rtPASA用于检测棉蚜种群等位基因突变频率的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体来说，是指一种用实时荧光定量等位特异性 PCR(rtPASA)技术快速检测棉蚜种群烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR)等位基因突变频率的方 法。
【背景技术】
[0002] 棉蚜是一种世界性棉花害虫，繁殖快，危害重，其中化学防治是最有效的治理措 施。新烟碱类杀虫剂是防治棉蚜的一类高效药剂，但是随着新烟碱类杀虫剂的大量使用，棉 蚜对其产生了较高水平的抗药性。因此，棉蚜对新烟碱类杀虫剂抗性的研究迫在眉睫。
[0003] 棉蚜对新烟碱类杀虫剂抗性研究主要集中在代谢抗性和靶标抗性，新烟碱类杀虫 剂的作用靶标是烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR)。研究表明，棉蚜对新烟碱类杀虫剂产生抗性 的主要原因是nAChR的betal亚基第81位氨基酸的突变（R81T)。基于这一点，建立一种抗 性分子检测技术，快速检测棉蚜种群该位点的突变频率。在分子水平上，监测棉蚜田间种群 的抗性，为抗性治理提供理论指导。
[0004] 本发明针对nAChR的betal亚基的基因序列以及已知的突变位点，将等位特异性 突变引物（rtPASA_3R)的3'端与突变位点碱基配对，等位特异性敏感引物（rtPASA_3s)的 3'端与未突变等位基因配对，5'上游引物（rtPASA_F)扩增184bp大小的目的片段。鉴于 该基因位点突变是G-C的突变，仅通过引物3'端一个碱基的错配区分不出突变和未突变， 于是在等位特异性引物3'端倒数第三个碱基引入人为错配碱基（G/C)。因为人为错配碱基 的加入降低了等位特异性引物扩增的效率，提高了其扩增的特异性，从而能区分出突变和 未突变个体。用设计的等位特异性引物，用质粒做标准品作为模板进行荧光定量等位特异 性PCR反应。根据反应产生的Ct值与等位基因突变频率，拟合标准曲线，检测未知样本等 位基因突变频率。本发明可以快速、准确地检测棉蚜种群nAChR betal亚基等位基因突变 频率。
【发明内容】
[0005] 本发明解决的技术问题是设计和开发4条特异性引物检测棉蚜nAChR betal基因 242位点等位基因是否发生突变，并进行荧光定量PCR反应，拟合标准曲线。申请人将这四 条引物分别命名为 rtPASA_F、rtPASA-3R、rtPASA-3S 和 3' nAChR_X。
[0006] 具体的，本发明设计开发的4条特异性引物的核苷酸序列如下：
[0007] 上游引物 rtPASA_F 序列为：5' ACGAGAAGCGTCTGGTTAG 3'。
[0008] 特异性未突变下游引物 rtPASA-3S 序列为 5' TGATAGTCCCTCCATACAACTC3'。
[0009] 特异性突变下游引物 rtPASA-3R 序列为 5' TGATAGTCCCTCCATACAACTG 3'。
[0010] 普通下游引物 3' nAChR_X 序列为 5' GTCCGTCTGGGTAGGTGA 3'。
[0011] 本发明采用以下技术方案：根据已公布的棉蚜nAChR betal基因mRNA编码区序 列，应用Primer Primer5. 0软件，根据突变位点（G-C)，将特异性引物的3'端固定于突 变位点处，同时在引物的倒数第三个碱基，人为错配（G/C)，等位特异性引物能与上游引物 rtPASA_F扩增出单一目的条带。这三条引物特异性高，扩增效果好，能检测出棉姐betal亚 基氨基酸81位点是否发生突变，以及等位基因是纯合子还是杂合子。当进行荧光定量PCR 反应时，需要对模板定量，因此用上游引物rtPASA_F与普通下游引物3' nAChR_X扩增出包 含突变位点的586bp目的片段，用于荧光定量PCR反应的模板，进而快速检测棉蚜种群等位 基因突变频率。
【附图说明】
[0012] 图1实施例1中设计的4条rtPASA扩增引物；
[0013] 图2实施例1中以3R和3S引物方案进行PASA扩增区分突变位点R81T基因分型 的电泳图。
[0014] 图3实施例1中以3R为引物进行荧光定量等位特异性PCR反应，检测常规突变频 率（> 1% )时的标准曲线。
[0015] 图4实施例1中以3R为引物进行荧光定量等位特异性PCR反应，检测常规突变频 率（< 1% )时的标准曲线。
【具体实施方式】
[0016] 根据已公布的棉蚜nAChR betal基因mRNA编码区序列，以及已经报道的242位点 的突变（G-C)，应用Primer Primer5. 0软件设计包含该突变位点，产物长度为586bp的一对 引物，并且根据突变位点设计可以区分突变和未突变的两条等位特异性下游引物进行荧光 定量等位特异性PCR反应，这两条引物除3'端为突变碱基外，其他的碱基均相同。应用下 述步骤检测棉纟牙种群nAChR betal基因的突变频率。
[0017] 1.RNA 的提取
[0018] (1)取单头棉蚜放入1. 5mL离心管中。
[0019] (2)先加入100 y L裂解液，用组织研磨器研磨，然后补足350 y L裂解液。
[0020] (3)向上一步研磨液中加入350 y L 70%乙醇，充分混匀（移液吸打，勿离心）。
[0021] (4)将700 yL样品（包含全部沉淀），转入吸附柱中，lOOOOrpm离心15s，弃去滤 液。
[0022] (5)加入700 y L RW1缓冲液到吸附柱中，lOOOOrpm离心15s，弃滤液。离心后小心 移出柱子，确保不接触弃液。
[0023] (6)加500yL RPE缓冲液到柱内，lOOOOrpm离心15s，弃滤液。
[0024] (7)再加500 y L RPE缓冲液到柱内，lOOOOrpm离心2min，弃滤液。将吸附柱放入 一个新的2mL收集管中，盖好盖子，再lOOOOrpm离心lmin
[0025] (8)将吸附柱放入一个新的1. 5mL离心管中。直接向吸附柱中间膜部位悬空加入 30-50 y L RNase-free 水。盖好盖子 lOOOOrpm 离心 lmin，洗潘 RNA。
[0026] 2.反转录，得到cDNA
[0027] (1)基因组DNA的除去反应
[0028]
[0029]将 10yL 体系，42°C孵育 2min。
[0030] (2)反转录反应
[0031]
[0032] 将上述20yL体系，按如下程序反应：37°C 15min，85°C 5s。
[0033] 3. PCR 扩增
[0034]反应体系如下：10XPCR Buffer (Mg2+Plus) 2. 5 yL，dNTP Mixture (各 2. 5mM)2 y L，上游引物（rtPASA-F)、下游引物（3'nAChR_X)、特异性下游引物cPASA-3R或者 CPASA-3S 各 1 y L，Taq DNA 聚合酶 0? 3 y L，模板 DNA 2 y L，总体积 25 y L。
[0035] 扩增条件如下：
[0036] 94°C 4min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C 40s，35 个循环；72°C 7min。
[0037] 4. PCR产物检测
[0038] 取5 y LPCR产物用2 %琼脂糖凝胶进行电泳，电泳缓冲液为1 X TAE，150V恒压电泳 20min。用紫外凝胶成像系统鉴定PCR产物条带大小。
[0039] 5.PCR产物的纯化
[0040] 将PCR反应液用UniversalDNA纯化回收试剂盒，进行回收、纯化，操作步骤如下：
[0041] (1)向吸附柱中加入500 y L平衡液，12, OOOrpm离心lmin，倒掉收集管中的废液， 将吸附柱重新放回收集管中。（使用当天处理过的柱子）
[0042] (2)估计PCR反应液的体积，向其中加入等体积回收液，充分混匀。
[0043] (3)将上一步所得溶液加入已处理好的吸附柱中，室温放2min，12, OOOrpm离心 lmin，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。
[0044] 注意：吸附柱容积为800 y L，若样品体积大于800 y L可分批加入。
[0045] (4)向吸附柱中加入600 y L漂洗液，