由3个碱基缺 失造成的，其它已知的5个erl等位基因都是由单碱基突变引起的化ump虹yetal., 2011; Pavanetal., 2011;Sunetal., 2015a;201f5b)。
[0004] 目前，魏豆白粉病已对我国魏豆生产造成严重威胁，在白粉病易发生地区，在魏豆 感病品种上发病率高达100%。目前，我国对魏豆抗白粉病的研究较少，主要集中在魏豆抗 白粉病的资源筛选，并在中国魏豆资源中发现了对中国白粉菌分离物EPYN和EPBJ均表现 免疫的较好的抗源（彭化贤等，1991 ;曾亮等，2012 ;王仲怡等，2013 ;付海宁等，2014)。通 过控制培养条件，筛选出了多个魏豆抗性资源，并在运些抗病资源中鉴定了抗白粉病基因 erl-l、e;rl-2、erl-G、e;rl-7 和erl-S(Sunetal. , 2015a;201f5b;2015c)。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供魏豆抗白粉病erl新等位基因erl-9及其编码蛋白。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明提供的erl-9蛋白，其氨基酸序列如SeqIDNo.1所 示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0007] 本发明还提供编码所述蛋白的魏豆抗白粉病erl等位基因erl-9,其cDNA序列如 SeqIDNo. 2 所示。
[0008] 本发明进一步提供所述等位基因erl-9在魏豆资源抗白粉病的分子育种中的应 用。
[0009] 为了明确魏豆抗白粉病资源G0004400的抗病erl等位基因，本发明对G0004400 的erl候选基因PsMLOlcDNA进行测序。序列分析结果显示G0004400的PsMLOlcDNA序 列与野生型感病基因PsMLOlcDNA序列相比，在928bp处发生单碱基突变，运一缺失导致第 310个氨基酸由丝氨酸（巧变为亮氨酸化)，从而引起PsMLOl蛋白功能的变化。运与已鉴 定的8个erl等位基因的突变位置均不相同，表明运是一个erl的新等位基因，将其命名为 erl-9。该等位基因位于魏豆遗传图谱第VI连锁群的erl基因座位上。魏豆抗白粉病资源 G0004400的PsMLOlcDNA对应的CDS序列及其编码氨基酸序列见SeqIDNo. 5。
[0010] 本发明通过对魏豆抗白粉病资源G0004400的erl候选基因PsMLOlcDNA序列分 析，发现了新的抗性等位基因erl-9。确定了新等位基因erl-9的cDNA序列。本发明首次 鉴定了erl的新等位基因erl-9,对魏豆抗白粉病育种工作具有重要意义，通过育种手段可 有效控制魏豆白粉病的发生，减轻该病害造成的经济损失，并为魏豆资源抗白粉病的分子 育种提供新的基因资源。
【附图说明】
[0011] 图1为本发明中抗病资源G0004400(左）和感病品种巧魏6号（右）接种魏豆白 粉菌分离物EPYN10天后的表型。
[0012] 图2为本发明中魏豆白粉病抗病资源G0004400和野生型魏豆感病资源在基因 PsMLOl编码区的核巧酸序列比对结果。
【具体实施方式】
[0013]W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0014]W下实施例中设及的抗病魏豆资源G0004400和感病对照品种巧魏6号均来自于 中国国家作物种质库，抗病对照品种YI由美国华盛顿州立大学陈卫东教授提供。
[0015] 实施例1魏豆抗白粉病资源G0004400的表型鉴定
[0016] 将抗病魏豆资源G0004400和感病对照品种巧魏6号W及抗病对照品种YI分别播 种于W粗赔石为基质的250mL的纸杯中，每杯播5粒，于18~26°C的溫室培养，待魏豆苗第 3或第4茎节叶片展开时，采用抖落法接种白粉菌分离物EPYN的分生抱子（NCBI，Accession number:KR957355)，接种后置于18~22°C溫室培养。采用0~4级的病害严重度分级标 准，0级：无病；1级：病斑上有淡薄菌丝层，可见绿色叶面，不产生抱子；2级：菌丝层较厚， 不透绿，产生一定量抱子；3级：菌丝层厚，产抱量较多；4级：产抱量多，病斑上的菌丝层全 被抱子覆盖（Vaidetal.，1997;Ranaetal.，2013)。接种10天后感病对照品种病害严 重度达4级后调查各供试资源的发病情况。抗性评价标准为：0级为免疫（I)，1~2级为 抗病（时，3~4级为感病（S)。共进行Ξ次重复接种鉴定。
[0017]接种10天后，感病对照品种巧魏6号所有植株的叶片、茎杆和卷须上全部覆盖 厚的菌丝层，并产生大量分生抱子，茎杆和卷须也布满菌丝体和分生抱子，病害严重度为4 级，表现感病；抗病对照品种ΥΙ(ΡΙ391630)叶片、茎杆和卷须上均无可见症状，病级为0， 表现免疫。对照品种对分离物ΕΡΥΝ的表型反应与王仲怡等（2013)的鉴定结果相同。抗性 资源G0004400的表现型与抗病对照ΥΙ相同，对分离物ΕΡΥΝ表现免疫反应。
[001引抗病资源G0004400和感病品种巧魏6号接种魏豆白粉菌分离物ΕΡΥΝ10天后的 表型如图1所示。
[0019] 实施例2抗性资源的erl候选基因PsMLOlcDNA序列鉴定
[0020] 用RNAprep植物总RNA提取试剂盒（离屯、柱型，购自天根生化）提取魏豆资源 G0004400W及感病对照品种巧魏6号的植物总RNA。具体操作方法如下：
[0021] 1)取约lOOmg魏豆幼嫩叶片在液氮中迅速研磨成粉末，加入450μL化（使用前加 入β-琉基乙醇至终浓度为1 % )，满旋剧烈震荡混匀；
[0022] 2)将所有溶液转移至过滤柱CS上（过滤柱CS放在收集管中），1200化pm离屯、 5min，小屯、吸取收集管中的上清至RNase-化ee的离屯、管中；
[0023] 3)缓慢向离屯、管中加入0. 5倍体积的无水乙醇，混匀，将得到的溶液和沉淀一起 转入吸附柱CR3中，静置2min，12000巧m离屯、Imin，倒掉收集管中的废液；
[0024] 4)向吸附柱CR3中加入500μL去蛋白液RW1，静置2min，12000巧m离屯、Imin，倒 掉收集管中的废液；
[00巧]5)面aseI工作液的配制：取10μL面aseI储存液放入新的RNase-化ee离屯、管 中，加入70μLRDD溶液，轻柔混匀；
[002引 6)向吸附柱CR3中央加入80μL的面aseI工作液，室溫放置20min;
[0027] 7)向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1，静置2min，12000巧m离屯、Imin，倒 掉收集管中的废液；
[0028]8)向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW(使用前加入无水乙醇），室溫静置2min， 1200化pm离屯、Imin，倒掉收集管中的废液；
[002引 9)重复步骤8);
[0030] 10) 12000巧m离屯、2min，倒掉废液，将吸附柱CR3置于室溫放置数分钟，彻底惊干 残留的漂洗液；
[0031] 11)将吸附柱CR3放入一个新的RNase-化ee离屯、管中，向吸附膜的中间位置悬空 滴加50μLRNase-freed地2〇,室溫放置lOmin，12000巧m离屯、2min，得到RNA溶液；
[003引 RNA完整性检测：普通琼脂糖凝胶电泳，电泳条件：胶浓度1. 2 % ; 1XT邸电泳 缓冲液；150V;15min。
[003引用BioRT逆转录扩增脚-PCR)试剂