专利名称：选择性制备1－磷酸化糖衍生物端基异构体的方法和制备核苷的方法
背景技术：
1.发明领域本发明涉及制备1-磷酸化糖衍生物的方法。1-磷酸化糖广泛分布在自然界中，是许多酶的反应底物，是被利用为制备有用物质如药品和营养食品的原料。已预期合成的1-磷酸化糖衍生物用作制备药品如抗病毒制剂和酶抑制剂的原料。
本发明还涉及制备用作医药如抗病毒药、抗癌药和抗致敏药的原料或药物物质的核苷化合物。
2.现有技术的描述已知制备1-磷酸化糖的方法，例如1)1-溴代糖和磷酸银盐的缩合反应(J.Biol.Chem.，Vol.121，P.465(1937)；J.Am.Chem.Soc.，Vol.78，P.811(1956)；J.Am.Chem.Soc.，Vol.79，P.5057(1957))；2)1-卤代糖和二苄基磷酸的三乙胺盐的缩合反应(J.Am.Chem.Soc.，Vol.77，P.3423(1955)；J.Am.Chem.Soc.，Vol.80，P.1994(1958)；J.Am.Chem.SoC.，Vol.106，P.37851(1984)；J.Org.Chem.，Vol.59，P.690(1994))；3)1-乙酰化糖和正磷酸的热缩合反应(J.Org.Chem.，Vol.27，P.1107(1962)；Carbohydrate Res.，Vol.3，P.117(1966)；Carbohydrate Res.，Vol.3，P.463(1967)；Can.J.Biochem.，Vol.50，P.574(1972))；4)二苄基磷酸和在1-位通过酰亚胺化活化的糖的缩合(Carbohydrate Res.，Vol.61，P.181(1978)；Tetrahedron Lett.，Vol.23，P.405(1982))；5)用氯化二苄基磷处理用醇亚铊或醇锂在1-位活化的糖(Carbohydrate Res.，Vol.94，P.165(1981)；Chem.Lett.，Vol.23，P.405(1982))；6)利用核苷磷酸化酶的反应磷酸解核苷以形成1-磷酸化糖衍生物(J.Biol.Chem.，Vol.184，P.437(1980))。
这些方法具有下面的缺点。
在上述1)-5)的化学方法中普遍的问题是难于建立制备所需的具有良好选择性的异构体的一般合成方法，这是因为由于和1-位相邻的官能团的影响，α/β端基异构体之间的端基异构体选择性的变化造成的。为了达到选择性和好的收率，2-乙酰氧基或乙酰氨基的存在是必需的。但是，既然2-脱氧糖不稳定，这些合成方法可以被限制到相当窄的应用范围。由此，难于控制端基异构体的选择性，而需要柱色谱纯化，导致差的收率(Chem.Zvesti，Vol.28(1)，P.115(1974)；Izv.Akad.Nauk SSSR，Ser.Khim.，Vol.8，P.1843(1975))。
当然，没有化学制备1-磷酸化的2-脱氧呋喃糖的报道，该糖比1-磷酸化2-脱氧吡喃糖更不稳定，导致更难于控制选择性。
在第6)项中，制备核苷本身是困难的，除了相当有限类型的核糖核苷例如肌苷之外。因此，可以制备有限类型的1-磷酸化糖衍生物如核糖-1-磷酸酯(phosphate)。此外，既然核苷本身作为原料是昂贵的，那么该方法在成本方面是不令人满意的。
如上所述，术语“核苷磷酸化酶”是能够在磷酸存在下磷酸解核苷中的N-苷键的酶的通称，磷酸催化由下面的反应式表示的反应核苷+磷酸(盐)→碱基+1-磷酸化糖衍生物可一般归入嘌呤核苷磷酸化酶和嘧啶核苷磷酸化酶这两组的酶广泛分布在自然界中。它们存在于哺乳动物、鸟和鱼、酵母和细菌中。酶反应是可逆的，已公开了许多利用逆反应合成各种核苷的方法。从1-磷酸2′-脱氧核糖和核酸碱基合成胸苷(胸腺嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤)(JP-A01-104190)，2′-脱氧腺苷(JP-A11-137290)或2′-脱氧鸟苷(JP-A11-137290)。
而且，Agric.Biol.Chem.，Vol.50(1)，pp.121-126(1986)描述了一种方法，其中通过在磷酸存在下，使用来自产气杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶进行反应，肌苷被分解成为1-磷酸核糖和次黄嘌呤，使用离子交换树脂分离前者，也用来自产气杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶处理1，2，4-三唑-3-甲酰胺来制备作为抗病毒制剂的利巴韦林。
但是，如上所述，还没有建立制备1-磷酸化糖衍生物的工业方法，由此也没有建立利用核苷磷酸化酶的逆反应制备通用的核苷的工业方法。
而且，既然利用酶的逆反应由1-磷酸化糖衍生物和碱基形成核苷的反应是可逆的，有转化率不能提高的技术缺点。
发明概述本发明的目的是提供一种制备1-磷酸化糖衍生物的高度通用的和端基异构体选择性的方法，该方法不受糖骨架如呋喃糖和吡喃糖不同的影响，不受是否存在取代基如脱氧糖的影响或不受糖类型即天然糖或合成糖的影响。
本发明另一个目的是提供通过用核苷磷酸化酶处理1-磷酸化糖衍生物和核酸碱基，制备核苷的高度通用的方法和提高反应中核苷转化率的方法。
换句话说，本发明根本的目的是提供通过达到上述第一和第二目的，制备高纯度和低成本的核苷的方法。
我们已非常努力以达到第一目的。最后，我们发现1-磷酸化糖衍生物在一定条件下和1-磷酸化糖衍生物的端基异构体以及二聚物存在着平衡，调节该条件以仅使所需的端基异构体作为晶体沉淀，以便平衡可以向优选的方向转移，以提供所需的具有好的选择性和高收率的端基异构体。由此，基于这些发现，我们完成了本发明。
具体地说，本发明包括下面的实施方案。
(1)选择性制备1-磷酸化糖衍生物单体的α或β异构体的方法，该方法包含磷酸解和异构化1-磷酸化糖衍生物的端基异构体混合物，得到1-磷酸化糖衍生物单体的α和β异构体，和选择性结晶这些异构体的一种以取代这些端基异构体之间的平衡的步骤。
(2)选择性制备1-磷酸化糖衍生物单体的α或β异构体的方法，该方法包含磷酸解和异构化由式(1)表示的1-磷酸化糖衍生物的端基异构体混合物的步骤 其中，R1和R2独立地表示氢，甲基，被保护的羟甲基或被保护的羧基；R3表示酰基；R4表示羟基的保护基；X表示卤素，烷氧基或烷硫基；W表示氧或硫；Z表示氧，硫或任选取代的碳；m表示1-3的整数；n表示0或1；p和q表示0-4的整数；和r表示0或1；条件是，当Z是氧或硫时，p、q、r和n满足p+r≤n+1和q≤2×(n+1)-2×(p+r)和当Z是碳时，p+r≤n+2和q≤2×(n+2)-2×(p+r)的条件，得到1-磷酸化糖衍生物单体的α和β异构体，和选择性结晶这些异构体的一种以取代这些端基异构体之间的平衡。
(3)制备由式(3)表示的1-磷酸化糖衍生物单体的方法 其中R1和R2独立地表示氢，甲基，羟甲基或羧基；R3表示氢或酰基；和X、W、Z、n、p、q和r是如式(1)定义的，该方法包含磷酸解和异构化由式(1)表示的1-磷酸化糖衍生物的端基异构体混合物，得到1-磷酸化糖衍生物单体的α和β异构体；选择性结晶这些异构体的一种以取代这些端基异构体之间的平衡；然后除去由R4表示的保护基团的步骤。
(4)由式(4)表示的1-磷酸化糖衍生物的三聚物、二聚物或单体或其盐 其中R1和R2独立地表示氢，甲基，用取代的苯甲酰基保护的羟甲基或被保护的羧基；R4表示氢或羟基的保护基；和R3、X、W、Z、m、n、p、q和r是如式(1)定义的。
(5)由式(5)表示的1-磷酸化糖衍生物单体或其盐 其中p和q表示0-3的整数；r表示0或1；和R1、R2、R3、R4、X、W和Z是如式(1)定义的；条件是当Z是氧或硫时，p、q和r满足p+q+r≤3和当Z是碳时，p+q+r≤5的条件。
(6)由式(6)表示的1-磷酸化糖衍生物单体或其盐 其中R1和R2独立地表示氢，甲基，羟甲基或羧基；R3、X、W、Z、n、p、q和r是如式(1)定义的。
(7)由式(7)表示的1-磷酸化糖衍生物单体或其盐 其中p和q表示0-3的整数；r表示0或1；和R1、R2、R3、R4、X、W和Z是如式(1)定义的；条件是当Z是氧或硫时，p、q和r满足p+r≤1，q≤2-2×(p+r)和当Z是碳时，p+r≤2，q≤4-2×(p+r)的条件。
(8)制备由式(20)表示的1-磷酸化糖的方法 其中R11表示被保护的羟甲基和R14表示羟基的被保护基，该方法包含在碱(base)的存在下，用磷酸处理由式(18)表示的化合物的步骤 其中R11和R14如上定义，得到由式(19)表示的1-磷酸化糖衍生物的端基异构体混合物 其中R11和R14如上定义，m是如权利要求2定义的；磷酸解和异构化该混合物；和通过选择性结晶形成的α-异构体，取代端基异构体间的平衡。
(9)制备2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸酯的方法，该方法包含在碱存在下，用磷酸处理式(18)表示的化合物 其中R11表示被保护的羟甲基和R14表示羟基的保护基，得到式(19)表示的1-磷酸化糖衍生物的端基异构体混合物 其中R11和R14是如上定义的，m是如权利要求2定义的；磷酸解和异构化该混合物；通过选择性结晶形成的α-异构体，取代端基异构体间的平衡，得到α-异构体；然后除去保护基。
我们经过努力研究达到了第二个目的，由此形成了一个高度通用的制备核苷的方法，该方法通过利用广泛分布在自然界中的核苷磷酸化酶的逆反应以及结合上述制备1-磷酸化糖衍生物的方法而得到的。我们进一步发现能够和磷酸根离子形成水不溶性盐的金属阳离子可以存在以使反应中作为副产物的磷酸根离子作为水不溶性盐沉淀出来，结果反应平衡向生产核苷的方向移动，由此提高反应收率。由此，我们完成了本发明，提供了一种制备高纯度和低成本核苷的方法。
基于上述发现的本发明包括下面的实施方案。
(10)一种制备式(8)表示的核苷的方法 其中B是碱基，独立地选自嘧啶、嘌呤、氮嘌呤(azapurine)和去氮嘌呤，其任选地被卤素、烷基、卤代烷基、链烯基、卤代链烯基、炔基、氨基、烷基氨基、羟基、羟基氨基、氨氧基(aminoxy)、烷氧基、巯基、烷基巯基、芳基、芳氧基或氰基取代；且R1、R2、R3、X、W、Z、n、p、q和r是如式(1)定义的，该方法包含第一步，上述(3)中制备1-磷酸化糖衍生物单体，包括磷酸解和异构化1-磷酸化糖衍生物的端基异构体混合物的步骤，得到1-磷酸化糖衍生物单体的α和β异构体；选择性结晶这些异构体的一种以取代这些端基异构体之间的平衡；然后除去由R4表示的保护基团；和第二步，在核苷磷酸化酶的作用下，第一步获得的1-磷酸化糖衍生物的磷酸根基团和碱基进行交换反应。
(11)一种制备式(9)表示的核苷的方法 其中B是如式(8)定义的；R1、R2、R3、R4、X、W、Z、n、p、q和r是如式(1)定义的，该方法包含在核苷磷酸化酶的作用下，上述(6)中1-磷酸化糖衍生物单体的磷酸根基团和碱基的交换反应。
(12)一种制备式(10)表示的核苷的方法 其中B是如式(8)定义的；R1、R2、R3、R4、X、W、Z、p、q和r是如式(1)定义的，该方法包含在核苷磷酸化酶的作用下，上述(7)中1-磷酸化糖衍生物单体的磷酸根基团和碱基的交换反应。
(13)一种制备式(21)表示的核苷的方法 其中B是如权利要求11中式(8)所定义的，该方法包含第一步，制备上述(12)中的2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸酯，其中R1是羟甲基，R2是氢，p和r是0，X是氟；和第二步，在核苷磷酸化酶的作用下，第一步获得的1-磷酸化糖衍生物的磷酸根基团和碱基进行交换反应。
在上述(10)-(13)的实施方案中，核苷磷酸化酶可以是选自下列的至少一种嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.1)、鸟嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.15)、嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2)、尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.3)、胸苷磷酸化酶(EC2.4.2.4)和脱氧尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.23)。
使用表达至少一种核苷磷酸化酶的微生物来获得核苷磷酸化酶活性，所述核苷磷酸化酶选自嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.1)、鸟嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.15)、嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2)、尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.3)、胸苷磷酸化酶(EC2.4.2.4)和脱氧尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.23)。
在上述(10)-(13)的实施方案中，在核苷磷酸化酶的作用下，1-磷酸化糖衍生物单体的磷酸根基团和碱基进行交换反应的过程中，能够和磷酸根离子形成水不溶性盐的金属阳离子可以存在于反应溶液中。
在上述(10)-(13)的实施方案中能够和磷酸根离子形成水不溶性盐的金属阳离子可以是至少一种选自钙、钡、铝和镁离子的金属阳离子。
而且，本发明包括由式(11)-(13)和式(20)任一表示的化合物。
即，本发明还包括不是天然产生的由式(11)表示的合成核苷或其盐 其中B、R1、R2、R3、R4、X、W、Z、n、p、q和r是如式(1)和(8)定义的，不包括三氟胸苷、利巴韦林、乳清酸核苷、尿嘧啶阿拉伯糖苷、腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-甲基腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-氯-次黄嘌呤阿拉伯糖苷、硫代鸟嘌呤阿拉伯糖苷、2，6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、鸟嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胸苷、依诺他滨、吉西他滨、叠氮胸苷、碘苷、双脱氧腺苷、双脱氧肌苷、双脱氧胞苷、双脱氢脱氧胸苷、硫杂双脱氧胞苷、sorivudine、5-甲基尿苷、三氮唑核苷、硫代肌苷、呋氟尿嘧啶、doxifluridine、布雷青霉素、水松蕈素、别嘌醇尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、2′-氨基尿苷、2′-氨基腺苷、2′-氨基胍、2-氯-2′-氨基肌苷、DMDC和FMDC。
不是天然产生的由式(12)表示的合成核苷或其盐 其中B、R1、R2、R3、R4、X、W、Z、n、p、q和r是如式(1)和(8)定义的，不包括三氟胸苷、利巴韦林、乳清酸核苷、尿嘧啶阿拉伯糖苷、腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-甲基腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-氯-次黄嘌呤阿拉伯糖苷、硫代鸟嘌呤阿拉伯糖苷、2，6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、鸟嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胸苷、依诺他滨、吉西他滨、叠氮胸苷、碘苷、双脱氧腺苷、双脱氧肌苷、双脱氧胞苷、双脱氢脱氧胸苷、硫杂双脱氧胞苷、sorivudine、5-甲基尿苷、三氮唑核苷、硫代肌苷、呋氟尿嘧啶、doxifluridine、布雷青霉素、水松蕈素、别嘌醇尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、2′-氨基尿苷、2′-氨基腺苷、2′-氨基胍、2-氯-2′-氨基肌苷、DMDC和FMDC；式(13)表示的核苷或其盐 其中B、R1、R2、R3、R4、X、W、Z、n、p、q和r是如式(1)和(8)定义的，不包括三氟胸苷、利巴韦林、乳清酸核苷、尿嘧啶阿拉伯糖苷、腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-甲基腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-氯-次黄嘌呤阿拉伯糖苷、硫代鸟嘌呤阿拉伯糖苷、2，6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、鸟嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胸苷、依诺他滨、吉西他滨、叠氮胸苷、碘苷、双脱氧腺苷、双脱氧肌苷、双脱氧胞苷、双脱氢脱氧胸苷、硫杂双脱氧胞苷、sorivudine、5-甲基尿苷、三氮唑核苷、硫代肌苷、呋氟尿嘧啶、doxifluridine、布雷青霉素、水松蕈素、别嘌醇尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、2′-氨基尿苷、2′-氨基腺苷、2′-氨基胍、2-氯-2′-氨基肌苷、DMDC和FMDC；和式(20)表示的1-磷酸化糖及或其盐 其中R11和R14是如式(18)定义的。
优选实施方案的详细描述下面详细描述本发明。
用于本发明的糖包括但不限于衍生自D-和L-型天然单糖的残基，包括6-脱氧糖如岩藻糖、鼠李糖、毛地黄毒素糖、齐墩果糖和异鼠李糖，己糖如阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖和塔罗糖，戊糖如核糖、阿拉伯糖、木糖和来苏糖，丁糖如赤藓糖和苏糖，氨基糖如葡糖胺和daunosamine，糖醛酸如葡糖醛酸和半乳糖醛酸，酮糖如阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖和pentulose，和脱氧糖如2-脱氧核糖；衍生自合成吡喃糖和呋喃糖的残基；和上述任何残基中的羟基和/或氨基被保护或酰化的糖残基衍生物或具有卤化糖残基的糖，其中羟基被卤素如氟取代。
本发明中，1-磷酸化糖衍生物是指其中残基衍生自天然或合成单糖的糖衍生物，1-羟基是磷酸化的。除非另外说明，它可以包括单体、二聚物或三聚物或其混合物，对其混合比例没有限制。
就“被保护的羟甲基”和“羟基的保护基”而论的保护基是指可通过适当的化学方法例如氢解、水解和光解除去的基团，包括甲酰基、酰基、甲硅烷基、烷基、芳烷基、羰基，优选甲酰基、脂族酰基、芳族酰基、甲硅烷基、烷氧烷基、卤化的烷基、芳烷基、烷氧羰基和芳烷氧羰基。
脂族酰基可以是烷基羰基和卤化的低级烷基羰基。
烷基羰基的实例包括乙酰基、丙酰基、丁酰基、异丁酰基、戊酰基、新戊酰、戊酰基、异戊酰基、辛酰基、壬基羰基、癸基羰基、3-甲基壬基羰基、8-甲基壬基羰基、3-乙基辛基羰基、3，7-二甲基辛基羰基、十一烷羰基、十二烷羰基、十三烷羰基、十四烷羰基、十五烷羰基、十六烷羰基、1-甲基十五烷羰基、14-甲基十五烷羰基、13，13-二甲基十四烷羰基、十七烷羰基、15-甲基十六烷羰基和十八烷羰基。
卤代低级烷基羰基的实例包括氯乙酰基、二氯乙酰基、三氯乙酰基和三氟乙酰基。
芳族酰基可以是芳基羰基、卤化的芳基羰基、低级烷基化的芳基羰基、低级烷氧基化的芳基羰基、硝化芳基羰基、低级烷氧羰基化的芳基羰基或芳化的芳基羰基。
芳基羰基的实例包括苯甲酰基、α-萘甲酰基和β-萘甲酰基。
卤化的芳基羰基的实例包括2-氟苯甲酰基、3-氟苯甲酰基、4-氟苯甲酰基、2-氯苯甲酰基、3-氯苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、2-溴苯甲酰基、3-溴苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、2，4-二氯苯甲酰基、2，6-二氯苯甲酰基、3，4-二氯苯甲酰基和3，5-二氯苯甲酰基。
低烷基化的芳基羰基的实例包括2-甲苯甲酰、3-甲苯甲酰、4-甲苯甲酰和2，4，6-三甲基苯甲酰基。
低级烷氧基芳基羰基的实例包括2-茴香酰基、3-茴香酰基和4-茴香酰基。
硝化芳基羰基的实例包括2-硝基苯甲酰基、3-硝基苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基和3，5-二硝基苯甲酰基。
低级烷氧羰基化的芳基羰基的实例包括2-(甲氧基羰基)苯甲酰基。芳化的芳基羰基的实例包括4-苯基苯甲酰基。
甲硅烷基可以是低级烷基甲硅烷基和芳基取代的低级烷基甲硅烷基。
低级烷基甲硅烷基的实例包括三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、异丙基二甲基甲硅烷基、叔-丁基二甲基甲硅烷基、甲基二异丙基甲硅烷基和三异丙基甲硅烷基。
芳基取代的低级烷基甲硅烷基的实例包括二苯基甲基甲硅烷基、二苯基异丙基甲硅烷基和苯基二异丙基甲硅烷基。
芳烷基可以是苄基、用低级烷基取代的芳烷基、用低级烷氧基取代的芳烷基、用硝基取代的芳烷基、用卤素取代的芳烷基或用氰基取代的芳烷基。
这些实例包括2-甲基苄基、3-甲基苄基、4-甲基苄基、2，4，6-三甲基苄基、2-甲氧基苄基、3-甲氧基苄基、4-甲氧基苄基、2-硝基苄基、3-硝基苄基、4-硝基苄基、2-氯苄基、3-氯苄基、4-氯苄基、2-溴苄基、3-溴苄基、4-溴苄基、2-氰基苄基、3-氰基苄基和4-氰基苄基。
芳烷氧基羰基可以是用低级烷基取代的芳烷氧基羰基、用低级烷氧基取代的芳烷氧基羰基、用硝基取代的芳烷氧基羰基、用卤素取代的芳烷氧基羰基或用氰基取代的芳烷氧基羰基。
这些的实例包括2-甲基苄氧基羰基、3-甲基苄氧基羰基、4-甲基苄氧基羰基、2，4，6-三甲基苄氧基羰基、2-甲氧基苄氧基羰基、3-甲氧基苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基、3-硝基苄氧基羰基、4-硝基苄氧基羰基、2-氯苄氧基羰基、3-氯苄氧基羰基、4-氯苄氧基羰基、2-溴苄氧基羰基、3-溴苄氧基羰基、4-溴苄氧基羰基、2-氰基苄氧基羰基、3-氰基苄氧基羰基和4-氰基苄氧基羰基。
烷氧基羰基可以是低级烷氧基羰基、用卤素取代的烷氧基羰基或用烷基甲硅烷基取代的烷氧基羰基。
低级烷氧基羰基的实例包括甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基、仲丁氧基羰基和叔-丁氧基羰基。
用卤素取代的烷氧基羰基的实例包括2，2，2-三氯乙氧基羰基。用烷基甲硅烷基取代的烷氧基羰基的实例包括2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基。
烷基可以是烷氧基烷基如甲氧乙基、乙氧甲基、2-甲氧乙基和2-甲氧乙氧甲基；卤化的烷基如2，2，2-三氯乙基；或用芳基取代的低级烷基如苄基、α-萘甲基、β-萘甲基、二苯基甲基和三苯基甲基。
其中，优选脂族酰基、芳族酰基和芳烷基；更优选4-甲苯甲酰基、4-氯苯甲酰基和苄基。就“被保护的羧基”中的R1和R2而论的保护基是指通过适当的化学方法如氢解、水解和光解而被除去的基团，包括优选低级烷基如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基；甲硅烷基化的低级烷基如2-(三甲基甲硅烷基)乙基和2-(三乙基甲硅烷基)乙基；或上述芳烷基或烷氧烷基，更优选甲基、叔丁基或苄基。
以X表示的卤素是指氟、氯、溴或碘。
以X表示的烷氧基和烷硫基可以是具有上述低级烷基、芳烷基或烷氧烷基的烷氧基和烷硫基，优选甲氧基、甲氧乙氧基或甲硫基。
用Z表示的任选取代的碳是指具有一个或两个由式(Xq和NHR3)表示的取代基的碳，或当不具有取代基时，具有氢原子的碳。
R3表示的酰基可以是上述脂族酰基、芳族酰基、烷氧羰基或芳烷氧羰基、或低级链烷磺酰基如甲磺酰基和三氟甲磺酰基或芳基磺酰基如苯磺酰基和对-甲苯磺酰基；优选脂族酰基、芳酰基或低级链烷磺酰基；具体地说，乙酰基、三氟乙酰基、苯甲酰基和甲磺酰基。当使用超过一种NHR3作为取代基时，在各个NHR3中的R3独立地是上述任一基团。
R4、R11和R14表示的“被保护的羟甲基”和“羟基的保护基”中的保护基可选自R1和R2所定义的那些。
具有由式(1)-(17)任一表示的结构的糖残基优选但不限于那些衍生自上述天然单糖的残基、上述那些衍生自合成糖的残基、来自糖残基的衍生物或卤化的糖残基，正如上面所述。
由式(4)-(7)任一表示的化合物的盐可以是那些通过化合物中的磷酸根基团形成的盐。该盐的实例包括碱金属盐如钠、钾和锂盐；碱土金属盐如镁、钙和钡盐；金属盐如铝和铁盐；铵盐；或烷基胺盐如伯、仲和叔烷基胺盐。
在此伯胺可以是烷基胺如甲胺、乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、己胺和辛胺；环烷基胺如环己胺；或苄胺。
仲胺可以是二烷基胺如二乙胺、二异丙基胺、二丁胺、二己胺和二辛胺；二环烷基胺如二环己基胺；或环胺如哌啶、吗啉和N-甲基哌啶(piperadine)。
叔胺可以是叔烷基胺如三甲胺、三乙胺、三丙胺、N-乙基二异丙胺、三丁胺、三己胺、三辛胺、N-乙基二环己胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉和N，N，N′N′-四甲基乙二胺；苯胺化合物如苯胺、N，N-二甲基苯胺、N，N-二乙基苯胺、N，N-二丁基苯胺和N，N-二辛基苯胺、吡啶化合物如吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，4，6-二甲基吡啶和烟酰胺；氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸和谷氨酸；或任选的活性胺如辛可尼丁、1-(1-萘基)乙胺和1-苯基乙胺，所有这些包括一价和二价盐。
本发明的由式(4)-(7)任一表示的化合物可吸收水分以具有吸收的水或成为水合物，它们都包括在本发明中。
可通过但不限于由反应式(I)表示的反应来制备本发明的1-磷酸化糖衍生物的端基异构体混合物反应式(I) 在该式中，R1、R2、R3、R4、X、W、Z、m、n、p、q和r是如式(1)定义的，Y表示氟、氯、溴或碘。当m是1、2或3时，分别得到磷酸三酯、磷酸二酯或磷酸单酯。这些分别称作1-磷酸化糖衍生物三聚物、1-磷酸化糖衍生物二聚物和1-磷酸化糖衍生物单体。而且，1-磷酸化糖衍生物三聚物、1-磷酸化糖衍生物二聚物和1-磷酸化糖衍生物单体共同称为1-磷酸化糖衍生物，对其混合比例没有限制。
优选的磷酸可以是但不限于具有低水分含量的磷酸如正磷酸。
对碱没有限定，只要它不抑制作为脱氧剂的反应和功能。优选的无机碱包括碱金属和碱土金属的碳酸盐和氢氧化物。优选的有机碱包括叔烷基胺、苯胺类、吡啶类和任选的活性胺。
当来自溶剂或添加剂的水分对反应有副作用时，可以使用脱水剂。对脱水剂没有限定，只要它具有充分的吸水性或和水的反应性；优选分子筛和五氧化二磷。
反应一般在溶剂存在下进行。对溶剂没有限定只要它在某种程度上不抑制反应和溶解原料。可以使用的溶剂包括脂族烃如己烷和庚烷；芳烃如苯、甲苯、二甲苯和茴香醚；卤代烃如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、二氯乙烷、氯苯和二氯苯；酯如甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸正丁酯和碳酸二乙酯；醚如二乙醚、二异丙醚、四氢呋喃、二噁烷、二甲氧乙烷和二甘醇二甲醚；腈如乙腈、丙腈和异丁腈；酰胺如甲酰胺、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮和N，N-二甲基-2-咪唑酮(imidazolydinone)；酮如丙酮、2-丁酮、甲基异丙基酮和甲基异丁基酮；和选自上述两种或多种的混合物。
对反应温度没有限定，一般是-80℃至60℃，优选-10℃至25℃。
完成反应的反应时间可以取决于许多因素如原料、试剂、溶剂的类型和反应温度，一般是1分钟-24小时，优选10分钟-2小时。
对糖衍生物(14)与磷酸的比例没有限定，反应一般在化合物(14)∶磷酸＝1∶10-3∶1的比例下进行。此时，产物(1)是其和磷酸偶合的糖残基数(即m)为1、2或3的化合物的混合物，这取决于化合物(14)∶磷酸的比例。
而且，可以通过由反应式(II)表示的反应制备α-或β-形式的1-磷酸化糖衍生物(16a)或(16b) 在该式中，R1、R2、R3、R4、X、W、Z、m、n、p、q和r是如式(1)定义的。
根据该制备方法，由式(15)表示的1-磷酸化糖衍生物可以是单体、二聚物或三聚物或其以任何混合比例的混合物，因为它们在反应系统中可以被转化为由式(16)表示的1-磷酸化糖衍生物。
优选的磷酸可以是但不限于水分含量低的磷酸，如正磷酸。
碱对在化合物(16)中和磷酸根基团形成盐以选择性结晶α-和β-化合物即(16a)或(16b)之一是重要的。根据用于反应中的溶剂可以选择最适合的碱，优选上述无机碱、叔烷基胺、苯胺类、吡啶、氨基酸和任选的活性胺，和形成的盐包括一价和二价盐。
当来自溶剂或添加剂的水分对反应有副作用时，可以使用脱水剂。对脱水剂没有限定，只要它具有充分的吸水性或和水的反应性；优选分子筛和五氧化二磷。
反应一般在溶剂存在下进行。对溶剂没有限定只要它在某种程度上不抑制反应，溶解原料和促进选择性结晶α-和β-形式，即(16a)或(16b)之一，该形式是通过在化合物(16)中的磷酸根基团形成盐产生的，溶剂包括上述脂族烃、芳烃、卤代烃、酯、醚、腈、酰胺、酮和选自其中的两种或多种的混合物。
对反应温度没有限定，只要它加速化合物(15)和(16)之间的平衡反应以促进选择性结晶α-和β-形式即(16a)或(16b)之一，该形式是通过在化合物(16)中的磷酸根基团形成盐产生的，一般是-80℃至60℃，优选-10℃至25℃。
完成反应的反应时间可以取决于许多因素如原料、试剂、溶剂的类型和反应温度，一般是3小时-1周，优选6小时-24小时。
对糖衍生物(1)与磷酸的比例没有限定，反应一般在化合物(1)∶磷酸＝1∶10-3∶1的比例下进行。此时，反应系统的pH一般是1-7，适合的是在1-4的酸性范围。
α-或β-形式的1-磷酸化糖衍生物(16a)或(16b)可以用不同于用于由盐交换反应产生的的反应系统中的碱作为磷酸盐分离出来。
在此使用的碱包括上述无机碱基、伯烷基胺、仲烷基胺、叔烷基胺、苯胺类、吡啶类、氨基酸和任选的活性胺，和形成的盐包括一价和二价盐。
通过反应式(III)可除去保护基以制备1-磷酸化糖衍生物(17a)或(17b)。反应式(III) 在该式中，R1、R2、R3、R4、X、W、Z、n、p、q和r是如式(1)定义的；R1′和R2′独立地代表氢、甲基、羟甲基或羧基；和R3′代表氢或酰基。
当使用上述脂族酰基、芳酰基或烷氧羰基作为R1和R2中的羟甲基或R4中的羟基的保护基时，或使用上述低级烷基作为化合物(16a)或(16b)的R1和R2中的羧基的保护基时，它可通过用在含水溶剂中的碱处理该化合物而被除去。可使用的碱优选包括碱金属碳酸盐如碳酸钠和碳酸钾；碱金属氢氧化物如氢氧化锂、氢氧化钠和氢氧化钾；氢氧化铵如氢氧化铵和氢氧化叔正丁基铵；和上述无机碱、伯烷基胺、仲烷基胺和叔烷基胺。
可使用的溶剂没有限制，包括通常用于水解中的溶剂；优选水；醇如甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇；和上述醚。反应温度和反应时间没有限制，随许多因素而变化，如原料和所使用的碱。反应一般可以在-10℃至100℃下进行1小时至5天。如果适当的话，通过调节反应温度、反应时间和试剂的当量值，保护基R3可以脱离或同时除去。
当使用上述芳烷基或芳烷氧基羰基作为R1和R2中的羟甲基或R4中的羟基的保护基时或使用上述芳烷基作为化合物(16a)或(16b)的R1和R2中的羧基的保护基时，例如可通过使用金属催化剂催化氢化除去它们。
催化剂可以优选选自钯-碳、阮内镍、氧化铂、铂黑、铑-铝氧化物、三苯基膦-氯化铑和钯-钡硫酸盐。对反应压力没有限制。一般来说，所用溶剂可以是任何通常用于水解的溶剂，没有限制。优选水，醇如甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇；和上述醚；和上述酯。反应温度和反应时间没有限制，随许多因素而变化，如原料和所使用的碱。反应一般可以在-10℃至100℃下进行1小时至5天。一般可以除去保护基R3。
当使用上述甲硅烷基作为R1和R2中的羟甲基或R4中的羟基的保护基时或使用上述甲硅烷基化的低级烷基作为化合物(16a)或(16b)的R1和R2中的羧基的保护基时，例如可通过使用产生氟化物阴离子的化合物如氟化叔正丁基铵除去它们。
对溶剂没有限制只要它不抑制反应，例如可使用上述醚。反应温度和反应时间没有限制，随许多因素而变化，如原料和所使用的碱。反应一般可以在-10℃至50℃下进行10分钟至10小时。一般可以除去保护基R3。
在除去任何保护基中，产物中的磷酸根基团，作为与存在于反应系统中的碱的盐得到。如果需要，该盐可以转化为与另一种碱基的盐。此时，所用碱可选自上述无机碱、伯烷基胺、仲烷基胺、叔烷基胺、苯胺类、吡啶类、氨基酸和任选的活性胺，和形成的盐包括一价和二价盐。
本文使用的1-磷酸化糖衍生物是糖或其衍生物，其中磷酸部分在1-位通过酯键偶合。
它可由式(6)具体表示 其中R1和R2独立地表示氢、甲基、羟甲基或羧基；R3、X、W、Z、n、p、q和r是如式(4)定义的。
典型的实例包括但不限于核糖-1-磷酸酯、2-脱氧核糖-1-磷酸酯、2，3-二脱氧核糖-1-磷酸酯和阿拉伯糖-1-磷酸酯，但可以使用任何衍生物而没有区别，只要它可通过任何上述高通用和端基异构体选择性的制备方法获得。
来自天然物质构成1-磷酸化糖衍生物的糖的实例包括但不限于戊醛糖如D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、L-来苏糖和D-核糖；戊酮糖如D-木糖、L-木糖和D-核酮糖；己醛糖如D-半乳糖、L-半乳糖、D-葡萄糖、D-塔罗糖和D-甘露糖；己酮糖如D-塔格糖、L-山梨糖、D-阿洛酮糖和D-果糖；脱氧糖如D-2-脱氧核糖、D-2，3-二脱氧核糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-鼠李糖、L-鼠李糖、D-吡喃岩藻糖(fucopyranose)、L-吡喃岩藻糖、D-鼠李呋喃糖、L-鼠李呋喃糖、D-阿洛甲基糖、D-异鼠李糖、D-antiallose、D-塔罗甲基糖、L-塔罗甲基糖、D-毛地黄糖、D-毛地黄毒素糖、D-磁麻糖、泰威糖、阿比可糖、泊雷糖、可立糖和ascarilose、氨基糖如葡糖胺和daunosamine；和糖醛酸如葡糖醛酸和半乳糖醛酸。
将描述制备本发明的核苷的方法。用在该方法中的碱基是天然或合成的碱基，选自嘧啶、嘌呤、氮嘌呤和脱氮嘌呤，它们可用卤素、烷基、卤代烷基、链烯基、卤代链烯基、炔基、氨基、烷氨基、羟基、羟氨基、氨氧基、烷氧基、巯基、烷巯基、芳基、芳氧基和/或氰基取代。
作为取代基的卤素的实例包括氯、氟、溴和碘。烷基的实例包括1-7个碳原子的低级烷基如甲基、乙基和丙基。卤代烷基的实例包括具有1-7个碳原子的烷基的那些如氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、溴甲基和溴乙基。链烯基的实例包括具有2-7个碳原子的那些如乙烯基和烯丙基。卤代烷基的实例包括具有2-7个碳原子的链烯基如那些如溴乙烯基和氯乙烯基。炔基的实例包括带有2-7个碳原子的那些如乙炔基和丙炔基。烷氨基的实例包括具有1-7个碳原子的烷基的那些如甲氨基和乙氨基。烷氧基的实例包括具有1-7个碳原子的那些如甲氧基和乙氧基。烷巯基的实例包括具有1-7个碳原子的烷基的那些如甲巯基和乙巯基。芳基的实例包括苯基；带有1-5个碳原子的烷基的烷基苯基如甲基苯基和乙基苯基；；带有1-5个碳原子的烷氧基的烷氧基苯基如甲氧基苯基和乙氧基苯基；带有1-5个碳原子的烷氨基的烷氨基苯基如二甲氨基苯基和二乙氨基苯基；和卤代苯基如氯苯基和溴苯基。
嘧啶碱基的实例包括胞嘧啶、尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶(胸腺嘧啶)、5-乙基胞嘧啶、5-乙基尿嘧啶、5-氟甲基胞嘧啶、5-氟甲基尿嘧啶、5-三氟胞嘧啶、5-三氟尿嘧啶、5-乙烯基尿嘧啶、5-溴乙烯基尿嘧啶、5-氯乙烯基尿嘧啶、5-乙炔基胞嘧啶、5-乙炔基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、嘧啶-2-酮、4-羟氨基嘧啶-2-酮、4-氨氧基嘧啶-2-酮、4-甲氧基嘧啶-2-酮、4-乙酰氧基嘧啶-2-酮、4-氟嘧啶-2-酮和5-氟嘧啶-2-酮。
嘌呤碱基的实例包括嘌呤、6-氨基嘌呤(腺嘌呤)、6-羟基嘌呤、6-氟嘌呤、6-氯嘌呤、6-甲氨基嘌呤、6-二甲基氨基嘌呤、6-三氟甲基氨基嘌呤、6-苯甲酰基氨基嘌呤、6-乙酰基氨基嘌呤、6-羟氨基嘌呤、6-氨氧基嘌呤、6-甲氧基嘌呤、6-乙酰氧基嘌呤、6-苯甲酰氧基嘌呤、6-甲基嘌呤、6-乙基嘌呤、6-三氟甲基嘌呤、6-苯基嘌呤、6-巯基嘌呤、6-甲巯基嘌呤、6-氨基嘌呤-1-氧化物、6-羟基嘌呤-1-氧化物、2-氨基-6-羟基嘌呤(鸟嘌呤)、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2-氨基-6-碘嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-巯基嘌呤、2-氨基-6-甲巯基嘌呤、2-氨基-6-羟氨基嘌呤、2-氨基-6-甲氧基嘌呤、2-氨基-6-苯甲酰氧基嘌呤、2-氨基-6-乙酰氧基嘌呤、2-氨基-6-甲基嘌呤、2-氨基-6-环丙基氨基甲基嘌呤、2-氨基-6-苯基嘌呤、2-氨基-8-溴嘌呤、6-氰基嘌呤、6-氨基-2-氯嘌呤(2-氯腺嘌呤)和6-氨基-2-氟嘌呤(2-氟腺嘌呤)。
氮嘌呤和脱氮嘌呤碱基的实例包括6-氨基-3-脱氮嘌呤、6-氨基-8-氮嘌呤、2-氨基-6-羟基-8-氮嘌呤、6-氨基-7-脱氮嘌呤、6-氨基-1-脱氮嘌呤和6-氨基-氮嘌呤。
核苷磷酸化酶是能够在磷酸存在下磷酸解核苷中的N-苷键的酶的通称，本发明利用其逆反应。用于反应中的酶可以是任何类型或来源的，只要它具有由相应的1-磷酸化糖衍生物和碱基形成所需的核苷的活性。酶一般归为两类，嘌呤和嘧啶型。嘌呤型酶的实例包括嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.1)和鸟嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.15)。嘧啶型酶的实例包括嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2)、尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.3)、胸苷磷酸化酶(EC2.4.2.4)和脱氧尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.23)。
在本发明中表达核苷磷酸化酶的微生物没有限制，可以是任何表达至少一种选自下述的核苷磷酸化酶的微生物嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.1)、鸟嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.15)、嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2)、尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.3)、胸苷磷酸化酶(EC2.4.2.4)和脱氧尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.23)。
优选的这样的微生物的实例包括属于诺卡氏菌属、细杆菌属、棒状杆菌属、短颈细菌属、单胞菌族、Flabobacterium、Kluyvere、细杆菌属、嗜血杆菌属、Micoplana、精蛋白杆菌属、念珠菌属、酵母属、杆菌属、嗜热杆菌、假单胞菌属、微球菌、哈夫尼菌属、变形杆菌属、弧菌属、葡萄球菌属、丙酸菌属、Sartina、游动球菌属、埃希氏杆菌属、库尔特氏杆菌属、红球菌属、不动杆菌属、黄杆菌属(Xanthobacter)、链霉菌属、根瘤菌属、沙门氏菌属、克雷白氏杆菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属、气单胞菌属、柠檬杆菌属、无色杆菌属、土壤杆菌属、节杆菌属和假诺卡氏菌属的菌株。
近年来的分子生物学和基因工程的进步允许我们分析分子生物特性、氨基酸序列以及在为从菌株获得蛋白质的基因的上述菌株中的核苷磷酸化酶的上述特性，以便构建重组质粒，其中插入基因和其表达所需的控制区域以便将质粒引入给定的宿主和产生表达蛋白质的基因重组菌株，这些方法已变得相对较容易。根据最近的技术水平，将其中的核苷磷酸化酶的基因引入给定的宿主的该基因重组菌株也包括在本发明的表达核苷磷酸化酶的微生物中。
在此表达所需的控制区域可以是启动子序列(包括控制转录的操纵基因序列)，核糖体结合序列(SD序列)，转录终止序列等。启动子序列的实例包括来源于大肠杆菌的色氨酸操纵子中的trp操纵基因；乳糖操纵子中的lac启动子；来源于λ噬菌体的PL和PR启动子；来源于枯草芽孢杆菌的葡糖酸合酶启动子(gnt)；碱性蛋白酶启动子(apr)；中性蛋白酶启动子(npr)和α-淀粉酶启动子(amy)。可以使用专门改性和设计的序列例如tac启动子。核糖体键合序列可以例如是来源于大肠杆菌或枯草芽孢杆菌的序列，但也可以使用任何序列，只要它在所需的宿主例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中起作用。例如，人们可以使用由DNA合成形成的共有序列，即和16S核糖体RNA中的3′-末端区域互补的有超过4个连续碱基的序列。不总是需要转录终止序列，但是可以使用不依赖于ρ-因子的终止子如脂蛋白终止子和trp操纵子终止子。希望在重组质粒上的这些控制区域可以顺序地排列如下从5′-末端上游、启动子序列、核糖体键合序列、核苷磷酸化酶编码基因和转录终止序列。
本文中的质粒的实例可以使用在大肠杆菌中具有自主复制区域的pBR322、pUC18、Bluescript II SK(+)、pKK223-3和pSC101；在枯草芽孢杆菌中具有自主复制区域的pUB110、pTZ4、pC194、ρ11、φ1和φ105，作为载体。在两个或更多的宿主中可自主复制的质粒的实例中，可以使用pHV14、TRp7、Yep7和pBS7，作为载体。
本文中给定的宿主典型地是，但不限于如后面实施例描述的大肠杆菌，但也可以使用其它菌株如包括枯草芽孢杆菌的枯草菌属属、酵母和放线菌属。
本发明的核苷磷酸化酶活性除了从上述具有酶活性的菌株获得外，还可以从显示酶活性的菌株的经加工的材料和其固定化产物获得。菌株经加工的材料可以是，例如丙酮干燥的菌株或通过适当的步骤如机械破坏、超声分裂、冷冻和解冻、加压和减压、渗透压方法、自溶、细胞壁分解和表面活性剂处理制备的细菌碎片。如果需要，可通过硫酸铵沉淀、丙酮沉淀或柱色谱法进一步纯化菌株。
本发明中，能够和磷酸根离子形成水不溶性盐的金属阳离子没有限制，可以是任何在反应中和磷酸根离子形成作为副产物的水不溶性盐的并可沉淀的金属阳离子，例如钙、镁、钡、铁、钴、镍、铜、银、钼、铅、锌和锂离子。其中，特别优选工业上通用的且安全的对反应没有副作用的金属离子，如钙、钡、铝和镁离子。
本发明中能够和磷酸根离子形成水不溶性盐的金属阳离子可以通过将带有至少一种阴离子的能够和磷酸根离子形成水不溶性盐的金属阳离子的盐加进反应溶液中而获得，所述阴离子选自氯离子、氮化物离子、碳酸根离子、硫酸根离子、醋酸根离子和氢氧根离子。这样的盐的实例包括氯化钙、氮化钙、碳酸钙、硫酸钙、醋酸钙、氯化钡、氮化钡、碳酸钡、硫酸钡、醋酸钡、氯化铝、氮化铝、碳酸铝、硫酸铝、醋酸铝、氢氧化钙、氢氧化钡、氢氧化铝、氢氧化镁、氯化镁、氮化镁、碳酸镁、硫酸镁和醋酸镁。
这样的金属阳离子可以在反应溶液中作为带有戊糖-1-磷酸的盐存在，例如核糖-1-磷酸钙盐、2-脱氧核糖-1-磷酸钙盐、2，3-二脱氧核糖-1-磷酸钙盐、阿拉伯糖-1-磷酸钙盐、核糖-1-磷酸钡盐、2-脱氧核糖-1-磷酸钡盐、2，3-二脱氧核糖-1-磷酸钡盐、阿拉伯糖-1-磷酸钡盐、核糖-1-磷酸铝盐、2-脱氧核糖-1-磷酸铝盐、2，3-二脱氧核糖-1-磷酸铝盐和阿拉伯糖-1-磷酸铝盐。
本发明中制备核苷化合物的反应可以在诸如适当的pH和温度以及在其控制范围内的条件下进行，这取决于目标核苷、1-磷酸化糖衍生物和作为底物的碱基、核苷磷酸化酶或表达作为反应催化剂的酶的活性的微生物以及为从反应系统除去磷酸而添加的金属盐的类型和特性，一般是在pH5-10，温度10-60℃下进行。如果pH不在控制范围内，由于例如目标产物或底物差的稳定性，酶活性降低和不能和磷酸形成水不溶性盐，反应转化率可能降低。如果pH在反应过程中变化，当需要时，可以在适当的时间添加酸如盐酸和硫酸或碱如氢氧化钠和氢氧化钾。1-磷酸化糖衍生物和碱基的浓度适合的是约0.1-1000mM。根据它们之间的摩尔比，碱基与1-磷酸化糖衍生物或其盐的摩尔比是1-10，根据反应转化率，优选0.95或更小。
添加的可以和磷酸形成水不溶性盐的金属盐可以和用于反应的1-磷酸化糖衍生物以0.1-10，更优选0.5-5的摩尔比添加。对盐的添加步骤没有限定，它可以在反应过程中一部分添加或分批添加。本发明主要用水作为溶剂，如果需要，也可以添加适当量的一般用于常用酶反应中的有机溶剂如醇和二甲亚砜。在较高浓度的反应中，作为底物的碱基或作为产物的核苷在反应溶液中可能不是完全溶解。本发明也适用于这样的情况。
通过常规步骤分离可以上述生产的核苷化合物，例如浓缩、结晶、溶解、电渗析以及使用离子交换树脂或木炭的附吸和解吸。
为了制备分析样品，将这些化合物转化为环乙胺盐，然后通过硅胶柱色谱纯化，从用甲醇-乙酸乙酯(1∶10)洗脱部分得到标题化合物(19)的两种端基异构体(19a)和(19b)。(19a)较小极性部分1H NMR(CDCl3，270MHz)d；8.0-7.8(m，8H)，7.4-7.2(m，8H)，6.06(m，1.2H)，5.98(m，0.8H)，5.56(m，1.2H)，5.41(m，0.8H)，4.7-4.3(m，6H)，2.6-2.4(m，1H)，2.75-2.6(m，2H)，2.5-2.3(m，2H)，2.2-1.9(m，2H)，1.8-1.6(m，2H)，1.6-0.9(m，8H)；MS(APCI)m/z 883(M-H).(19b)较大极性部分1H NMR(CDCl3，270MHz)d8.0-7.8(m，8H)，7.4-7.2(m，8H)，6.1-5.9(m，2H)，5.55(m，0.67H)，5.39(m，1.33H)，4.7-4.3(m，6H)，3.1-2.85(m，1H)，2.75-2.4(m，2H)，2.32(m，2H)，2.2-1.9(m，2H)，1.8-1.6(m，2H)，1.6-0.9(m，8H)；MS(APCI)m/z 883(M-H).
往49mL2-丁酮中的1.11g正磷酸的混合物中添加2.11g三-正丁胺和4.9g分子筛4A，在搅拌下冷却混合物至5℃。往混合物中添加4.9g3，5-O-双(4-氯苯甲酰基)-2-脱氧-α-D-核糖基氯(纯度85％)，搅拌该混合物10分钟，得到在2-丁酮中的标题化合物(18)和(19)的混合物的溶液[(18)∶(19)＝1∶4，α-型/β型的化合物(18)＝7/10]。
1H NMR(DMSO-d6，270MHz)d8.00(d，J＝8.6Hz，2H)，7.96(d，J＝8.6Hz，2H)，7.58(d，J＝8.6Hz，2H)，7.58(d，J＝8.6Hz，2H)，5.82(dd，J＝5.3，5.3Hz，1H)，5.36(d，J＝8.6Hz，1H)，4.6-4.3(m，3H)，4.7-3.5(br，6H)，2.7-2.6(m，2H)，2.55-2.4(m，1H)，2.25(d，J＝4.2Hz，1H)，1.85-1.75(m，4H)，1.7-1.6(m，4H)，1.55-1.45(m，2H)，1.25-0.9(m，10H)；MS(APCI)m/z 590(M+C6H14N).
1H NMR(D2O，270MHz)d5.56(s，1H)4.03(m，2H)，3.52(dd，J＝3.3，12.2Hz，1H)，3.41(dd，J＝5.3，12.2Hz，1H)，2.17(m，1H)，1.87(d，J＝13.9Hz，1H)；MS(APCI)m/z213(M-H)。
1H NMR(DMSO-d6，270MHz)d8.2-7.8(m，6H)，7.6-7.4(m，6H)，5.9-5.7(m，1H)，5.6-5.4(m，3H)，4.6-4.3(m，1H)，4.7-3.5(br，6H)，2.7-2.6(m，2H)，1.9-1.7(m，4H)，1.7-1.6(m，4H)，1.55-1.4(m，2H)，1.3-0.9(m，10H)；MS(APCI)m/z 745(M+C6H14N).
1H NMR(D2O，270MHz)d5.6(m，1H)4.2(m，1H)，4.1-4.0(m，2H)，3.75(m，1H)，3.7(m，1H)；MS(APCI)m/z229(M-H)。
1H NMR(DMSO-d6，270MHz)d8.2-7.8(m，2H)，7.6-7.4(m，2H)，5.9-5.7(m，1H)，5.6-5.4(m，1H)，4.6-4.3(m，1H)，4.7-3.5(br，6H)，2.7-2.6(m，2H)，1.9-1.7(m，8H)，1.7-1.6(m，4H)，1.55-1.4(m，2H)，1.3-0.9(m，10H)；MS(APCI)m/z 374(M+C6H14N).
1H NMR(D2O，270MHz) d5.2(m，1H)4.1-3.9(m，1H)，3.6-3.3(m，2H)，2.1-2.3(m，2H)，1.9-1.7(m，2H)；MS(APCI)m/z197(M-H)。
MS(APCI)m/z 745(M+C6H14N)。
1H NMR(D2O，270MHz)d5.3(m，1H)，3.95-3.3(m，5H)；MS(APCI)m/z229(M-H)。
1H-NMR(D2O)δ0.98-1.10(2H，m)，1.14-1.23(6H，m)，1.47-1.51(2H，m)，1.61-1.64(4H，m)，1.78-1.83(4H，m)，2.94-3.00(2H，m)，3.46-3.60(2H，m)，3.72-3.79(1H，m)，3.92-4.00(1H，m)，4.41-4.51(2H，m)，5.01-5.03 and5.22-5.24(total 1H，m)，5.64-5.72(total 1H，m)，7.24-7.30(5H，m)；MS(APCI)m/z390(M+C6H14N)+.
1H-NMR(D2O)δ0.99-1.06(2H，m)，1.10-1.24(6H，m)，1.47-1.50(2H，m)，1.62-1.66(4H，m)，1.80-1.85(4H，m)，1.96-3.02(2H，m)，3.51-3.57(2H，m)，3.72-3.79(1H，m)，3.93-4.00(1H，m)，4.99-5.01 and 5.13-5.15(全部1H，m)，5.64-5.67和5.70-5.73(全部1H，m)；MS(APCI)m/z199(M-H)-.实施例17制备2，3-二脱氧-3-氟-5-O-(4-苯基苯甲酰基)-α-D-赤藓呋喃戊糖(erythropentofuranose)-1-磷酸酯(29)在室温下将70mg分子筛4A加到62mg正磷酸、52μL三-正丁胺和0.7mL乙腈的经搅拌的混合物中，在冰浴中搅拌该混合物。往该混合物中添加70mg 2，3-二脱氧-3-氟-5-O-(4-苯基苯甲酰基)-D-赤藓呋喃戊糖基氯，使该混合物在相同的温度下反应1天。然后，往该混合物中添加156μL三-正丁胺，然后添加去离子水。使该混合物和甲苯反应三次。往该有机层添加48μl环己胺，搅拌该混合物30分钟。在真空下浓缩该混合物，添加丙酮以形成通过过滤收集的沉淀。用氯仿洗涤残余物并在室温下真空干燥，得到化合物(29)的二环己胺，为白色固体。
1H-NMR(CD3OD)δ1.1-1.4(10H，m)，1.65(2H，m)，1.89(4H，m)，1.96(4H，m)，2.3-2.5(2H，m)，2.91(2H，m)，4.5(2H，m)，4.6-4.8(1H，m)，5.1-5.3(1H，m)，5.97(1H，m)，7.41(1H，m)，7.47(2H，m)，7.68(2H，m)，7.75(2H，m)，8.08(2H，m)；MS(APCI)m/z496(M+C6H14N)+.
1H-NMR(CD3OD)δ1.1-1.4(10H，m)，1.66(2H，m)，1.79(4H，m)，1.94(4H，m)，2.3-2.4(2H，m)，2.88(2H，m)，3.59(2H，m)，4.3-4.4(1H，m)，5.11(0.5H，m；其它0.5H是不能区分的，因为它在水的峰的后面)，5.89(1H，m)；MS(APCI)m/z215(M-H)-。
1H-NMR(CD3OD)δ1.1-1.4ppm(10H，m)，1.66(2H，m)，1.78(4H，m)，1.98(4H，m)，2.3-2.6(2H，m)，2.89(2H，m)，4.44 & 4.46(α&β，2H)，4.6-4.8(1H，m)，5.1-5.3 &5.3-5.4(α&β，1H，m)，5.97 & 6.00(α&β，1H，m)，7.40(1H，m)，7.47(2H，m)，7.68(2H，m)，7.75(2H，m)，8.07(1H，m)，8.13(1H，m).
1H-NMR(CD3OD)δ1.1-1.4ppm(10H，m)，1.67(2H，m)，1.79(4H，m)，2.2-2.4(2H，m)，2.94(2H，m)，3.59和3.62(α和β，2H，m)，3.3-3.4(2H，m)，5.10和5.1-5.24(α和β，0.5H和1H，m，α-型的0.5H不能区分，因为信号在水峰的后面)，5.88和5.93(α和β，1H，m)。
MS(APCI)m/z451(M-H)-；IR(KBr)cm-13448，2963，1721，1453，1278，1111，976，711，558。
1H-NMR(D2O)δ3.37(s，3H)，3.49(dd，1H，J＝4.9Hz，12.7Hz)，3.62(d，1H，J＝4.9Hz)，3.69(dd，1H，J＝2.7Hz，12.7Hz)，3.74-3.78(m，1H)，4.28(dd，1H，J＝4.6Hz，7.8Hz)，5.39(d，1H，J＝5.9Hz)；MS(APCI)m/z243(M-H)-.
1H NMR(D2O)d5.57(dd，J＝5.1，6.1Hz，1H)，4.03(m，2H)，3.54(ddd，J＝1.2，2.2，12.2 Hz，1H)，3.42(ddd，J＝1.2，5.1，12.2Hz，1H)，3.18-2.94(m，2H)，2.17(m，1H)，1.90(d，J＝1.2，12.8Hz，1H)，1.8-1.45(m，10H)，1.25-0.9(m，12H).
元素分析计算值C5H9O7P·C12H28N2，C49.50％；H9.04％；N6.79％；P7.51％，实测值C49.26％；H8.81％；N6.64％；P7.29％.
使用基于在大肠杆菌中的已知的deoD基因的序列而设计的SEQID Nos.1和2的低聚核苷酸(带有碱基号码11531-12250的编码区域的基因库序号AE000508)作为PCR的引物。这些引物分别具有靠近5′-和3′-末端的EcoRI和Hind III的限制酶识别序列。
SEQ ID No.1GTGAATTCAC AAAAAGGATA AAACAATGGCSEQ ID No.2TCGAAGCTTG CGAAACACAA TTACTCTTT使用0.1mL含有完全被限制酶Hind III和引物(每个为3μM)消化的6ng/μL上述大肠杆菌染色体DNA的PCR反应溶液，在变性条件下进行30次PCR循环每此循环96℃，1分钟；退火55℃，1分钟；延伸74℃，1分钟每个循环。
通过EcoRI和Hind III消化上述反应产物和质粒pUC18(TakaraShuzo有限公司)和使用Ligation-High(Toyobo有限公司)进行连接。使用获得的重组质粒以转化大肠杆菌DH5α。在含有50μg/mL氨苄青霉素和X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-半乳糖甙)的LB琼脂培养基中培养转移的菌株以提供作为白色菌落的抗Am的转化体。从由此获得的转化体萃取质粒，其中已插入所需DNA片段的质粒称为pUC-PNP73。由此获得的转化体称为大肠杆菌MT-10905。
通过在含有50μg/mLAm的100mLLB培养基中，在37℃下摇动过夜，培养大肠杆菌MT-10905。在13000rpm下离心培养基10分钟以收集细菌。将细菌悬浮在10mL10mM的Tris-hydrochloride缓冲剂(pH8.0)中，进行超声处理，得到以后用作酶源的匀浆。
通过往实施例8制备的2.5mM2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸二铵盐、2.5mM腺嘌呤(Wako Pure Chemicals，超纯级)、0.1mL来自产嘌呤核苷-磷酸化酶的菌株的超声酶匀浆和10mM Tris-hydrochloride缓冲剂(pH7.4)的混合物中添加不同浓度的氯化钙(Waco Pure Chemicals，超纯级)来制备反应溶液。使1mL反应溶果。(实施例10)
图19A至19D为示意的剖面图，所示的是这个实施例的闪烁器面板。在这个实施例中，通过浸渍的方法为无定形碳130基体元件形成一个聚酰亚胺树脂131作为绝缘层。通过浸渍的方法形成聚酰亚胺树脂131作为绝缘层的好处在于，无定形碳130的整个外周可以被聚酰亚胺树脂131涂层，作为一个具有耐热性的绝缘层。
因此，无定形碳130的整个外周被聚酰亚胺树脂131涂覆，在基体元件侧部形成绝缘。所以，如图19B所示，当一个铝制成的反射层132被形成时，由于在遮盖时并不需要喷镀，所以，可以更进一步增加荧光物质层的有效面积。
在图19C中，一种用于反射层保护层的聚酰亚胺树脂133形成在铝制反射层132上，如图19D中所示，一个荧光层(CsI)134形成在基体元件的大体整个表面上。然后，形成一个聚对苯二甲基(parylene)保护层135。从而，闪烁器面板136被制成。在这个实施例中，绝缘层131和用于反射层保护膜133都设置在基体元件的整个表面上。然而，即使当其中之一被设置时，也能起到足够的效果。当两者都设置时，效果会得到进一步提高。
表2所示的是对实施例6、实施例7以及图10A所示结构(具有基体元件、绝缘层、反射层、荧光层和保护层的结构，并且反射层延伸到绝缘层的端表面上)的单个闪烁器面板同时进行温度和湿度耐久性试验时获得的结果。
表2
从表2可以看出，根据实施例6和7的结构，与反射层的端部与绝缘层的端部对齐的结构相比，能进一步提高耐久性。此外，很明显，在实施例7中获得高的耐久性。
条件温度70℃、湿度90％。评价是在铝的电化学腐蚀产生时(确定花纹出现或者不出现)根据视觉作出的。
(实施例11)图20为一个方框图，示出实施例11的X光诊断系统的示意结构。由一个X制备2′-脱氧腺苷(3)如实施例25所述的进行反应，除了用10mM氯化钡代替氯化钙。反应结束时，形成白色沉淀物。如实施例25所述的反应后溶液的HPLC分析表明了在所有反应后溶液中的一个和2′-脱氧腺苷(Wako PureChemicals，超纯级)的峰完全相同的峰。计算在确定反应后溶液中的2′-脱氧腺苷的浓度后的反应转化率为92.4％。
柱温40℃泵流速1.0mL/min检测UV254nm洗脱剂25mM磷酸二氢钾∶甲醇＝875∶125(V/V)
柱温40℃泵流速1.0mL/min检测UV254nm洗脱剂25mM磷酸二氢钾∶甲醇＝75∶25(V/V)
如实施例34所述进行反应，所不同的是添加2-氨基-6-环丙基氨基嘌呤来代替2-氨基-6-氯嘌呤。如实施例38所述的反应后溶液的HPLC分析表明了一个2-氨基-6-环丙基氨基嘌呤-2′-脱氧-β-D-核苷的峰。确定反应后溶液中的2-氨基-6-环丙基氨基嘌呤-2′-脱氧-β-D-核苷的浓度后，计算反应转化率为87.6％。
柱温40℃泵流速1.0mL/min检测UV254nm洗脱剂25mM磷酸二氢钾∶甲醇＝75∶25(V/V)
柱温40℃泵流速1.0mL/min检测UV254nm洗脱剂25mM磷酸二氢钾∶甲醇＝50∶50(V/V)LC-MS分析数据MS(APCI)m/z236(MH)+
柱温40℃泵流速1.0mL/min检测UV254nm洗脱剂25mM磷酸二氢钾∶甲醇＝875∶125(V/V)LC-MS分析数据MS(APCI)m/z253(MH)+
柱温40℃泵流速1.0mL/min检测UV254nm洗脱剂25mM磷酸二氢钾∶甲醇＝875∶125(V/V)
柱温40℃泵流速1.0mL/min检测UV210nm洗脱剂25mM磷酸二氢钾柱温40℃泵流速1.0mL/min检测UV254nm洗脱剂25mM磷酸二氢钾∶甲醇＝93∶7(V/V)
工业实用性如上所述，本发明作为生产1-磷酸化糖衍生物或核苷的端基异构体选择性的方法是相当有用的，并且可以预期可用于各种应用领域。
序列表<110>MITSUI CHEMICALS，INC.<120>糖-1-磷酸酯的端基异构体选择性合成及其核苷的合成<130>MCI01P018-jn<160>2<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>作为用于克隆大肠杆菌K-12的嘌呤核苷磷酸化酶的PCR引物的低聚核苷酸<400>1gtgaattcac aaaaaggata aaacaatggc 30<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>作为用于克隆大肠杆菌K-12的嘌呤核苷磷酸化酶的PCR引物的低聚核苷酸<400>2tcgaagcttg cgaaacacaa ttactcttt 29
权利要求
1.一种选择性制备1-磷酸化糖衍生物单体的α或β异构体的方法，该方法包含磷酸解和异构化1-磷酸化糖衍生物的端基异构体混合物，得到1-磷酸化糖衍生物单体的α和β异构体，和选择性结晶这些异构体之一以取代这些端基异构体之间的平衡的步骤。
2.一种选择性制备1-磷酸化糖衍生物单体的α或β异构体的方法，该方法包含磷酸解和异构化由式(1)表示的1-磷酸化糖衍生物的端基异构体混合物的步骤 其中，R1和R2独立地表示氢，甲基，被保护的羟甲基或被保护的羧基；R3表示酰基；R4表示羟基的保护基；X表示卤素，烷氧基或烷硫基；W表示氧或硫；Z表示氧，硫或任选取代的碳；m表示1-3的整数；n表示0或1；p和q表示0-4的整数；和r表示0或1；条件是，当z是氧或硫时，p、q、r和n满足p+r≤n+1和q≤2×(n+1)-2×(p+r)和当z是碳时，p+r≤n+2和q≤2×(n+2)-2×(p+r)的条件，得到1-磷酸化糖衍生物单体的α和β异构体，和选择性结晶这些异构体的一种以取代这些端基异构体之间的平衡。
3.一种制备由式(3)表示的1-磷酸化糖衍生物单体的方法 其中R1和R2独立地表示氢，甲基，羟甲基或羧基；R3表示氢或酰基；和X、W、Z、n、p、q和r是如上所定义的，该方法包含磷酸解和异构化由式(1)表示的1-磷酸化糖衍生物的端基异构体混合物的步骤 其中R1、R2、R3、R4、X、W、Z、m、n、p、q和r是如 2所定义的，得到1-磷酸化糖衍生物单体的α和β异构体；选择性结晶这些异构体的一种以取代这些端基异构体之间的平衡；然后除去由R4表示的保护基团。
4.由式(4)表示的1-磷酸化糖衍生物的三聚物、二聚物或单体或其盐 其中R1和R2独立地表示氢，甲基，用取代的苯甲酰基保护的羟甲基或被保护的羧基；R4表示氢或羟基的保护基；和R3、X、W、Z、m、n、p、q和r是如权利要求2所定义。
5.由式(5)表示的1-磷酸化糖衍生物单体或其盐 其中p和q表示0-3的整数；r表示0或1；和R1、R2、R3、R4、X、W和Z是如权利要求2所定义的；条件是当Z是氧或硫时，p、q和r满足p+q+r≤3和当Z是碳时，p+q+r≤5的条件。
6.由式(6)表示的1-磷酸化糖衍生物单体或其盐 其中R1和R2独立地表示氢，甲基，羟甲基或羧基；R3、X、W、Z、n、p、q和r是如权利要求2所定义的，除天然产物之外。
7.根据权利要求6的1-磷酸化糖衍生物单体，其中式(6)中n＝1，或其盐。
8.根据权利要求7的1-磷酸化糖衍生物单体，其中R1是羟甲基；R2是氢；p和r是0；和X是氟，或其盐。
9.一种制备由式(20)表示的1-磷酸化糖的方法 其中R11表示被保护的羟甲基和R14表示羟基的保护基，该方法包含在碱的存在下，用磷酸处理由式(18)表示的化合物的步骤 其中其中R11和R14如上定义，得到由式(19)表示的1-磷酸化糖衍生物的端基异构体混合物 其中R11和R14如上定义，m是如权利要求2定义的；磷酸解和异构化该混合物；和通过选择性结晶形成的α-异构体，取代端基异构体间的平衡。
10.一种制备2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸酯的方法，该方法包含在碱存在下，用磷酸处理式(18)表示的化合物的步骤 其中R11表示被保护的羟甲基和R14表示羟基的保护基，得到式(19)表示的1-磷酸化糖衍生物的端基异构体混合物 其中R11和R14是如上定义的，m是如权利要求2定义的；磷酸解和异构化该混合物；通过选择性结晶形成的α-异构体，取代端基异构体间的平衡得到α-异构体；然后除去保护基。
11.一种制备式(8)表示的核苷的方法 其中B是碱基(base)，独立地选自任选地被卤素、烷基、卤代烷基、链烯基、卤代链烯基、炔基、氨基、烷基氨基、羟基、羟基氨基、氨氧基、烷氧基、巯基、烷基巯基、芳基、芳氧基或氰基取代的嘧啶、嘌呤、氮嘌呤和去氮嘌呤；R1、R2、R3、X、W、Z、n、p、q和r是如权利要求3中的式(3)定义的，该方法包含第一步，如权利要求3所要求的制备1-磷酸化糖衍生物单体的步骤；和第二步，在核苷磷酸化酶的作用下，第一步获得的1-磷酸化糖衍生物的磷酸根基团和碱基进行交换反应。
12.一种制备式(8)表示的核苷的方法 其中B是如权利要求11中的式(8)所定义的；和R1、R2、R3、R4、X、W、Z、n、p、q和r是如权利要求6中的式(6)定义的，该方法包含在核苷磷酸化酶的作用下，如权利要求6所要求的1-磷酸化糖衍生物单体的磷酸根基团和碱基进行交换反应。
13.一种制备式(10)表示的核苷的方法 其中B如权利要求11中的式(8)所定义的；和R1、R2、R3、R4、X、W、Z、n、p、q和r是如权利要求7中的式(7)定义的，该方法包含在核苷磷酸化酶的作用下，如权利要求7所要求的1-磷酸化糖衍生物单体的磷酸根基团和碱基进行交换反应。
14.根据权利要求13的制备核苷的方法，其中R1是羟甲基；R2是氢；p和r是0；和X是氟。
15.一种制备式(21)表示的核苷的方法 其中B是如权利要求11中的式(8)所定义的，该方法包含第一步，如权利要求14所要求的制备2-脱氧-α-D-核糖-1-磷酸酯的步骤；和第二步，在核苷磷酸化酶的作用下，第一步获得的1-磷酸化糖衍生物的磷酸根基团和碱基进行交换反应。
16.根据权利要求11-15任一权利要求的制备核苷的方法，其中核苷磷酸化酶是至少一种选自嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.1)、鸟嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.15)、嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2)、尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.3)、胸苷磷酸化酶(EC2.4.2.4)和脱氧尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.23)的酶。
17.根据权利要求11-15任一权利要求的制备核苷的方法，其中核苷磷酸化酶的活性被表达至少一种核苷磷酸化酶的微生物所取代，所述的酶选自嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.1)、鸟嘌呤核苷磷酸化酶(EC2.4.2.15)、嘧啶核苷磷酸化酶(EC2.4.2.2)、尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.3)、胸苷磷酸化酶(EC2.4.2.4)和脱氧尿苷磷酸化酶(EC2.4.2.23)。
18.根据权利要求11-15任一权利要求的制备核苷的方法，其中在通过核苷磷酸化酶的作用下1-磷酸化糖衍生物单体中的磷酸根基团和碱基进行交换反应的过程中，能够和磷酸根离子形成水不溶性盐的金属阳离子存在于反应溶液中。
19.根据权利要求18的制备核苷的方法，其中能够和磷酸根离子形成水不溶性盐的金属阳离子是至少一种选自钙、钡、铝和镁离子的金属阳离子。
20.根据权利要求8的制备核苷的方法，其中核苷是天然核苷。
21.由式(11)表示的合成核苷或其盐 其中B、R1、R2、R3、R4、X、W、Z、n、p、q和r是如 11中的式(8)定义的，不包括三氟胸苷、利巴韦林、乳清酸核苷、尿嘧啶阿拉伯糖苷、腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-甲基腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-氯-次黄嘌呤阿拉伯糖苷、硫代鸟嘌呤阿拉伯糖苷、2，6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、鸟嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胸苷、依诺他滨、吉西他滨、叠氮胸苷、碘苷、双脱氧腺苷、双脱氧肌苷、双脱氧胞苷、双脱氢脱氧胸苷、硫杂双脱氧胞苷、sorivudine、5-甲基尿苷、三氮唑核苷、硫代肌苷、呋氟尿嘧啶、doxifluridine、布雷青霉素、水松蕈素、别嘌醇尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、2′-氨基尿苷、2′-氨基腺苷、2′-氨基胍、2-氯-2′-氨基肌苷、DMDC和FMDC。
22.由式(12)表示的合成核苷或其盐 其中B、R1、R2、R3、R4、X、W、Z、n、p、q和r是如 11中的式(8)定义的，不包括三氟胸苷、利巴韦林、乳清酸核苷、尿嘧啶阿拉伯糖苷、腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-甲基腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-氯-次黄嘌呤阿拉伯糖苷、硫代鸟嘌呤阿拉伯糖苷、2，6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、鸟嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胸苷、依诺他滨、吉西他滨、叠氮胸苷、碘苷、双脱氧腺苷、双脱氧肌苷、双脱氧胞苷、双脱氢脱氧胸苷、硫杂双脱氧胞苷、sorivudine、5-甲基尿苷、三氮唑核苷、硫代肌苷、呋氟尿嘧啶、doxifluridine、布雷青霉素、水松蕈素、别嘌醇尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、2′-氨基尿苷、2′-氨基腺苷、2′-氨基胍、2-氯-2′-氨基肌苷、DMDC和FMDC。
23.式(13)表示的核苷及其盐 其中B、R1、R2、R3、R4、X、W、Z、n、p、q和r是如 11中的式(8)定义的，不包括三氟胸苷、利巴韦林、乳清酸核苷、尿嘧啶阿拉伯糖苷、腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-甲基腺嘌呤阿拉伯糖苷、2-氯-次黄嘌呤阿拉伯糖苷、硫代鸟嘌呤阿拉伯糖苷、2，6-二氨基嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、鸟嘌呤阿拉伯糖苷、阿糖胸苷、依诺他滨、吉西他滨、叠氮胸苷、碘苷、双脱氧腺苷、双脱氧肌苷、双脱氧胞苷、双脱氢脱氧胸苷、硫杂双脱氧胞苷、sorivudine、5-甲基尿苷、三氮唑核苷、硫代肌苷、呋氟尿嘧啶、doxifluridine、布雷青霉素、水松蕈素、别嘌醇尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、2′-氨基尿苷、2′-氨基腺苷、2′-氨基胍、2-氯-2′-氨基肌苷、DMDC和FMDC。
24.式(20)表示的1-磷酸化糖或其盐 其中R11表示被保护的羟甲基；和R14表示羟基的保护基。
全文摘要
磷酸解和异构化1－磷酸化糖衍生物端基异构体的混合物,由此结晶端基异构体之一。由此平衡转移,只选择性产生所需的异构体。从由此获得的1－磷酸化糖衍生物和碱基,在核苷磷酸化酶的作用下,可以高立体选择性和高产率制备核苷。由此,提供了一种端基异构体选择性制备1－磷酸化糖衍生物的方法和制备核苷的方法。
文档编号C07H19/10GK1372564SQ01800874
公开日2002年10月2日 申请日期2001年2月13日 优先权日2000年2月10日
发明者小松弘典, 粟野博一, 深泽信幸, 伊藤洁, 池田一郎, 安乐城正, 中村武史, 浅野保, 藤原纯也, 安藤知行, 土屋克敏, 丸山恭子, 梅谷豪毅, 山内孝弘, 三宅仁基 申请人:三井化学株式会社