专利名称：不含选择性标记基因的转质体植物的制作方法
不含选择性标记基因的转质体植物
本发明涉及不含选择性标记基因的转质体(transplastomic)植物、获得
这种植物的方法和所用载体。
植物转基因由将源自各种生物(细菌、病毒、昆虫、植物)的一种或多 种基因引入植物组成，其目的是为该植物提供新特性或提高某些农业或食 品质量。随着常规基因转化技术的发展，大量的各种基因已经导致新的植 物品种的产生。在某些情况下，由于引入了产生除草剂抗性、病原体抗性 或各种应激抗性的特征，可有利于农作物生产并提高产量。在其它情况下， 可提高该植物的营养价值和某些基础化合物的含量。
许多用于获得稳定的转基因植物的技术包括将外来基因引入该植物 的核基因组。然而，整合入宿主植物核染色体的外来基因可通过花粉散布 给野生种类。因此，降低转基因散布到环境中的风险的方法是非常有益的。
获得转基因植物的另一种方式是直接转化质体。具体说，质体转化有 许多优点，其中可注意
-通过双同源重组将基因插入各个细胞中存在的一个或多个拷贝的环 状质体基因组(或质体组)的质体转化具有通过位于转化载体中转基因任一 侧的质体序列将感兴趣的基因精确靶向至质体组中所需区域的优点。这种 精确耙向避免了核转基因过程中通常所观察到的"位置"效应。
-每个细胞获得非常大量拷贝的转基因。具体说，根据发育阶段，叶 片细胞可含有高达10000个拷贝的120-160千碱基的小环状基因组，每个 分子携带一个大的重复序列。随后可操作植物细胞，以使其含有高达20 000 个拷贝的感兴趣基因。
这导致高水平表达；转基因产物可能占总可溶性蛋白质的40%以上 (DeCosa等，2001)。
-质体转化具有其它优点，它能大大限制转基因散布到环境中的风险。 由于质体中所编码的特征通常不能通过花粉传播，限制了转基因传播给野 生物种的潜在风险。McBride等(1994)的文章；美国专利号5,451,513; 5,545,817; 5,545,818 和5,576,198以及国际专利申请WO 95/16783和WO 97/32977描述了质体 转化技术。最初在单细胞藻类莱茵衣藻(C/7/flmj^omomw re/"Aa^"/)中用生 物射弹进行质体转化(Boynton等，1988)，此方法已经延伸至烟草(Svab等， 1990)。
常规的质体转化技术包括用连接有DNA的微粒轰击叶片(Svab等， 1993)。
目前，仅在烟草植物普通烟草(M to&ram)中进行高等植物质体的稳 定转化(Svab和Maliga， 1990; Svab等，1993)。然而近年来，水稻(Khan 和Maligna, 1999)、拟南芥(Jra6Zt/o/w^ Afl/&"a)(Sikdar等，1998)、马铃 薯(Sidorov等，1999)、油菜籽(Chaudhuri等，1999)和番茄(Ruf等，2001)
的质体转化取得了一些进展。获得了烟草、番茄、马铃薯和大豆的可繁殖 的转质体植株(WO 04/053133)。
直接质体转化已经用于获得对除草剂具有良好耐受水平或对昆虫的 抗性，或者产生大量蛋白质。因此，烟草质体组的除草剂如草甘膦(Daniell， 1998; WO 99/10513; Ye等，2000; WO 01/04331， WO 01/04327)或草胺 膦(Basta) (Lutz等，2001)的耐受基因过度表达产生了对这些除草剂出色的 耐受性。其它应用导致产生对昆虫耐受或过量产生治疗性蛋白的转质体植 物(McBride等，1995;美国专利5,451,513; Staub等(2000); WO 99/10513)。
然而，如常规进行的高等植物质体的直接转化的一个主要缺点是采用 抗生素抗性基因作为选择性标记。
通常用于选择转质体品系的选择性标记是细菌基因^W，它在质体 调控元件的控制下表达(Svab等，1993; Staub等，1993)。编码氨基糖苷3'-腺苷转移酶的""^4基因的表达产生两种抗生素抗性，即壮观霉素和链霉 素抗性。afl^L4基因产物防止壮观霉素(或链霉素)结合于质体核糖体30S亚 基的部件16S RNA(参与识别翻译起始密码子)，从而防止了抑制质体内的 翻译。仅有含有表达基因产物的质体的细胞能够继续在体外最优地 生长并保持绿色。另一种选择性标记是具有点突变的16SRNA序列，此点 突变使其对壮观霉素不敏感。
不幸的是，这种抗生素也控制人和动物中的细菌感染。因此，转基因
作物中抗生素抗性基因的存在所伴随的健康和环境的潜在风险引起了大 量忧虑。因此，人们主要关心可以清除选择性标记基因，特别是抗生素标 记基因，同时将感兴趣的基因保持在转基因植物中的方法。
已经对一定数量的复杂程度或高或低的技术进行了描述，以用于清除 整合入染色体的选择性标记基因。如果标记基因未遗传连接于感兴趣基 因，人们可以希望通过杂交和后代分析清除该基因。当选择性标记为遗传
连接时，可采用其它技术，如基于釆用转座因子(PCT/US91/04679; Yoder 等，1993)或采用位点特异性重组系统如Pl噬菌体的c //ox系统或酵母 FLP/FRT系统(FliPase重组酶；Lyzrik等，1997)的技术。
通过其转运肽将编码靶向叶绿体的CRE蛋白的第二种转基因引入该 植物的核基因组中(EP1218488)，位点特异性重组也已应用于清除转质体标 记基因，。
在莱茵衣藻中，基于光合突变体的选择方法使得不用抗生素选择性标 记基因如aa^L4将感兴趣的外来基因引入质体基因组成为可能。然而，这 些方法不可用于高等植物，因为它们基于光合突变体的存在。
作为质体基因组转化基础的双同源重组现象也可用于随后清除部分 转基因，尤其是选择性标记。描述了衣藻(Fischer等，1996)和烟草(WO 01/81600)中这种清除的原理。所用技术由用含有取向相同的感兴趣基因和 其边界是两个相同DNA序列的选择性标记基因的核酸序列转化质体基因 组组成，所述两个相同DNA序列的长度足以激活同源重组系统。通过在 对应于所用选择性标记基因的第一种选择培养基上培养对转化事件进行 选择。在选择培养基中增殖愈伤组织，以获得所有质体基因组含有选择性 标记基因和感兴趣基因的同质植物。随后在非选择性培养基中培养植物及 其后代，以消除选择性标记基因。
在拟南芥中已经使用了对己经清除标记基因的植株进行选择的系统， 但它涉及核基因组的转化(WO 01/96583)。在这种方法中，用在阳性选择性 标记基因和阴性选择性标记基因周围含有取向相同的两个拷贝的感兴趣 基因的载体转化植物。阳性选择性标记基因能够选择将转基因掺入其基因 组的事件。存在两个拷贝的感兴趣基因使得可能通过同源重组清除这两种 (阳性和阴性)选择性标记基因，同时清除两个拷贝感兴趣基因中的一个拷 贝。然后，通过在阴性选择性标记上培养选择已经经过这种同源重组的事 件，阴性选择性标记能阻止仍然含有相应选择性标记基因的细胞生长。这 种阴性选择性标记基因的例子是CooL4(大肠杆菌(&c/zen'cWa co/0胞嘧啶脱 氨酶)，它使5-氟胞嘧啶(非毒性)脱氨形成有毒的5-氟尿嘧啶。
在本申请内容中，作者成功开发了一种方法，其包括在质体转化过程 中选择已清除标记基因的植株。此方法能够可靠地获得存在感兴趣基因和 不存在选择性标记(特别是抗生素选择性标记)的同质事件。该方法也具 有以下优点感兴趣基因的表达与标记基因的清除有关并依赖于标记基因 的清除，以及这种清除在重组期间除了感兴趣基因以外不会留下任何其它 外源性DNA。该方法也有以下显著优点当感兴趣基因的表达提供了选择 性特征时，促进或加速感兴趣基因存在同质植物的生产。例如，当感兴趣 的基因是耐受除草剂如异嚼唑草酮、草甘膦或草胺膦(Basta)的基因时，就 是这种情况。
图1:质粒pCLT146的图谱 发明详述
本发明主题是获得不含选择性标记，特别是抗生素选择性标记的转质 体植物的方法，所述方法至少包括以下步骤
a) 用适合转化质体的载体转化至少一个植物细胞，所述载体在转录方
向上包含对应于感兴趣嵌合基因的5'部分的序列(i)、包含编码对选择剂
产生抗性的选择性标记的序列的嵌合基因(ii)、与序列(i)的3'部分相同的n 个核苷酸的片段(iii)、对应于感兴趣嵌合基因的其余3'部分的序列(iv);
b) 在含有选择剂的第一种培养基上培养包含转化质体的细胞；
c) 在不含选择剂的第二种培养基上培养细胞。
应理解，按照本发明，上述方法的步骤a)所用载体不包含完整形式的 感兴趣的嵌合基因。
术语"完整形式的感兴趣的嵌合基因"或"完整的感兴趣的嵌合基因" 指感兴趣的基因的非截短序列。
在具体实施方式
中，n代表至少25个核苷酸，优选至少30个，优选 至少50个核苷酸。
术语"适用于转化植物的载体"可以指(例如)包含用于与植物质体组同 源重组的两个区域的转化载体，这两个区域形成如本发明所述的遗传构建 物或构建物的边界。
定位于所述基础嵌合基因上游(LHRR)和下游(RHRR)的这些区域，能 够与含毗连LHRR和RHRR区的质体组的基因间区进行双同源重组。
优选地，本发明的两个同源重组区对应于能够将嵌合基因整合入质体 组基因间区的毗连序列。在具体实施方式
中，此区域对应于质体组核糖体 RNA操纵子的区域。在另一具体实施方式
中，此基因间区包括编码Rubisco 大亚基的rbcL基因的3，末端和包括编码乙酰基-CoA-羧化酶的亚基的accD 基因的5'末端的另一个同源序列。此外，更具体说，此基因间区包括对应 于普通烟草Petit Havana变种(W. to6acwm cv. Petit Havana)质体组的核苷酸 57755-59297的编码Rubisco大亚基的r6cL基因的3，末端，，另一同源序列 包括对应于普通烟草Petit Havana变种质体组的核苷酸59298-60526的 accD基因的5'末端，。
术语"感兴趣嵌合基因的其余3'部分"指序列(i)和序列(iv)在转录方向 上并列重建了整个感兴趣的嵌合基因。
术语"感兴趣的嵌合基因"指一种核苷酸序列，其包含在质体中有功能 的调控启动子序列、编码感兴趣蛋白的序列和在植物细胞质体中有功能的 终止子，它们在转录方向上彼此功能性连接。
术语"包含编码选择性标记的序列的嵌合基因"指一种核苷酸序列，其 包含在质体中有功能的调控启动子序列、编码选择性标记的序列和在植物 细胞质体中有功能的终止子，它们在转录方向上彼此功能性连接。
术语"嵌合基因"通常指其中某些元件不存在于天然基因中，但取代了 天然基因中存在的元件或加入了某些元件的基因。
本发明所用术语"嵌合基因"也可对应于天然基因中存在所有基因元 件的情况，或者，术语"基因"可对应于嵌合基因。
也可存在其作用在于提高转化基因的表达或功能的其它元件，如内含
子、增强子、聚腺苷酸化序列和衍生物，以提高基因表达。
术语"彼此功能性连接"指所述嵌合基因元件以彼此相连的方式使它 们的功能协调且能表达编码序列。例如，当能确保所述编码序列表达时， 将启动子与编码序列功能性连接。构建本发明嵌合基因和其各种元件的装
配可用本领域技术人员熟知的技术完成，具体如Sambrook等(1989,《分 子克隆实验室手册》(Molecular Cloning: A Laboratory Manual), Nolan C. 编辑,，New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)所述技术。组成嵌合 基因的调控元件的选择主要取决于它们必须在其中起作用的植物和质体 的类型，本领域技术人员能够选择在给定植物中起作用的调控元件D
在植物细胞的质体中有功能和可用于实施本发明的启动子中，可以提 及(例如)编码PSII的Dl蛋白的基因的启动子(Staub等，1993，EMBO Journal 12(2): 601-606)或核糖体RNA操纵子Prrn的组成性启动子(Staub 等，1992， PlantCell 4: 39-45)或与烟草r^L基因5'非翻译区的5'部分结 合的烟草Prrn启动子(Svab等，1993，尸roc. AW/. Jcad 90: 913-917)。 通常，衍生自植物质体组基因或细菌基因的任何启动子都合适，本领域技 术人员能够在可获得的各种启动子中作出合适的选择，以获得所需表达方 法(组成型或诱导型)。
在植物细胞的质体中有功能的终止子中，可以提及(例如)戸W基因的 终止子、编码Rubisco大亚基的AcL基因或编码烟草核糖体蛋白的 基因(Shinozaki等，1986; Staub等，1993)。
包含编码选择性标记的序列的嵌合基因可用于选择有效转化的质体 和细胞，即将嵌合基因掺入其质体组的质体和细胞。通过在含有选择剂的 培养基上培养转化的细胞或组织选择转化子。
常用的选择性标记基因包括编码对抗生素、除草剂或其它化合物有抗 性的基因的基因，这些物质可能对不表达抗性基因或等位基因的细胞、细 胞器或组织是致命的。那么，选择剂是相应的抗生素、除草剂或选择性化 合物。如果所述物质对细胞是致命的，那么在这种培养基上只有转化细胞 能存活并发展，而非转化细胞会死亡。如果选择剂对细胞不致命，就根据 可能显示出的不同行为区分转化细胞和非转化细胞。
选择性标记可能在细胞水平不致命，但在细胞器水平致命。例如，抗 生素壮观霉素在质体中，而非胞质中抑制mRNA翻译成蛋白质。含有非抗
性质体的组织会发白，而含有抗性质体的组织为绿色。在含有转化质体和 非转化质体的分裂细胞中，对转化质体有利的是，在选择压力下非转化质 体会消失，可获得仅含转化质体的细胞群体。
术语"选择性标记基因"指编码选择性标记的基因，或编码选择性标记 的嵌合基因。
在可采用的编码选择性标记的基因中，可以提及抗生素壮观霉素-链 霉素和卡那霉素的抗性基因，例如，编码氨基糖苷3"-腺苷转移酶的嵌合 基因^W(Svab等，1993)和编码新霉素磷酸转移酶的"eo(Carrer等，1993)， 还有甜菜醛耐受基因，如编码甜菜醛脱氢酶的基因(Daniell等，2001)，还 有除草剂耐受基因，如双丙氨膦耐受基因bar基因(White等，19卯，Nucleic Acids Res. 18(4):1062)，或草甘膦耐受基因基因(美国5,188,642)。 也可采用编码易于鉴定的酶如GUS酶((3-葡糖醛酸糖苷酶)(Staub等，1993) 或GFP(绿色荧光蛋白)(Sidorov等，1999)的报道基因，或编码色素或在转 化细胞中调节色素产生的酶的基因。专利申请WO 91/02071 、 WO 95/06128、 WO 96/38567、 WO 97/04103和WO 01/64023中具体描述了这 些基因。
优选地，编码选择性标记的基因是抗生素抗性基因。编码选择性标记 的优选基因是编码对链霉素和壮观霉素产生抗性的氨基糖苷3"-腺苷转移 酶的flflt/j基因(Svab等，1993)。
根据本发明，包含编码选择性标记的序列的嵌合基因的任一侧与同一 感兴趣嵌合基因的两个片段相接，使得这两个片段在转录方向上的并列重 建了感兴趣的嵌合基因。这两个片段是对应于感兴趣嵌合基因的5'部分的 序列(i)和对应于感兴趣嵌合基因的其余3'部分的序列(iv)。此外，与序列(i) 的3'部分相同的n个核苷酸的片段存在于包含编码选择性标记的序列的嵌 合基因(ii)和对应于感兴趣嵌合基因的其余3'部分的序列(iv)之间。此n个 核苷酸的片段对应于感兴趣基因的第一个片段的3'端，其侧接于包含编码 选择性标记的序列的嵌合基因的5'端，且此片段在感兴趣基因的第二个片 段的5'端上重复，其侧接于包含编码选择性标记的序列的嵌合基因的3， 端。依此方式，感兴趣基因的n个核苷酸的直接重复序列框定了包
化侧接于编码选择性标记的嵌合基因的两个相同片段间同源重组系统的 大小。这两个相同片段之间的同源重组引起包含编码选择性标记的序列的
嵌合基因的切除，和n个核苷酸的两个相同片段之一的切除，并引起感兴
趣的完整和功能性嵌合基因的重建，随后该嵌合基因可在细胞中表达。 可用本领域技术人员熟知的技术进行本发明构建，具体说，如
Sambrook等(1卿，《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)， Nolan C.编，New York: Cold Spring Harbor Laboratory
Press)所述。也可用常规化学合成技术完全或部分地合成或产生。
直接重复序列是重复的核酸序列，其重复序列与原始序列的取向相 同，而不是反向。
优选地，在包含编码选择性标记的序列的嵌合基因任一侧的重复序列 是至少有50个核苷酸的序列，更优选至少有100个核苷酸。
根据本发明，术语"转质体植物"t旨将质体，特别是叶绿体中有功能的 嵌合基因稳定整合入其质体组的植物。质体组由除核以外的细胞器的基因 组，特别是叶绿体基因组组成。
可通过转化植物细胞的任何方法转化细胞。在可用于获得本发明转化 细胞的转化方法中， 一种方法由将待转化的植物细胞或组织与聚乙二醇 (PEG)和转化载体相接触组成(Chang禾B Cohen， 1979， Mo/. Gew. 168(1)， 111-115; Mercenier和Chassy， 1988， Biochimie 70(4)， 503-517)。 电穿孔是另一种方法，它由将电场施加于待转化的细胞或组织组成 (Andreason禾口 Evans ， 1988， 说'ofcc/2m々we51 6(7)， 650-660; Shigekawa禾口 Dower， 1989， Aust， J.胸ec/wo/. 3(1)， 56-62)。另一种方法由直接通过 显微注射将载体注射入细胞或组织组成(Gordon和Ruddle， 1985， Gene 33(2)， 121-136)。也可通过土壤杆菌G4gra6flcto7'ww)种的细菌进行植物细 胞或组织的转化，优选用经遗传修饰的根癌土壤杆菌(A ^me,c,era)(Knopf， 1979， Sw6ce〃.说'oc/ze肌6， 143-173; Shaw等，1983， Gene 23(3):315-330)或毛根土壤杆菌04. W2/z0ge"e力(Bevan和Chilton， 1982， Gen". 16:357-384; Tepfer禾口 Casse陽Delbart， 1987， A//cra6,o/. Sc/. 4(1)， 24-28)感染所述植物的细胞或组织，从而允许T-DNA特异性耙向质 体。优选地，按照Ishida等所述方法(1996， 5/Wec/z"o/. 14(6)， 745-750)用根癌土壤杆菌(^gro6acten^w ^we/ac/era)转化植物细胞或组织。
根据本发明方法的优选实施方式，将采用称为粒子轰击或生物射弹法 的方法。该方法由用吸附有本发明载体的颗粒轰击组织组成(Bruce等， 1989，扁.Jcfld园86(24)， 9692-9696; Klein等，1992， 所otec/z"o/ogy 10(3)， 286-291;美国专利号4,945,050)。
转化后，用含有对应于所用选择性标记基因的选择剂的第一培养基进 行选择步骤，该步骤能够选择将外源性DNA整合入质体基因组的转化事 件。例如，如果基因用作选择性标记基因，所用的选择培养基将含 有壮观霉素和/或链霉素。在维持此壮观霉素和/或链霉素选择的情况下， 能够在此培养基上生长的物质会增殖和/或再生，从而获得在所有质体基因 组中含有外源性DNA的组织或植物。
在后续步骤中，将第一培养基上选择的细胞或组织置入称为非选择性 培养基的第二培养基中，从而能够清除编码选择性标记的基因并通过重复 序列之间的重组获得感兴趣的完整的功能性基因。可通过检测细胞对选择 剂的敏感性，和/或检测感兴趣基因的表达，和/或采用分子生物学技术如 Southern印迹型杂交和PCR技术来证明是否清除了选择性标记。
术语"非选择性培养基"指不含选择剂的培养基。
本领域技术人员熟知所用的培养基，尤其是Gamborg等(1968， Exptl Cell Res 50， 151陽158)和Murashige等(1962， Physiologia Plantarum 15，
473-497)所述的培养基。
"感兴趣的完整的功能性基因"指能够表达并编码肽或功能性蛋白质 的感兴趣基因。此外，根据本发明，它是通过同源重组切除编码选择性标 记的基因后重建的基因。
感兴趣基因可以是引入植物的任何基因，从而赋予其具体优势。
根据本发明的具体实施方式
，感兴趣基因编码产生不同于选择性标记 所提供特征的选择性特征的肽或蛋白质。
在此具体实施方式
中，通过在含有对应于感兴趣嵌合基因的选择剂的 培养基上进行额外选择的步骤，可有益地改进获得本发明转质体植物的方 法。
额外选择步骤可与本发明方法的步骤c)一起进行，然后在不含对应于 选择性标记的选择剂和含有对应于感兴趣嵌合基因的选择剂的培养基上 培养细胞。
或者，在不含对应于选择性标记的选择剂的培养基上进行培养步骤之 后，在含有对应于感兴趣嵌合基因的选择剂的培养基上进行选择步骤。
在所有情况下，这种在含有对应于感兴趣嵌合基因的选择剂的培养基 上的额外选择步骤是在含有对应于选择性标记的选择剂的第一培养基上 的选择步骤(b)之后进行的。
在此具体实施方式
中，获得不含选择性标记，尤其是抗生素选择性标 记的转质体植物的方法至少包括以下步骤
a) 用适合转化质体的载体转化至少一个植物细胞，所述载体在转录方 向上包含对应于产生不同于选择性标记所提供特征的选择性特征的感兴 趣嵌合基因的5'部分的序列(i)、包含编码对选择剂产生抗性的选择性标记 的序列的嵌合基因(ii)、与序列(i)的3'部分相同的n个核苷酸的片段(iii)、
对应于感兴趣嵌合基因的其余3'部分的序列(iv);
b) 在含有对应于选择性标记的选择剂的第一培养基上培养包含转化
质体的细胞；
c) 在不含对应于选择性标记的选择剂和含有对应于感兴趣嵌合基因
的选择剂的第二培养基上培养细胞。
应理解，按照本发明，上述方法步骤a)所用的载体不含完整形式的感 兴趣嵌合基因。
在另一具体实施方式
中，在步骤b)和步骤c)之间进行步骤b')，此步 骤b')由在既不含对应于标记基因的选择剂、也不含对应于感兴趣嵌合基因 的选择剂的第三种培养基上培养细胞组成。
术语"产生选择特征的感兴趣嵌合基因"指编码产生特定特征的肽或 蛋白质的感兴趣基因，使得能够通过对应于此特定特征的选择剂的方式选 择表达此肽或此特定蛋白质的细胞或质体。这种基因通常是对植物细胞致 命的化合物的抗性基因。
通常，可采用能够在植物细胞上对所述植物细胞的致命性化合物产生 抗性的任何基因或基因类群。此外，对所述化合物的抗性可由通过修饰其 结构使所述化合物解毒组成，所述修饰导致所述化合物致命作用的消除。
在这种情况下，感兴趣基因通常编码解毒酶。解毒酶的例子是对溴苯腈或
basta耐受的酶(EP242 236， EP337 899)。抗性也可由对所述化合物的耙点 脱敏而产生的抗性组成。在这种情况下，感兴趣基因通常编码修饰的功能 靶点，通过突变、添加或缺失特定氨基酸的方式修饰其肽结构使其对所述 化合物不敏感。对除草剂或其活性代谢物敏感性较低的功能酶的例子是草 甘膦-耐受酶(EP293 356， Padgette S.R.等，J. S/(9丄.， 266,33， 1991; FR 2 736 926)。抗性也可由敏感酶的过度表达组成，从而使得从此酶对除 草剂的动力学常数来看在植物中产生足量的靶酶，，从而具有足量的功能 酶，尽管存在抑制剂。
根据本发明的优选实施方式，产生选择性特征的感兴趣嵌合基因是除 草剂抗性基因。
更优选地，产生选择性特征的感兴趣嵌合基因编码羟基苯基丙酮酸双 加氧酶(HPPD)。
羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)是催化对羟基苯基丙酮酸(HPP)转化 为尿黑酸的反应的酶(CrouchN.R等，Tetrahedron, 53， 20， 6993-7010， 1997)。
术语"HPPD"指具有HPPD活性的任何天然、突变或嵌合的HPPD酶。 文献中描述了许多HPPD，具体是细菌如假单胞菌(i^^fow朋ay)(Riietschi 等，五""肠cAem.， 205， 459-466， 1992， WO 96/38567)、植物如拟南芥 (WO 96/38567， Genebank AF047834)或胡萝卜(WO 96/38567， Genebank 87257)、 Cocc/co咖(Genebank COITRP)或哺乳动物如人、小鼠或猪的 HPPD。
本发明所用术语"突变的HPPD"指与对应天然HPPD相比通过突变获 得耐受HPPD-抑制性除草剂的特性更高的HPPD。突变的HPPD宜为C末 端部分突变的HPPD，如专利申请WO 99/24585所述。突变的HPPD宜包 含突变W336，如专利申请WO 99/24585所述。
术语"嵌合HPPD"指含有来自各种HPPD的元件的HPPD，具体是专 利申请WO 99/24586所述的嵌合HPPD。
HPPD宜为荧光假单胞菌(尸化wc/omo"oy ^/7womsce"力HPPD (WO 96/38567)。
而且，抑制此酶的某些分子(连接于该酶以抑制HPP转化为尿黑酸)
是已知的。 一些这种分子可用作除草剂，它们抑制植物中的反应，导致所 处理植物的叶被漂白、所述植物死亡(Pallett K.E.等，1997尸e幼'c. 50 83-84)。本领域所述的这种以HPPD为耙点的除草剂尤其是异嗯唑(EP418 175、 EP 470 856、 EP 487 352、 EP 527 036、 EP 560 482、 EP 682 659、 US 5 424 276)，具体是对玉米有选择性的除草剂异恶唑草酮(IFT); 二酮腈 (diketonitrile)或DKN(EP 496 630， EP 496 631),具体是2-氰基-3-环丙基 -l-(2-S02CH3-4-CF3苯基)丙垸-1,3- 二酮禾卩2-氰基-3-环丙基 -l-(2-S02CH3-4-2,3-Cl2-苯基)丙垸-l,3-二酮；三酮(EP 625 505， EP 625 508， US 5,506,195)，具体是磺草酮或甲基磺草酮；或者吡唑啉酸(pyrazolinates)。
根据本发明的另一优选实施方式，产生选择性特征的感兴趣嵌合基因 编码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)。
EPSPS是参与莽草酸生物合成途径的质体酶，导致合成芳族氨基酸。 已知EPSPS是膦酰基甲基甘氨酸类型的膦酸家族的除草剂的耙酶。
己知编码在天然情况下耐受膦酰基甲基甘氨酸家族除草剂(具体是草 甘膦)或以此形式使用的EPSPS的序列。例如，编码耐受性EPSPS酶的基 因，可以提及鼠伤寒沙门菌(Sa/mo"e〃a (y/^/mw/"m)的」ra^基因的序列 (Comai等，1983， Science 221， 370-371)、 土壤杆菌04grakzcfe〃'wm)的C尸4 基因的序歹i」(WO 92/04449)或编码矮牵牛花(Shah等，1986， Sc/ee 233， 478-481)、番茄(Gasser等，1988， /5z'o/. C7zem. 263， 4280-4289)或牛筋草 (WO 01/66704)的EPSPS的基因序列。
也已知编码经过突变对草甘膦耐受的EPSPS的序列。例如，可以提 及编码细菌来源(Stalker等，1985， J说o/. Ozem. 260(8)， 4724-4728)或植 物来源(EP 0293358; Ruff等，1991，尸/滅96(S), Abstract 592; WO 91/04323; WO 92/06201; EP 0837944)的突变EPSPS的基因序列。
根据本发明另一优选实施方式，产生选择性特征的感兴趣嵌合基因是 ter基因，它产生对除草剂如草胺膦(Basta)的抗性(Lutz等，2001)。
根据本发明，通过重组切除选择性标记基因，这种切除可以重建完整 的感兴趣嵌合基因，随后该基因可表达并产生有功能的感兴趣蛋白质。在 含有能使此肽或此蛋白的产生赋予选择性优势的物质的培养基上培养转 化的细胞或组织，从而选择表达感兴趣基因的质体。在细胞分裂时，未切 除选择性标记的质体在选择压力下将消失，有利于(选择)切除了选择性标 记的质体，与不进行基于感兴趣基因的重建而选择时相比，可以更迅速地 获得存在感兴趣基因和不存在选择性标记的同质细胞群体。
术语"同质植物、细胞或组织"指仅含转化质体组的植物、细胞或组织， 即不含任何野生型质体的植物、细胞或组织。
本发明也涉及在转录方向上包含以下部分的遗传构建或构建物
对应于感兴趣嵌合基因的5'部分的序列(i)，
包含编码选择性标记的序列的嵌合基因(ii)，
与序列(i)的3'部分相同的n个核苷酸的片段(iii)，
对应于感兴趣嵌合基因的其余3'部分的序列(iv)。
应理解，根据本发明所述遗传构建或构建物不含完整的感兴趣嵌合基 因。切除包含编码选择性标记的序列的嵌合基因后重建此完整的感兴趣嵌 合基因。
本发明涉及在转录方向上包含以下部分的遗传构建或构建物对应于
感兴趣嵌合基因的5'部分的序列(i)、包含编码选择性标记的序列的嵌合基 因(ii)、与序列(i)的3'部分相同的n个核苷酸的片段(iii)、对应于感兴趣嵌 合基因的其余3'部分的序列(iv)，序列(ii)的位置5'中不存在所述序列(iv)。 根据本发明具体实施方式
，构建物在转录方向上包含，对应于编码产 生不同于选择性标记所提供特征的选择性特征的肽或蛋白质的感兴趣嵌 合基因的5'部分的序列(i)、包含编码选择性标记的序列的嵌合基因(ii)、与 序列(i)的3'部分相同的n个核苷酸的片段(iii)，和对应于感兴趣嵌合基因 的其余3'部分的序列(iv)。
应理解，根据本发明，所述构建物不含完整的感兴趣嵌合基因。 实际上，序列(iv)因此对应于编码产生不同于选择性标记所提供特征 的选择性特征的肽或蛋白质的感兴趣嵌合基因的其余3'部分。序列(i加勺5， 位置中不存在序列(iv)。
根据优选实施方式，感兴趣基因是除草剂抗性基因。 更优选地，感兴趣嵌合基因编码羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)，编 码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，或编码基因。
本发明也涉及产生构建物的方法，所述方法至少包括以下步骤 a) 将含有编码选择性标记的嵌合基因的序列(ii)引入编码感兴趣嵌合
基因的序列，
b) 在对应于感兴趣嵌合基因的其余3'部分的序列(iv)的5'位置中复制 位于对应于位于序列(ii)5'位置的感兴趣嵌合基因5'部分的序列(i)的3'位置 的n个核苷酸片段(iii)。
本发明也涉及可通过上述方法获得的构建物。
本发明也涉及适用于转化植物质体的转化载体，其特征是它包含本发 明构建物。
本发明主题也是可通过上述方法之一获得的含有感兴趣基因且不含 抗生素选择性标记的转质体植物细胞。
本发明主题也是可通过上述方法之一获得的含有感兴趣基因且不含 抗生素选择性标记的转质体植物或这些植物的一部分，以及这些植物的后 代。
分子生物学技术参见Ausubel(编)，《新编分子生物学实验指南》 (C群e"f尸ratoco/s M /ecw/or伤o/ogy)， John Wiley & Sons Inc. (1994): Maniatis T.， Fritsch E.F.和Sambrook J,《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)， Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor,NY (1989)。用Perkin Elmer GeneAmp PCR系统9600装置进行PCR 反应。用30个循环的过程进行各个样品的扩增反应，每个循环包括以下 步骤变性步骤94°C l分钟，配对步骤50-60°C45秒(取决于所用引物)， 延伸步骤72°C l-2分钟(取决于所扩增的PCR产物的大小)。这些循环之 前是94'C持续5分钟的变性步骤，之后是最终延伸步骤72'C5分钟。30 个循环后4'C保存。用琼脂糖凝胶分离PCR产物。
按照Shinozki等1986提出并在Genebank登录号Z00044下重复的编 号方法表示衍生自普通烟草(McW/a"fl totoci/m)质体组的各种DNA片段的 位置。
通过下面的实施例更具体地说明了本发明，应理解，这些实施例没有 限制性。
实施例l:用于清除标记基因的质体转化载体的构建
质粒pCLT146含有嵌合基因AADA-146和两个不完整的嵌合 HPPD-146基因，其边界是两个DNA片段一"RHRR"(右侧同源重组区)禾口 "LHRR"(左侧同源重组区)，这有利于将这些盒整合入烟草质体基因组的 n^L-flccZ)区。LHRR片段对应于编码Rubisco大亚基的Ac丄基因的3，端， RHRR片段对应于accD基因的5'端，专利FR 2848568-A1中对它们进行 了描述。
质粒pCLT146在转录方向上包含对应于感兴趣嵌合基因/^;7J的5， 部分的序列(i)HPPD-146a，包含编码选择性标记的序列的嵌合基因 (ii)AADA-146，包含与序列(i)3'部分相同的序列(iii)的片段HPPD-146b和 对应于感兴趣嵌合基因/2/7/^的其余3'部分的序列(iv)。
自5'-3'来看，嵌合基因AADA-146由核糖体RNA操纵子的启动子 ("尸/777"，普通烟草质体组的核苷酸102 564-102 680)、 Ac丄基因的5'转录 和非翻译区的一部分("5Wci:"，普通烟草质体组的核苷酸57 577-57 594)、 其产物能产生壮观霉素抗性的a"fl^基因的编码序列(Svab和Maliga， 1993) 和r戸M基因终止子('Tr戸76"，普通烟草质体组的核苷酸4930-50卯)组成。 其两侧侧接有两个不完整的嵌合基因HPPD-146a和HPPD-146b。 HPPD-146a位于AADA-146的5'端，在5'-3'方向上包含戸M基因启动子 ("尸/wW， FR 2848568-Al)和荧光假单胞菌的/7p/^基因的5'端(W0 98/02562;序列1;核苷酸l-579)(图1)。 HPPD-146b位于AADA-146的3， 端，在5，-3'方向上包含与HPPD-146a的3'端相同且对应于/zp/^基因编码 区的核苷酸177-579的序列(iii)，和对应于/^;%/基因编码序列的其余3'部 分(核苷酸580-1077)和；^v^基因终止子('？'/75M"， FR 2848568-Al)的序 歹U(iv)。 AADA-146盒两侧作为直接重复存在的相同序列(iii)使得能够通过 同源重组清除嵌合标记基因AADA-146和重建完整的感兴趣嵌合基因 HPPD國146。
实施例2:用生物射弹法转化烟草质体基因组
在无菌条件下在添加维生素Gamborg B5 (Kalys M231-l)和蔗糖(30 g/1) 的MS培养基(Murashige T.和Skoog R ， 1962)上培育普通烟草Petit Havana 变种。按照Finer等(1992)所述技术用"PIG"(颗粒流入枪)在下表面上轰击 3-5 cm的叶片。在存在CaCl2(0.8-l M)和亚精胺(14-16 mM)的条件下将金
微粒(0.6pm的微粒)与DNA(5吗/发射)复合。然后放下轰击的叶片，使轰 击的下表面位于补充有0.05 mg/1 a-萘乙酸(NAA; Sigma)、 2 mg/1 6-节基氨 基嘌呤(BAP; Sigma)、 30 g/1蔗糖和7 g/1植物琼脂的MS培养基(MS 0.05-2 培养基)上。轰击后2-3天，将轰击的叶片切成5 mm见方的方块(如专利 FR2848568-A1所述)，仍然以下表面朝下的方式放在含有500 mg/1 二盐酸 壮观霉素的MS 0.05-2培养基上。在相同培养基上再生对壮观霉素有抗性 的愈伤组织和芽，使其在含有1/2 MS、 15 g/1蔗糖和500 mg/1壮观霉素的 培养基上生根，以获得TO植株(对应于第一个再生循环，称为R1)。为了 促进清除过程，在不含选择剂的MS 0.05-2培养基上进行第二个再生循环。 使再生芽(称为R2事件)在含有WMS、 15 g/1蔗糖和各种浓度的DKN的培 养基上生根。将TORI和T0R2植株转移到温室中。第一代种子(获自TORI 或T0R2植株)是T1代。
实施例3: CLT146转质体品系的产生和分子分析
在实施例2所述的实验条件下用pCLT146质粒轰击普通烟草(Petit Havana变种)叶片。最初在壮观霉素(500 mg/l)上进行转化的愈伤组织的选 择的第一个步骤(参见实施例2)。在20次发射的实验后获得13个壮观霉素 耐受事件(CLT146-1至-13)。
用PCR在13个耐受事件中鉴定转质体品系，通过设计特定引物鉴定 嵌合基因AADA-146和HPPD-146是否整合入质体组。经过选择，使一条 引物与整合点邻近的天然质体基因组杂交，而另一条引物与嵌合基因杂 交。选择以下引物ORBCL52(5，-atgtcaccacaaacagagactaaagc-3')和 psbA176R(5，-catcagggactcccaagcacactag -3，)，它们分别与质f本组上的Ac丄 基因(核苷酸57595-57620)和嵌合基因HPPD-146的尸，M启动子杂交。仅 在转质体品系中观察到大小对应于预计片段的PCR产物，在非轰击野生型 烟草植株中没有观察到这种产物。通过pCLT146转化获得的这13个壮观 霉素耐受事件都显示出，嵌合基因插入了烟草质体组。
通过PCR分析验证转质体事件中存在两个嵌合基因。分别杂交于 aaW 基因编码区的 5'禾B 3' 端的引物 OAAN5(5，-gaagcttccatggcagaagcggtgatcgccgaag-3，) 禾口 OAAXba3(5，-actagttctagattatttgccgactaccttggtgatctcgcc-3')"(吏个寻會巨够在所有CLT146转质体事件中扩增784 bp PCR产物。杂交于恰好在序列(iii)上游的 序列(i)的HPPD+(5 ，-caacagcatcgcctcctactttgcg-3')和杂交于序列(iii)的3 ，端 的HPPD-(5'-ttcacggaagttgaacaatttctcg-3，)的引物对能够从总DNA中扩增两 种预计的PCR产物对应于含有被嵌合基因AADA-146打断的嵌合基因 HPPD-146的转质体组的1876 bp的DNA片段和对应于序列(iii)的373 bp 的PCR产物。
可通过PCR用分别结合于P;wW启动子和3'"M终止子的寡核苷酸 对 psbA230F(5，-tttgtagaaaactagtgtgcttggg國3，) 禾n 3'psbA
(5，-ttgctcctttcttttcaaaacctcc-3，)证明同源重组产生的标记基因清除现象。观察 到两种PCR产物对应于含有被AADA-146基因打断的嵌合基因 HPPD-146的转质体组的2689 bp的DNA片段和对应于可能通过同源重组 清除了嵌合基因AADA-146并重建/^;^基因的转质体组的1186 bp的PCR 产物。
实施例4:清除CLT146转质体品系中的选择性标记基因并评价转质 体品系的体外DKN耐受
在含有壮观霉素的培养基上初步选择整合有嵌合基因AADA-146的 转质体事件。将壮观霉素上再生的各T0R1转质体植物的叶片切碎，放置 在不含选择剂的MS 0.05-2再生培养基上大约一个月。后一步骤能够再生 不仅在细胞分裂过程中通过同源重组清除了转基因质体组AADA-146,而 且获得重建和有功能的嵌合/z;;/^基因的转质体植物(T0R2)。然后通过移植 在含有1 ppm DKN的生根培养基上对各种品系的T0R2转质体小植株的耐 受性进行体外评价。对于所测试的各转质体品系而言，不像野生型植株， 一些小植株对1 ppmDKN完全耐受。这些植株保持绿色、能够生长并正常 生根。没有观察到植物毒性症状。
实施例5: TORI转质体植物的Tl后代对DKN的耐受
从自花授粉的TORI转质体植物收集约500粒对应于Tl代的 CLT146-1、 -2、 -3事件的种子，将其种在含有10 ppm DKN的MSI/21/2 萌发培养基中。获得具有正常绿色表型的小植株并因此获得其中嵌合基因 AADA-146已被清除的质体。
实施例6: CLT146转质体植物的Western印迹分析出于检测清除后重建的HPPD蛋白的目的，在变性条件下用丙烯酰胺
凝胶分离获自野生型以及CLT146-1和-2转质体烟草植株(TO)的叶片的蛋 白质提取物，转移到硝酸纤维素膜上，与荧光假单胞菌HPPD特异性单克 隆抗-HPPD第一抗体一起孵育。Western印迹分析显示出CLT146提取物中 存在一个大约40 kDa的条带，此大小与纯化的参比HPPD蛋白相同，在 野生型烟草蛋白质提取物中没有发现此条带。
Western印迹分析和DKN-耐受测试证明，通过同源重组，已经清楚地 发生了 aflcM标记基因的清除，导致在CLT146转质体品系中产生重建和有 功能的HPPD蛋白。
实施例7: TO和Tl代的CLT146转质体植物的Southern印迹分析
总基因组DNA分离自野生型烟草、TO代的CLT146事件(CLT146-1 和CLT146-2)、衍生自CLT146-1和146-2的Tl代植株的叶片，这些植株 是在体外根据它们对除草剂DKN的良好耐受性选择的(T1S la、 lb、 lc、 2a、 2b和2c)，总基因组DNA也分离自衍生自CLT146-1和CLT146-2的 Tl代植株(T1SR)，这些植株是在体外根据它们对除草剂DKN的良好耐受 性选择，然后在存在所述除草剂的条件下下第二次再生的。
用Sacl和Xhol酶消化基因组DNA，在琼脂糖凝胶上分离，然后转移 到硝酸纤维素膜上。然后，用覆盖在aadA基因选择盒两侧重复的hppd重 复区(核苷酸177-579)的P32-标记的放射性探针杂交此膜。
放射性自显影照片显示，正如所料，野生型烟草提取物没有信号。对 于TO代的2个事件(CLT146-1和CLT146-2)，观察到两条主要条带(2.5 kb 和4.7 kb)，对应于所有构建物元件整合入重组质体组时所预计的两个片 段。此时还观察到一条强度较弱的条带(5.7 kb)，它对应于两个重复hppd 片段的重组。在某些Tl代植株(如CLT146-2b和CLT146-2d)中，仅在除草 剂DKN存在下第二次再生的植物(T1SR)中观察到存在P1探针检测到的单 一条带。这对应于在所述除草剂存在下在体外第二次再生的植物中已完全 清除标记基因，它来自Tl代。
实施例8: T1和T2代植株的分子分析以及T2代植株的表型分析
提取由野生型烟草、CLT146-2事件(T0代)以及CLT146-2d和 CLT146-2c植株(TlSR代；体外再生的植株)的幼苗产生的10-20株小植株
的DNA，并用PCR分析，以采用最灵敏的方法验证可能残留的aadA标记 基因拷贝。所用弓l物(5，-gaagcttccatggcagaagcggtgatcgccgaag-3，禾口 5'-ttatttgccgactaccttggtgatctcgcc-3，)使其能够在aadA基因存在的条件下扩增 784 bp片段。
此分析明确显示出CLT-146-2事件的后代中存在aadA基因。另一方 面，在CLT146-2c和CLT146-2d植株后代中没有检测到信号，这表明T2 代中完全清除了标记基因。
体外表型分析显示，由CLT146-2b、 CLT146-2c和CLT146-2d植株后 代获得的小植株100%对壮观霉素敏感，并且100%对除草剂DKN有抗性。
这些结果显示了从T2代或者甚至是T1代中完全和迅速地有效清除标 记基因。
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1.一种获得不含选择性标记的转质体植物的方法，所述方法包括以下步骤a)用适合转化质体的载体转化至少一个植物细胞，所述载体在转录方向上包含对应于感兴趣嵌合基因的5’部分的序列(i)，包含编码对选择剂产生抗性的选择性标记的序列的嵌合基因(ii)，与序列(i)的3’部分相同的n个核苷酸的片段(iii)，对应于感兴趣嵌合基因的其余3’部分的序列(iv)；b)在含有所述选择剂的第一种培养基上培养包含转化质体的细胞；c)在不含所述选择剂的第二种培养基上培养所述细胞。
2. 如权利要求1所述获得不含选择性标记基因的转质体植物的方法，其特征在 于，所述序列(i)对应于产生不同于选择性标记所提供特征的选择性特征的感兴趣嵌 合基因的5'部分，并且其中步骤c)中所用的第二种培养基还含有对应于感兴趣嵌合 基因的选择剂。
3. 如权利要求2所述获得不含选择性标记的转质体植物的方法，其特征在于， 所述方法在步骤b)和步骤c)之间包括一个额外步骤，所述步骤由在既不含对应于选 择性标记的选择剂、也不含对应于感兴趣嵌合基因的选择剂的第三种培养基上培养 包含转化质体的细胞组成。
4. 如权利要求1-3中任一项所述的方法 生抗生素抗性。
5. 如权利要求1-4中任一项所述的方法 码氨基糖苷3-腺苷转移酶。
6. 如权利要求1-3中任一项所述的方法 生甜菜醛抗性。
7. 如权利要求1-6中任一项所述的方法 生除草剂抗性的蛋白质。
8. 如权利要求1-7中任一项所述的方法 基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)。
9. 如权利要求1-7中任一项所述的方法 烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)。
10. 如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述感兴趣基因是6w其特征在于，所述选择性标记基因产 其特征在于，所述选择性标记基因编 其特征在于，所述选择性标记基因产 其特征在于，所述感兴趣基因编码产 其特征在于，所述感兴趣基因编码羟 其特征在于，所述感兴趣基因编码5- 基因。
11. 一种构建物，其在转录方向上包含 对应于感兴趣嵌合基因的5'部分的序列(i)，包含编码选择性标记的序列的嵌合基因(ii)， 与序列(i)的3'部分相同的n个核苷酸的片段(iii)， 对应于感兴趣嵌合基因的其余3'部分的序列(iv)。
12. 如权利要求ll所述的构建物，其特征在于，所述序列(i)对应于编码产生不 同于选择性标记所提供特征的选择性特征的蛋白质或肽的感兴趣嵌合基因的5，部 分。
13. —种适合转化植物质体的转化载体，其特征在于，所述转化载体包含权利 要求11或12所述的构建物。
14. 一种含有感兴趣基因且不含选择性标记的转质体植物细胞，所述细胞可通 过权利要求1-10中任一项所述的方法获得。
15. —种含有感兴趣基因且不含选择性标记的转质体植物或此植物的一部分以 及此植物的后代，其可通过权利要求1-10中任一项所述的方法获得。
全文摘要
本发明涉及不含选择性标记基因的转质体植物、获得这种植物的方法和所用载体。
文档编号A01H5/00GK101098966SQ200680001710
公开日2008年1月2日 申请日期2006年1月3日 优先权日2005年1月5日
发明者G·提索特, J·-M·费吕略, M·杜巴尔德 申请人:拜尔农科股份有限公司