表达sos2突变等位基因的转基因拟南芥植物中耐盐性的评价的制作方法

专利名称：表达sos2突变等位基因的转基因拟南芥植物中耐盐性的评价的制作方法
技术领域：
本发明提供了一种通过在至少一种植物细胞类型中过度表达编码变异SOS2蛋白的基因，而增加植物耐盐性的方法。本发明还提供了表达该变异SOS2蛋白的转基因植物。

背景技术：
土壤盐度是限制植物生产力的严重环境压力。在盐渍土里富含的钠离子(Na+)，当在植物中积累到高浓度时具有细胞毒性。Na+通过运载体例如HKT1(Rus等，2001)和非选择性阳离子通道(Amtmann和Sanders，1999)进入植物细胞。为了防止Na+在细胞质中积累，植物细胞利用质膜和液泡膜上的Na+/FH+反向转运体将Na+分别转运到质外体和液泡中(Apse等，1999；Qiu等，2002)。拟南芥(Arabidopsis thaliana)质膜Na+/H+反向转运体盐过度敏感1(SaltOverly Sensitivel，SOS1)或液泡Na+/H+反向转运体AtNHX1的过度表达，改善了转基因植物的耐盐性(Apse等，1999；Zhang和Blumwald，2001；Zhang等，2001；Shi等，2003)。通过液泡H+-焦磷酸酶AVP1的过度表达也可以实现耐盐性提高，该酶产生将Na+转运至液泡内的驱动力(Gaxiola等，2001)。
最近，拟南芥(A.thaliana)中离子内环境稳定和耐盐性的调控路径得到鉴定(Zhu，2000，2002)。已知盐胁迫引发细胞质内游离钙离子浓度迅速增加(Knight等，1997)。SOS3，十四烷酰化的钙结合蛋白，被建议检测所述钙离子信号(Liu和Zhu，1998；Ishitani等，2000)。SOS3与蛋白激酶SOS2物理相互作用，以钙依赖方式激活SOS2的底物磷酸化活性(Halfter等，2000；Liu等，2000)。SOS3还召集SOS2至质膜，在那里SOS3-SOS2蛋白激酶复合体磷酸化SOS1以刺激其Na+/H+反向转运活性(Qiu等，2002；Quintero等，2002)。SOS3、SOS2或SOS1的功能缺失突变引发Na+过敏症(Zhu等，1998)。
SOS2具有高度保守的N-端催化域，类似于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的SNF1和动物的AMPK(Liu等，2000)。在SOS2蛋白中，N-端催化域与C-端调控域相互作用(Guo等，2001)。SOS3与SOS2 C-端区域中的FISL基序相互作用(Guo等，2001)，其用作自动抑制域。组成型活性的SOS2激酶T/DSOS2可以通过Thr168到Asp的改变(通过上游激酶模拟磷酸化作用)而在假定的激活作用环(activation loop)中得到设计。T/DSOS2的激酶活性不依赖SOS3和钙(Guo等，2001)。去除FISL基序(SOS2DF)或整个C-端调控域(SOS2/308)可能得到SOS2的组成型活性形式(Guo等，2001；Qiu等，2002)。激活作用环变异和自动抑制域删除在SOS2的激酶活性方面具有协同效应，当着两种改变组合时，可以产生强效SOS2激酶T/DSOS2/308或T/DSOS2/DF(Guo等，2001；Qiu等，2002)。本发明的发明人已经指出T/DSOS2/DF能在体外激活SOS1的转运活性，但是野生型SOS2蛋白不能激活(Qiu等，2002)。然而，直到本发明的时候，该SOS2的活性形式能否在体内起作用尚属未知。
在营养链中，植物的根通过从土壤溶液中吸收矿质营养素而起到关键作用。植物的根经历土壤环境中的不断变动。土壤溶液中的频繁变量为Na+浓度(Epstein等，1980)。Na+不是大多数植物必需的离子。事实上，在高浓度土壤Na+存在下，例如淡土植物的大多数植物的生长受抑制。外部的Na+通过抑制K+被吸收到植物细胞内而引起K+缺乏(Wu等，1996)。Na+在细胞内积聚对许多细胞溶质酶有毒。相反，许多细胞酶通过K+活化，K+为细胞质中最富含的阳离子。当K+离子浓度降低时，一些胞质酶特别易于受Na+抑制(Murguia等，1995)。因此保持细胞内K+和保持高K+/Na+比的内环境稳定对所有细胞都重要，并且对植物细胞特别关键。
由于有限的供水和灌溉的普及使用，许多种植区域的土壤已经变得日益盐渍化。尤其是现代农业实践，例如灌溉，当可用的灌溉水蒸发并留下先前溶解的盐，从而传递渐增的盐浓度。结果开发农艺学上重要农作物的耐盐性品种在世界的许多部分变得重要；例如，在诸如南加利福尼亚、亚利桑那州、新墨西哥和德克萨斯州的区域中发现含盐土壤。
在土壤中溶解的盐增加了土壤中溶液的渗透压，趋向减少水从土壤进入根的比率。如果土壤中的溶液溶解的盐变得过饱和，水实际上可能从植物根中抽出。因此虽然水的供应和溶解的营养素可能远远充足，植物仍然会慢慢饿死。
耐盐性植物可以促进边际土地用于农作物生产，或者允许灌溉水源的范围更大。传统的植物育种方法迄今还不能产生农作物植物耐盐性和生长的实质上进步。此外，该方法在新品种得到鉴定之前，需要长期的选择和测试。
因此，需要改善和/或提高植物中的耐盐性，特别是那些有利于用作农业作物的植物。


发明内容
为了处理上述本领域的问题，本发明的发明人鉴定了酿酒酵母(S.cerevisiae)和拟南芥中各种活化的SOS2蛋白。此外，本发明的发明人发现SOS2蛋白的蛋白激酶活性足以在体内和在植物(planta)中激活SOS1质膜Na+/H+反向转运体。这样的结果能鉴定SOS2蛋白中对植物功能(planta function)重要的结构域。
因此，本发明的一个目的是提供一种通过在至少一种植物细胞类型中过度表达编码变异SOS2蛋白的基因，而增加植物耐盐性的方法。
该发明目的可以通过表达编码变异SOS2蛋白的基因达到，所述变异SOS2蛋白具有选自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8和SEQ ED NO10的序列。可选地，所述编码变异SOS2蛋白的基因具有选自SEQ ID NO3、SEQID NO5、SEQ ID NO7和SEQ ED NO9的序列。
本发明的另一目的是，在含有与SEQ ID NO11至少70％同源的多聚核苷酸序列的载体存在下，执行上述方法，其中所述多聚核苷酸序列编码具有SOS3钙结合活性的蛋白。因此，所述多聚核苷酸序列可以为SEQ ID NO11或者能够编码SEQ ID NO12的蛋白。
本发明的优选目的中，每一个被表达的基因或多聚核苷酸序列可操作地连接于植物细胞中起作用的启动子，其中所述启动子调控上述基因或多聚核苷酸序列的表达。
在本发明的又一目的中，含有在至少一种植物细胞类型中用于表达编码变异SOS2蛋白的载体的转基因植物。该发明目的可以通过表达编码变异SOS2蛋白的基因达到，所述变异SOS2蛋白具有选自SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8和SEQ ED NO10的序列。可选地，所述编码变异SOS2蛋白的基因具有选自SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7和SEQ ED NO9的序列。和先前的目的中一样，优选每一个被表达的基因或多聚核苷酸序列可操作地连接于植物细胞中起作用的启动子，其中所述启动子调控上述基因或多聚核苷酸序列的表达；然而前述SOS2突变体基因还可以整合到转基因植物基因组中。
本发明的另一目的中，前述转基因植物含有包括与SEQ ID NO11至少70％同源的多聚核苷酸序列的载体，其中所述多聚核苷酸序列编码具有SOS3钙结合活性的蛋白。因此，所述多聚核苷酸序列可以为SEQ ID NO11或者能够编码SEQ ID NO12的蛋白。
虽然用于上述目的的植物可以为任何单子叶(monochot)或双子叶(dichot)植物，但优选所述植物为拟南芥、小麦、谷物、花生、棉花、燕麦或者大豆中的一种。
上述目的强调了本发明的一些方面。本发明的其它目的、方面和实施方式可以在以下本发明的详细描述中找到。



通过参考下列附图结合以下详细叙述，很容易获得同时更好理解对本发明及其附带优点的更完整领会。
图1活化SOS2激酶 展示了野生型及改变的SOS2蛋白激酶的结构域模型(A)。评价了改变形式的SOS2(T/DSOS2、T/DSOS2/308、T/DSOS2DF和T/DSOS2/329的GST融合蛋白)的激酶活性(自磷酸化作用和体外底物磷酸化作用)。T/DSOS2(多聚核苷酸序列＝SEQ TD NO3；蛋白序列＝SEQ ID NO4)、T/DSOS2/308(多聚核苷酸序列＝SEQ ID NO5；蛋白序列＝SEQ ID NO6)和T/DSOS2/329(多聚核苷酸序列＝SEQ ID NO7；蛋白序列＝SEQ ID NO8)得自如Guo等，2001的文献中所述，而T/DSOS2DF(多聚核苷酸序列＝SEQ ID NO9；蛋白序列＝SEQ ID NO10)得自如Qiu等，2002的文献中所述。自磷酸化作用测定后，蛋白通过SDS-PAGE分离，所得凝胶用考马斯蓝染色(B)并曝光于X光片(C)。测定同样的GST-SOS2融合蛋白磷酸化肽底物p3(每次测定400pmol)的能力(D)； 图2各种形式SOS2激酶和辅助蛋白SOS3的感受态增强表达SOS1的酿酒酵母的耐盐性； (A)野生型SOS2、活化的SOS2激酶(T/DSOS2、T/DSOS2/DF、T/DSOS2/329和T/DSOS2/308)和无活性的SOS2突变体(T/DSOS2/KN)与或者不与SOS3共转化到酿酒酵母菌株YP890细胞中。转化体在含1mM KCl的液体AP培养基中生长过夜，然后以5μL系列十倍稀释液点在含1mM KCl或添加有100或200mM NaCl的AP培养基平板上。在28℃下孵育平板，4天后照相； (B)野生型SOS2及活化的激酶T/DSOS2与野生型SOS3或者突变体SOS3-1在YP890细胞中共表达。这些蛋白组合所得的耐盐性按上述说明测定； (C)带有用于表达hSos:SOS2嵌合体质粒pSRS2-1的Cdc25-2细胞，被转化以产生野生型SOS3或突变体SOS3-1蛋白，或者被空载体转化。细胞在选择培养基中于25℃生长过夜，然后点在复制YPD平板上在或者25℃或者37℃下孵育2天。在37℃下生长表明靶向SOS激酶到质膜； 图3SOS2的表达补足sos2-2盐敏感表型，但不补足sos3-1盐敏感表型； 在MS琼脂培养基上生长的五天龄幼苗转移到不含NaCl([A]和[C])或者含100mM NaCl([B]和[D])的MS琼脂培养基上，转移后10天照相。展示了SOS2在sos2-2、sos3-1和35S:SOS2转基因系中的转录水平(E)。用提取自在无NaCl条件下生长的sos2-2(1)、sos3-1(2)、sos2-2(3)和sos3-1(4)转基因植物的总RNA进行RNA凝胶印迹分析。25 S rRNA(溴化乙锭染色)用作加载对照。WT，野生型； 图4T/DSOS2在sos2-2和sos3-1中的表达； 在无NaCl条件下生长的sos3-1、sos2-2或sos3-1和sos2-2转基因系中T/DSOS2表达的RNA凝胶印迹分析(A)。25 S rRNA(溴化乙锭染色)用作加载对照。从突变体和转基因植物中提取总蛋白并与偶联谷胱甘肽-琼脂糖珠的GST-SOS3温育。GST-SOS3-T/DSOS2/SOS2复合体与来自sos3-1(1)和sos2-2(3)突变体或sos3-1(2)和sos2-2(4)转基因系的蛋白用于免疫印迹分析(B)。蛋白用抗SOS2抗体探针检测。GST-SOS3-T/DSOS2/SOS2复合体还与来自sos3-1(1)、sos3-1转基因系(2)、sos2-2(3)和sos2-2转基因系(4)的蛋白用于肽磷酸化检测(C)； 图5T/DSOS2的表达部分拯救sos2-2和sos3-1盐过敏表型； 在MS琼脂培养基上生长的五天龄幼苗转移到不含NaCl(A)或者含100mM NaCl(B)的MS琼脂培养基上；转移后10天照相。转移到MS+100mMNaCl 2周后，野生型(1)、sos3-1(2)、sos3-1转基因系(3)、sos2-2(4)和sos2-2转基因系(5)五种植物的鲜重(fresh weight))(C)(以毫克计)(三次重复实验的平均值±SE)。sos2-2和sos2-2转基因系(D)以及sos3-1和sos3-1转基因系(E)在土壤中的生长，所述土壤的NaCl水平每4天增加50mM直到达到终浓度200mM；在200mM NaCl中15天后照相。
图6SOS2的表达不增加拟南芥的耐盐性； 展示了在无NaCl条件下生长的野生型以及三种35S:SOS2转基因系中SOS2转录本水平(A)。25S rRNA(溴化乙锭染色)用作加载对照。来自野生型(顶部)和两种35S:SOS2转基因系(底部)的种子在MS培养基(B)或MS+100mM NaCl(C)上萌发；在萌发后5天(左侧嵌板)和10天(右侧嵌板)后照相。在MS琼脂培养基上生长的五天龄幼苗转移到不含NaCl(D)或者含50(E)或100mM NaCl(F)的MS琼脂培养基上；转移后10天照相； 图7拟南芥中T/DSOS2的表达； T/DSOS2在野生型和WT/T/DSOS2转基因系中的转录水平(A)。用提取自在无NaCl条件下生长的野生型和两种WT/T/DSOS2系的总RNA进行RNA凝胶印迹分析。25S rRNA(溴化乙锭染色)用作加载对照。从野生型和转基因植物中提取总蛋白并与偶联谷胱甘肽-琼脂糖珠的GST-SOS3温育。GST-SOS3-T/DSOS2/SOS2蛋白复合体与抗SOS2抗体用于免疫印迹分析(B)和肽磷酸化检测(C)； 图8T/DSOS2的表达增加拟南芥的耐盐性； (A)来自野生型(顶部)和两种WT/T/DSOS2转基因系(底部)的种子在MS培养基(左侧嵌板)或MS+100mM NaCl(右侧嵌板)上萌发；在萌发后5天(左侧嵌板)和10天(右侧嵌板)后照相。
(B)在MS琼脂培养基上生长的来自野生型或WT/T/DSOS2转基因系的五天龄幼苗转移到不含NaCl(顶部嵌板)或者含100(中部嵌板)或者含120mM NaCl(底部嵌板)的MS琼脂培养基上；转移后15天照相； (C)野生型和转基因(WT+35S:T/DSOS2)植物在土壤中生长，所述土壤的NaCl水平每4天增加50mM直到达到终浓度200mM；在200mM NaCl中15天后照相； 图9活性T/DSOS2在体外和体内增加质膜Na+/H+交换活性； 当在体外添加，T/DSOS2蛋白刺激分离自野生型植物小泡(vesicles)中的质膜Na+/H+交换(反向转运)活性(A)。转运测验按照下述方法进行。在不存在(闭环)或者存在T/DSOS2蛋白(开环)条件下形成pH梯度(ΔpH)。当ΔpH达到稳定状态，在遍及终浓度范围(0至100mM)加入NaCl，并测定起始扩散速度(Na+/H+交换)。当与野生型、sos2和sos3的活性比较时，质膜Na+/H+交换活性在过度表达TZDSOS2的野生型(B)、sos2(C)和sos3(D)中更高。使用分离自亲本植物(闭环，[B]至[D])和转基因植物(开环，[B]至[D])的小泡进行测定。当ΔpH达到稳定状态，在遍及终浓度范围(0至100mM)加入NaCl，并测定起始扩散速度。Na+/H+交换的单位为Δ％F mg-1蛋白min-1。(A)到(D)中的数据代表了至少三次重复实验的平均值+SE。每次重复实验使用独立的膜标本进行； 图10T/DSOS2/308或T/DSOS2/329的表达不弥补sos2-2和sos3-1盐敏感表型； 在MS琼脂培养基上生长的五天龄幼苗转移到不含NaCl([A]和[D])或者含100mM NaCl([B]和[E])的MS琼脂培养基上；转移后10天照相。展示了T/DSOS2/308(C)或T/DSOS2/329(F)在无NaCl条件下生长的sos2-2(1)、sos3-1(2)或sos2-2(3)和sos3-1(4)转基因系中的转录水平。25S rRNA(溴化乙锭染色)用作加载对照； 图11T/DSOS2的表达增加拟南芥的耐盐性； 在无NaCl条件下生长的野生型和两种转基因系中T/DSOS2DF的转录水平(A)。25S rRNA(溴化乙锭染色)用作加载对照。来自野生型(顶部)和两种转基因系(底部)的种子在MS培养基(B)或MS+100mM NaCl(C)上萌发；在萌发后5天(左侧嵌板)和10天(右侧嵌板)后照相。在MS琼脂培养基上生长的五天龄幼苗转移到不含NaCl(D)或者含100(E)或120mMNaCl(F)的MS琼脂培养基上；转移后10天(D)和15天([E]和[F])照相； 图12T/DSOS2DF的表达拯救sos2-2盐敏感表型，但不拯救sos3-1盐敏感表型； 在MS琼脂培养基上生长的五天龄幼苗转移到不含NaCl([A]和[C])或者含100mM NaCl([B]和[D])的MS琼脂培养基上；转移后10天照相。野生型(1)、sos3-1(2)、sos3-1转基因系(3)、sos2-2(4)和sos2-2转基因系(5)在MS培养基+100 mM NaCl生长2周后的根的生长(E)(以厘米计)(三次重复实验的平均值±SE)。展示了T/DSOS2DF的转录水平(F)。用提取自在无NaCl条件下生长的sos2-2(1)、sos3-1(2)、sos2-2转基因系(3)和sos3-1转基因系(4)的总RNA进行RNA凝胶印迹分析。25 S rRNA(溴化乙锭染色)用作加载对照。

具体实施例方式 除非特别定义，此处使用的所有技术和科学术语具有和酶学、生物化学、细胞生物学、分子生物学、植物学以及医药科学领域技术人员普遍理解的同样的含义。
类似或等同于此处所述的所有方法和材料都能通过此处所述合适的方法和材料用于本发明实践或测试。此处提到的所有专利、专利申请、出版物以及其他参考文献全部引入作为参考。在相矛盾的情况下，以本发明说明书包括定义为主。此外，材料、方法和实施例仅用于说明而不规定为限定，除非有其他特殊说明。
sos1、sos2和sos3突变体的遗传分析说明SOS1、SOS2和SOS3在拟南芥的相同Na+内环境稳定途径中起作用(Zhu等，1998)。SOS2通过其与SOS3蛋白以钙依赖方式相互作用而激活(Halfter等，2000)。当在酿酒酵母中表达，SOS3-SOS2复合体磷酸化并激活SOS1提高Na+散出和耐盐性(Quintero等，2002)。SOS1的Na+/H+交换活性在sos2和sos3突变植物中基本上消失，在体外添加激活形式的SOS2、T/DSOS2DF，不仅拯救sos2质膜小泡中的交换活性并且拯救sos3质膜小泡中的交换活性(Qiu等，2002)。因此，通过预先形成活化的SOS2蛋白能绕过对用于SOS1活化的体外SOS3的需求。
此处表现的结果证明在酿酒酵母中，耐盐性对SOS3的需求也可以部分地通过体内活化形式的SOS2绕过。然而在植物中(in planta)，只有保持结构完整性的活化形式的SOS2(即T/DSOS2)能绕过对SOS3的需求。这些结果表明得自体外甚至体内的异源体系数据只部分地反映了在植物体内的情况。因此植物内的实验揭示调控蛋白及其重要结构域的新功能。
不同形式SOS2在体外、在酿酒酵母中以及在野生型和突变拟南芥中的活性和功能总结于表1(见后文)。在酿酒酵母中，激酶形式对SOS1激活和耐盐性方面的效果很大程度上与它们在体外的激酶活性相互关联，两者都在无SOS3的情况下测量。
例如，T/DSOS2/308在体外活性最好，并且提高不表达SOS3的酿酒酵母细胞耐盐性最有效，但是野生型SOS2在两种测试中基本上都无活性。与之相比，SOS2变异体体内激活SOS1的能力也取决于它们通过FISL基序与辅助蛋白SOS3相互作用的能力。因此，激活形式的T/DSOS2和T/DSOS2/329都含有FISL基序，在SOS3存在下传送更大耐盐性，但是T/DSOS2DF和T/DSOS2/308却不能。
该结果表明激活的SOS2在膜上的定位通过其与SOS3相互作用增强，但不是SOS1的激活作用所必需的。SOS2的结构完整性也很重要，因为SOS2-SOS3和T/DSOS2-SOS3复合体产生SOS1激活作用和在100mM NaCl以上的耐盐性最大(图2并且未显示数据)。
虽然T/DSOS2/308、T/DSOS2/DF和T/DSOS2/329在体外全都有活性，并且导致在酿酒酵母细胞中对SOS3有限的独立性，但是它们在植物(planta)中不能绕过SOS3缺乏。意外地，当在拟南芥中表达时，只有T/DSOS2形式能够部分地拯救sos3-1突变体表型，尽管在酿酒酵母中T/DSOS2严格依赖功能性SOS3蛋白。sos3-1突变引起在SOS3的EF手(EF hands)之一中三个氨基酸缺失，减少但不消除SOS3的钙结合(Liu和Zhu，1998；Ishitani等，2000)。因此可能该种SOS3的突变形式仍部分有功能。因为只从T/DSOS2除去FISL基序的变体T/DSOOS2DF不抑制sos3-1突变，虽然T/DSOS2抑制，因此可能突变多肽SOS3-1仍能结合T/DSOS2并且靶向质膜激活激酶磷酸化SOS1。然而，前述研究已表明突变SOS3-1蛋白在酿酒酵母双杂交测试中不与SOS2相互作用(Ishitani等，2000)，并且本发明的发明人此处展示了SOS3-1不能聚集SOS2或T/DSOS2到质膜(图2B和图2C)。
可选地，T/DSOS2能与另一SOS3样钙结合蛋白(SCaBP)相互作用，并被靶向到没有SOS3存在的质膜。如果是这样，也能解释为什么T/DSOS2DF部分拯救sos2-2突变体表型但不能抑制sos3-1突变的原因，因为FISL基序的缺失消除了与SOS3和其它SCaBP的相互作用。sos2-2突变导致截短的含有激酶催化域的蛋白(Liu等，2000)。不能排除在变异体中该截短的蛋白可能影响在植物中的结果。还应注意的是，SOS2与其它蛋白直接或间接地物理相互作用，可能帮助T/DSOS2以不依赖SOS3的方式向膜聚集。例如，最近已经表明SOS2结合到ABI2，一种与脱落酸和应激信号有关的蛋白磷酸化酶2C(Ohta等，2003)。此外合理预期SOS2除了激活SOS1外，可能还实现另外导致植物耐盐性的作用，其能不依赖其与SCaBP的相互作用和/或靶向质膜。这里的发现共同揭示了植物中的耐盐性需要SOS2C-端调控区域。
另一个意外发现为T/DSOS2部分地拯救sos2和sos3突变体茎干(shoot)中的盐过敏症，但不能拯救sos2和sos3突变体根中的盐过敏症。在根中缺乏作用不应该解释为使用CaMV 35S启动子，因为在同样的启动子下表达的野生型SOS2，在茎干和根中都拯救sos2突变体。SOS2的根特异性调控可能通过其激活作用环发生，T/D突变可能干扰该调控。虽然假定的SOS2上游蛋白激酶尚未鉴定出，但是可以想到可能存在所述激酶的根特异性同工型。另一方面，T/DSOS2DF的表达能拯救sos2突变体表型。因此，如果该假定的根特异性上游激酶对根中T/DSOS2的无活性负责，它必须对T/DSOS2DF没有影响。
通常认为调控基因是植物改良生物技术应用的优良靶标，因为它们控制许多下游效应器基因。例如，CBF/DREB1A家族转录因子和MAPKKK ANP1的异位表达已经显示实质上提高植物对各种非生物胁迫的耐受性(Jaglo-Ottosen等，1998；Gilmour等，2000；Kovtun等，2000)。SOS2是离子转运蛋白的重要调控子(Zhu，2002)，当在转基因植物中过度表达时，一些SOS2蛋白表现带来增强的耐盐性(Apse等，1999；Shi等，2003)。在此项研究中，本发明的发明人评价了使用SOS2改善植物耐盐性的可行性。野生型SOS2的过度表达不能带来转基因拟南芥中增强的耐盐性。然而，激活形式的T/DSOS2和T/DSOS2/DF的异位表达引起转基因拟南芥中耐盐性的可测定增强。这些结果增加了通过探索各种蛋白激酶模型(version)，鉴定出有效等位基因的希望，从而甚至有利于田间条件。
因此，通过此处提供的描述和下面进一步解释和举例说明，本发明得到具体化。
术语“植物”包括全部植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子和植物细胞以及它们的子代。能用于本发明方法中的植物的类别，通常符合转化技术的高等植物的类别一样宽，包括单子叶植物和双子叶植物。优选植物包括水稻、玉米、小麦、棉花、花生和大豆。
因此，在本发明的一个实施方式中，耐盐性能通过增加植物中可供蛋白的量得到提高或增强，优选通过增强植物中sos2突变基因。
因此本发明的一个实施方式为携带有编码本发明sos2突变体的多聚核苷酸的植物细胞，优选携带有该分离的多聚核苷酸的转基因植物。
如此处所用，术语“增强”意思是增加植物细胞和/或植物中的一种或多种酶的细胞内活性，所述酶由相应的DNA编码。在植物细胞的各种细菌细胞处理帮助下能达到增强。为了达到提高，尤其是过度表达，可以增加对应基因的拷贝数，可以使用强启动子，或者可以突变启动子-和调控区域或者位于结构基因上游的核糖体结合位点。并入结构基因上游的表达盒可能以相同方式起作用。此外，可能通过使用诱导型启动子增加表达。还可以使用编码对应高活性酶的基因。表达还可以通过延长mRNA寿命的措施提高。此外，防止酶的降解就整体而言增加酶活性。另外这些措施可以以任何想要的方式任意结合。如所述，已知改变植物中基因活性的这些和其他方法，例如，在植物分子生物学方法，Maliga等，Eds.，冷泉港实验室出版，纽约(1995)(Methods in PlantMolecular Biology，Maliga et al，Eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork(1995))中。
此处所用“表达盒”包括在植物细胞中有功能的启动子，可操作地连接于根据本发明的编码SOS2突变体的核苷酸，由SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8和SEQ ID NO10表示(例如，分别具有SEQ ID NO3、SEQ IDNO5、SEQ ID NO7和SEQ ID NO9序列的多聚核苷酸)，其中，植物细胞中蛋白增强表达带来该植物细胞的耐盐性增强。
在本发明的优选实施方式中，所述启动子选自由病毒外壳蛋白启动子、组织特异性启动子、单子叶植物启动子、泛素启动子、胁迫诱导型启动子、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、CaMV 19S启动子、肌动蛋白启动子、cab启动子、蔗糖合酶启动子、微管蛋白启动子、napin R基因复合体启动子、番茄E8启动子、patatin启动子、甘露碱合酶启动子、大豆种子蛋白大豆球蛋白启动子、大豆营养储藏蛋白启动子、噬菌体SP6启动子、噬菌体T3启动子、噬菌体T7启动子、Ptac启动子、根细胞启动子、ABA-诱导型启动子和膨压诱导型(turgor-inducible)启动子所组成的组中。
此外，本发明表达盒的另一个例子用于如上所述SOS2突变体，但是它宁可含编码SEQ ID NO12 SOS3蛋白的核苷酸(例如，具有SEQ ID NO11序列的多聚核苷酸)，其中，在表达本发明SOS2突变体的植物细胞中的前述蛋白的表达增强，带来该植物细胞的耐盐性增强。
在又一个实施方式中，表达盒包含编码本发明SOS2突变体和SOS3两者的多聚核苷酸(该多聚核苷酸及其变异体如下面所述)，或者在相同的启动子控制下，或者在选择性地诱导型启动子的控制下，在相同(或不同)质粒或载体中。
如此处所用的术语“选择性地诱导型启动子”意识是当两个或两个以上启动子出现在同一质粒或载体上时，或者当这些启动子出现在不同的质粒或载体上，但该质粒或载体包含在同一宿主细胞、植物细胞或转基因植物中，这些启动子与宿主相容(通过宿主细胞、植物细胞或转基因植物稳定维持)，并可以各自被激活或被增强转录(例如，在一种启动子的情况下通过添加IPTG以及在另外一种启动子情况下通过升高温度)。
虽然T/DSOS2(多聚核苷酸序列＝SEQ ID NO3；蛋白序列＝SEQ ID NO4)、T/DSOS2/308(多聚核苷酸序列＝SEQ ID NO5；蛋白序列＝SEQ ID NO6)、T/DSOS2/329(多聚核苷酸序列＝SEQ IDNO7；蛋白序列＝SEQ ID NO8)和T/DSOS2DF(多聚核苷酸序列＝SEQ ID NO9；蛋白序列＝SEQ ID NO10)代表了优选SOS2突变形式，还可以想到本发明的SOS2范围不限于这些突变形式。在本发明范围内，它还可能使用上述SOS2的突变形式作为额外突变体的关键(linchpin)。
显然，在核苷酸水平使用沉默突变体在本发明范围内。换句话说，本发明还涉及编码DNA序列，通过遗传密码变性由上述序列得到。在相同的方式中，本发明进一步涉及在严谨条件下，与本发明序列杂交的DNA序列，或者与该序列的部分杂交的DNA序列。此外，本领域技术人员还知道蛋白质中保守氨基酸取代，例如甘氨酸被丙氨酸取代，或者天冬氨酸被谷氨酸取代，作为“同义突变(sense mutations)”不引起蛋白质活性任何根本变化，即功能上的中性突变。
还可以使用编码高活性的对应酶或变异体酶(例如SOS2和/或SOS3)的基因。优选地，所述对应酶具有的活性高于其来源的酶的形式，更优选高于至少5％、10％、25％或50％的更大活性，最优选比其来源的酶的活性高两倍。
本申请上下文中，多聚核苷酸序列与本发明的序列“同源”，如果至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的其碱基组成和碱基序列对应本发明的序列。根据本发明，可以理解“同源蛋白”包括的蛋白所包含氨基酸序列的至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％，对应于本发明氨基酸序列，或者由上述核苷酸序列编码，其中可以理解“对应”的意思是相应的氨基酸或者相同或者为互相类似的氨基酸。
如此处所阐述，本发明序列对应T/DSOS2(多聚核苷酸序列＝SEQ ID NO3；蛋白序列＝SEQ ID NO4)、T/DSOS2/308(多聚核苷酸序列＝SEQ ID NO5；蛋白序列＝SEQ ID NO6)、T/DSOS2/329(多聚核苷酸序列＝SEQ ID NO7；蛋白序列＝SEQ ID NO8)和T/DSOS2DF(多聚核苷酸序列＝SEQ ID NO9；蛋白序列＝SEQ ID NO10)。当使用前述同源的多聚核苷酸和/或蛋白时，这些序列应当分别编码具有或者应当具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的蛋白。在本发明的特定实施方式中，也包括具有天然SEQ ID NO11多聚核苷酸序列和SEQID NO12蛋白序列的钙结合蛋白SOS3。当然，本发明包括全部范围的上述序列的同源物。
表达“类似氨基酸”表示那些具有相应性质的氨基酸，特别是关于它们的电荷、疏水特性、立体化学性质等。因此，所述蛋白可以是与前述序列具有从70％直到小于100％的同源性。
常规测定核苷酸或氨基酸序列的同源性、序列相似性或者序列同一性，可以通过使用已知软件或计算机程序，例如BestFit或Gap配对比较程序(GCGWisconsin Package，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin 53711)。BestFit使用Smith和Waterman，应用数学进展2482-489(1981)(Smith and Waterman，Advances in Applied Mathematics 2482-489(1981))中的局部同源性算法，发现两个序列之间同一性或近似性的最佳区段。Gap进行总体对比一个序列的全部和另一个相似序列的全部使用Needleman和Wunsch，分子生物学，48443-453(1970)(Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48443-453(1970))的方法。当使用序列定位程序例如BestFit测定序列同源性、相似性或同一性程度时，可以使用默认的设置，或者选择合适的评分矩阵(matrix)以优化同一性、相似性或同源性得分。类似地，当使用程序例如BestFit测定两个不同氨基酸序列的序列同一性、相似性或同源性时，可以使用默认的设置，或者选择合适的评分矩阵(matrix)例如blosum45或blosum80以优化同一性、相似性或同源性得分。
本发明还涉及多聚核苷酸，多聚核苷酸包含相应于SEQ ID NO3、SEQ IDNO5、SEQ ID NO7或SEQ ID NO9的多聚核苷酸序列的完整基因或其片段，以及能够通过筛选得到的多聚核苷酸序列，筛选该多聚核苷酸序列，通过用包含所述相应于SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7或SEQID NO9的多聚核苷酸序列或其片段的探针杂交相应的基因库，并且分离所述DNA序列。
根据本发明，多聚核苷酸序列适于用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离那些与突变SOS2基因的序列表现高水平相似性的cDNA或基因，特别是与SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7或SEQ ID NO9的突变SOS2基因表现高水平相似性的cDNA或基因。
根据本发明，多聚核苷酸序列还能适于用作聚合酶链式反应(PCR)的引物，用于制备编码具SOS2丝氨酸/苏氨酸激酶活性的酶的DNA。
寡核苷酸，例如那些用作探针或引物的寡核苷酸，可以包括大于30个，优选多至30个，更优选多至20个，最优选至少15个连续的核苷酸。具有长度至少40或50个核苷酸的寡核苷酸也适用。
术语“分离的”意思是从其自然环境中分离。可以理解本发明“分离的”多聚核苷酸和多肽还可以基本上纯净或纯净(即所述多聚核苷酸和多肽经过纯化)。如此处所用，术语“基本纯净”意思是所述多聚核苷酸和多肽已经从其天然环境中分离至只有少数杂质残留的程度(例如，所得多聚核苷酸和多肽至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％纯净)。如此处所用，术语“纯净”意思是所述多聚核苷酸和多肽不含污染物(即100％纯净)。
术语“多聚核苷酸”一般是指多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，可以为未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。
术语“多肽”可以理解为肽或蛋白，含有通过肽键连接的两个或两个以上氨基酸。
根据本发明，所述多肽包括对应SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10的多肽，特别是那些具有SOS2丝氨酸/苏氨酸激酶激活剂生物活性的多肽，还包括那些至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％与对应SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ IDNO10的多肽同源，以及具有所述活性的多肽。因此，所述多肽对于SEQ IDNO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8或SEQ ID NO10可以具有从70％直至100％的同源性。
术语“严谨条件”或“严谨杂交条件”包括参考这样的条件，在该条件下多聚核苷酸将与其靶序列杂交，且达到较与其它序列杂交多的程度(例如，高出本底至少2倍)。严谨条件是序列依赖的，并且在不同的环境中会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严谨度，能鉴定出与探针100％互补的靶序列(同源探测)。可选地，可以调整严谨条件允许序列中的一些错配，以便检测到较低程度的相似性(异源探测)。
通常，严谨条件将为盐浓度低于约1.5M钠离子，一般约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH值在7.0至8.3并且温度用于短探针(例如，10至15个核苷酸)至少约30℃，用于长探针(例如，长于50个核苷酸)至少约60℃。严谨条件还可以通过加入去稳定剂例如甲酰胺达到。示例性低严谨条件包括用30％至35％甲酰胺的缓冲溶液、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)在37℃下杂交，然后在1X到2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3 M柠檬酸三钠)中在50到55℃下洗涤。示例性的中等严谨条件包括用40％至45％甲酰胺的缓冲溶液、1M NaCl、1％SDS在37℃下杂交，然后在0.5X到1X SSC中在55到60℃下洗涤。示例性的高严谨条件包括用50％甲酰胺的缓冲溶液、1MNaCl、1％SDS在37℃下杂交，然后在0.1X SSC中在60到65℃下洗涤。
“特异性”通常为杂交后洗涤的函数，临界因子为离子强度和最后洗涤溶液的温度。对于DNA-DNA杂交，Tm可以由Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.来估计，138267-284(1984)的方程Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中，M为一价阳离子的摩尔浓度，％GC为鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分数，％form为甲酰胺在杂交溶液中的百分数，以及L为杂交碱基对的长度。Tm为50％的互补靶序列与完全配对的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。Tm下降约1℃每1％错配；因此Tm、杂交和/或洗涤条件可以调整杂交需要的同一性序列。例如，如果寻找具有大概90％的同一性的序列，Tm可以下降10℃。一般来说，选择严谨条件在确定的离子强度和pH下，比特异性序列及其互补序列的热溶解点(Tm)低约5℃。然而，严格严谨条件可以使用低于热熔解点(Tm)1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中等严谨条件可以使用低于热熔解点(Tm)6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严谨条件可以使用低于热熔解点(Tm)11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。使用上述方程，杂交和洗涤组合物，以及想要的Tm，本领域技术人员将理解杂交和/或洗涤溶液的严谨度的变化得到本质叙述。如果想要的错配程度导致Tm低于45℃(含水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度从而能使用较高的温度。核苷酸杂交多方面的指导可以参见分子生物学通用方案，第二章，Ausubel等，Eds.，Greene Publishing andWiley-Interscience，纽约(2000)(Current Protocols in Molecular Biology，Chapter2，Ausubel，et al.，Eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(2000))。
因此，根据前述信息，本领域技术人员能够鉴别和分离基本上与本发明多聚核苷酸类似的多聚核苷酸。如此分离这类多聚核苷酸，该多聚核苷酸可以用作例如，本发明提高植物耐盐性的多聚核苷酸。
在本发明范围内还可以想到的是本领域技术人员利用突变SOS2蛋白的片段筛选与本发明多聚核苷酸具有实质同源性的多聚核苷酸，优选那些编码具SOS2丝氨酸/苏氨酸激酶活性的蛋白质的多聚核苷酸。
本发明多聚核苷酸序列可以由一种或多种合适的质粒或载体(如表达载体)携带，如本领域公知的用于植物等的质粒或载体。如上所述，在本发明范围内还包括在相同或不同的质粒或载体上具有多聚核苷酸序列(例如，SEQ IDNO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7或SEQ ID NO9以及SEQ ID NO11之一)。在本发明的实施方式中，那些多聚核苷酸在相同(或者不同)的质粒或载体上能可操作地连接于单一启动子、同一类型的不同启动子、或者选择性诱导型启动子。
在一个实施方式中，在细菌或真菌菌株中用适于该细胞类型的合适载体携带多聚核苷酸，有利于多聚核苷酸的增殖。增殖多聚核苷酸和在所述细胞中制备蛋白的普通方法为本领域公知，且得到描述，例如在Maniatis等，分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版，纽约(1982)(Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1982))和Sambrook等，分子克隆实验手册，冷泉港实验室出版，纽约(1989)(Sambrooket al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York(1989))中。
在本发明的实施方式中，本发明的多聚核苷酸(即，SOS2突变体、及其变异体，如上所述)包含在质粒或载体中，或者缺乏或者存在与SOS3或其变异体(如上所述)相关的多聚核苷酸。
在本发明的另一实施方式中，本发明的质粒或载体包含在宿主细胞、植物细胞或转基因植物中。优选地，所述植物为拟南芥，或者选自由小麦、玉米、花生、棉花、燕麦和大豆植物所组成的组中。在优选实施方式中，本发明所述多聚核苷酸可操作地连接于启动子，优选为诱导型启动子。如上文所述，所述多聚核苷酸在相同(或者不同)的质粒或载体上，可以可操作地连接于单一启动子、同一类型的不同启动子，或者选择性诱导型启动子。
在另一优选实施方式中，本发明提供了制备转基因植物的方法，该方法包括将本发明的多聚核苷酸引入植物中。
在另一优选实施方式中，本发明提供了增加植物所需耐盐性的方法，该方法包括将本发明的多聚核苷酸(包括此处确定的单独用于SOS2的多聚核苷酸或者在此处确定的用于SOS3存在下的多聚核苷酸)引入该植物中。
在优选实施方式中，其中发生所述过度表达的植物细胞在植物的茎干或根中，更优选在植物的茎干中。
根据本发明用于转化植物和植物细胞的方法、载体和组合物为本领域技术人员公知，并无特殊限制。叙述性的实例参见Karimi等，植物科学趋势，第七卷，第5期，2002年5月，pp.193-195(Karimi et al.，TRENDS in Plant Science，Vol.7，NO5，May 2002，pp.193-195)，此处引入作为参考。此外，该方法需要包括诱导各个基因的表达，通过使植物含有本发明的载体足够的时间，并在适于带给所述植物盐敏感性的条件下。时间和条件可以按照经验确定。然而，应该理解的是本发明基因的基础表达足以支持和/或带给含有该基因的植物的提高的耐盐性。
在本发明的又一个实施方式中，上述转基因植物可以包括前述用于SOS2变异体的基因，该基因可以整合到转基因植物基因组中。基因组整合的方法为本领域技术人员公知。
上述本发明的书面描述提供了制造和使用其的方式和过程，这样任何本领域技术人员都能制造和使用本发明，这样尤其是对所附权利要求的主题，提供了弥补部分原始记载的可能。
如上述所用，短语“选自所组成的组中”、“选自”等包括具体原料的混合物。
此处所述的数字的限定或范围，包括端点。此外，具体包括在数字的限定或范围内的所有值和亚范围，就象其被明确写出一样。
提出上述描述以使本领域技术人员能够制造和使用本发明，在上下文中提供了特别应用及其要求。优选实施方式的各种改良对本领域技术人员显而易见，不背离本发明精神和范围的情况下，此处定义的一般原理可以应用于其他实施方式和应用中。因此，本发明并不意图限制于所示的实施方式，而是应当与符合此处公开的原理和特征的最宽范围一致。
本发明已经得到概括描述，通过参考特定实施例，能得到进一步理解。此处提供所述实施例仅为解释说明目的，除非特别说明，并不意图限制。
实施例 材料和方法 制备活性SOS2激酶表达质粒和植物转化 按照Guo等，2001(此处全部引入作为参考)的描述，得到T/DSOS2(多聚核苷酸序列＝SEQ ID NO3；蛋白序列＝SEQ ID NO4)、T/DSOS2/308(多聚核苷酸序列＝SEQ ID NO5；蛋白序列＝SEQ ID NO6)和T/DSOS2/329(多聚核苷酸序列＝SEQ ID NO7；蛋白序列＝SEQ ID NO8)，而按照Qiu等，2002(此处全部引入作为参考)的描述，得到T/DSOS2DF(多聚核苷酸序列＝SEQID NO9；蛋白序列＝SEQ ID NO10)。天然SOS2具有SEQ ID NO1的多聚核苷酸序列以及SEQ ID NO2的蛋白序列，而天然SOS3具有SEQ ID NO11的多聚核苷酸序列以及SEQ ID NO12的蛋白序列。
为了在拟南芥中表达组成性活性的SOS2激酶，T/DSOS2、T/DSOS2/308、T/DSOS2/329和T/DSOS2D的DNA片段用BamHI和EcoRI从它们的GST融合构建体上消化(Guo等，2001)下来，并在CaMV 35S启动子控制下，克隆到二元载体(pCAMBIA1027)中，。通过电穿孔法将所述载体导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3 101中，然后通过真空渗入转移到野生型(拟南芥哥伦比亚生态型)、sos2-2或sos3-1突变植物中。潮霉素抗性转基因T2和T3植物用于盐中生长测试。
生长测量 野生型、sos2-2、sos3-1和转基因植物的种子在7％(w/v)次氯酸盐和0.01％(w/v)Triton X-100中表面灭菌，然后用无菌水冲洗五次。在含有0.6％琼脂且标明NaCl浓度的MS营养培养基(JRH Biosciences，Lenexa，KS)上种植所述种子。所述种子在4℃下层积3天，然后转移到22℃下在连续光照下测量萌发和生长。
为使幼苗在盐中生长，野生型、sos2-2、sos3-1和转基因植物的五天龄幼苗转移到含有1.2％琼脂且标明NaCl浓度的MS营养培养基。生长使用根弯曲测定法(root bending assay)监测(Zhu等，1998)。植物在土壤中的耐盐性如上Shi等(2003)中所述方法进行测定。
RNA分析 从2周龄幼苗提取总RNA，每个样品40μg用于上述RNA分析(Guo等，2001)。
免疫印迹分析和激酶测定 在4℃下从野生型、sos2-2、sos3-1和转基因植物在含5mM二硫苏糖醇、2μg抑酞酶mL-1、2μg亮肽素mL-1和2mM苯甲基磺酰氟的10mL 1×PBS缓冲液(137mM NaCl、2.7mM KCl、4.3mM Na2HPO4和1.4mM NaH2PO4，pH7.4)中提取总蛋白(5克10天龄幼苗)。为了分离足够量的T/DSOS2蛋白，用谷胱甘肽-琼脂糖珠(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden瑞典)第一次纯化GST-SOS3融合蛋白(Halfter等，2000)。然后全部拟南芥蛋白与100μL偶联谷胱甘肽-琼脂糖珠的GST-SOS3在4℃下温育2小时。将GST-SOS3珠-T/DSOS2蛋白复合物用1×PBS缓冲液洗涤三次。10微升蛋白复合物用于或者免疫印迹分析或者蛋白激酶测定。
对于免疫印迹分析，将3μL of3×蛋白加样缓冲液(200mM Tris-HCl，pH6.8，8％SDS，30％丙三醇、1.5％β-巯基乙醇和0.3％溴酚蓝)加入10μL蛋白，所得样品煮沸5分钟。所得样品在10％SDS-PAGE凝胶上分离，在80V下60分钟，所得蛋白得以转移到纯净硝酸纤维膜(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)上。该膜在4℃下于含5％无脂肪奶的1×PBS缓冲液中封闭过夜，用1×PBS冲洗一次，与SOS2抗体(1∶1000稀释)在室温下温育3小时。在用1×PBS缓冲液洗涤3次后，该膜与1∶2500稀释的抗兔IgG第二抗体(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)在室温下温育1小时。然后所述膜用1×PBS洗涤五次，用化学发光ECL检测底物(Amersham Biosciences)来检测免疫反应带。
按照Halfter等(2000)所述，10微升SOS3-T/DSOS2珠用于p3肽磷酸化测定。
Na+/H+交换 使用所述水性两相分配(Qiu和Su，1998；Qiu等，2002)分离质膜小泡。以Na+诱导的pH梯度消耗(ΔpH，即Na+诱导的喹吖因荧光增强；Qiu等，2002)测量Na+/H+交换(反向转运)活性。当ΔpH达到稳定状态，加入NaCl起始Na+转运。为了测定Na+/H+交换的初始速度(每分钟荧光的变化；Δ％Fmin-1)，在加入Na+之后紧接着15s内测定相对荧光的变化。通过用初始速度除以质膜蛋白的质量来计算反应中的比活性(Δ％F mg-1蛋白min-1)。为了测定T/DSOS2是否在体外激活SOS1，进行反向转运活性测试之前，将200ng的T/DSOS2蛋白与野生型膜小泡在室温下预温育7分钟。
酵母生长 酿酒酵母YP890株为AXT3K(Δena1HIS3ena4、nha1LEU2和nhx1KanMX)的衍生物(Quintero等，2002)，其中PGK1SOS1CYC1表达盒被插入在染色体基因CYC1的3′端非翻译区。转基因的染色体布局和PGK1启动子的使用在YP890细胞中提供了适度的拟南芥SOS1蛋白组成型表达。通过将衍生自pGEX-SOS2的BamHI-EcoRI片段(Guo等，2001)插入p414GPD载体的BamHI-EcoRI位点中，制备质粒，该质粒含有或者野生型SOS2、SOS2的激活形式(T/DSOS2、T/DSOS2/308、T/DSOS2/329和T/DSOS2/DF)，或者具有将Lys40取代成Asn的无活性SOS2突变体(T/DSOS2/KN)。将野生型SOS3和突变体sos3-1的cDNA克隆到表达载体pYPGE15的XbaI-XhoI位点。使用标准锂-聚乙二醇方法进行酿酒酵母的转化。酿酒酵母在盐中的生长能力在AP培养基中测试，该培养基基本不含碱阳离子。菌株在补充有1mM KCl的液体AP培养基中培养过夜。收获后，在蒸馏水中重悬并且十倍稀释细胞。等分部分(5μL)被点在补充有1mM KCl和各种浓度NaCl的AP平板上，如上所记录的，在28℃下生长3至4天。
含有基因融合物hSosSOS2的质粒pSRS2-1用于监测质膜靶标SOS2(Quintero等，2002)。用上述载体质粒pYPGE15表达SOS3和sos3-1。所有用于SRS的质粒都转化到酿酒酵母菌株Cdc25-2(Mata、cdc25-2、ura3、lys2、leu2、trp1、his3和ade101)中，该菌株在37℃条件致死，除非融合蛋白hSosSOS2到达质膜(Aronheim等，1997)。在YPD平板中(1％酵母提取物、2％蛋白胨和2％葡萄糖)测定37℃下的细胞生活力。
结果 SOS2蛋白的变化制备组成型活性激酶 基于SOS2不能自磷酸化作用或磷酸化肽底物，SOS2表现为无活性激酶。钙结合蛋白SOS3已经在体外表现出在钙存在的情况下，与SOS2相互作用并激活SOS2(Halfter等，2000)。本发明的发明人先前已经展示，能够产生在SOS3和钙不存在的情况下具有活性的SOS2激酶(组成型活性SOS2)，或者通过将激活作用环中的Thr168换成酸性残基Asp(T/DSOS2)，或者通过缺失SOS2蛋白C-端调控域的FISL基序(SOS2DF)(Guo等，2001；Qiu等，2002)，通过结合这两种变化产生超效SOS2激酶(T/DSOS2DF)(Qiu等，2002)。
在此研究中，对SOS2激酶做了另外的改变，允许开发一系列SOS2蛋白用于研究SOS2的结构和功能。分别去除谷胱甘肽S-转移酶(GST)-T/DSOS2/308和GST-T/DSOS2/329构建体中的FISL基序和C-端117氨基酸，或者去除C-端117氨基酸(图1A)。测定这些蛋白的自磷酸化作用或者它们磷酸化肽底物的能力，并将它们的活性与野生型SOS2蛋白、T/DSOS2或T/DSOS2DF的活性作比较。T/DSOS2/308具有最强的活性，然后是T/DSOS2DF、T/DSOS2、T/DSOS2/329和SOS2(图1B至图1D)。这些激酶构建体作为以下在酿酒酵母和拟南芥中转基因研究的基础。
SOS2的蛋白激酶活性在异源系统中部分满足体内耐盐性 最近，拟南芥SOS调控路径已经在酿酒酵母中重建(Quintero等，2002)，提供了用于研究SOS2结构功能关系的体内系统。为了测定SOS2激酶活性是否与SOS1的激活作用相关，将野生型和组成型活性SOS2激酶引入酿酒酵母菌株YP890，其中已经去除内源性酿酒酵母Na+转运体(Na+散出蛋白ENA1-4和NHA1以及液泡Na+/H+交换器NHX1)，并且拟南芥SOS1基因从染色体插入得到组成型表达。转化后的酿酒酵母菌株在含有1mM KCl和各种浓度NaCl的Arg磷酸盐(AP)培养基上生长，结果如图2所示。
在YP890菌株中达到的低基础活性的SOS1和中等水平的表达未能支持细胞在超过50mM的NaCl中生长(数据未示出)。YP890的耐盐性不能通过野生型SOS2的表达实质上得到提高(图2A)，但是通过SOS2-SOS3激酶复合体的共表达得到引人注目地增强。
当T/DSOS2取代野生型SOS2得到表达时，耐盐性没有进一步增加(图2)；所述T/DSOS2具有模拟SOS2磷酸化状态的Thr168-到-Asp的突变(Gong等，2002)。相比之下，在磷酸转移活性必需的催化位点中lys40-到-Asn的突变产生了甚至在SOS3存在的情况下无活性的激酶(T/DSOS2/KN)。
表达T/DSOS2/308，带有除去了SOS2整个C-端自动抑制部分的截短，有力增强酿酒酵母在没有SOS3存在的情况下在NaCl中生长的能力，并且由于缺乏T/DSOS2/308和SOS3两种蛋白的共同作用，SOS3的共表达未能进一步增加耐盐性。FISL基序的缺失(T/DSOS2DF)部分地从自动抑制中释放了SOS2，如在T/DSOS2/329中截短所作的去除末尾117个C-端氨基酸但是保留FISL结构域。然而，虽然SOS3通过FISL结构域与T/DSOS2/329合作，但是SOS3的共表达并没有对T/DSOS2DF起作用(图2A)。由T/DSOS2/308在没有SOS3存在的情况下关联T/DSOS2DF和T/DSOS2/329带来的更好的耐盐性，与图1中所示的数据一起表明SOS2的整个C-端部分促成激酶活性的自动抑制。
在SOS3存在下，T/DSOS2/308和T/DSOS2/329关于SOS1激活作用表现类似(图2A)，尽管它们载体外显著不同的激酶及自磷酸化作用活性(图1)。同时，这些结果表明体外测定的激酶活性与SOS2在体内及在SOS3不存在的情况下的功能性非常相关，但是它们也说明了结合SOS3以及聚集到质膜的能力对SOS2胜任SOS1的激活作用很关键。另一方面，没有一种通过蛋白截短激活的SOS2激酶能够将酿酒酵母的耐盐性增强达到一定的水平，该水平与当共表达SOS1和保持结构完整性的SOS2及SOS3蛋白时所能达到的水平相同，表明全长多肽之间的相互作用对于实现功能是最佳的。
拟南芥sos3-1突变引起三个在中心EF手中的保守氨基酸缺失(Liu和Zhu，1998)。虽然本发明的发明人已经在先前展示了sos3-1突变彻底降低SOS3在体外激活SOS2的能力(Ishitani等，2000)，本发明的发明人测试了是否SOS3-1多肽仍在体内与被激活的保留FISL基序的SOS2蛋白相互作用，并且聚集它们到质膜。等位基因SOS2和T/DSOS2在YP890细胞中与sos3-1的eDNA共表达。如图2B所示，SOS3-1突变多肽未能通过SOS2或T/DSOS2间接激活SOS1。此外，使用SOS聚集系统(SOS Recruitment System，SRS)监测SOS2靶向质膜(Quintero等，2002)，本发明的发明人测定SOS3-1不能聚集SOS2或T/DSOS2到质膜(图2C)。
SOS2的蛋白激酶活性在植物中部分满足耐盐性 为了测定SOS2的蛋白激酶活性在植物中是否满足耐盐性，在拟南芥sos2和sos3突变体中，在花椰菜花叶病毒(Cauliflower mosaic virus，CaMV)35S启动子下表达野生型和组成激活形式的SOS2。将表达35S:SOS2的五天龄T2转基因植物(在无盐MS培养基上萌发)转移到平板上，所述平板或者为MS培养基或者为含100mM NaCl的MS培养基。在sos2-2背景中评价十二个独立T2转基因系中的三个，盐耐受性几乎恢复与野生型相等的水平。相比之下，在sos3-1背景中评价24个独立转基因系没有一个显示增强与sos3-1突变体相关的耐盐性。
在sos3-1和sos2-2背景下评价一个具有代表性的T3纯合35S:SOS2系在盐中的SOS2转录本积聚和生长(图3)。RNA分析表明，转基因植物积聚了高水平的来自转基因的SOS2 mRNA，这是因为内源性SOS2表达极低(图3E)，并且仅在印迹延长曝光时能看到(数据未展示)。结果表明，SOS2在CaMV 35S启动子下的异位表达能拯救sos2-2表型(图3B)。正如所料，SOS2的异位表达并不拯救sos3-1盐高敏表型(图3D)，证实在拟南芥中，野生型SOS2蛋白必须通过SOS3在体内激活而有功能。
活性T/DSOS2激酶在sos2-2和sos3-1中的表达导致12个T2 sos2-2转基因系中的5个以及12个T2 sos3-1转基因系中的4个得到拯救，其中拯救了茎干敏感性而不是根敏感性的突变表型。RNA分析表明，sos2-2和sos3-1转基因植物积聚高水平的T/DSOS2转录本(图4A)。SOS2转录本和蛋白在拟南芥中丰度低，即使当SOS2转录本水平较高时，由于强CaMV 35S启动子，使用我们的抗血清，SOS2蛋白水平仍然实质上不可检测(数据未显示)。
因此，为分析T/DSOS2蛋白在转基因植物中的水平，从变异体和转基因植物中提取总蛋白，并且基于SOS2结合于SOS3，富集SOS2蛋白(从内源性SOS2和35S:T/DSOS2两种)。该蛋白装入含有GST-SOS3融合蛋白的柱，所述融合蛋白结合到谷胱甘肽-琼脂糖珠上。所得GST-SOS3-SOS2或T/DSOS2复合物或者用于免疫印迹分析或者用于肽磷酸化试验。如图4B所示，T/DSOS2的表达无论在sos2-2还是在sos3-1内都导致T/DSOS2蛋白较高的水平积聚，该水平比在sos2-2和sos3-1突变体中的预成SOS2蛋白水平高。基于p3肽的磷酸化作用，得自sos2-2和sos3-1两种转基因植物的T/DSOS2激酶活性比在相应突变体中高大概4倍(图4C)。因为几个PKS(SOS2样蛋白激酶)蛋白也与SOS3相互作用(Guo等，2001)，来自未转化突变体的激酶活性不能代表只有SOS2的活性。
野生型、突变体和T/DSOS2转基因植物的五天龄幼苗被转移到或者MS培养基或者含100mM NaCl的MS培养基。在MS培养基上观察在植物生长方面没有显著不同(图5A)。当植物在含100mM NaCl的培养基上生长时，野生型植物的生长迟缓，但是弯曲的根在很大程度上没有影响，然而sos2-2和sos3-1的生长严重受抑制(图5B)并且植物在2周内死亡(数据未展示)。在sos2-2中T/DSOS2的表达能部分地拯救茎干盐过敏症，但是不能拯救根盐过敏症(图5B)。
该结果表明在茎干中，T/DSOS2的异位表达在sos2-2背景中部分地拯救耐盐性。T/DSOS2在sos3-1中的表达也能部分地拯救茎干盐过敏症但是不能拯救根盐过敏症(图5B和图5C)，表明在茎干中，添加活性激酶部分地绕过对SOS3的要求。
当突变体和转基因植物在土壤中生长，用含0.05 x MS营养素不含NaCl的水浇水时，观察到它们的营养生长或生殖生长没有区别。然而，当植物用NaCl处理时，sos2-2和sos3-1很快失去活力，并且营养生长和生殖生长减小(图5D和图5E)。T/DSOS2的表达改善了在NaCl胁迫下的突变体生长(图5D和图5E)，虽然不能恢复耐盐性到达野生型水平(数据未展示)。
SOS2的蛋白激酶活性可能限制拟南芥中耐盐性 为了确定SOS2蛋白水平是否在体内限制，以及是否增加活性SOS2水平导致改善植物中的耐盐性，在野生型植物中在CaMV 35S启动子控制下表达SOS2和T/DSOS2。评价24个T2 35S:SOS2转基因系，全部24个基因系具有的耐盐性水平与未转化的野生型中的水平类似。在三个T3纯合体35S:SOS2系中测定SOS2转录本水平，并检测所有转基因植物的有力表达(图6A)。随后评价了这些系中的两个在发芽(图6B和图6C)和幼苗生长(图6D和图6C)中的耐盐性；对盐的反应在两个时期与在野生型中的反应相类似。过度表达野生型SOS2在植物中不能带来耐盐性的提高，表明SOS2蛋白水平在拟南芥体内无限定。
通过未知上游激酶，用在SOS2蛋白激活作用环中Thr168与Asp的交换模拟Thr168的磷酸化作用，并且导致SOS2的激活作用(Guo等，2001)。当T/DSOS2在野生型植物中得到表达时，评价34个T2转基因系中的7个，与未转化的野生型植物相比，耐盐性增强。分析7个T3纯合体35S:SOS2系中的2个，分析T/DSOS2转录本和蛋白积聚以及耐盐性。转基因植物积聚高水平T/DSOS2转录本和蛋白(图7A和图7B)。来自转基因植物的T/DSOS2激酶活性，在野生型激酶活性水平上提高了四到五倍(图7C)。当在无盐MS培养基上萌发时，没有发现转基因植物和野生型植物的差别(图8A，左侧嵌板)。
然而，来自转基因系的种子显示在含100mM NaCl的MS培养基上更迅速地萌发(图8A，右侧嵌板)，并且转基因植物中幼苗在盐中进一步进行发育(绿色子叶发育)。野生型和转基因幼苗在无盐存在的情况下的生长相类似(图8B，顶部嵌板)。然而，当幼苗转移到含NaCl的培养基时，转基因植物表现出较小的生长抑制，在120mM NaCl下特别明显(图8B，中间和底部嵌板)。
为了测试当植物在土壤中生长时的耐盐性，野生型和转基因种子在土壤中萌发，并用0.05×MS营养素浇水。3周后，所述植物用NaCl处理，通过日益增多的NaCl浓度，每4天增加50mM直到达到终浓度200mM(Shi等，2003)。当与野生型植物的生长相比时，转基因植物表现出在含200mM NaCl土壤中改善的营养生长和生殖生长(图8C)；当植物在无NaCl生长时未发现有差别(数据未示出)。表达T/DSOS2激酶的植物耐盐性增强表明，激活激酶的水平可能在拟南芥体内被限制，增加植物中的活化SOS2水平可以导致耐盐性提高。
通过组成型活性SOS2在体内提高SOS1的活性 先前的研究表明，活性SOS2蛋白在体外刺激SOS1的Na+/H+反向转运体活性(Qiu等，2002)，表明SOS2直接调控SOS1的活性。为了确定SOS2激酶活性是否在体内足以调控SOS1活性，以及是否SOS1激活作用能促成耐盐性的提高，其由T/DSOS2赋予，本发明的发明人测量了35S:T/DSOS2转基因内植物和未转化野生型植物、sos2-2和sos3-1对照植物中的SOS1转运活性。
为了上述研究，在用250mM NaCl处理3天后，从野生型、sos2-2、sos3-1和它们的T/DSOS2转基因植物中分离高度纯化质膜小泡。当T/DSOS2蛋白在体外加入分离自未转化的野生型植物的质膜小泡时，Na+/H+-交换活性随渐增NaCl的浓度增加，在所有NaCl浓度中，Na+/H+-交换活性比没有T/DSOS2蛋白存在的情况下的活性更高(图9A)。用100mM NaCl测量最大刺激活性相当于未加蛋白活性的40％。在分离自T/DSOS2转基因的野生型、sos2和sos3植物小泡中测定的Na+/H+-交换活性，高于各自的未转化对照(图9B至图8D)；然而，sos2-2和sos3-1转基因系的交换活性恢复到只有一半或三分之二的在未转化野生型中测量的活性水平，符合它们的盐敏感性部分抑制(图5)。
这些结果表明活性激酶T/DSOS2的表达提高了SOS1在转基因植物体内的活性。这些测量结果还提供了进一步证据，在体内需要多于满足完全SOS1活性和耐盐性的SOS2。除了激活SOS1之外，活性激酶的表达还可以通过其他机制提高耐盐性(例如，提高小泡Na+/H+反向转运活性)，因为SOS2已经表现为小泡Na+/H+反向转运体的调控子(Qiu等，2004)。
SOS2C-端区域为植物中功能所必需 上述实验展示了当在野生型、sos2或sos3植物任一中表达时，活性激酶T/DSOS2能提高SOS1活性以及耐盐性。因为T/DSOS2/308(具有Thr168-至-Asp的变化，并且其中去除了FISL域和C-端117个氨基酸)在体外表现出最高蛋白激酶活性(图1)，并且在SOS3不存在的情况下在酿酒酵母中最胜任SOS1的激活作用(图2)，T/DSOS2/308在CaMV 35S启动子下在sos2-2或sos3-1突变体中表达。从每种转化中测试24个独立T2转基因系在盐中的生长；没有一个基因系具有的耐盐性比sos2-2或sos3-1突变体的耐盐性更好。T/DSOS2/308在sos2-2(图10A和图10B，顶部)内和在sos3-1(图10A和图10B，底部)内的具有代表性的T3纯合体系得到展示。虽然转基因在转基因植物中以高水平表达(图10C)，但是耐盐性并没有得到提高。该结果表明FISL基序和/或C-端117个氨基酸是植物中耐盐性所必需的。
与T/DSOS2/308相比，T/DSOS2/329(具有Thr168-至-Asp的变化，并且除去C-端117个氨基酸)包括FISL基序但是不如T/DSOS2/308有活性，因为FISL基序抑制SOS2活性(图1和图2)。当在sos2-2或sos3-1突变体中表达35S:T/DSOS2/329时，耐盐性没有恢复。T/DSOS2/329在sos2-2(图10D和图10E，顶部)内和在sos3-1(图10D和图10E，底部)内的具有代表性的T3纯合系也得到展示。与T/DSOS2/308一致，虽然转基因在转基因植物中高表达(图10C)，但是耐盐性并没有得到提高。由表达T/DSOS2/329的sos2-2和sos3-1转基因系的分析数据表明，加回FISL基序在植物体中不足以恢复活性T/DSOS2/308激酶的功能。与来自表达T/DSOS2/308转基因植物的数据一起，所述结果揭示了SOS2C-端区域在植物耐盐性中所起的重要作用。
为了进一步考察FISL基序和C-端117个残基的功能，在野生型拟南芥以及sos2-2或sos3-1背景下表达T/DSOS2DF(具有Thr168-至-Asp的变化，并且其中除去FISL域)。当在野生型植物中表达T/DSOS2DF时，12个T2转基因系中的4个评价具有比未转化的野生型更大耐盐性。T/DSOS2DF转录本水平在两个T3纯合系中测定，两个中都检测到了高积聚(图11A)。当这些植物在萌发和幼苗生长过程中评价耐盐性时，在无盐培养基上萌发中没有检测到显著差异(图11B)。相比之下，转基因植物萌发更快，并且在含100mM NaCl的MS培养基上幼苗发育改善(图11C)。当五天龄幼苗转移到MS培养基上时，野生型和转基因型植物的生长相似(图11D)。当幼苗转移到含100mM NaCl或120mM NaCl的的MS培养基上时，转基因植物的生长受NaCl抑制小(图11E和图11F)。
本发明的发明人尝试通过使总蛋白提取物(来自具有增强的耐盐性的转基因系)与谷胱甘肽-琼脂糖珠上的GST-SOS3温育富集T/DSOS2DF。然而，T/DSOS2DF蛋白不能通过免疫印迹分析(数据未示出)检测，并且在肽磷酸化测试中没有检测到T/DSOS2DF激酶活性(数据未示出)，表明T/DSOS2DF不能与SOS3相互作用，进一步支持先前相互作用研究所表明的，FISL基序是SOS2/SOS3相互作用所必需的。
当T/DSOS2DF在sos2-2和sos3-1背景中表达，12个T2 sos2-2转基因系中的3个具有恢复到几乎达到野生型水平的耐盐性。然而，评价24个T2 sos3-1转基因系，全部具有sos3-1表型只带有轻微根卷曲。代表性的T3纯合sos2-2和sos3-1转基因系在图12中得到展示。T/DSOS2DF转录本在两种转基因系中都得到检测(图12F)。当得自野生型、sos2-2、sos3-1以及转基因sos2-2或转基因sos3-1系的五天龄幼苗转移到无盐MS培养基中时，没有发现生长的显著差异(图12A和图12C)。然而，当幼苗转移到含100mM NaCl的MS培养基上时，sos2-2植物在两周内死亡，但是sos2-2转基因植物表型与野生型类似，除了有稍微较小的茎干和较少侧根外(图12B)。当植物在100mM NaCl中生长时，T/DSOS2DF在sos3-1中的表达引起相对于sos3-1根延长轻微增加(图12D和图12E)；然而，sos3-1和sos3-1转基因系都不能在这种培养基中存活>2周。
通过35S:T/DSOS2DF转基因植物的结果表明，向FISL基序的C-端117个残基是必需的，并且足以用于在野生型和sos2-2突变植物中活化的SOS2激酶蛋白的植物功能。然而，在sos3-1突变植物中该活性激酶的功能显示出还需要FISL基序。野生型转基因植物中改良的耐盐性提供了进一步支持SOS2的激酶活性在体内限制，增加该活性可以有利于耐盐性。
不同形式的SOS2在体外、在酿酒酵母中以及在野生型拟南芥和突变拟南芥中的活性和功能总结在表1中。
表1野生型和激活形式的SOS2的体外和体内活性总结 每种SOS2变异体的体外磷酸化活性和体内相对耐盐性水平用“+”标志的数量表示。负号标志表示未检出磷酸化作用或没有生长。ND，没有测定；WT，SOS2的野生型形式。命名“+SOS3”或者“-SOS3”是指存在或者不存在SOS3。命名“sos2”和“sos3”是指突变体表型(参见上文实施例)。
在上述教导的启发下关于本发明可能有很多改良和变化。因此可以理解在所附权利要求范围内，本发明实践可以与此处具体描述不同。
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裘全盛
卡伦·休·舒梅克
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郭岩
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Met Thr Lys Lys Met Arg Arg Val Gly Lys Tyr Glu Val Gly Arg Thr
1 5 10 15
Ile Gly Glu Gly Thr Phe Ala Lys Val Lys Phe Ala Arg Asn Thr Asp
20 25 30
Thr Gly Asp Asn Val Ala Ile Lys Ile Met Ala Lys Ser Thr Ile Leu
35 40 45
Lys Asn Arg Met Val Asp Gln Ile Lys Arg Glu Ile Ser Ile Met Lys
50 55 60
Ile Val Arg His Pro Asn Ile Val Arg Leu Tyr Glu Val Leu Ala Ser
65 70 75 80
Pro Ser Lys Ile Tyr Ile Val Leu Glu Phe Val Thr Gly Gly Glu Leu
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Phe Asp Arg Ile Val His Lys Gly Arg Leu Glu Glu Ser Glu Ser Arg
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Lys Tyr Phe Gln Gln Leu Val Asp Ala Val Ala His Cys His Cys Lys
115 120 125
Gly Val Tyr His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Asp Thr
130 135 140
Asn Gly Asn Leu Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Ala Leu Pro Gln
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Glu Gly Val Glu Leu Leu Arg Thr Thr Cys Gly Thr Pro Asn Tyr Val
165 170 175
Ala Pro Glu Val Leu Ser Gly Gln Gly Tyr Asp Gly Ser Ala Ala Asp
180 185 190
Ile Trp Ser Cys Gly Val Ile Leu Phe Val Ile Leu Ala Gly Tyr Leu
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210 215 220
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225 230 235 240
Ile His Arg Ile Leu Asp Pro Asn Pro Lys Thr Arg Ile Gln Ile Gln
245 250 255
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Ala Arg Glu Glu Glu Glu Val Asn Leu Asp Asp Ile Arg Ala Val Phe
275 280 285
Asp Gly Ile Glu Gly Ser Tyr Val Ala Glu Asn Val Glu Arg Asn Asp
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Glu Gly Pro Leu Met Met Asn Ala Phe Glu Met Ile Thr Leu Ser Gln
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Asn Phe Lys Thr Arg Leu Glu Gly Leu Ser Ser lle Lys Ala Gly Gln
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Leu Ala Val Val Ile Glu Ile Tyr Glu Val Ala Pro Ser Leu Phe Met
385 390 395 400
Val Asp Val Arg Lys Ala Ala Gly Glu Thr Leu Glu Tyr His Lys Phe
405 410 415
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435 440 445
<210>3
<211>1341
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>3
atgacaaaga aaatgagaag agtgggcaag tacgaggttg gtcgcacaat aggtgaagga60
acctttgcta aggttaagtt tgcgaggaac acagacactg gtgataatgt agccatcaaa 120
attatggcta agagtacaat acttaagaac agaatggttg atcagataaa aagagagata 180
tctataatga agattgttcg tcacccgaac atagtgaggt tgtatgaggt gttggcgagt 240
ccttcgaaaa tatatatagt tttggagttt gtgacaggag gagagctctt tgatagaatt 300
gttcataaag ggaggcttga agaaagtgag tctcggaaat actttcaaca gcttgtagat 360
gctgttgctc attgtcactg caagggtgtt taccaccgtg acctaaagcc agaaaatctt 420
ttactcgata caaatggaaa tctgaaggtt tcggatttcg gactcagtgc attgcctcag 480
gaaggagtag aacttctgcg tgacacatgt ggaactccga actatgtagc tccagaggta 540
cttagtggac agggttacga tggttcagca gctgatattt ggtcttgcgg ggttattctt 600
ttcgttatat tggctggata tttacctttt tccgagacgg atcttccagg gttgtacaga 660
aaaataaatg cagcagagtt ttcttgtcca ccgtggtttt ccgcagaagt gaagttttta 720
atacatagga tacttgaccc caatcccaaa acacgtattc aaattcaagg aatcaagaaa 780
gatccttggt tcagattaaa ttatgtgcct atacgagcaa gggaagaaga agaagtgaat 840
ttggatgata ttcgtgcagt ttttgatgga attgagggca gttatgtagc ggagaatgta900
gagagaaatg atgaagggcc cctgatgatg aatgcctttg agatgattac cttatcacaa960
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gtagacgtaa gaaaggctgc tggtgaaact cttgaatatc acaagttcta caagaagcta 1260
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ctcagaacaa tcacgttttg a 1341
<210>4
<211>446
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成多肽
<400>4
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Lys Asn Arg Met Val Asp Gln Ile Lys Arg Glu Ile Ser Ile Met Lys
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65 70 75 80
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Tyr Lys Lys Leu Cys Ser Lys Leu Glu Asn Ile Ile Trp Arg Ala Thr
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Glu Gly Ile Pro Lys Ser Glu Ile Leu Arg Thr Ile Thr Phe
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ttactcgata caaatggaaa tctgaaggtt tcggatttcg gactcagtgc attgcctcag 480
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<213>人工序列
<220>
<223>合成多肽
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Met Thr Lys Lys Met Arg Arg Val Gly Lys Tyr Glu Val Gly Arg Thr
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165 170 175
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275 280 285
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Gly Leu Ash Leu Ser Ala Leu Phe Asp
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<223>合成DNA
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acctttgcta aggttaagtt tgcgaggaac acagacactg gtgataatgt agccatcaaa 120
attatggcta agagtacaat acttaagaac agaatggttg atcagataaa aagagagata 180
tctataatga agattgttcg tcacccgaac atagtgaggt tgtatgaggt gttggcgagt 240
ccttcgaaaa tatatatagt tttggagttt gtgacaggag gagagctctt tgatagaatt 300
gttcataaag ggaggcttga agaaagtgag tctcggaaat actttcaaca gcttgtagat 360
gctgttgctc attgtcactg caagggtgtt taccaccgtg acctaaagcc agaaaatctt 420
ttactcgata caaatggaaa tctgaaggtt tcggatttcg gactcagtgc attgcctcag 480
gaaggagtag aacttctgcg tgacacatgt ggaactccga actatgtagc tccagaggta 540
cttagtggac agggttacga tggttcagca gctgatattt ggtcttgcgg ggttattctt 600
ttcgttatat tggctggata tttacctttt tccgagacgg atcttccagg gttgtacaga 660
aaaataaatg cagcagagtt ttcttgtcca ccgtggtttt ccgcagaagt gaagttttta 720
atacatagga tacttgaccc caatcccaaa acacgtattc aaattcaagg aatcaagaaa 780
gatccttggt tcagattaaa ttatgtgcct atacgagcaa gggaagaaga agaagtgaat 840
ttggatgata ttcgtgcagt ttttgatgga attgagggca gttatgtagc ggagaatgta 900
gagagaaatg atgaagggcc cctgaggcga caggattttg ttaaaaggca aacccgtttt 960
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ggttttaagt ctcatacacg aaacttcaag acaaggctcg agggattatc ttcgatcaag 1080
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gacgtaagaa aggctgctgg tgaaactctt gaatatcaca agttctacaa gaagctatgt 1200
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成多肽
<400>10
Met Thr Lys Lys Met Arg Arg Val Gly Lys Tyr Glu Val Gly Arg Thr
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Ile Gly Glu Gly Thr Phe Ala Lys Val Lys Phe Ala Arg Asn Thr Asp
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Thr Gly Asp Asn Val Ala Ile Lys Ile Met Ala Lys Ser Thr Ile Leu
35 40 45
Lys Asn Arg Met Val Asp Gln Ile Lys Arg Glu Ile Ser Ile Met Lys
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180 185 190
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210 215 220
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225 230 235 240
Ile His Arg Ile Leu Asp Pro Asn Pro Lys Thr Arg Ile Gln Ile Gln
245 250 255
Gly Ile Lys Lys Asp Pro Trp Phe Arg Leu Asn Tyr Val Pro Ile Arg
260 265 270
Ala Arg Glu Glu Glu Glu Val Asn Leu Asp Asp Ile Arg Ala Val Phe
275 280 285
Asp Gly Ile Glu Gly Ser Tyr Val Ala Glu Asn Val Glu Arg Asn Asp
290 295 300
Glu Gly Pro Leu Arg Arg Gln Asp Phe Val Lys Arg Gln Thr Arg Phe
305 310 315 320
Val Ser Arg Arg Glu Pro Ser Glu Ile Ile Ala Asn Ile Glu Ala Val
325 330 335
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340 345 350
Leu Glu Gly Leu Ser Ser Ile Lys Ala Gly Gln Leu Ala Val Val Ile
355 360 365
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Ala Ala Gly Glu Thr Leu Glu Tyr His Lys Phe Tyr Lys Lys Leu Cys
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gaactgttca agaagctaag cagctcaatt atcgatgatg gtcttattca taaggaagaa180
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145 150 155 160
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165 170 175
Trp Lys Asp Phe Val Ser Leu Asn Pro Ser Leu Ile Lys Asn Met Thr
180 185 190
Leu Pro Tyr Leu Lys Asp Ile Asn Arg Thr Phe Pro Ser Phe Val Ser
195 200 205
Ser Cys Glu Glu Glu Glu Met Glu Leu Gln Asn Val Ser Ser
210 215 220
权利要求
1.一种增加植物中所需耐盐性的方法，该方法包括在所述植物的至少一种细胞类型中过度表达编码突变SOS2蛋白的基因，其中，所述突变SOS2蛋白具有选自由SEQ ID NO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8和SEQ ID NO10所组成的组中的序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述突变SOS2蛋白具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述突变SOS2蛋白具有SEQ IDNO4的序列。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述突变SOS2蛋白具有SEQ IDNO6的序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述突变SOS2蛋白具有SEQ IDNO8的序列。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述突变SOS2蛋白具有SEQ IDNO10的序列。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述植物为拟南芥。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述植物选自由小麦、玉米、花生、棉花、燕麦和大豆所组成的组中。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述植物中过度表达所述基因的该细胞用载体转化，该载体包含与SEQ ID NO11至少70％同源的多聚核苷酸序列，其中，所述多聚核苷酸序列编码具有SOS3钙结合活性的蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述多聚核苷酸序列为SEQ ID NO11。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述多聚核苷酸序列编码SEQ IDNO12的蛋白。
12.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述植物中过度表达所述基因的该细胞用表达盒转化，该表达盒包括在植物细胞中有功能的启动子，该启动子可操作地连接于分离的编码所述基因的核苷酸，其中，所述启动子调控所述过度表达。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述启动子选自由病毒外壳蛋白启动子、组织特异性启动子、单子叶植物启动子、泛素启动子、胁迫诱导型启动子、CaMV 35S启动子、CaMV 19S启动子、肌动蛋白启动子、cab启动子、蔗糖合酶启动子、微管蛋白启动子、napin R基因复合体启动子、番茄E8启动子、patatin启动子、甘露碱合酶启动子、大豆种子蛋白大豆球蛋白启动子、大豆营养储藏蛋白启动子、噬菌体SP6启动子、噬菌体T3启动子、噬菌体T7启动子、Ptac启动子、根细胞启动子、ABA-诱导型启动子和膨压诱导型启动子所组成的组中。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述表达盒包含在表达载体中。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述表达载体还包括与SEQ IDNO11至少70％同源的多聚核苷酸序列，其中，所述多聚核苷酸序列编码具有SOS3钙结合活性的蛋白。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述多聚核苷酸序列为SEQ IDNO11。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述多聚核苷酸序列编码SEQID NO12的蛋白。
18.根据权利要求1所述的方法，其中，所述过度表达包括通过使所述植物在适于传递盐敏感性给该植物的条件下诱导所述基因表达足够的时间。
19.一种包含载体的转基因植物，该载体在该植物的至少一种细胞类型中表达编码突变SOS2蛋白的基因，其中，所述突变SOS2蛋白具有选自由SEQ IDNO4、SEQ ID NO6、SEQ ID NO8和SEQ ID NO10所组成的组中的序列。
20.根据权利要求19所述的转基因植物，其中，所述载体还包括在植物细胞中有功能的、可操作地连接于所述基因的启动子，其中，所述启动子调控所述基因的表达。
21.根据权利要求20所述的转基因植物，其中，所述启动子选自由病毒外壳蛋白启动子、组织特异性启动子、单子叶植物启动子、泛素启动子、胁迫诱导型启动子、CaMV 35S启动子、CaMV 19S启动子、肌动蛋白启动子、cab启动子、蔗糖合酶启动子、微管蛋白启动子、napin R基因复合体启动子、番茄E8启动子、patatin启动子、甘露碱合酶启动子、大豆种子蛋白大豆球蛋白启动子、大豆营养储藏蛋白启动子、噬菌体SP6启动子、噬菌体T3启动子、噬菌体T7启动子、Ptac启动子、根细胞启动子、ABA-诱导型启动子和膨压诱导型启动子所组成的组中。
22.根据权利要求19所述的转基因植物，还包括表达载体，该表达载体包括与SEQ ID NO11至少70％同源的多聚核苷酸序列，其中，所述多聚核苷酸序列编码具有SOS3钙结合活性的蛋白，并且其中，所述多聚核苷酸序列的表达受在植物细胞中有功能的、可操作地连接于该多聚核苷酸序列的启动子的控制。
23.根据权利要求22所述的转基因植物，其中，所述多聚核苷酸序列为SEQ ID NO11。
24.根据权利要求22所述的转基因植物，其中，所述多聚核苷酸序列编码SEQ ID NO12的蛋白。
25.根据权利要求19所述的转基因植物，其中，所述植物选自由小麦、玉米、花生、棉花、燕麦和大豆植物所组成的组中。
26.一种增加植物中所需耐盐性的方法，该方法包括在所述植物的至少一种细胞类型中过度表达编码突变SOS2蛋白的基因，其中，所述基因具有选自由SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7和SEQ ID NO9所组成的组中的序列。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述基因编码具有SOS2丝氨酸/苏氨酸激酶活性的蛋白。
28.根据权利要求26所述的方法，其中，所述突变SOS2蛋白具有SEQ IDNO4的序列。
29.根据权利要求26所述的方法，其中，所述突变SOS2蛋白具有SEQ IDNO6的序列。
30.根据权利要求26所述的方法，其中，所述突变SOS2蛋白具有SEQ IDNO8的序列。
31.根据权利要求26所述的方法，其中，所述突变SOS2蛋白具有SEQ IDNO10的序列。
32.根据权利要求26所述的方法，其中，所述植物为拟南芥。
33.根据权利要求26所述的方法，其中，所述植物选自由小麦、玉米、花生、棉花、燕麦和大豆所组成的组中。
34.根据权利要求26所述的方法，其中，在所述植物中过度表达所述基因的该细胞用载体转化，该载体包含与SEQ ID NO11至少70％同源的多聚核苷酸序列，其中，所述多聚核苷酸序列编码具有SOS3钙结合活性的蛋白。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述多聚核苷酸序列为SEQ IDNO11。
36.根据权利要求34所述的方法，其中，所述多聚核苷酸序列编码SEQID NO12的蛋白。
37.根据权利要求26所述的方法，其中，在所述植物中过度表达所述基因的该细胞用表达盒转化，该表达盒包括在植物细胞中有功能的启动子，该启动子可操作地连接于分离的编码所述基因的核苷酸，其中，所述启动子调控所述过度表达。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述启动子选自由病毒外壳蛋白启动子、组织特异性启动子、单子叶植物启动子、泛素启动子、胁迫诱导型启动子、CaMV 35S启动子、CaMV 19S启动子、肌动蛋白启动子、cab启动子、蔗糖合酶启动子、微管蛋白启动子、napin R基因复合体启动子、番茄E8启动子、patatin启动子、甘露碱合酶启动子、大豆种子蛋白大豆球蛋白启动子、大豆营养储藏蛋白启动子、噬菌体SP6启动子、噬菌体T3启动子、噬菌体T7启动子、Ptac启动子、根细胞启动子、ABA-诱导型启动子和膨压诱导型启动子所组成的组中。
39.根据权利要求37所述的方法，其中，所述表达盒包含在表达载体中。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述表达载体还包括与SEQ IDNO11至少70％同源的多聚核苷酸序列，其中，所述多聚核苷酸序列编码具有SOS3钙结合活性的蛋白。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述多聚核苷酸序列为SEQ IDNO11。
42.根据权利要求40所述的方法，其中，所述多聚核苷酸序列编码SEQID NO12的蛋白。
43.根据权利要求26所述的方法，其中，所述过度表达包括通过使所述植物在适于传递盐敏感性给该植物的条件下诱导所述基因表达足够的时间。
44.一种包含载体的转基因植物，该载体在该植物的至少一种细胞类型中表达编码突变SOS2蛋白的基因，其中，所述基因具有选自由SEQ ID NO3、SEQ ID NO5、SEQ ID NO7和SEQ ID NO9所组成的组中的序列。
45.根据权利要求44所述的转基因植物，其中，所述载体还包括在植物细胞中有功能的启动子，该启动子可操作地连接于所述基因，其中，所述启动子调控所述基因表达。
46.根据权利要求45所述的转基因植物，其中，所述启动子选自由病毒外壳蛋白启动子、组织特异性启动子、单子叶植物启动子、泛素启动子、胁迫诱导型启动子、CaMV 35S启动子、CaMV 19S启动子、肌动蛋白启动子、cab启动子、蔗糖合酶启动子、微管蛋白启动子、napin R基因复合体启动子、番茄E8启动子、patatin启动子、甘露碱合酶启动子、大豆种子蛋白大豆球蛋白启动子、大豆营养储藏蛋白启动子、噬菌体SP6启动子、噬菌体T3启动子、噬菌体T7启动子、Ptac启动子、根细胞启动子、ABA-诱导型启动子和膨压诱导型启动子所组成的组中。
47.根据权利要求44所述的转基因植物，其中，还包括表达载体，所述表达载体包括与SEQ ID NO11至少70％同源的多聚核苷酸序列，其中，所述多聚核苷酸序列编码具有SOS3钙结合活性的蛋白，并且其中，所述多聚核苷酸序列的表达受在植物细胞中有功能的、可操作地连接于该多聚核苷酸序列的启动子的控制。
48.根据权利要求47所述的转基因植物，其中，所述多聚核苷酸序列为SEQ ID NO11。
49.根据权利要求47所述的转基因植物，其中，所述多聚核苷酸序列编码SEQ ID NO12的蛋白。
50.根据权利要求44所述的转基因植物，其中，所述植物选自由小麦、玉米、花生、棉花、燕麦和大豆植物所组成的组中。
全文摘要
本发明提供了一种通过在至少一种植物细胞类型中过度表达编码变异SOS2蛋白的基因，而增加植物耐盐性的方法。本发明还提供了表达该变异SOS2蛋白的转基因植物。
文档编号A01H1/00GK101124326SQ200680002797
公开日2008年2月13日 申请日期2006年1月24日 优先权日2005年1月24日
发明者朱健康, 弗朗西斯科·哈维尔·基恩特罗-托斯卡诺, 何塞·帕尔多-普列托, 裘全盛, 卡伦·休·舒梅克, 太田贤, 张常青, 岩 郭 申请人:美国亚利桑那大学董事会, 西班牙高等科研理事会