通过突变cdr和/或fr位点提供改进的免疫球蛋白序列的制作方法

专利名称：通过突变cdr和/或fr位点提供改进的免疫球蛋白序列的制作方法
专利说明通过突变CDR和/或FR位点提供改进的免疫球蛋白序列 本发明涉及提供可以用作单抗原结合结构域的改进的氨基酸序列的方法和技术。
具体地，本发明涉及用于提供可以用作单抗原结合结构域的改进的氨基酸序列的方法和技术，所述单抗原结合结构域包括至少一种免疫球蛋白序列或基本由其组成。更具体地，本文提供的氨基酸序列可以包括至少一种可变结构域序列或其适合的片段或基本由其组成，如至少一种轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)或其适合的片段，或至少一种重链可变结构域序列(例如，VH-序列或VHH序列)或其适合的片段。
本发明的方法特别适合用于提供改进的结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸序列)，单结构域抗体(或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列)，″dAb’s″(或适合用作dAb的氨基酸序列)或纳米抗体TM(NanobodiesTM)(如本文定义，包括但不限于VHH序列)。[注意纳米抗体(NanobodyTM)，纳米抗体TM(NanobodiesTM)和纳米克隆TM(NanocloneTM)是埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的商标]。
本发明还涉及可以使用本发明的方法产生的改进的氨基酸序列，以及编码其的核苷酸序列或核酸(因此，术语“序列”用于本文时，根据上下文需要，可以指氨基酸序列，相应的核苷酸序列/核酸，或两者。此外，术语“核苷酸序列”用于本文时，还涵盖具有所述核苷酸序列的核酸分子，以致术语“核苷酸序列”和“核酸”应该被考虑等同并且在本文交互使用。
本发明还涉及这样的蛋白或多肽，其包括一种或多种本发明的免疫球蛋白序列或基本由其组成。
本发明的其它方面，实施方案，优势和应用将通过本文进一步描述变得清楚。
装配PCR(assembly PCR)是用于产生编码大蛋白或多肽的核苷酸序列的众所周知的技术(Stemmer等.，基因(Gene)，1995，164(1)，49-53)。一般而言，装配PCR包括编码所需的蛋白或多肽的基因的单步骤合成，其通过使用一组重叠寡核苷酸(即，具有短重叠区段的引物)的PCR反应进行。用作装配引物的寡核苷酸是部分重叠的有义和反义引物的混合物，其中重叠区段用于安排(order)PCR片段从而使它们选择性装配为完整的核苷酸序列，其可以接着被表达以提供所需的蛋白或多肽。
目前，将装配PCR常规用于制备所需的蛋白和多肽(也在商业基础上)，并且例如也用于制备所谓ScFv’s(参见例如Deng等.，临床和诊断实验室免疫学(Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology)，2003年7月，587-595)。
本领域中已知包括一种或多种免疫球蛋白单可变结构域的蛋白和多肽，其中每种单可变结构域形成单个功能性抗原-结合单位(即没有与需要的另一种可变结构域的相互作用，如对于常规VH/VL结构域的情形，其必须相互作用以形成单抗原结合位点)。可以用在所述蛋白或多肽中的单可变结构域的实例包括结构域抗体，单结构域抗体和“dAb’s”，对于其例如参考EP 0 368 684；Ward等.(自然(Nature)1989年10月12日；341(6242)544-6)；Holt等.，生物技术趋势(Trends Biotechnol.)，2003，21(11)484-490；WO06/030220；WO 06/003388和Domantis有限公司(Domantis Ltd.)的其它公布的专利申请，其描述也称为“dAb’s”的(单)结构域抗体。还已知来自某些鲨鱼物种的单结构域抗体(例如，所谓“IgNAR结构域”，参见例如WO05/18629)。
纳米抗体TM形成可以用作单可变结构域的特别优选种类的氨基酸序列。对于纳米抗体的进一步的描述，参考本文进一步的公开内容，本文提及的现有技术，以及例如由Muyldermans在分子生物技术综述(Reviews inMolecular Biotechnology)74(2001)，277-302中的综述文章，以及下列专利申请，其可以作为一般背景技术提及Vrije Universiteit Brussel的WO94/04678，WO 95/04079和WO 96/34103；Unilever的WO 94/25591，WO99/37681，WO 00/40968，WO 00/43507，WO 00/65057，WO 01/40310，WO01/44301，EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituut voorBiotechnologie(VIB)的WO 97/49805，WO 01/21817，WO 03/035694，WO03/054016和WO 03/055527；Algonomics N.V.和埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会(NationalResearch Council of Canada)的WO 01/90190；抗体研究所(Institute ofAntibodies)的WO 03/025020(＝EP 1 433 793)；以及埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的WO 04/041867，WO 04/041862，WO 04/041865，WO04/041863，WO 04/062551，WO 05/044858，WO 06/40153，WO 06/079372，WO 06/122786，WO 06/122787和WO 06/122825，埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的进一步公开的专利申请。还参考这些申请中提及的其它现有技术，和具体地涉及国际申请WO 06/040153第41-43页提及的参考文献列表，将所述列表和参考文献结合在本文作为参考。
按照上述参考文献中所用的术语学(见上述参考文献)，在天然存在的重链抗体中存在的可变结构域还叫作“VHH结构域”，以将它们与在常规的4-链抗体中存在的重链可变结构域(其在下文中叫作“VH结构域”)区分，以及与在常规4-链抗体中存在的轻链可变结构域(其在下文中叫作“VL结构域”)区分。
如在该现有技术中提及，VHH结构域(以及基于此的纳米抗体，其与天然存在的VHH结构域共享这些结构特征和功能特性)具有许多独特的结构特征和功能特性，这使得分离的VHH结构域以及包含其的纳米抗体和蛋白和多肽高度有利地用作功能性抗原-结合结构域或蛋白。特别地，并且不限于此，VHH结构域(其天然地就“设计”为功能性地结合抗原，而无需存在轻链可变结构域，并且无需与轻链可变结构域的任何相互作用)和纳米抗体可以作为单一的、相对小的、功能性抗原-结合结构单位、结构域或蛋白发挥作用。这将VHH结构域与常规4-链抗体的VH和VL结构域区分开，所述常规4-链抗体的VH和VL结构域本身通常不适合作为单一抗原-结合蛋白或结构域用于实际应用，而是需要以某种形式或其他形式结合以提供功能性抗原-结合单位(例如，在常规抗体片段诸如Fab片段中；在ScFv’s片段中，其由共价连接到VL结构域上的VH结构域组成)。
由于这些独特的特性，VHH结构域和纳米抗体用作单一抗原-结合蛋白或用作抗原-结合结构域(即，作为较大的蛋白或多肽的部分)的应用提供许多优于常规VH和VL结构域、scFv’s或常规抗体片段(诸如Fab-或F(ab’)2-片段)的应用的显著优点 -只需要单结构域来以高亲和性和高选择性结合抗原，以致不需要存在两个单独的结构域，也不需要保证这两个结构域以正确的空间构象和构型(即，通过使用专门设计的接头，如同scFv’s)存在； -VHH结构域和纳米抗体可以从单一基因表达，并且不需要翻译后折叠或修饰； -VHH结构域和纳米抗体可以容易地改造成多价和多特异性形式(如本文进一步所讨论)； -VHH结构域和纳米抗体高度可溶，并且没有聚集倾向(如同Ward等，自然(Nature)，341卷，1989，第544页所述的来源于小鼠的“dAb’s”)； -VHH结构域和纳米抗体对热、pH、蛋白酶和其它变性剂或条件高度稳定(参见，例如，Ewert等，同前所述)； -VHH结构域和纳米抗体制备容易并且相对廉价，甚至以生产需要的规模制备。例如，VHH结构域、纳米抗体和包含其的蛋白/多肽可以使用微生物发酵生产(例如，下文进一步所述)，并且不需要使用哺乳动物表达系统，如同例如常规抗体片段； -与常规4-链抗体及其抗原-结合片段相比，VHH结构域和纳米抗体相对较小(大约15kDa，或比常规IgG小10倍)，并且因此表现出比所述常规4-链抗体及其抗原-结合片段更高的组织(包括但不限于实体瘤和其它致密组织)穿透性； -VHH结构域和纳米抗体可以表现出所谓的腔-结合(cavity-binding)特性(尤其是由于它们延长的CDR3环，与常规VH结构域相比)，并且因此还可以接近常规4-链抗体及其抗原-结合片段不能接近的靶点和表位。例如，已经表明VHH结构域和纳米抗体可以抑制酶(参见，例如，WO 97/49805；Transue等，蛋白(Proteins)1998年9月1日；32(4)515-22；Lauwereys等，EMBO J.1998年7月1日；17(13)3512-20)。
由于这些和其他原因，纳米抗体以及包含其的蛋白和/或多肽通常具有提高的治疗和/或药理学性质和/其它有利性质(如，例如，提高的制备容易性和/或减少的成本)，所述提高是与常规抗体或其片段比较，与可以基于所述常规抗体或抗体片段的构建体(如Fab’片段，F(ab’)2片段，ScFv构建体，“双抗体”和其它多特异性构建体(参见例如Holliger和Hudson的综述，自然生物技术(Nat Biotechnol).2005年9月；23(9)1126-36))比较，并且还与可以来自常规抗体的可变结构域的所谓“dAb’s”或类似(单)结构域抗体比较。这些提高的和有利的性质将由本文进一步的描述而变得清楚，并且例如包括，但不限于下列的一种或多种 -增加的对于目的靶标或抗原的亲和性和/或亲和力，以单价形式，以多价形式(例如以二价形式)和/或多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式的一种)； -更好的适用性，适用于以多价形式(例如，以二价形式)设计； -更好的适用性，适用于以多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式的一种)设计； -对于“人源化”取代(如本文定义那样)的提高的适用性或敏感性；和/或 -更低的免疫原性，以单价形式，以多价形式(例如以二价形式)和/或以多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式的一种)； -增加的稳定性，以单价形式，以多价形式(例如以二价形式)和/或以多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式的一种)； -增加的针对目的靶标或抗原的特异性，以单价形式，以多价形式(例如以二价形式)和/或以多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式的一种)； -减小的或在需要的情形中增加的与来自不同物种的目的靶标或抗原的交叉反应性； 和/或 -一种或多种适于医药应用(包括预防应用和/或治疗应用)和/或诊断应用(包括但不限于成像目的的应用)的其它改进的特性，以单价形式，以多价形式(例如以二价形式)和/或以多特异性形式(例如，下文所述的多特异性形式的一种)。
纳米抗体与例如“dAbs”比较的另一个优势是纳米抗体可以从获自已经用目的靶标适当免疫的动物的VHH序列起始而产生(即使用本文和本文引用的现有技术中提及的技术)。一般而言，这意味着纳米抗体将包含来自体内成熟过程的CDR’s和/或纳米抗体可以通过筛选免疫系统全部而获得(与例如通过筛选天然文库或随机或合成文库产生的CDR’s比较)。
然而，尽管天然VHH序列将通常具有对于靶标的亲和性或特异性，以及使它们本身适于用作单抗原-结合结构域的其它性质，在实践中，当基于所述VHH序列设计或产生纳米抗体时，通常要付诸努力以确定是否可以提高VHH序列的一种或多种需要的性质。
如果(单)结构域抗体来自非免疫，合成和/或随机文库，甚至更是如此，因为所述结构域抗体并不是体内成熟过程的结果，通常需要提高结构域抗体的一种或多种性质(通常以对于需要的靶标的亲和性起始)从而提供适合用在药物实践中的结构域抗体。
例如，但不限于，意欲用作单抗原-结合单位的氨基酸序列的可以是涉及修饰它们(具体地涉及改进它们)的努力主题的一些性质包括对于目的抗原的亲和性或特异性(即亲和力成熟)，效能或活性，选择性，可溶性，稳定性，聚集的倾向性，“黏着性”，与最接近的人种系序列的序列同一性程度(即人源化)，可以被人免疫系统识别的表位的存在(即去免疫化(deimmunization))，潜在的免疫原性(如果有的话)，以及本文提及的其它性质；或前述任一种的任何需要的组合和/或所述序列的任何其他需要的一种或多种性质。这样做的目标是提高这些性质的一种或多种，和/或在这些性质的两种或更多种之间建立适合的平衡。因而，本领域需要可以用于提高意欲用作单抗原-结合结构域的氨基酸序列的一种或多种需要的性质(或需要的性质的任何组合)的方法和/或可以用于提供具有一种或多种需要的或提高的性质(或需要的或提高的性质的组合)的氨基酸序列。本发明的目的是提供所述方法，并且还提供所述改进的氨基酸序列(以及编码其的核苷酸序列)。
本发明通过提供可以用于产生这样的氨基酸序列(或编码其的核苷酸序列)的组、集合或文库的方法解决该问题，所述氨基酸序列可以用作单抗原-结合结构域并且通过在氨基酸序列的一个或多个预定位置上存在一种或多种预定的氨基酸残基(本文也称为“特异性突变”)来区分彼此。使用本文所述的方法在其上引入或定位所述特异性突变的氨基酸序列上的位置在本文也称为“变化的”位置。
本发明还通过提供可以通过该方法产生的氨基酸序列的组，集合或文库(或编码其的核苷酸序列)解决该问题。该氨基酸序列的组，集合或文库(和/或本文存在的各个氨基酸序列)可以关于一种或多种需要的性质(或所需性质的任意合适组合)进行测试或筛选。
方便地，根据本发明的优选但非限制性方面(如本文进一步所述)，所述组，集合或文库可以在单步骤方法中产生，包括适当系列或集合的寡核苷酸的PCR装配(任选地接着适当的表达)。方便地，如本文进一步所述，这还可以以适合于筛选的形式提供所述组、集合或文库，例如使用本文所述的一种方法进行。
此外，根据本发明的另一个优选但非限制性方面(在本文也进一步所述)，所述组，集合或文库通过将已知或需要的单抗原-结合结构域(或编码其的核苷酸序列)的氨基酸序列或核苷酸序列(如VHH或(单)结构域抗体的序列)作为起点产生。以这种方式，基于起始序列，本发明可以提供一系列起始序列的类似物，其每种以在所述氨基酸序列的一个或多个预定位置上存在一种或多种预定的氨基酸残基(即，以一种或多种“特异性突变”)与起始序列区分(并且彼此之间区分)。这种类似物的组，集合或文库(和/或各个类似物)可以关于具有一种或多种需要的和/或提高的性质(即与起始序列比较)的类似物进行筛选和/或各个类似物可以关于一种或多种特异性突变(如本文定义)对这些性质的影响进行测试。
例如，如本文进一步所述，这些特异性突变可以是一种或多种人源化取代或骆驼源化取代，在互补性决定区中的一种或多种取代(例如用于亲和力成熟的目的制备)，意味着去除某些特定表位的一种或多种取代(例如用于去免疫化的目的制备)和/或意味着引入或去除其它具有特定结构和/或生物学功能的氨基酸残基的一种或多种特异性突变。
因而，在第一方面，本发明涉及提供编码可以用作(和/或意欲用作)单抗原-结合结构域的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸的组，集合或文库的方法，所述方法至少包括下列步骤 i)提供寡核苷酸的集合体，其包括(i)一系列的至少两种寡核苷酸，所述至少两种寡核苷酸可以通过PCR装配的方式装配为编码可以用作(和/或意欲用作)单抗原-结合结构域的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸，和此外包括(ii)形成所述系列的一部分的所述至少两种寡核苷酸中的至少一种的至少一种变体，其中所述至少一种变体不同于所述寡核苷酸(也不同于在所述集合体中存在的所述寡核苷酸的其它变体，如果有的话)，所述不同在于其编码区别在于在一个或多个预定的位置上存在一种或多种预定的氨基酸残基的氨基酸序列(即存在一种或多种“特异性突变”)； 和 ii)将所述寡核苷酸的集合体进行PCR装配。
在步骤a)中提供和使用的寡核苷酸及其变体(即作为寡核苷酸集合体的一部分)在本文也一般统称为“在步骤a)中使用的寡核苷酸”。
一般而言，在本文所述的方法中，步骤b)的PCR装配以这样的方式进行以致将在步骤a)中使用的寡核苷酸装配为编码可以用作(和/或意欲用作)单抗原-结合结构域的氨基酸序列的(较大或全长)核苷酸序列或核酸的组，集合或文库。如本领域技术人员清楚地，作为步骤b)中的PCR装配的结果究竟将获得哪种(较大或全长)核苷酸序列或核酸将主要取决于在步骤a)中使用的寡核苷酸。因而，通过适当地选择在步骤a)中使用的寡核苷酸-如本文进一步所述-本发明可以用于提供需要的或预定的(较大或全长)核苷酸序列或核酸的组，集合或文库。此外，最优选地，在步骤a)中使用的寡核苷酸这样选择以致作为PCR装配步骤b)的结果获得的核苷酸序列或核酸编码在一种或多种(预定的)特异性突变(如本文定义)的存在上彼此不同的氨基酸序列。
例如，本文所述的方法可以用于提供合成或半合成的序列或变体的组，集合或文库。这些可以例如是“随机化”序列的组，即在一个或多个(预定的)氨基酸位置具有一种或多种随机氨基酸残基的序列。所述随机化序列的组，集合或文库可以例如通过使用这样的引物进行提供，所述引物在将被随机化的一个或多个氨基酸位置包含所谓的简并密码子(例如使用NNK或NNS密码子，其中K＝G或T和S＝C或G。这些密码子可以编码标准氨基酸的完整组)。
因此，在本发明的一个方面中，在步骤a)中使用的寡核苷酸的至少一种在至少一个预定的氨基酸位置包含至少一种简并密码子。如下所示，当使用本发明的方法装配的氨基酸序列包含四个构架序列和三个互补性决定序列，所述一种或多种简并密码子可以在一种或多种构架序列中；可以在一种或多种互补性决定序列中；和/或可以在一种或多种构架序列中和/或在一种或多种互补性决定序列中。
例如，起始自已知构架序列(例如，如本文所述的纳米抗体构架序列)的组合，本发明的方法可以用于提供这样的氨基酸序列的(合成或半合成)组、集合或文库，所述氨基酸序列包含四个构架序列和三个互补性决定序列，具有(完全或部分)随机CDR’s，其可以例如关于对需要的抗原具有亲和性的氨基酸序列进行筛选。
此外，起始自对需要的抗原具有已知亲和性或特异性的氨基酸序列(例如VHH序列或其它纳米抗体)，本发明的方法可以用于提供该起始序列的变体的(合成或半合成)组、集合或文库，所述变体在一个或多个CDR’s中具有一种或多种随机突变或可以具有特定的一种或多种突变(例如，每个CDR残基被具有类似侧链化学性质的氨基酸突变，或例如每个CDR残基被天然存在于给定位置上的氨基酸的组的突变)。所述组，集合或文库可以例如针对对需要的抗原具有改进的亲和性或特异性的氨基酸序列进行筛选(即，作为对起始序列的亲和力成熟的技术的一部分)。其中引入一种或多种随机突变的本发明的方法的其它应用和使用对于本领域技术人员，基于本文的公开内容是清楚的。
具体地，如本文进一步所述，本发明涉及如上所述的方法，其中提供的核苷酸序列或核酸的组，集合或文库是分别编码作为预定的氨基酸序列的类似物的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸的组，集合或文库(并且其中所述组，集合或文库可以任选地还包含编码预定的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸)。以这种方法，预定的氨基酸序列(并且作为结果，通常还有作为PCR装配的结果获得的其类似物)也最优选地是可以用作(和/或意欲用作)单抗原-结合结构域的氨基酸序列。因此，通过适当地选择在步骤a)中使用的寡核苷酸-如本文进一步所述-本发明可以用于提供分别编码预定的氨基酸序列的类似物的核苷酸序列或核酸的所述组，集合或文库，其中由所述组，集合或文库编码的类似物在存在一种或多种(预定的)特异性突变(如本文定义)上彼此(并且与预定的氨基酸序列不同)不同。例如但不限于，并且如本文进一步所述，本发明可以用于提供氨基酸序列(即纳米抗体)(编码核酸或核苷酸序列)的组，集合或文库，其是野生型VHH序列的变体；例如(但不限于)，人源化变体(例如，对于人源化)或在一个或多个CDR’s具有一种或多种预定的(例如，具有类似侧链的氨基酸取代或在给定位置天然存在的氨基酸)的变体或具有在一个或多个CDR’s中的随机突变(例如，对于亲和力成熟)的变体。
因此，在另一方面中，本发明涉及提供编码作为预定的氨基酸序列类似物的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸的组，集合或文库，其中至少预定的氨基酸序列(和优选地还有类似物)可以用作(和/或意欲用作)单抗原-结合结构域，所述方法至少包括上述步骤a)和b)，并且所述方法任选地还包括一个或多个其它本文提及的步骤。以这种方法，在PCR装配后获得的核苷酸序列或核酸的组，集合或文库可以任选地还包含编码预定的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸。
在本文所述的方法中，在步骤a)中使用的寡核苷酸优选地是这样的，以致作为在步骤b)中的PCR装配的结果获得的核苷酸序列编码这样的氨基酸序列，其包含免疫球蛋白折叠或能够形成(即通过在适当的情形下折叠)免疫球蛋白折叠。
更具体地，在步骤a)中使用的寡核苷酸可以是这样的以致作为在步骤b)中PCR装配的结果获得的核苷酸序列编码这样的氨基酸序列，其分别包含4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成。在本发明的这个方面，在步骤a)中使用的寡核苷酸可以是这样的以致作为在步骤b)中的PCR装配的结果获得的核苷酸序列编码这样的氨基酸序列，其在构架区(任一个)中一种或多种(预定的)特异性突变的存在上，在互补性决定区(任一个)中的一种或多种(预定的)特异性突变的存在上；和/或在构架区(任一个)中的一种或多种(预定的)特异性突变的存在上以及在互补性决定区(任一个)中的一种或多种(预定的)特异性突变的存在上彼此不同(并且与预定的序列不同，如果有的话)。
更具体地，对于如上提及的预定的特异性突变的取代的规则(部分或完全遵循)可以如下(即用具有类似侧链化学性质的氨基酸取代) -K被R取代； -R被K取代； -A被S或T取代； -S被A或T取代； -T被A或S取代； -I被L或V取代； -L被I或V取代； -V被I或L取代； -F被Y取代； -Y被F取代； -N被D取代； -D被N取代； -Q被E取代； -E被Q取代； -G被A取代； -M被L取代； -H，C，W和P保持不变。
此外，对于在位置27-35和位置50-58(使用Kabat编号系统)的取代，关于如上提及的预定的特异性突变的取代的规则(部分或者安全遵循)可以备选地如下 其中对于位置27-35 -在位置27上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被F；G；R；S；F，G，R，S中的2个；F，G，R，S中的3个；或它们全部，优选地它们全部取代； -在位置28上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被A；I；S；T；A，I，S，T中的2个；A，I，S，T中的3个；或它们全部，优选地它们全部取代； -在位置29上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被F；G；L；S；F，G，L，S中的2个；F，G，L，S中的3个；或它们全部，优选地它们全部取代； -在位置30上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被D；G；S；T；D，G，S，T中的2个；D，G，S，T中的3个；或它们全部，优选地它们全部取代； -在位置31上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被D；I；N；S；T；D，I，N，S，T中的2个；D，I，N，S，T中的3个；或它们全部，优选地它们全部取代； -在位置32上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被D；N；Y；D，n，Y中的2个；或它们全部，优选地它们全部取代； -在位置33上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被A；G；T；V；A，G，T，V中的2个；A，G，T，V中的3个；或它们全部，优选地它们全部取代； -在位置34上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被I；M；或它们全部，优选地它们全部取代； -在位置35上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被A；G；S；A，G，S中的2个；或它们全部，优选地它们全部取代； 和对于位置50-58，如果原始氨基酸序列具有在位置52a上的氨基酸序列(使用Kabat编号)， -在位置50上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被A；C；G；S；T；A，C，G，S，T中的2个；A，C，G，S，T中的3个；A，C，G，S，T中的4个；或它们全部，优选地它们全部取代； -在位置51上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被I取代； -在位置52上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被N；R；S；T；N，R，S，T中的2个；N，R，S，T中的3个；或它们全部，优选地它们全部取代； -在位置52a上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被R；S；T；W；R，S，T，W中的2个；R，S，T，W中的3个；或它们全部，优选地它们全部取代； -在位置53上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被D；G；N；S；T；D，G，N，S，T中的2个；D，G，N，S，T中的3个；D，G，N，S，T中的4个；或它们全部，优选地它们全部取代； -在位置54上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被D；G；或它们全部，优选地它们全部取代； -在位置55上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被D；G；S；D，G，S中的2个；或它们全部，优选地它们全部取代； -在位置56上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被I；N；R；S；T；I，N，R，S，T中的2个；I，N，R，S，T中的3个；I，N，R，S，T中的4个；或它们全部，优选地它们全部取代； -在位置57上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被T取代； -在位置58上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被D；H；N；S；Y；D，H，N，S，Y中的2个；D，H，N，S，Y中的3个；D，H，N，S，Y中的4个；或它们全部，优选地它们全部取代； 和其中对于位置50-58，如果原始氨基酸序列没有在位置52a上的氨基酸序列(使用Kabat编号)， -在位置50上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被A；G；R；S；T；A，G，R，S，T中的2个；A，G，R，S，T中的3个；A，G，R，S，T中的4个；或它们全部，优选地它们全部取代； -在位置51上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被I取代； -在位置52上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被N；S；T；N，S，T中的2个；或它们全部，优选地它们全部取代； -在位置53上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被N；R；S；T；Y；N，R，S，T，Y中的2个；N，R，S，T，Y中的3个；N，R，S，T，Y中的4个；或它们全部，优选地它们全部取代； -在位置54上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被D；G；R；S；D，G，R，S中的2个；D，G，R，S中的3个；或它们全部，优选地它们全部取代； -在位置55上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被G取代； -在位置56上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被G；N；R；S；T；D，N，R，S，T中的2个；D，N，R，S，T中的3个；D，N，R，S，T中的4个；或它们全部，优选地它们全部取代； -在位置57上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被T取代； -在位置58上的原始氨基酸残基(使用Kabat编号)被D；N；T；Y；D，N，T，Y中的2个；D，N，T，Y中的3个；或它们全部，优选地它们全部取代. 根据一个具体的，但非限制性的方面，在步骤a)中使用的寡核苷酸是这样的以致作为在步骤b)中的PCR装配的结果获得的核苷酸序列编码这样的氨基酸序列，其包括免疫球蛋白可变结构域或其适合的片段或基本由其组成，和具体地编码这样的氨基酸序列，其包括结构域抗体或适合用作结构域抗体的氨基酸序列或基本由其组成，包括单结构域抗体或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列或基本由其组成，包括“dAb”或适合用作dAb的氨基酸序列的氨基酸序列，或包括(优选地)纳米抗体TM(或前述任一种的任何适合的片段，如本文进一步定义)，或基本由其组成。
本发明还涉及可以使用上述方法获得的核苷酸序列或核酸的组，集合或文库。
本发明还涉及用于产生可以用作(和/或意欲用作)单抗原-结合结构域的氨基酸序列的组，集合或文库的方法，所述方法包括使上述核苷酸序列或核酸(一种或多种来自所述组，集合或文库的核苷酸序列或核酸)的组，集合或文库进行翻译和/或表达(即以本身已知的方式)；并且涉及可以使用该方法获得(或已经获得)的氨基酸序列的组，集合或文库。
本发明还涉及可以通过上述方法获得(或已经获得)和/或来自上述核苷酸序列或核酸的组，集合或文库的各个核苷酸序列或核酸，以及涉及可以通过表达所述核苷酸序列或核酸获得(或已经获得)的各个氨基酸序列。
本发明还涉及如上所述的方法，其还包括下列步骤 iii)筛选通过步骤a)和b)获得的核苷酸序列或核酸的组，集合或文库从而得到编码这样的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸，所述氨基酸序列具有一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)，和任选地分离一种或多种编码具有所述一种或多种需要性质的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸。
此外，以这种方法，在步骤c)中筛选的核苷酸序列或核酸的组，集合或文库优选地编码这样的氨基酸序列的组，集合或文库，所述氨基酸序列是作为预定的氨基酸序列的类似物(其中所述组，集合或文库还可以任选地包括编码预定的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸)，并且具体地作为在一种或多种(预定的)特异性突变的存在上彼此不同(并且与预定的序列不同)的类似物。具体而言，以所述方法，可以筛选所述组、集合或文库以得到编码与预定的氨基酸序列比较具有一种或多种改进的(需要的)性质的类似物的核苷酸序列或核酸。
本发明还涉及如上所述的方法，其还包括下列步骤 c)关于它们是否编码具有一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)的氨基酸序列，从通过步骤a)和b)获得的核苷酸序列或核酸的组，集合或文库测试一种或多种核苷酸序列或核酸。
此外，以这种方法，在步骤c)中测试的核苷酸序列或核酸优选地编码这样的氨基酸序列，其是预定的氨基酸序列的类似物(其中任选地，还可以测试编码预定的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸)，和具体地，是在一种或多种(预定的)特异性突变的存在上彼此不同(并且与预定的序列不同)的类似物。具体而言，以所述方法，还可以测试一种或多种核苷酸序列或核酸从而鉴定和/或提供这样的核苷酸序列或核酸，其编码与预定的氨基酸序列比较具有一种或多种改进的性质的类似物。
在上述提及的每个步骤c)中，核苷酸序列的组，集合或文库或各个核苷酸序列的筛选和/或测试可以以任何本身已知的适合方式进行，这也取决于待筛选或测试的一种或多种性质。一般而言，所述方法将至少包括将一个或多个所述核苷酸序列适当表达或翻译为相应的一个或多个氨基酸序列，并接着测试或筛选所述氨基酸序列的所述一种或多种性质的步骤。
例如，对于筛选核苷酸序列的组，集合或文库，所述氨基酸序列的组、集合或文库可以被展示在噬菌体、噬菌粒、核糖体、或适当的微生物(诸如酵母)上，以促进筛选。用于展示和筛选编码氨基酸序列的核苷酸序列(的组、集合或文库)的适当的方法、技术和宿主生物体，例如，基于本发明进一步的公开内容，对于本领域熟练的熟练技术人员将是清楚的。同样参考Hoogenboom在Nature Biotechnology(自然生物技术)，23，9，1105-1116(2005)中的综述。
还可以(例如在适合的宿主或宿主生物体中)分别表达各个核苷酸序列或核苷酸序列的有限的组，并且可以接着针对一种或多种性质来测试各个氨基酸序列，这使用任何适当的方法，技术或测定法来进行(例如体外，细胞或体内测定法或模型)。
本发明还涉及用于提供一种或多种编码这样的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸的方法，所述氨基酸序列可以用作(和/或意欲用作)单抗原-结合结构域并且具有一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)，所述方法包括筛选(即以本身已知的方式)上述核苷酸序列或核酸的组，集合或文库以获得编码这样的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸，所述氨基酸序列具有所述一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)。任选地，该方法还包括分离一种或多种编码具有一种或多种需要的性质的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸。
本发明还涉及用于提供编码这样的氨基酸序列的一种或多种核苷酸序列或核酸的方法，所述氨基酸序列可以用作(和/或意欲用作)单抗原-结合结构域并且其具有一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)，所述方法包括测试(即以本身已知的方式)一种或多种来自上述核苷酸序列或核酸的组、集合或文库的核苷酸序列或核酸是否编码具有所述一种或多种需要的性质的氨基酸序列。
本发明还涉及可以使用这些方法获得(或已经获得)的各个核苷酸序列或核酸，以及涉及可以通过表达所述核苷酸序列或核酸获得(或已经获得)的各个氨基酸序列。
此外，如上提及，筛选和/或测试核苷酸序列的组，集合或文库或各个核苷酸序列可以以任何本身已知的适合方式进行。
本发明还涉及用于提供可以用作(和/或意欲用作)单抗原-结合结构域的氨基酸序列的组，集合或文库的方法，所述方法至少包括下列步骤 a)提供寡核苷酸的集合体，所述寡核苷酸包括(i)一系列的至少两种寡核苷酸，其可以通过PCR装配的方式装配为编码可以用作(和/或意欲用作)单抗原-结合结构域的氨基酸序列的核苷酸序列，和此外包括(ii)形成所述系列的一部分的至少两种寡核苷酸中的至少一种的至少一种变体，其中所述至少一种变体不同于所述寡核苷酸(也不同于在所述集合体中存在的所述寡核苷酸的其它变体，如果有的话)，所述不同在于其编码区别在于存在一种或多种特异性突变的氨基酸序列； b)将所述寡核苷酸的集合体进行PCR装配； 和 c)使由此获得的装配的寡核苷酸序列以本身已知的适合方式进行翻译和/或表达。
在上述方法中，步骤a)和b)通常如本文所述，并且步骤c)可以以任何本身已知的适合方式进行以表达在步骤b)后获得的装配的核苷酸序列的组，集合或文库(或表达来自所述组、集合或文库的核苷酸序列的任意一种或多种，具体地任意两种或多种)。再次参照本文的进一步公开的内容。
至于本文所述的其它方法，在步骤c)后提供的氨基酸序列的组，集合或文库优选是预定的氨基酸序列的类似物的组，集合或文库(该组，集合或文库还可以任选地包含预定的氨基酸序列)，并且具体地是彼此不同(并且与预定的序列不同)的类似物的组，集合或文库，所述不同之处在于一种或多种(预定的)特异性突变的存在。这可以再次通过适当选择在步骤a)中使用的寡核苷酸来实现。另外，再一次地，预定的氨基酸序列及其类似物优选是可以用作(和/或意欲用作)单抗原结合结构域的氨基酸序列。
因此，在另一方面，本发明涉及提供编码作为预定氨基酸序列类似物的氨基酸序列的组，集合或文库的方法，其中至少预定氨基酸序列(也优选类似物)可以用作(和/或意欲用作)单抗原结合结构域，该方法至少包括上述步骤a)-c)，并且任选地还包括本文提及的一个或多个其它步骤。在这种方法中，氨基酸序列的组，集合或文库还可以任选地包含预定的氨基酸序列。
另外，再一次地，在上述方法中，优选以这样的方式来选择在步骤a)中使用的寡核苷酸，以致在步骤c)后提供的氨基酸序列包含免疫球蛋白折叠或能够形成(即通过在适当的情形下折叠)免疫球蛋白折叠。
更具体地，可以以这样的方式来选择在步骤a)中使用的寡核苷酸，以致在步骤c)后提供的氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成。在本发明的这方面，可以再次以这样的方式来选择在步骤a)中使用的寡核苷酸，以致在步骤a)后获得的氨基酸序列彼此不同(和/或与预定序列不同，如果使用的话)，所述不同之处在于构架区(任一个)中一种或多种(预定的)特异性突变的存在，互补性决定区(任一个)中一种或多种(预定的)特异性突变的存在；和/或在构架区(任一个)中一种或多种(预定的)特异性突变的存在以及在互补性决定区(任一个)中一种或多种(预定的)特异性突变的存在两者。
另外，再一次地，根据一个具体的，但非限制性的方面，在步骤a)中使用的寡核苷酸是这样的，以致在步骤c)后获得的氨基酸序列是这样的氨基酸序列，其包括免疫球蛋白可变结构域序列或其适合的片段或基本由其组成，具体地是这样的氨基酸序列，其包括结构域抗体或适于用作结构域抗体的氨基酸序列，单结构域抗体或适于用作单结构域抗体的氨基酸序列，“dAb”或适于用作dAb的氨基酸序列，或(优选地)纳米抗体TM(或上述任何一种的任何合适片段，如本文进一步定义)，或基本由其组成。
本发明还涉及可以使用上述方法获得(或已经获得)的氨基酸序列的组，集合或文库。
本发明还涉及可以通过上述方法获得(或已经获得)和/或来自上述氨基酸序列的组，集合或文库的各个氨基酸序列。
本发明还涉及如上所述的方法，其还包括下列步骤 iv)筛选通过步骤a)到c)获得的氨基酸序列的组、集合或文库，以获得具有一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)的氨基酸序列，以及任选地分离一种或多种具有所述一种或多种需要的性质的氨基酸序列。
再一次地，在该方法中，在步骤d)中筛选的氨基酸序列的组，集合或文库优选是作为预定的氨基酸序列的类似物的氨基酸序列的组，集合或文库(其中所述组，集合或文库还可以任选地包括预定的氨基酸序列)。具体而言，在所述方法中，可以对所述组，集合或文库进行筛选以得到与预定的氨基酸序列比较具有一种或多种改进的(需要的)性质的类似物。
本发明还涉及如上所述的方法，其还包括下列步骤 d)测试来自通过步骤a)-c)获得的氨基酸序列的组，集合或文库的一种或多种氨基酸序列，所述测试关于它们是否具有一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)进行。
再一次地，在这种方法中，在步骤d)中测试的氨基酸序列优选是预定的氨基酸序列的类似物(其中任选地还可以测试预定的氨基酸序列)。具体而言，在所述方法中，可以对所述一种或多种氨基酸序列进行测试以便鉴定和/或提供与预定的氨基酸序列比较具有一种或多种改进的(需要的)性质的类似物。
在上面提到的步骤c)中，氨基酸序列的组，集合或文库或各个氨基酸序列的筛选和/或测试可以是以任何本身已知的适合方式进行，这也取决于待筛选或测试的一种或多种性质。基于本文进一步的公开内容，这对于熟练技术人员来说将是显而易见的。
例如，对于筛选氨基酸序列的组，集合或文库来说，可以将氨基酸序列的组，集合或文库在噬菌体、噬菌粒，核糖体或适合的微生物(如酵母)上展示，从而利于筛选。例如在本文进一步的公开内容的基础上，用于展示和筛选氨基酸序列(的组，集合或文库)的适合的方法、技术和宿主生物对于本领域熟练技术人员来说将是显而易见的。还参照Hoogenboom在自然生物技术(Nature Biotechnology)，23，9，1105-1116(2005)中的综述。
还可以使用任何适当的方法，技术或测定法(例如，体外，细胞或体内测定法或模型)来对各个氨基酸序列测试一种或多种性质。
本发明还涉及用于提供一种或多种氨基酸序列的方法，所述氨基酸序列可以用作(和/或意欲用作)单抗原结合结构域并且其具有一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)，所述方法包括筛选(即以本身已知的方式)上述氨基酸序列的组，集合或文库，以获得具有所述一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)的氨基酸序列。任选地，该方法还包括分离一种或多种具有所述一种或多种需要的性质的氨基酸序列。
本发明还涉及用于提供一种或多种氨基酸序列的方法，所述氨基酸序列可以用作(和/或意欲用作)单抗原结合结构域并且其具有一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)，所述方法包括测试(即以本身已知的方式)来自上述氨基酸序列的组，集合或文库的一种或多种氨基酸序列是否具有所述一种或多种需要的性质。
本发明还涉及可以使用上述方法获得(或已经获得)的氨基酸序列。
在上述方法中，氨基酸序列的组，集合或文库或各个氨基酸序列的筛选和/或测试可以再一次地以任何本身已知的适合方式进行。
在本文所述的方法中，序列的组，集合或文库(即核苷酸序列或核酸的组，集合或文库或氨基酸序列的组，集合或文库)和/或各个序列(即被筛选或测试的各个核苷酸或各个氨基酸序列)分别可以针对任何合适或需要的性质或性质组合进行筛选或测试。
例如，可以针对一种或多种下列(需要的)性质对氨基酸序列筛选或测试(和/或可以对核苷酸序列或核酸筛选或测试以获得编码具有下列性质的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸)对目标抗原的亲和性或特异性(即亲和力成熟)，效能或活性(即在合适的体外，细胞或体内测定法或模型中)，选择性，可溶性，稳定性(例如，热稳定性；贮存下的稳定性；在不同pH值或温度下的稳定性；针对蛋白酶剪切的稳定性；在不同生物流体或条件下的稳定性，如在血清中或在胃、肠或胃肠道的任何其它部分的一般条件中；包含氨基酸序列的药物制剂的稳定性；抗(自动)氧化)，聚集倾向性，“黏着性”，氨基酸序列的折叠，与最近人类种系序列的序列同一性程度(即人源化作用)，可能被人免疫系统识别的表位的存在(即去免疫化)，潜在的免疫原性(如果有的话)，除了与目标抗原的相互作用之外允许氨基酸序列经历一种或多种相互作用的一种或多种氨基酸残基或氨基酸残基序列的存在(如为了与另一种抗原相互作用引入第二个结合位点)，在所需宿主或宿主细胞中的表达水平，半衰期，可以修饰(例如聚乙二醇化，糖基化和/或可以作为翻译后修饰的一部分而进行的修饰)的位点或氨基酸残基的存在或缺失，可以进行氧化作用的位点或氨基酸残基的存在或缺失(例如在生产/表达过程中或在贮存下)，可以形成二硫键的半胱氨酸残基的存在或缺失等，穿过生物膜或屏障如细胞膜、肠壁或血脑屏障的能力；或以上任何性质的任何所需组合和/或任何其它所需的一种或多种序列性质。在一个具体的，但非限制性的方面，可以针对一种或多种下列(需要的)性质，对氨基酸序列筛选或测试(和/或可以对核苷酸序列或核酸筛选或测试以获得编码具有下列性质的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸)对目标抗原的亲和性或特异性，效能或活性(即在合适的细胞或体内测定法中)和/或对目标抗原的选择性，具体地(至少)针对被筛选或测试的氨基酸序列的目标抗原的亲和性或特异性。具体而言，如本文进一步所述，本发明该方面可以用于涉及起始序列的亲和力成熟的方法中。根据这一具体方面，被筛选的氨基酸序列(或编码其的核苷酸序列或核酸)的组，集合或文库优选地是这样的氨基酸序列(或编码其的核苷酸序列或核酸)的组，集合或文库，所述氨基酸序列每种都包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，并且其彼此不同(并且任选地不同于预定的序列，如果使用的话)，所述不同之处在于所述互补性决定区中一种或多种特异性突变的存在。类似地，当测试一种或多种各个氨基酸序列(或编码其的核苷酸序列或核酸)时，它们优选是这样的氨基酸序列(或编码其的核苷酸序列或核酸)，其每种都包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，并且其彼此不同(并且任选地不同于预定的序列，如果使用的话)，所述不同之处在于所述互补性决定区中一种或多种特异性突变的存在。
在另一个具体的，但非限制性的方面，可以对氨基酸序列筛选或测试(和/或可以对核苷酸序列或核酸筛选或测试以获得编码具有下列性质的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸)一种或多种下列(需要的)性质稳定性，聚集倾向性，“黏着性”，氨基酸序列的折叠和/或在所需宿主或宿主细胞中的表达水平，具体地(至少)关于被筛选或测试的氨基酸序列的稳定性，聚集倾向性和/或”黏着性”。例如，如本文进一步所述，本发明的该方面可以用于产生起始序列的人源化类似物(或备选地骆驼源化类似物)的组，集合或文库和/或测定序列的人源化作用可以如何影响这些性质(或备选地，序列的骆驼源化作用可以如何影响这些性质)。根据这一具体方面，被筛选的氨基酸序列的组，集合或文库(或编码其的核苷酸序列或核酸)优选为这样的氨基酸序列的组，集合或文库(或编码其的核苷酸序列或核酸)，所述氨基酸序列每种都包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，并且其彼此不同(并且任选地不同于预定的序列，如果使用的话)，所述不同之处在于所述构架区中一种或多种特异性突变的存在。类似地，当测试一种或多种各个氨基酸序列(或编码其的核苷酸序列或核酸)时，它们优选是这样的氨基酸序列(或编码其的核苷酸序列或核酸)，其每种都包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，并且其彼此不同(并且任选地不同于预定的序列，如果使用的话)，所述不同之处在于所述构架区中一种或多种特异性突变的存在。
在又一个具体的，但非限制性的方面，可以针对改变(具体地为改进或提高)与最近人种系序列的序列同一性程度的影响对氨基酸序列筛选或测试，以便观察如何改变序列同一性程度可以影响序列的其它性质(如本文所提及的其它性质)。具体而言，如本文进一步所述，本发明的该方面可以用来产生起始序列的人源化类似物的组，集合或文库和/或确定序列的(进一步)人源化怎样影响序列的性质(或备选地，序列的骆驼源化怎样影响这些性质)。
根据这一具体的方面，所筛选的氨基酸序列的组，集合或文库(或编码其的核苷酸序列或核酸)优选为这样的氨基酸序列的组，集合或文库(或编码其的核苷酸序列或核酸)，所述氨基酸序列每种都包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，并且其彼此不同(并且任选地不同于预定的序列，如果使用的话)，所述不同之处在于所述构架区中一种或多种特异性突变的存在。类似地，当测试一种或多种各个氨基酸序列(或编码其的核苷酸序列或核酸)时，它们优选是这样的氨基酸序列(或编码其的核苷酸序列或核酸)，其每种都包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，并且其彼此不同(并且任选地不同于预定的序列，如果使用的话)，所述不同之处在于所述构架区中一种或多种特异性突变的存在。
在又一个具体的，但非限制性的方面，可以针对修饰(具体地为去除)一种或多种可以被人免疫系统识别的表位的影响来对氨基酸序列进行筛选或测试，以便观察突变(或甚至完全或部分去除)这种表位可以如何影响(潜在的)免疫原性(如果有的话)和/或序列的任何其它性质(如本文提及的其它性质)。例如，如本文进一步所述，本发明的该方面可以用来产生没有所述表位的起始序列的类似物的组，集合或文库和/或测定去除一种或多种这些表位(即去免疫化(deimmunisation))可以如何影响这些性质。根据这一具体的方面，所筛选的氨基酸序列的组，集合或文库(或编码其的核苷酸序列或核酸)优选为这样的氨基酸序列的组，集合或文库(或编码其核苷酸序列或核酸)，所述氨基酸序列彼此不同，所述不同之处在于对应于可以被人免疫系统识别的表位的氨基酸残基中一种或多种特异性突变的存在。
应当注意本发明还可以用来提供核酸或核苷酸序列的组，集合或文库，所述核酸或核苷酸序列可以被筛选或测试，以获得具有一种或多种有利性质的一种或多种核酸或核苷酸序列，所述有利性质如稳定性(例如，可以通过转录由本文所述方法获得的DNA而获得的RNA的稳定性)或在所需宿主或宿主细胞中的表达水平。
例如，但不限于，通过使用遗传密码的简并性，本发明的方法可以用于提供作为起始核苷酸序列的类似物(并且优选地编码与起始序列相同的氨基酸序列)的核酸或核苷酸序列的组，集合或文库，但所述类似物与起始序列在一个或多个密码子上有所不同。随后可以对这一组，集合或文库(或来自这一组，集合或文库的各个核酸)例如筛选或测试这样的核酸，所述核酸在所需的宿主生物中提供需要的氨基酸序列的改进/提高的表达水平。本发明的该方面可以例如用来提供编码需要的氨基酸序列(即与起始序列编码相同的氨基酸序列)的核酸，但其包含一个或多个优化的密码子用于在所需宿主或宿主生物中表达。基于本文公开的内容，本发明的这一具体的方面的其它应用和用途对于熟练技术人员来说将是清楚的。
本发明再一次地还涉及可以通过本文所述的方法获得(或已经获得)的核苷酸序列和/或氨基酸序列。
本发明还涉及核苷酸序列和/或氨基酸序列，其分别与通过本文所述方法已经获得的核苷酸序列和/或氨基酸序列具有相同的核苷酸序列或氨基酸序列。
在另一方面，本发明涉及包含至少一种氨基酸序列或基本由其组成的蛋白或多肽，所述氨基酸序列可以通过本文所述的方法之一获得(或已经获得)。这种蛋白或多肽可以如本文进一步所述，并且可以例如是单价，多价或多特异性构建体，如本文进一步所述。
在又一方面，本发明涉及至少包含这样的核苷酸序列或核酸或基本由其组成的核苷酸序列或核酸，所述核苷酸序列或核酸可以通过本文所述的方法之一获得(或已经获得)。这种核苷酸序列或核酸可以如本文进一步所述，并且可以是例如基因构建体的形成。
由本文的进一步描述，本发明的其它方面、实施方案、应用、用途和益处将是显而易见的。
本发明的进一步描述 在本发明的说明书，实施例和权利要求中 a)除非另外指明或限定，所用的所有术语具有它们在本领域内的通用意思，其对于熟练的技术人员应该是清楚的。例如，参考标准手册，如Sambrook等，″分子克隆实验室手册(Molecular CloningA LaboratoryManual)″(第2版)，卷1-3，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)(1989)；F.Ausubel等，编，″现代分子生物学方法(Currentprotocols in molecular biology)″，Green Publishing和Wiley Interscience，纽约(1987)；Lewin，“Genes II”，John Wiley & Sons，纽约市，纽约，(1985)；Old等，“基因操作原理基因工程导言(Principles of Gene ManipulationAnIntroduction to Genetic Engineering)”，第2版，加利福尼亚大学出版社(University of California Press)，伯克利，CA(1981)；Roitt等，“免疫学(Immunology)”(第6版)，Mosby/Elsevier，爱丁堡(2001)；Roitt等，Roitt基础免疫学(Roitt’s Essential Immunology)，第10版.Blackwell Publishing，英国(2001)；和Janeway等，“免疫生物学(Immunobiology)”(第6版)，Garland Science Publishing/Churchill Livingstone，纽约(2005)，以及本文所引用的公知背景技术； b)除非另外指明，术语“免疫球蛋白序列”——不管其在本文中用来指重链抗体或常规的4-链抗体——用作一般术语，包括全尺寸抗体、其单独的链、以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原-结合结构域或片段，分别诸如VHH结构域或VH/VL结构域)。另外，术语“序列”用于本文时(例如在类似“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”的术语中)通常应该理解为包括相关的氨基酸序列、以及编码所述氨基酸序列的核酸或核苷酸序列，除非上下文需要更狭义的解释； c)除非另外指明，所有没有具体详细描述的方法、步骤、技术和操作可以以本身已知的方式进行并且已经进行，这对于熟练的技术人员是清楚的。例如，仍旧参考标准手册，参考本文所提及的公知背景技术，和参考其中所引用的其它参考文献；以及参考例如下述综述高级药物递送综述(Presta，Adv.Drug Deliv.Rev.)2006，58(5-6)640-56；Levin和Weiss，分子生物系统学(Mol.Biosyst).2006，2(1)49-57；Irving等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)2001，248(1-2)，31-45；Schmitz等，Placenta，2000，21增刊.A，S106-12，Gonzales等，Tumour Biol.(肿瘤生物学)，2005，26(1)，31-43，其描述了蛋白质工程技术，诸如亲和力成熟，和用于提高蛋白如免疫球蛋白的特异性和其他需要的性质的其他技术。
d)氨基酸残基按照标准的三字母或一字母的氨基酸代码显示，如在表A-2提及的； 表A-2一字母和三字母氨基酸代码
e)出于比较两种或更多种核苷酸序列的目的，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“序列同一性”百分数可以通过用[第一核苷酸序列中与第二核苷酸序列中相应位置的核苷酸相同的核苷酸数目]除以[第一核苷酸序列中的核苷酸总数]并且乘以[100％[而计算，其中在第二核苷酸序列中核苷酸的每一缺失、插入、取代或添加——与第一核苷酸序列相比——都视作在单一核苷酸(位置)的差异。
备选地，两种或更多种核苷酸序列之间的序列同一性程度可以使用已知的用于序列比对的计算机算法使用标准设置进行计算，所述计算机算法诸如NCBI Blast v2.0。
例如，在WO 04/037999，EP 0 967 284，EP 1 085 089，WO 00/55318，WO00/78972，WO 98/49185和GB 2 357 768-A中描述了用于确定序列同一性程度的一些其它的技术、计算机算法和设置。
通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种核苷酸序列之间的“序列同一性”的百分数的目的，将具有最大核苷酸数目的核苷酸序列视作“第一”核苷酸序列，并且将另一种核苷酸序列视作“第二”核苷酸序列； f)出于比较两种或更多种氨基酸序列的目的，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同一性”百分数(在本文也称为“氨基酸同一性”)可以通过用[第一氨基酸序列中与第二氨基酸序列中相应位置的氨基酸残基相同的氨基酸残基数目]除以[第一氨基酸序列中的氨基酸残基总数]并且乘以[100％]而计算，其中第二氨基酸序列中氨基酸残基的每一缺失、插入、取代或添加——与第一氨基酸序列相比——都视作在单一氨基酸残基(位置)上的差异，即，视作本发明所定义的“氨基酸差异”。
备选地，两种氨基酸序列之间的序列同一性程度可以使用已知的计算机算法进行计算，诸如上文提及的用于确定核苷酸序列的序列同一性程度的那些，其仍旧使用标准设置。
通常，出于按照上文列出的计算方法来确定两种氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分数的目的，将具有最大氨基酸残基数目的氨基酸序列视作“第一”氨基酸序列，并且将另一种氨基酸序列视作“第二”氨基酸序列。
此外，在确定两种氨基酸序列之间的序列同一性程度时，熟练的技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，其通常可以描述为这样的氨基酸取代，即，其中氨基酸残基被具有相似化学结构的另一种氨基酸残基取代，并且其对所述多肽的功能、活性或其它生物学性质几乎没有或者基本上没有影响。这种保守氨基酸取代是本领域内公知的，例如，从WO 04/037999，GB-A-2 357 768，WO 98/49185，WO 00/46383和WO 01/09300中可知；并且可以基于WO 04/037999以及WO 98/49185和其中所引用的其它参考文献的相关教导而选择这种取代的(优选)类型和/或结合。
所述保守取代优选地是这样的取代，即，其中下列组(a)-(e)内的一个氨基酸被同组内的另一氨基酸残基取代(a)小的脂肪族、非极性或弱极性的残基Ala，Ser，Thr，Pro和Gly；(b)极性、带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺Asp，Asn，Glu和Gln；(c)极性、带正电荷的残基His，Arg和Lys；(d)大的脂肪族、非极性残基Met，Leu，Ile，Val和Cys；以及(e)芳族残基Phe，Tyr和Trp。
特别优选的保守取代如下Ala取代成Gly或取代成Ser；Arg取代成Lys；Asn取代成Gln或取代成His；Asp取代成Glu；Cys取代成Ser；Gln取代成Asn；Glu取代成Asp；Gly取代成Ala或取代成Pro；His取代成Asn或取代成Gln；Ile取代成Leu或取代成Val；Leu取代成Ile或取代成Val；Lys取代成Arg，取代成Gln或取代成Glu；Met取代成Leu，取代成Tyr或取代成Ile；Phe取代成Met，取代成Leu或取代成Tyr；Ser取代成Thr；Thr取代成Ser；Trp取代成Tyr；Tyr取代成Trp；和/或Phe取代成Val，取代成Ile或取代成Leu。
用于本文所述的多肽的任何氨基酸取代还可以基于Schulz等，蛋白结构原理(Principles of Protein Structure)，Springer-Verlag，1978发展的不同物种的同源蛋白之间的氨基酸变异频率的分析，基于Chou和Fasman，生物化学(Biochemistry)13211，1974和高级酶学(Adv.Enzymol.)，4745-149，1978研究的结构形成潜力的分析，和基于Eisenberg等，美国国家科学院学报(Proc.Nad.Acad Sci.USA)81140-144，1984；Kyte和Doolittle；分子生物学杂志(J Molec.Biol.).157105-132，1981，以及Goldman等，物理化学综述年刊(Ann.Rev.Biophys.Chem.).15321-353，1986研究的蛋白中疏水模式的分析，所有这些通过引用完全结合于此。在本文描述和上文引用的公知背景技术中给出关于纳米抗体的一级、二级和三级结构的信息。此外，出于这一目的，例如，Desmyter等，自然结构生物学(Nature StructuralBiology)，卷3，9，803(1996)；Spinelli等，自然结构生物学(Natural StructuralBiology)(1996)；3，752-757；和Decanniere等，结构(Structure)，卷7，4，361(1999)给出来自美洲驼(llama)的VHH结构域的晶体结构。关于在常规VH结构域中形成VH/VL界面的一些氨基酸残基和在这些位置的潜在的骆驼源化(camelizing)取代的其它信息可以在上文引用的现有技术中找到。
g)如果在它们的全长有100％的序列同一性(如本文所定义)，那么认为氨基酸序列和核酸“完全相同”。
h)当比较两种氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与第二序列相比，在第一序列位置上的单个氨基酸残基的插入、缺失或取代；应该理解两种氨基酸序列可以包含1个、2个或多个这样的氨基酸差异。
i)当认为核苷酸序列或氨基酸序列分别“包括”另一个核苷酸序列或氨基酸序列，或“基本由”另一个核苷酸序列或氨基酸序列“组成”时，这可以意指后一个核苷酸序列或氨基酸序列已经分别结合在最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列中，但是更通常地，这一般意指最先提及的核苷酸序列或氨基酸序列在其序列内分别包括核苷酸或氨基酸残基的序列，其分别与后一个序列具有相同的核苷酸序列或氨基酸序列，而不管实际上已经怎样产生或获得最先提及的序列(例如，其可以通过本发明所述的任何适当的方法进行)。通过非限制性实例的方式，当认为本发明的纳米抗体包括CDR序列时，这可以意指所述CDR序列已经结合在本发明的纳米抗体内，但是更通常地，这一般意指本发明的纳米抗体在其序列内包含具有与所述CDR序列相同的氨基酸序列的氨基酸残基序列，而不管已经怎样产生或获得所述本发明的纳米抗体。还应该注意到，当后一个氨基酸序列具有特异性生物学或结构功能时，它优选地具有在最先提及的氨基酸序列中基本相同、相似或等价的生物学或结构功能(换言之，最先提及的氨基酸序列优选是这样的，以致后一个序列能够实施基本上相同的、相似的或等价的生物学或结构功能)。例如，当认为本发明的纳米抗体分别包括CDR序列或构架序列时，在所述纳米抗体中的所述CDR序列和构架优选地分别能够作为CDR序列或构架序列行使功能。此外，当认为核苷酸序列包括另一个核苷酸序列时，最先提及的核苷酸序列优选是这样的，以致当它被表达成表达产物(例如，多肽)时，由后一个核苷酸序列编码的氨基酸序列形成所述表达产物的一部分(换言之，后一个核苷酸序列处在与所述最先提及的、较大的核苷酸序列相同的阅读框内)。
j)核酸或氨基酸序列视作“(以)基本上分离的(形式)”——例如，与其天然生物来源和/或其从中获得的反应介质或培养介质相比——此时其已经与其通常在所述来源或介质中与之结合的至少一种其它成分(诸如另一种核酸，另一种蛋白/多肽，另一种生物成分或高分子或至少一种污染物、杂质或微量组分)分离。特别地，当它已被纯化至少2倍，特别是至少10倍，更特别地至少100倍，并且达到1000倍或更多时，认为核酸或氨基酸序列“基本上分离”。当使用适当技术(诸如适当的层析技术，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳技术)确定时，“以基本上分离形式”的核酸或氨基酸序列优选地基本上是均相的； k)当用于本文时，术语“结构域”通常是指氨基酸序列的球状区域(如抗体链，并且特别是指重链抗体的球状区域)，或者指基本上由所述球状区域组成的多肽。通常，例如，这样的结构域包括作为片层或通过二硫键而稳定的肽环(例如3或4个肽环)；术语“结合结构域”指这样的结构域，其针对抗原决定簇(如本文定义)； l)术语‘抗原决定簇’是指抗原上由抗原-结合分子(诸如本发明的纳米抗体或多肽)并且更特别是所述分子的抗原-结合位点而识别的表位。术语“抗原决定簇”和“表位”在本文中还可以互换地使用； m)对于特定的抗原决定簇、表位、抗原或蛋白(或对于至少其的一部分、片段或表位)可以(特异性)结合、具有亲和性和/或具有特异性的氨基酸序列(诸如本发明的纳米抗体、抗体、多肽，或通常为抗原结合蛋白或多肽或其片段)认为是“抗(against)”或者“针对(directed against)”所述抗原决定簇、表位、抗原或蛋白。
n)术语“特异性”是指特定的抗原-结合分子或抗原-结合蛋白(诸如本发明的纳米抗体或多肽)分子可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。一种抗原-结合蛋白的特异性可以依据亲和性和/或亲和力(avidity)而确定。亲和性，表示为抗原与抗原-结合蛋白的解离平衡常数(KD)，是抗原决定簇和所述抗原-结合蛋白上抗原-结合位点之间的结合强度的量度KD值越小，抗原决定簇和抗原-结合分子之间的结合强度越强(备选地，亲和性还可以表示为亲和常数(KA)，其为1/KD)。熟练的技术人员应该清楚(例如，基于本发明进一步的公开内容)，亲和性可以以本身已知的方式确定，其取决于目的特定抗原。亲和力是抗原-结合分子(诸如本发明的纳米抗体或多肽)和相关抗原之间的结合强度的量度。亲和力与抗原决定簇及其在抗原-结合分子上的抗原结合位点之间的亲和性以及在所述抗原-结合分子上存在的相关结合位点的数目相关。典型地，抗原-结合蛋白(诸如本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽)将以10-5-10-12摩尔/升或更小、并且优选地10-7-10-12摩尔/升或更小并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即，以105-1012升/摩尔或更大、并且优选地107-1012升/摩尔或更大、且更优选地108-1012升/摩尔的缔合常数(KA))而结合它们的抗原。任何大于104摩尔/升的KD值(或任何小于104M-1的KA值)升/摩尔通常认为指示非特异性结合。优选地，本发明的单价免疫球蛋白序列将以小于500nM、优选地小于200nM、更优选地小于10nM诸如小于500pM的亲和性与需要的抗原结合。抗原-结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以以本身已知的任何适当的方法确定，其包括，例如，斯卡查德分析和/或竞争结合检测，诸如放射性免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心式(sandwich)竞争测定，和本领域本身已知的其不同的变化；以及本发明提及的其它技术。
解离常数可以是实际的或表观解离常数，熟练的技术人员应该清楚。确定解离常数的方法对于熟练的技术人员应该是清楚的，并且例如，包括本发明提及的技术。在这一点上，还应该清楚，不可能测量大于10-4摩尔/升或10-3摩尔/升(例如，10-2摩尔/升)的解离常数。任选地，熟练的技术人员应该清楚，可以根据(实际或表观)缔合常数(KA)利用[KD＝1/KA]的关系计算所述(实际或表观)解离常数。
亲和性表示分子相互作用的强度或稳定性。亲和性通常作为KD或解离常数给出，其具有的单位为摩尔/升(或M)。亲和性还可以表示为缔合常数KA，其等于1/KD，并且具有的单位为(摩尔/升)-1(或M-1)。在本说明书中，两个分子(诸如本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽及其目的靶点)之间的相互作用的稳定性将主要以它们相互作用的KD值表示；熟练的技术人员应该清楚，考虑到KA＝1/KD的关系，通过其KD值表示分子相互作用的强度也可以用于计算相对应的KA值。由于KD-值通过公知的关系式DG＝RT.ln(KD)(等价于DG＝-RT.ln(KA))与结合的自由能(DG)相关，KD-值还在热力学意义上表征分子相互作用的强度，在所述关系式中，R等于气体常数，T等于绝对温度，并且ln表示自然对数。
关于认为是有意义的(例如，特异性的)生物学相互作用的KD典型地在10-10M(0.1nM)-10-5M(10000nM)范围内。相互作用越强，其KD越低。
KD也可以表示为复合体的解离速率常数(表示为koff)与其缔合速率(表示为kon)的比例(因此KD＝koff/kon和KA＝kon/koff)。解离速率koff具有单位s-1(其中s是秒的SI单位符号)。缔合速率kon具有单位M-1s-1。缔合速率可以在102M-1s-1-约107M-1s-1之间变化，对于两分子相互作用达到扩散-极限缔合速率常数。解离速率以关系式t1/2＝ln(2)/koff与给定的分子相互作用的半衰期相关。解离速率可以在10-6s-1(接近具有数天的t1/2的不可逆复合体)到1s-1(t1/2＝0.69s)之间变化。
两个分子之间的分子相互作用的亲和性可以通过本身已知的不同技术测量，诸如公知的表面等离子体共振(SPR)生物传感器技术(例如，参见Ober等，国际免疫学(Intern.Immunology)，13，1551-1559，2001)，其中将一个分子固定在生物传感器芯片上，另一个分子在流动条件下经过所固定的分子，产生kon，koff测量值以及因此产生KD(或KA)值。例如，这可以使用公知的BIACORE仪器进行。
熟练的技术人员还应该理解，如果测量过程以某种方式影响暗指的分子的内在结合亲和性，例如通过与一个分子的生物传感器上的涂层相关的人为产物影响，则测量的KD可以与表观KD相对应。此外，如果一个分子含有针对另一个分子的多于一个的识别位点，则可以测量表观KD。在这样的情形中，所测量的亲和性可以受到两个分子之间相互作用的亲和力的影响。
可以用来评估亲和性的另一个方法是Friguet等(免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)，77，305-19，1985)的2步ELISA(酶联免疫吸附测定)方法。该方法建立溶液相结合平衡测量，并且避免与在支持物如塑料上的一个分子的吸附相关的可能的人为产物。
然而，KD的准确测量可能是非常费力的，并且作为结果，通常确定表观KD值来评估两个分子的结合强度。应该注意到，只要所有的测量以一致的方式(例如，保持测定条件不变)进行，表观KD测量可以用作真实KD的近似值，并且因此在本文献中，应该以同等的重要性或相关性对待KD和表观KD。
最后，应该注意到，在许多情形中，有经验的科学家可以判断相对于一些参照分子确定结合亲和力是便利的。例如，为了评估分子A和B之间的结合强度，例如，人们可以使用已知与B结合且用荧光团或生色团或其它化学部分适合标记的参照分子C，诸如在ELISA或FACS(荧光活化的细胞分选)中容易检测的生物素、或其它形式(用于荧光检测的荧光团，用于光吸收检测的生色团，用于链霉抗生物素蛋白-介导的ELISA检测的生物素)。典型地，参照分子C保持在固定的浓度，并且A的浓度关于B的给定的浓度或量变化。结果，对应于A的浓度获得IC50值，在所述A的浓度下将在不存在A的条件下C的测量信号减半。假定已知参照分子的KD，即KDref，以及参照分子的总浓度cref，则可以通过下式获得关于A-B相互作用的表观KDKD＝IC50/(1+cref/KDref)。注意，如果cref＜＜KDref，则KD≈IC50。假定以一致的方式(例如，保持cref不变)针对比较的结合剂进行IC50测量，则分子相互作用的强度或稳定性可以通过IC50进行评估，并且在本发明的整个内容中，认为该测量值等价于KD或等价于表观KD。
o)本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的半衰期通常可以定义为所述氨基酸序列、化合物或多肽的血清浓度在体内减少50％所花费的时间，例如，由于所述序列或化合物的降解和/或通过天然机制对所述序列或化合物的清除或螯合(sequestration)。本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的体内半衰期可以以本身已知的任何方式确定，诸如通过药物动力学分析。适当的技术对于本领域熟练的技术人员应该是清楚的，并且例如，通常可以包括下列步骤将适当剂量的本发明的氨基酸序列、化合物或多肽适当施用给温血动物(即，施用给人或另一种适当的哺乳动物，诸如小鼠、兔、大鼠、猪、狗或灵长类动物，例如来自猕猴属的猴子(诸如，并且特别是食蟹猴(食蟹猴(Macaca fascicularis))和/或恒河猴(恒河猴(Macacamulatta)))和狒狒(豚尾狒狒(Papio ursinus)))；从所述动物收集血液样品或其它样品；确定在所述血液样品中的本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的水平或浓度；并且从这样获得的数据(的图表)计算与在给药时的初始水平相比较直到本发明的氨基酸序列、化合物或多肽的水平或浓度已经减少50％的时间。例如，参考下述实验部分，以及标准手册，诸如Kenneth，A等药物的化学稳定性药剂师手册(Chemical Stability of PharmaceuticalsA Handbook for Pharmacists)和Peters等，药物动力学分子实践方法(Pharmacokinete analysisA Practical Approach)(1996)。还参考″药物动力学(Pharmacokinetics)″，M Gibaldi和D Perron，Marcel Dekker出版，第2综述版(2nd Rev.edition)(1982)。
熟练的技术人员还应该清楚(例如，参见WO 04/003019的第6和7页以及其中引用的其它参考文献)，半衰期可以用参数如t1/2-α，t1/2-β和曲线下面积(AUC)表示。在本说明书中，“半衰期增加”是指在这些参数的任何一种的增加，诸如这些参数的任何两种，或基本上所有这三种参数的增加。当用于本发明时，“半衰期增加”或“增加的半衰期”特别是指t1/2-β的增加，具有或不具有t1/2-α和/或AUC或二者的增加。
p)如本发明进一步所述，纳米抗体中氨基酸残基总数可以在110-120区间，优选112-115，并且最优选113。然而，应该注意纳米抗体的部分、片段、类似物或衍生物(如本发明进一步所述)不特别限制它们的长度和/或大小，只要这样的部分、片段、类似物或衍生物满足本发明列出的进一步要求，并且还优选地适于本文所述的目的； q)纳米抗体的氨基酸残基按照Kabat等(“免疫学目的蛋白的序列(Sequence of proteins of immunological interest)”，美国公众健康服务中心(US Public Health Services)，NIH贝塞斯达，MD，公开号91)给出的关于VH结构域的通用编号方式进行编号，这种编号方式在Riechmann和Muyldermans，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)2000年6月23日；240(1-2)185-195的文章中用于来自骆驼科动物的VHH结构域(例如，参见该出版物的图2)；或参照本文。按照这种编号方式，纳米抗体的FR1包括位置1-30的氨基酸残基，纳米抗体的CDR1包括位置31-35的氨基酸残基，纳米抗体的FR2包括位置36-49的氨基酸，纳米抗体的CDR2包括位置50-65的氨基酸残基，纳米抗体的FR3包括位置66-94的氨基酸残基，纳米抗体的CDR3包括位置95-102的氨基酸残基，以及，纳米抗体的FR4包括位置103-113的氨基酸残基。[在这一方面，应该注意——如在本领域内关于VH结构域和关于VHH结构域公知的——在每一CDR中的氨基酸残基的总数可以不同，并且可以不与由Kabat编号方式指示的氨基酸残基的总数相对应(即，按照Kabat编号方式的一个或多个位置可能不占据在实际序列中，或者实际序列可能包含比由Kabat编号方式允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，按照Kabat的编号方式可能与或可能不与实际序列中的氨基酸残基的实际编号方式相对应。然而，通常可以认为，按照Kabat的编号方式并且不考虑CDR中的氨基酸残基的数目，按照Kabat编号方式的位置1对应FR1的起点，并且反之亦然，按照Kabat编号方式的位置36对应FR2的起点，并且反之亦然，按照Kabat编号方式的位置66对应FR3的起点，并且反之亦然，以及按照Kabat编号方式的位置103对应FR4的起点，并且反之亦然。]。
用于编号VH结构域的氨基酸残基的备选方法是由Chothia等(自然(Nature)342，877-883(1989))所述的方法，即所谓的“AbM定义”和所谓的“联系定义”，所述方法还可以以类似的方式用于来自骆驼科动物的VHH结构域以及用于纳米抗体。然而，在本说明书、权利要求和附图中，遵循由Riechmann和Muyldermans用于VHH结构域的按照Kabat的编号方式，除非另外指明； r)对于本申请的目的，“在互补性决定区(CDRs)中或接近互补性决定区(CDRs)”意为CDR1在位置27-35(使用Kabat编号系统)包含氨基酸残基(使用Kabat编号系统)，CDR2在位置50-65或小于65例如58的位置包含氨基酸残基，并且CDR3在位置95-102包含氨基酸残基； s)给出附图、序列表和实验部分/实施例只是进一步举例说明本发明，并且不应该被解释为或者认为以任何方式限制本发明和/或后附的权利要求的范围，除非本文中另外明确指明。
本发明的原理示意性地由非限制性的

图1举例说明，其显示寡核苷酸的集合体，包含寡核苷酸(a)-(e)的系列，其可以通过PCR装配的方式被装配为编码氨基酸序列(2)的核苷酸序列(1)，所述氨基酸序列(2)是可以用作单抗原-结合结构域的氨基酸序列。除了寡核苷酸(a)-(e)之外，所述集合体还分别包含许多寡核苷酸(b)和(d)的变体，其分别在图1中显示为(b1)，(b2)，(b3)和(d1)，(d2)和(d3)。寡核苷酸(b)的变体(b1)，(b2)，(b3)与寡核苷酸(b)的不同在于它们分别编码与由寡核苷酸(b)编码的氨基酸序列不同，并且也与由用作集合体的一部分的寡核苷酸(b)的其它变体编码的氨基酸序列不同的氨基酸序列-区别在于存在一种或多种特异性突变(如本文定义)，所述特异性突变示意性地由图1中的点、正方形或三角形指示。类似地，寡核苷酸(d)的变体(d1)，(d2)，(d3)与寡核苷酸(d)的不同在于它们分别编码这样的氨基酸序列，其与由寡核苷酸(d)编码的氨基酸序列不同-也和与由用作集合体的部分的寡核苷酸(d)的其它变体编码的氨基酸序列不同-区别在于存在一种或多种特异性突变，也由图1中的点、正方形或三角形指示。当将寡核苷酸的集合体进行PCR装配时，结果是一系列核苷酸序列(在图1中分别指 示为1A，1B，1C，1D，等)，其分别编码氨基酸序列(2)的不同类似物(在图1中指示为2A，2B，2C，2D等)，其中每种类似物与氨基酸序列(2)不同-并且与在PCR装配后获得的其它类似物不同-区别在于存在一种或多种特异性突变。所述结果是氨基酸序列(2，2A，2B，2C，2D，等)的组，集合或文库，其分别适合或意欲用作单抗原-结合结构域并且通过存在一种或多种特异性突变而彼此不同。该组，集合或文库(或本文存在的各个氨基酸序列2，2A，2B，2C，2D，等)可以然后针对一种或多种需要的性质(或所需性质的任意合适组合)的存在进行测试或筛选。
一般地，在本发明的实践中，特异性突变(如本文定义)包含在待改变(如本文定义)的位置存在的氨基酸残基被另一种氨基酸残基的取代。然而，应该注意，根据本发明，在其最广泛的意义上，特异性突变(如本文定义)还可以包含位于待改变的位置(如本文定义)上的氨基酸残基的缺失，或可以包含在将改变的位置上的氨基酸残基的插入。
也如上文提及，根据一个优选的但非限制性的方面，本发明可以用于提供一系列已知或预定的起始序列的类似物，所述类似物在一种或多种(预定的)特异性突变的存在上(如本文定义)与起始序列不同(并且彼此不同)，并且所述类似物可以针对一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)进行测试或筛选。对于熟练技术人员清楚的是，取决于怎样选择在步骤a)中使用的寡核苷酸，本文所述的方法通常将得到装配的核苷酸序列的组，集合或文库，其中一种装配的核苷酸序列将编码预定的氨基酸序列，并且所述一种或多种其他核苷酸序列分别编码所述预定的氨基酸序列的类似物。这通常在实践中是优选的，因为其容许预定的序列在随后的类似物的测试或筛选中用作参照。然而，如果需要，也可以以这样的方式选择在步骤a)中使用的寡核苷酸以致它们可以被装配为仅编码预定的序列的类似物的核苷酸序列的组，集合或文库。
一般而言，本文所述的方法可以用于修饰(或尝试修饰)，和具体地改善(或尝试改善)起始序列的任何需要的性质或性质的组合，并且基于本文的公开内容，所述性质或性质的组合对于本领域技术人员是清楚的。一般而言，所述性质可以是这样的性质，其通过在目的氨基酸序列(的一级序列)中的一种或多种具体氨基酸残基的存在或缺乏来确定或影响(其当然也可以影响所述氨基酸序列的二级和/或三级结构并且以这种方式影响氨基酸序列的性质)。这些性质例如包括对于目的抗原的亲和性或特异性(意为本文所述的方法用于起始序列的亲和力成熟)，效能或活性(即以适合的体外，细胞或体内测定法或模型)，选择性，可溶性，稳定性(例如，热稳定性；贮存稳定性，在不同的pH值的稳定性，和/或在不同的生物流体或条件下(如血清或肠)的稳定性；包含氨基酸序列的药物制剂的稳定性；对(自动-)氧化的抗性)，聚集的倾向性，“黏着性”，氨基酸序列的折叠，与最接近的人(和/或美洲驼或骆驼)种系序列的序列同一性程度(意为本文所述的方法可以用于起始序列的人源化或骆驼源化)，并且确定其对序列的性质的影响，如其对本文提及的一种或多种其它性质的影响)，可以被人免疫系统识别的表位的存在和序列的潜在的免疫原性(如果有的话)(意为本文所述的方法用于去免疫化，并用于确定其对序列的性质的影响，如其对本文提及的一种或多种其它性质的影响)，容许所述氨基酸序列经历除与目的抗原的相互作用之外的一种或多种相互作用的一种或多种氨基酸残基或氨基酸残基序列的存在(意为可以例如使用本发明的方法从而引入第二结合位点以与另一抗原相互作用)，在需要的宿主或宿主细胞中的表达水平，半衰期，可以被修饰(例如聚乙二醇化，糖基化和/或可以作为翻译后修饰的部分进行修饰)的位点或氨基酸残基的存在与否，可以进行氧化(例如在生产/表达或在贮存下)的位点或氨基酸残基的存在与否，可以形成二硫键的半胱氨酸残基的存在与否等；或前述任一项的任何需要的组合。在这种情况下，目标可以是提高这些性质的一种或多种，和/或在这些性质的两种或更多种之间建立适当的平衡。
对于本领域技术人员清楚的是，如果使用本文所述的方法产生的氨基酸序列包括构架区和互补性决定区，那么一种或多种特异性突变可以存在于任意一个或多个构架区中，在任意一个或多个互补性决定区中，或在构架区的任一个和互补性决定区的任一个两者中。
在一个非限制性方面中，所述一种或多种特异性突变仅存在于构架区中。在另一个非限制性方面中，所述一种或多种特异性突变仅存在于构架区中。
还对于本领域技术人员清楚的是，当意欲修饰或改善上述列出的一些特异性性质时，出于该目的，可以优选在构架区中的特异性突变(即“改变”在构架区中的位置)。类似地，出于修饰和改善一些其他特异性性质的目的，可以优选在互补性决定区中的特异性突变(即“改变”在互补性决定区中的位置)。此外，当然，出于修饰或改善两种或更多种所述性质的组合的目的，可以优选地在构架区以及互补性决定区两者中具有特异性突变(即“改变”在构架区以及互补性决定区两者中的位置)。
一般而言，对于熟练技术人员清楚的是，基于公开内容和本文提及的现有技术，在构架区中的氨基酸位置或在互补性决定区中的氨基酸位置是否与氨基酸序列的特异性性质相关，并且因此在构架区中的氨基酸位置或在互补性决定区中的氨基酸位置是否应该被选择可以潜在(potential)可以(或应该被)改变(如本文定义)的位置从而尝试改变或提高所述性质。
还对于熟练技术人员清楚的是，基于公开内容和本文提及的现有技术，在氨基酸序列中的某些位置可以在不同的氨基酸序列代表类别中高度保守。例如对于纳米抗体，如从下表A-5中可见，氨基酸残基如在位置4，9，22，38和86的那些显示基本为0的VHH熵和基本为1的VHH可变性，并且尽管并不排除这些位置通过本文所述的方法进行改变(如本文定义)，这些位置在具体的情形中对于引入特异性突变(如本文定义)可能不是最优选的候选物。
可能有时对于熟练技术人员清楚的是，基于公开内容和本文提及的现有技术，某些具体的氨基酸位置或氨基酸残基(在构架区和/或在互补性决定区中)是否与或可能与氨基酸序列的特异性性质相关，和因此所述具体位置或氨基酸残基是否应该被改变(如本文定义)从而尝试改变或提高所述性质。
因而，基于本文公开内容并取决于待改变或改进的一种或多种性质，熟练技术人员能够选择对于引入特异性突变(如本文定义)是适合的候选物的氨基酸序列中的具体氨基酸位置，这任选地在有限程度的试验和误差后，即通过在所述位置引入有限数量的特异性突变(如本文定义)并确定对一种或多种目的性质的作用。
此外，如本文进一步所述，本文所述的方法可以用于提供氨基酸序列的组，集合或文库，其在一个或多个预定的位置包含一种或多种“随机”突变。也可以使用本文所述的方法来提供这样的氨基酸序列的组，集合或文库，其在一个或多个预定的位置包含一种或多种“随机”突变以及在一个或多个其他氨基酸位置包含一种或多种预定的特异性突变(如本文定义)。此外，可以针对一种或多种需要的或改进的(即与已知的起始序列比较的)性质来筛选或测试组，集合或文库(或在所述文库中的各个序列)。
此外，如本文提及，本文所述的方法可以用于提供这样的核酸或核苷酸序列的组，集合或文库，所述核酸或核苷酸序列与起始核酸或核苷酸序列相比具有一种或多种需要的或改进的(即与已知起始序列比较)性质。例如，根据该方面，在所述组，集合或文库中的不同核酸或核苷酸序列都可以编码相同的氨基酸序列(例如由起始序列编码的相同的氨基酸序列)，但是在使用的密码子上彼此不同(即由于遗传密码的简并性)。
使用本文所述的方法(或备选地，待缺失或插入的氨基酸残基)，熟练技术人员还能够选择可以作为特异性突变(如本文定义)在待改变(如本文定义)的位置引入和测试的适合的氨基酸残基，又任选地在有限程度的试验和误差后，即通过在待改变的位置(如本文定义)引入有限数量的具体氨基酸残基并确定对一种或多种目的性质的作用。例如，可以对所述氨基酸残基进行选择从而使所述特异性突变是保守的氨基酸取代(如本文定义)或使所述特异性突变不是保守氨基酸取代。
还对于熟练技术人员清楚的是，本文所述的方法还可以用于确定氨基酸序列中的哪一个位置与氨基酸序列的特定性质相关，并且在所述位置的具体氨基酸残基的缺失，插入或取代是否和怎样可以影响所述一种或多种性质。通过这样做，本文所述的方法甚至可以是这样方便的方式，其可以用于推导在序列的某些位置存在的氨基酸残基和序列需要的性质之间的特定“结构活性关系”。如对于熟练技术人员清楚地，这对于研究目的可以是有价值的(例如对于表位作图和/或互补位作图)，而且当本文所述的方法用于增加目的靶标的序列的亲和性或特异性(即如起始序列的亲和力成熟的方式)时，也是有价值的。
例如但不限于，当本文所述的方法用于改变或提高目的抗原的序列的亲和性或特异性(即对于亲和力成熟)时，特异性突变(如本文定义)将通常被引入一个或多个互补性决定区。基于公开内容和本文引用的现有技术，这些位置和可以在这些位置被引入和测试的残基对于熟练技术人员是清楚的。还对于熟练技术人员清楚的是，还可以引入和测试所述特异性突变从而改变或提高在适合的体外、细胞或体内测定法或模型中的效能或活性。
更通常地，本发明还可以用于产生一系列类似物，其可以分别在适合的体外、细胞或体内测定法或模型中测试效能或活性。
当本文所述的方法用于改变或提高序列的可溶性，稳定性，聚集倾向性，“黏着性”，特异性突变(如本文定义)通常将被引入一个或多个构架区中，并且具体地被引入构架区中的那些位置，所述位置是表面暴露的和/或形成用于与其它氨基酸残基(例如，形成VH/VL界面的氨基酸残基)相互作用的接触残基或界面。基于公开内容和本文提及的现有技术(例如，对于VHH序列或纳米抗体，特异性突变可以在一个或多个标志残基和/或一个或多个其它位置引入和测试)，所述位置和可以在这些位置引入和测试的残基对于熟练技术人员是清楚的。还清楚的是，根据该非限制性的方面，本发明的方法可以用于引入和测试所谓“骆驼源化”取代(如本文进一步所述)。还对于熟练技术人员清楚的是，可以引入和测试所述异性突变从而改进或提高在需要的宿主或宿主细胞中的表达水平。
当本文所述的方法用于改变或提高氨基酸序列的折叠时(如形成α-螺旋，β-折叠，免疫球蛋白折叠或“环-和-桶”结构)，通常将特异性突变(如本文定义)在涉及氨基酸序列的折叠的位置引入。基于公开内容和本文提及的现有技术，所述位置和可以在这些位置引入和测试的残基对于熟练技术人员是清楚的，并且通常将存在于构架区中。还对于熟练技术人员清楚的是，可以引入和测试所述特异性突变从而在需要的宿主或宿主细胞中改进或提高表达水平。本文所述的方法还可以用于引入和测试意欲修饰CDR’s的柔性或刚性的特异性突变。通常地，在位于CDR’s中或接近CDR’s的序列中的位置引入所述特异性突变，并且基于公开内容和本文引用的现有技术，所述位置和待引入的残基对于熟练技术人员是清楚的。
当本文所述的方法用于改变或提高序列与最接近的人种系序列的同一性程度(即对于人源化)时，通常将特异性突变(如本文定义)引入一个或多个构架区(尽管本发明不限于此，还可以在CDR’s中，具体地在具有低序列熵(例如，VHH熵，如本文所述)和/或低序列可变性(例如，VHH可变性，如本文所述)的氨基酸位置包括一种或多种特异性突变)。基于公开内容和本文引用的现有技术，可以这些位置引入和测试的所述位置和残基对于熟练技术人员是清楚的。
例如，还可以通过比较起始氨基酸序列与一种或多种最接近的人种系序列来确定待改变的适合的位置(如本文定义)和将在所述位置引入的适合的人源化氨基酸残基。例如，基于本文进一步的公开内容，对于VHH序列(和更通常地对于提供纳米抗体)，可以使用本文所述的方法引入和测试的一种或多种适合的人源化特异性突变(或其任何适合的组合)，对于熟练技术人员是清楚的，并且包括对于VHH序列和本文进一步的公开内容中的纳米抗体指定的潜在的人源化取代(即，在一种或多种标志残基和/或一个或多个其它位置)。
当本文所述的方法用于修饰(和具体地去除)可以被人免疫系统识别的表位时，通常将在(可能)对应于所述表位的位置引入特异性突变(如本文定义)。基于公开内容和本文引用的现有技术，所述位置和可以在这些位置引入和测试的残基对于熟练技术人员是清楚的。例如可以获得用于对可能潜在地被人免疫系统(即被T细胞)识别的表位作图的各种计算机(in silico)和体外技术，如Algonomics(根特，比利时)的EpiBaseTM技术或Antitope(剑桥，英国)的EpiScreenTM技术。这些和类似技术可以用于对氨基酸序列中的潜在T细胞表位进行作图，在所述潜在T细胞表位上可以接着使用本文所述的方法引入和测试特异性突变(如本文定义)，所述特异性突变优选地是这样的以致它们去除T-细胞表位。还对于熟练技术人员清楚的是，可以引入和测试所述特异性突变从而修饰或改进所述氨基酸序列的潜在免疫原性(如果有的话)。
本文所述的方法还可以用于引入和测试特异性突变，所述特异性突变意欲引入或去除使氨基酸序列经历除与目的抗原的相互作用之外的一种或多种相互作用的一种或多种氨基酸残基(或氨基酸残基的序列)。基于公开内容和本文引用的现有技术，所述位置和可以在这些位置引入和测试的残基对于熟练技术人员是清楚的。还对于熟练技术人员清楚的是，可以引入和测试所述特异性突变从而改变或提高可溶性、稳定性、聚集倾向性，“黏着性”和/或在需要的宿主或宿主细胞中的表达水平。
例如，本文所述的方法可以用于引入和测试特异性突变，所述突变意欲在氨基酸残基引入第二结合位点以便与CDR’s所针对的抗原之外的抗原相互作用。对于所述位置，其通常是在构架区中的位置，如在“底环(bottomloops)”中的位置，参考例如Keck和Huston，生物物理杂志(BiophysicalJournal)71，1996年10月，2002-2011；EP 0 640 130和WO 06/072620，以及埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)于2006年11月27日提交的共同待决的美国临时申请60/861,182，题为具有多个结合位点的免疫球蛋白结构域(Immunoglobulin domains with multiple binding sites)。如本文所述，可以例如引入所述第二结合位点从而改变或提高所述氨基酸序列的半衰期，例如通过引入结合血清蛋白或血清白蛋白的的第二结合位点进行。
本文所述的方法还可以用于引入和测试特异性突变，所述特异性突变意欲引入或去除可以进行翻译后修饰(例如形成二硫键或糖基化，这取决于用于表达的宿主或宿主细胞)或可以另外进行修饰(例如通过聚乙二醇化)的位点。基于公开内容和本文引用的现有技术，所述位置和可以在这些位置引入和测试的残基对于技术人员是清楚的，并且可以例如包括适当地引入或去除一个或多个半胱氨酸残基，所述半胱氨酸残基可以进行糖基化，聚乙二醇化或形成二硫键。还对于熟练技术人员清楚的是，可以引入和测试所述特异性突变从而改变或提高可溶性、稳定性、聚集倾向性、“黏着性”和/或在需要的宿主或宿主细胞中的表达水平。
关于使用本文所述的方法制备的氨基酸序列(2)和类似物的大小，尽管本发明不特别进行限制(任何所述限定主要是关于实际的性质，如可以使用设计的引物通过PCR有效装配的核苷酸序列的大小)，但是本发明可以例如用于制备包含约10-约1000，如约20和约500个氨基酸残基，和具体地50和200个氨基酸残基，如约75-150个氨基酸残基(例如VH，VL或VHH结构域的一般大小。例如VHH结构域可以包括110-140个氨基酸残基，这取决于其中存在的CDR’s的长度)的氨基酸序列或变体(和/或编码其的核苷酸序列或核酸)。
使用本文所述的方法改变(如本文定义)的位置的数目可以适当地进行选择，并且可以从单一位置变化到10个以上的位置，但是通常是1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个位置。类似地，在每个位置作为特异性突变(如本文定义)引入从而提供如本文所述的类似物的不同的氨基酸残基的数目也可以适当地进行选择，并且可以从单一氨基酸残基变化到20个或甚至更多(例如，对于制备免疫球蛋白可变结构域的随机集合或文库，可以在多到20个不同预定的氨基酸位置或更多引入简并密码子如NNK或NNS)，但是通常是1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个氨基酸残基。此外，如上提及，待改变(如本文定义)的具体的一个或多个位置以及作为特异性突变被引入和测试的一种或多种具体氨基酸残基可以由熟练技术人员，基于本文公开内容适当地选择，并且可以取决于在起始序列中的相关位置存在的氨基酸残基，以及意欲进行测试的修饰种类(例如从带电的氨基酸残基改变为不带电的氨基酸残基，或反之亦然)。
在实践中，通常优选地选择待改变(如本文定义)的具体的一个或多个位置，以及作为特异性突变被引入和测试的一个或多个具体氨基酸残基，以及被改变的位置的数目，并且在每个位置引入的不同的氨基酸残基的数目是这样的以致所述类似物和它们的相关性质可以以有意义的方式彼此进行比较(并且任选地与起始序列比较)，即从而选择或设计具有优化的需要的一种或多种性质的类似物，和/或得出关于特异性突变或特异性突变组合对需要的一种或多种性质具有的影响的结论。基于本文公开内容，所有这些都在熟练技术人员的技术之内。
因此，在另一个具体的但非限制性的方面中，本发明涉及编码可以用作(和/或意欲用作)单抗原-结合结构域的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸的组，集合或文库，所述核苷酸序列或核酸的组，集合或文库可以通过PCR装配的方式获得(或已经获得)，其中在组，集合或文库中存在的核苷酸序列或核酸编码这样的氨基酸序列，其在一种或多种特异性突变(如本文定义)的存在上彼此不同。此外，所述组，集合或文库可以编码预定的起始序列的类似物(和任选地，编码预定的起始序列本身的核苷酸序列或核酸)。此外，由所述核苷酸序列或核酸编码的氨基酸序列可以如本文进一步所述。
在另一个具体的但非限制性的方面中，本发明涉及可以用作(和/或意欲用作)单抗原-结合结构域的氨基酸序列的组，集合或文库，所述氨基酸序列的组，集合或文库可以通过编码所述氨基酸序列的核苷酸序列或核酸的组，集合或文库的PCR装配以及随后所述核苷酸序列或核酸的表达而获得(或已经获得)，其中在组，集合或文库中的氨基酸序列彼此不同，所述不同之处在于一种或多种特异性突变(如本文定义)的存在。此外，所述组，集合或文库可以包括预定的起始序列的类似物，如-例如但不限于-VHH序列或纳米抗体(和任选地，起始序列本身)。此外，氨基酸序列可以如本文进一步所述。
在另一个具体的但非限制性的方面，本发明涉及编码可以用作(和/或意欲用作)单抗原-结合结构域的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸的组，集合或文库，所述核苷酸序列或核酸的组，集合或文库可以通过PCR装配的方式获得(或已经获得)，其中在组，集合或文库中存在的核苷酸序列或核酸编码这样的氨基酸序列，其在作为人源化取代(或骆驼源化取代)的一种或多种特异性突变(如本文定义)的存在上彼此不同。此外，所述组，集合或文库可以编码人源化(或骆驼源化)的预定的起始序列的类似物(和任选地，编码预定的起始序列本身的核苷酸序列或核酸)。此外，由核苷酸序列或核酸编码的氨基酸序列可以如本文进一步所述。因而，本发明还涉及编码可以用作(和/或意欲用作)单抗原-结合结构域的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸的组，集合或文库，并且所述氨基酸序列包括4个构架区或3个互补性决定区或基本由其组成，所述核苷酸序列或核酸的组，集合或文库可以通过PCR装配的方式获得(或已经获得)，其中在组，集合或文库中存在的核苷酸序列或核酸编码这样的氨基酸序列，其在作为人源化取代(或骆驼源化取代)的一种或多种特异性突变的存在上彼此不同，其中所述人源化取代在构架区中(例如，在一个或多个标志位置和/或在一个或多个其它位置中)。
在另一个具体的，但非限制性的方面，本发明涉及可以用作(和/或意欲用作)单抗原结合结构域的氨基酸序列的组，集合或文库，所述氨基酸序列的组，集合或文库可以通过编码所述氨基酸序列的核苷酸序列或核酸的组，集合或文库的PCR装配的方式，随后进行所述核苷酸序列或核酸的表达而获得(或已经获得)，其中所述氨基酸序列彼此不同之处在于存在一种或多种特异性突变(如本文定义)，所述特异性突变是人源化取代(或骆驼源化取代)。此外，这种组，集合或文库可以包含预定起始序列的人源化(或骆驼源化)的类似物，诸如-例如但不限于-VHH序列或纳米抗体(和任选地预定的起始序列本身)。另外，所述氨基酸序列可以如本文进一步所述。因而，本发明还涉及氨基酸序列的组，集合或文库，所述氨基酸序列可以用作(和/或意欲用作)单抗原结合结构域并包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列的组，集合或文库可以通过编码所述氨基酸序列的核苷酸序列或核酸的组，集合或文库的PCR装配的方式，随后进行所述核苷酸序列或核酸的表达而获得(或已经获得)，其中存在于所述组，集合或文库中的氨基酸序列彼此不同之处在于存在一种或多种特异性突变，所述特异性突变是人源化取代(或骆驼源化取代)，其中所述人源化取代在构架区中(例如，在一个或多个标志位置和/或在一个或多个其它位置上)。
本发明还涉及编码这样的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸的组，集合或文库，所述氨基酸序列可以用作(和/或意欲用作)单抗原结合结构域并包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述核苷酸序列或核酸的组，集合或文库可以通过PCR装配的方式而获得(或已经获得)，其中存在于所述组，集合或文库中的核苷酸序列或核酸编码这样的氨基酸序列，其彼此不同之处在于在一个或多个互补性决定区中存在一种或多种特异性突变。
本发明还涉及氨基酸序列的组，集合或文库，所述氨基酸序列可以用作(和/或意欲用作)单抗原结合结构域，并包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列的组，集合或文库可以通过编码所述氨基酸序列的核苷酸序列或核酸的组，集合或文库的PCR装配的方式，随后进行所述核苷酸序列或核酸的表达而获得(或已经获得)，其中存在于所述组，集合或文库中的氨基酸序列彼此不同之处在于在一个或多个互补性决定区中存在一种或多种特异性突变。
本发明还涉及编码可以用作(和/或意欲用作)单抗原结合结构域的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸的组，集合或文库，所述核苷酸序列或核酸的组，集合或文库可以通过PCR装配的方式获得(或已经获得)，其中存在于所述组，集合或文库中的核苷酸序列或核酸编码这样的氨基酸序列，其彼此不同之处在于在可以被人免疫系统识别的一种或多种表位(因此存在或缺失)中存在一种或多种特异性突变。
本发明还涉及可以用作(和/或意欲用作)单抗原结合结构域的氨基酸序列的组，集合或文库，所述氨基酸序列的组，集合或文库可以通过编码所述氨基酸序列的核苷酸序列或核酸的组，集合或文库的PCR装配的方式获得(或已经获得)，其中所述氨基酸序列彼此不同之处在于在可以被人免疫系统识别的一种或多种表位中存在一种或多种特异性突变(因此存在或缺失所述表位)。
在本文所述的方法中使用的寡核苷酸可以是任何合适的组或系列的寡核苷酸，只要它们可以装配(即通过装配PCR)成编码所需氨基酸序列(即系列类似物，有或无起始序列)的组，集合或文库的核苷酸序列的组，集合或文库。基于本文的公开内容和引用的现有技术，以及他的一般性装配PCR知识，熟练技术人员将能够适当地选择(i)可以装配成全长核苷酸序列的一系列的至少两个寡核苷酸，并且也能够适当地选择(ii)编码特异性突变(如本文定义)的某些所述寡核苷酸的变体，所述特异性突变将会引入类似物中。
所用寡核苷酸的大小将取决于所要装配的氨基酸序列(2)和变体的大小，以及要引入的特异性或随机突变的数目。一般而言，寡核苷酸的大小(包括在它们之间的任何重叠)可以由熟练技术人员基于本文公开的内容适当地进行选择。
例如，但不限于，为了装配编码VH，VL或VHH结构域的核苷酸序列或核酸的组，合适的寡核苷酸将具有约10个和约200个核苷酸之间的长度，具体地介于约20个和约100个核苷酸之间的长度，如约30，40，50，60或70个核苷酸，合适的重叠为介于约10个到约30个核苷酸的寡核苷酸，如约15个核苷酸；其一般意味着为了装配编码VH，VL或VHH结构域的核苷酸序列或核酸的组，可以使用介于约4个到约40个之间，如介于约5个和约20个之间，如约6，8，10，12或16个不同的寡核苷酸。可以使用类似大小的寡核苷酸，和/或类似数目的不同寡核苷酸用于产生其它蛋白或多肽。还对于熟练技术人员清楚的是并非所有在步骤a)中使用的寡核苷酸将会需要具有绝对相同的长度，也并非例如寡核苷酸将会需要分别绝对地对应于构架序列或CDR’s。不过，对于熟练技术人员清楚的是为了让寡核苷酸得以装配，寡核苷酸必须适当地具有核苷酸的短重叠区段并且还在有义和反义方向之间适当地交替(参见例如Stemmer等.，同上，和本文引用的一些其它现有技术)，并且寡核苷酸的变体一般将会与所述寡核苷酸具有相同的长度(除非，例如，所述变体包含一种或多种插入或缺失作为特异性突变)。另外，最优选地，优选选择和设计所述寡核苷酸从而使得特异性突变不是短重叠区段的一部分。
所用的寡核苷酸可以以任何其本身已知的方式获得，例如使用其本身已知进行(自动)DNA合成的方法。
可以将本文所述的方法中使用的每种寡核苷酸及其变体以任何适于提供需要的氨基酸序列(2)及其需要的类似物的量加入到PCR装配反应中。在这样做时，非限制性地，所述寡核苷酸及其变体可以以等摩尔量或非等摩尔量加入。当需要产生氨基酸序列(2)及其在给定位置上具有等同分布的特异性突变的类似物时，将向反应混合物中加入等摩尔量的寡核苷酸及其变体，其包括所述位置并编码需要的氨基酸残基和特异性突变。当需要不均分布的特异性突变时，可以相应地调整编码寡核苷酸及其变体的比例(例如，如果在给定位置上优选原始的，天然的或野生型的氨基酸，则可以相对于类似寡核苷酸提高编码寡核苷酸的浓度)。
PCR装配反应可以以任何本身已知的适合方式进行，为此再一次地参考Stemmer等.，同上，和本文引用的一些其它现有技术。
方便地，可以将PCR装配反应作为单-步骤PCR反应进行。所述装配反应可以在包括所有寡核苷酸的“集合体”的单反应混合物中进行，或可以通过使用一系列反应混合物通过平行反应进行，其中在每种反应混合物中存在的寡核苷酸是这样的以致，在装配时，每种反应混合物提供不同的类似物。后者可以例如以适合的多孔形式进行，并且也可以适当地自动化。
此外，在装配后，编码全长氨基酸序列/变体的核苷酸序列可以通过使用正向引物和反向引物的(最终)扩增来产生(即“拯救”)，所述引物分别在编码需要的氨基酸序列/变体的核苷酸序列的3’-末端和5’末端退火。
在PCR装配后，可以利用任何合适的本身已知的技术或技术的组合来适当地分离、纯化、克隆和/或表达编码所述类似物的核苷酸序列。表达后，随后可以利用任何合适的本身已知的方法、技术或测定法或技术的组合对由此获得的类似物测试或筛选一种或多种需要的性质或性质的组合，如本文进一步所述。
基于公开内容和本文所引用的现有技术，用来分离、纯化、克隆和/或表达所述核苷酸序列的合适技术对于熟练技术人员将是清楚的。类似地，基于公开内容和本文所引用的现有技术，用于对类似物测试或筛选一种或多种需要的性质或性质的组合的合适技术对于熟练技术人员也将是清楚的。
还如上面所提及的，可以利用本文所述方法产生的序列可以是(或可以编码)免疫球蛋白序列，即包含免疫球蛋白折叠或能够形成免疫球蛋白折叠的序列，例如通过在适当的情形下折叠来形成免疫球蛋白折叠。类似地，本文所述的方法可以用于产生起始序列的一系列类似物，所述起始序列包含免疫球蛋白折叠或能够形成免疫球蛋白折叠。
更具体地，可以利用本文所述方法产生的序列可以包括(或可以编码)免疫球蛋白可变结构域序列或其适合的片段，如轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)或其适合的片段；或重链可变结构域序列(例如，VH-序列)或其适合的片段，或基本由其组成(在本发明的上下文中，可变结构域序列的“合适片段”是适合用作单抗原结合结构域的片段，其(仍然)能够特异性结合(如本文定义)目标抗原，并且其优选地还仍然包含免疫球蛋白折叠或能够形成免疫球蛋白折叠。基于本文公开的内容，这种合适的片段对于熟练技术人员来说将是清楚的，并且可以例如还包括两个或多个较小的片段，其适当地彼此相连接以形成较大片段)。
当利用本文所述的方法产生的序列是(或编码)重链可变结构域序列时，它可以是衍生自常规四链抗体的重链可变结构域序列(如，非限制性地，源自人抗体的VH序列)或是源自所谓“重链抗体”(如本文定义)的所谓VHH-序列(如本文定义)，或其适合的片段. 类似地，本文所述的方法可以用于产生用作起始序列的VL序列，VH序列或VHH序列的一系列类似物。
具体而言，但非限制性地，可以利用本文所述的方法产生的序列可以是(或可以编码)这样的序列，其基本上由4个构架区(分别是FR1-FR4)和3个互补性决定区(分别是CDR1-CDR3)组成；或这种序列的任何合适片段(该片段随后将通常包含形成至少一个CDR’s的至少一些氨基酸残基，如本文进一步所述)。类似地，本文所述的方法可以用于产生这种用作起始序列的序列的一系列类似物。
例如，可以利用本发明的方法产生的序列可以包含(或可以编码)结构域抗体或适合用作结构域抗体的氨基酸序列，单结构域抗体或适合用作单结构域抗体的氨基酸序列，“dAb”或适合用作dAb的氨基酸序列，或(优选地)纳米抗体TM，或其任何合适的片段。类似地，本文所述的方法可以用于产生用作起始序列的结构域抗体，单结构域抗体，“dAb”或纳米抗体TM的一系列类似物。
如本文提及的，本文所述的方法可以特别用于提供(改进的)可以用作单抗原结合结构域的氨基酸序列。
因此，通过本文所述的方法提供的氨基酸序列可以针对(如本文定义)任何合适或需要的抗原，靶标或蛋白。如熟练技术人员将会清楚的是，这将会通常由存在于所述氨基酸序列中的CDR’s或其它抗原-结合位点或残基来确定，其又将由起始序列的选择来确定。一般而言，由本文所述的方法提供的氨基酸序列将能够特异性结合(如本文定义)目标或需要的抗原，靶标或蛋白。
更具体地，可以利用本文所述的方法产生的氨基酸序列可以是这样的，以致其 i)以10-5-10-12摩尔/升或更小，优选地10-7-10-12摩尔/升或更小，更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)结合目标或需要的靶标(即具有105-1012升/摩尔或更大，优选地107-1012升/摩尔或更大，更加优选地108-1012升/摩尔的缔合常数(KA))； 和/或是这样的，以致其 ii)以介于102M-1s-1到约107M-1s-1之间，优选地介于103M-1s-1和107M-1s-1之间，更加优选地介于104M-1s-1和107M-1s-1之间，如介于105M-1s-1和107M-1s-1之间的缔合速率(kon-rate)结合到目标或需要的靶标上； 和/或是这样的，以致其 iii)以介于1s-1(t1/2＝0.69s)和10-6s-1之间(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合体)，优选地介于10-2s-1和10-6s-1之间，更加优选地介于10-3s-1和10-6s-1之间，如介于10-4s-1和10-6s-1之间的解离速率(koff速率)结合到目标或需要的靶标上。
例如，可以使用所述方法产生的单价氨基酸序列可以是这样，以致它将以小于500nM，优选小于200nM，更优选小于10nM，诸如小于500pM的亲和性与目标或需要的靶标结合。
在一个特别优选，但非限制性的方面中，本文所述的方法可以用于从天然存在的或野生型VHH序列(即以本身已知的方式获得的，对于其可以例如参考本文引用的关于纳米抗体和VHH序列的现有技术)起始来提供纳米抗体序列的组，集合或文库。接着，可以对该纳米抗体序列(来自所述组，集合或文库的各个纳米抗体序列)的组，集合或文库进行筛选或测试从而提供与用作预定的起始序列的野生型VHH序列比较具有一种或多种需要的或改进的性质的纳米抗体序列。
特别地，根据该方面，本文所述的方法可以用于从天然存在或野生型VHH序列起始来提供人源化纳米抗体的组，集合或文库。可以接着对来自所述组，集合或文库的各个人源化纳米抗体序列进行测试从而确定所述一种或多种人源化取代对所述纳米抗体的性质的影响(和具体地，在引入一种或多种人源化取代后，获得的序列是否保持纳米抗体的有利性质)，和/或可以对人源化纳米抗体序列的该组，集合或文库进行筛选从而得到这样的纳米抗体序列，其与用作预定的起始序列的首次用于实验的(naive)VHH序列相比具有一种或多种需要的或改进的性质。可以使用本文所述的方法作为特异性突变测试/引入的适合的人源化取代还将通过下文的进一步描述(参见例如表A-3-A-8)变得清楚，并且可以在一个或多个标志残基包括一种或多种人源化取代和/或在所述纳米抗体序列的其它位置包括一种或多种人源化取代。
在另一个特别优选，但非限制性的方面中，本文所述的方法可以用于从天然存在或首次用于实验的VHH序列起始，提供在一个或多个CDR’s中具有一种或多种特异性突变的纳米抗体序列的组，集合或文库。可以接着对该纳米抗体序列(或来自所述组，集合或文库的各个纳米抗体序列)的组，集合或文库进行筛选或测试从而提供与用作预定的起始序列的首次用于实验的VHH序列或其它纳米抗体序列相比，对需要的抗原具有改进的亲和性和/或特异性的纳米抗体序列。如对于熟练技术人员清楚的，根据该方面，本发明考虑了首次用于实验的VHH序列或其它纳米抗体序列的亲和力成熟。
在另一个特别优选，但是非限制性的方面中，本文所述的方法可以用于从天然存在或首次用于实验的VH序列(即以本身已知的方式获得)起始，提供骆驼源化的VH序列的组，集合或文库。骆驼源化的VH序列的该组，集合或文库(或来自所述组，集合或文库的各个骆驼源化的VH序列)可以接着进行筛选或测试，从而提供与用作预定的起始序列的首次用于实验的VHH序列相比具有一种或多种需要的或改进的性质的序列。具体而言，可以接着测试来自所述组，集合或文库的各个骆驼源化的VH序列从而确定一种或多种骆驼源化取代对VH序列的性质的影响(和具体的，所述骆驼源化取代是否赋予VH序列一种或多种作为纳米抗体特征的有利性质)，和/或可以筛选骆驼源化的VH序列的该组，集合或文库从而得到具有一种或多种作为纳米抗体的特征的有利性质的序列。可以使用本文所述的方法作为特异性突变测试/引入的适合的骆驼源化取代通过本文的进一步描述将是清楚的(参见例如表A-3至A-8)，并且可以在一个或多个标志残基(其通常是优选的)和/或在纳米抗体序列的其它位置具有一种或多种人源化骆驼源化。
在另一个方面，本发明涉及包含至少一种使用本文所述的方法产生的氨基酸序列(或其氨基酸序列或其核苷酸序列已经使用本文所述的方法产生，其中实际的氨基酸序列、核苷酸序列、蛋白或多肽已经使用任何本身已知的适合的技术进行制备)或基本由其组成，和任选地还包含一种或多种其它基团，残基，部分或结合单位。如通过本文进一步的公开内容，熟练技术人员将清楚的是，所述其它的基团，残基，部分，结合单位或氨基酸序列可以给或可以不给本发明的氨基酸序列(和/或它存在于其中的化合物或构建体)提供其它的功能并且可以或可以不修饰本发明的氨基酸序列的性质。
例如，所述其它基团、残基、部分或结合单位可以是一种或多种额外的氨基酸序列，以致所述化合物或构建体是一种(融合)蛋白或(融合)多肽。在一个优选而非限制性的方面中，所述一种或多种其它基团、残基、部分或结合单位是免疫球蛋白序列。甚至更优选地，所述一种或多种其它基团、残基、部分或结合单位选自由下列各项组成的组结构域抗体、适合用作结构域抗体的氨基酸序列、单结构域抗体、适合用作单结构域抗体的氨基酸序列、“dAb”、适合用作dAb的氨基酸序列、或纳米抗体。
备选地，例如，所述基团、残基、部分或结合单位可以是化学基团、残基、部分，其自身可以是或可以不是生物学和/或药理学活性的。例如，并且不限于，所述基团可以连接到一种或多种本发明的氨基酸序列上，以提供本发明的氨基酸序列或多肽的“衍生物”，如本文进一步所述。
也在本发明范围内的是这样的化合物或构建体，其包括一种或多种本文所述的衍生物或基本上由其组成，并且任选地还包括任选地通过一个或多个接头连接的一种或多种其它基团、残基、部分或结合单位。优选地，所述一个或多个其它基团、残基、部分或结合单位是氨基酸序列。
在上述化合物或构建体中，所述一种或多种本发明的氨基酸序列以及所述一种或多种基团、残基、部分或结合单位可以彼此直接连接和/或通过一个或多个适当的接头或间隔基连接。例如，当所述一种或多种基团、残基、部分或结合单位是氨基酸序列时，所述接头可以也是氨基酸序列，以致所得到的化合物或构建体是融合(蛋白)或融合(多肽)。
本发明的化合物或多肽通常可以通过这样的方法制备，所述方法包括将所述一种或多种本发明的氨基酸序列任选地通过一个或多个适当的接头适当地连接到所述一种或多种其它基团、残基、部分或结合单位上的至少一个步骤，以提供本发明的化合物或多肽。本发明的多肽还可以通过这样的方法制备，所述方法通常至少包括下述步骤提供编码本发明的多肽的核酸，以适当方式表达所述核酸，和回收所表达的本发明的多肽。这样的方法可以以本身已知的方式进行，例如，基于本文进一步所述的方法和技术，其对于熟练的技术人员将是清楚的。
由本发明的氨基酸序列起始，设计/选择和/或制备本发明的化合物或多肽的方法在本发明中还称为“格式化”所述的本发明的氨基酸序列；并且组成本发明的化合物或多肽的一部分的本发明的氨基酸被认为是“格式化的”或采用所述的本发明的化合物或多肽的“格式”。基于本文的公开内容，熟练的技术人员将清楚本发明的氨基酸序列可以被格式化的方法实例以及所述格式的实例；并且所述格式化的氨基酸序列形成本发明的另一个方面。
在本发明的一个具体方面中，与相对应的本发明的氨基酸序列相比，本发明的化合物或本发明的多肽可以具有增加的半衰期。基于本文进一步的公开内容，所述化合物和多肽的一些优选而非限制性实例对于熟练的技术人员将变得清楚。
在另一个方面中，本发明涉及编码本发明的氨基酸序列或本发明的多肽(或其适当的片段)的核酸。这样的核酸在本发明中还称为“本发明的核酸”，并且例如，可以采用遗传构建体的形式，如本文进一步所述。
在另一个方面中，本发明涉及表达(或在适当的环境下能够表达)本发明的氨基酸序列和/或本发明的多肽的宿主或宿主细胞，和/或包含本发明的核酸的宿主或宿主细胞。通过本文进一步的描述，所述宿主或宿主细胞的一些优选而非限制性的实例将变得清楚。
本发明还涉及一种产品或组合物，所述产品或组合物包含或包括至少一种本发明的氨基酸序列、至少一种本发明的多肽(或其适当的片段)和/或至少一种本发明的核酸、以及任选地一种或多种所述组合物的本身已知的其它成分，这取决于所述组合物的目的用途。例如，这样的产品或组合物可以是药物组合物(如本文所述)、兽医用组合物或用于诊断用途的产品或组合物(同样如本文所述)。通过本文进一步的描述，所述产品或组合物的一些优选而非限制性的实例将变得清楚。
在下文进一步描述中，本发明将参考其一个优选的但非限制性的方面更详细地进行解释和举例说明，即其中通过本文所述的方法提供的氨基酸序列是纳米抗体和/或其中本文所述的方法用于提供改进的纳米抗体，将VHH序列或其它纳米抗体的序列作为起点。
然而，应该注意本发明可以类似地用于提供可以用作单抗原结合结构域(并且所述氨基酸序列如本文进一步定义)的任何其它氨基酸序列和/或改进可以用作单抗原结合结构域的任何其它氨基酸序列，如结构域抗体，单结构域抗体或dAb。基于本文公开内容，这将对于熟练技术人员也是清楚的。
对于纳米抗体的概括描述，参考下文的进一步描述，以及参考本文所引用的现有技术。在这一方面，然而，应该注意到，本文描述和现有技术主要描述所谓“VH3种类”的纳米抗体(即，与VH3种类的人种系序列如DP-47、DP-51或DP-29具有高度序列同源性的纳米抗体)。然而，应该注意到，本发明在其最广泛意义上通常涵盖任何类型的使用本文所述的方法产生的纳米抗体，并且例如，还涵盖属于所谓的“VH4种类”的纳米抗体(即，与VH4种类的人种系序列如DP-78具有高度序列同源性的纳米抗体)，如埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)于2006年4月14日提交的美国临时申请60/792,279，题为“DP-78样纳米抗体”(DP-78-like Nanobodies)所述。
一般地，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)可以特别地特征在于，在一个或多个构架序列(同样如本文进一步所述)中存在一个或多个“标志残基(hallmark residues)”(如本文所述)。
因此，通常，纳米抗体可以定义为具有下述(通用)结构的氨基酸序列 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 其中FR1-FR4分别是指构架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补性决定区1至3，并且其中一个或多个标志残基如本文进一步所定义，其中构架序列如本文进一步定义。
更具体地，纳米抗体在其最广泛意义上通常可以定义为这样的多肽，所述多肽包括 a)包含被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中在按照Kabat编号方式的位置108处的氨基酸残基是Q； 和/或 b)包含被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中按照Kabat编号方式在位置45处的氨基酸残基是带电荷的氨基酸(如本发明所定义)或半胱氨酸残基，并且在位置44处的氨基酸残基优选是E； 和/或 c)包含被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中按照Kabat编号方式在位置103处的氨基酸残基选自由P、R和S组成的组，并且特别选自由R和S组成的组。
因此，在第一优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结构 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 其中FR1-FR4分别是指构架区1至4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1至3，并且其中 a)按照Kabat编号方式在位置108处的氨基酸残基是Q； 和/或其中 b)按照Kabat编号方式在位置45处的氨基酸残基是带电荷的氨基酸或半胱氨酸，并且按照Kabat编号方式在位置44处的氨基酸残基优选是E； 和/或其中 c)按照Kabat编号方式在位置103处的氨基酸残基选自由P、R和S组成的组，并且特别选自由R和S组成的组； 并且其中 d)CDR1，CDR2和CDR3是这样的以致纳米抗体如下结合其目的靶标或需要的靶标，所述结合具有 i)10-5-10-12摩尔/升或更小、并且优选地为10-7-10-12摩尔/升或更小、并且更优选地10-8-10-12摩尔/升的解离常数(KD)(即具有105-1012升/摩尔或更多、优选地107-1012升/摩尔或更多和更优选地108-1012升/摩尔的缔合常数(KA))； ii)和/或 iii)102M-1s-1-约107M-1s-1，优选103M-1s-1-107M-1s-1，更优选104M-1s-1-107M-1s-1，诸如105M-1s-1-107M-1s-1的缔合速率(kon-速率)； iv)和/或 v)1s-1(t1/2＝0.69s)-10-6s-1(假定具有多天的t1/2的几乎不可逆的复合体)，优选10-2s-1-10-6s-1，更优选10-3s-1-10-6s-1，诸如10-4s-1-10-6s-1的解离速率(koffrate)。
特别地，纳米抗体在其最广泛意义上可以通常定义为这样的多肽，所述多肽包括 a)包括被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中按照Kabat编号方式在位置108处的氨基酸残基是Q； 和/或 b)包括被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中按照Kabat编号方式在位置44处的氨基酸残基是E，并且其中按照Kabat编号方式在位置45处的氨基酸残基是R； 和/或 c)包括被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列，其中按照Kabat编号方式在位置103处的氨基酸残基选自由P，R和S组成的组，并且特别是选自由R和S组成的组。
因此，根据一个优选的但非限制性的方面，纳米抗体可以具有下述结构 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 其中FR1-FR4分别是指构架区1至4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1至3，并且其中 a)按照Kabat编号方式在位置108处的氨基酸残基是Q； 和/或其中 b)按照Kabat编号方式在位置44处的氨基酸残基是E，并且其中按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R； 和/或其中 c)按照Kabat编号方式在位置103处的氨基酸残基选自由P、R和S组成的组，并且特别选自由R和S组成的组； 并且其中 d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义。
特别地，纳米抗体可以具有下述结构 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 其中FR1-FR4分别是指构架区1至4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1至3，并且其中 a)按照Kabat编号方式在位置108处的氨基酸残基是Q； 和/或其中 b)按照Kabat编号方式在位置44处的氨基酸残基是E，并且其中按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R； 和/或其中 c)按照Kabat编号方式在位置103处的氨基酸残基选自由P、R和S组成的组，并且特别选自由R和S组成的组； 并且其中 d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义。
特别地，按照本发明方面的一个优选的但非限制性的方面，纳米抗体通常可以定义为包括包含被3个互补性决定区/序列中断的4个构架区/序列的氨基酸序列的多肽，其中 a-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由A，G，E，D，G，Q，R，S，L组成的组；并且优选地选自由G，E或Q组成的组；和 a-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R或C组成的组；并且优选地选自由L或R组成的组；和 a-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R或S组成的组；并且优选地是W或R，并且最优选地为W； a-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q； 或者其中 b-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由E和Q组成的组；和 b-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；和 b-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R和S组成的组；并且优选地为W； b-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；并且优选地为Q； 或者其中 c-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由A，G，E，D，Q，R，S，和L组成的组；并且优选地选自由G，E和Q组成的组；和 c-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R和C组成的组；并且优选地选自由L和R组成的组；和 c-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P，R和S组成的组；并且特别选自由R和S组成的组；和 c-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；优选地为Q； 并且其中 d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义。
因此，在另一个优选而非限制性的方面，纳米抗体可以具有下述结构 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 其中FR1至FR4分别是指构架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补性决定区1至3，并且其中 a-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由A，G，E，D，G，Q，R，S，L组成的组；并且优选地选自由G，E或Q组成的组； 并且其中 a-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R或C组成的组；并且优选地选自由L或R组成的组； 并且其中 a-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R或S组成的组；并且优选地选自由W或R组成的组，并且最优选地为W； 并且其中 a-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基是Q； 并且其中 d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义。
在另一个优选而非限制性的方面，纳米抗体可以具有下述结构 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 其中FR1至FR4分别是指构架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补性决定区1至3，并且其中 b-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由E和Q组成的组；并且其中 b-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基是R；并且其中 b-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由W，R和S组成的组；并且优选地为W； 并且其中 b-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；并且优选地为Q； 并且其中 d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义。
在另一个优选的但非限制性方面中，纳米抗体可以具有下述结构 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 其中FR1至FR4分别是指构架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补性决定区1至3，并且其中 c-1)按照Kabat编号方式在位置44的氨基酸残基选自由A，G，E，D，Q，R，S，和L组成的组；并且优选地选自由G，E和Q组成的组； 并且其中 c-2)按照Kabat编号方式在位置45的氨基酸残基选自由L，R和C组成的组；并且优选地选自由L和R组成的组； 并且其中 c-3)按照Kabat编号方式在位置103的氨基酸残基选自由P，R和S组成的组；并且特别选自由R和S组成的组； 并且其中 c-4)按照Kabat编号方式在位置108的氨基酸残基选自由Q和L组成的组；优选地为Q； 并且其中 d)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义。
纳米抗体的两个特别优选的但非限制性的组是按照上述a)；按照上述(a-1)到(a-4)；按照上述b)；按照上述(b-1)到(b-4)；按照上述(c)；和/或按照上述(c-1)到(c-4)的那些，其中 i)按照Kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列GLEW(或如文所述的GLEW-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q； 并且其中 ii)按照Kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列KERE或KQRE(或如所述的KERE-样序列)，并且在位置1 08的氨基酸残基是Q或L，并且优选地为Q。
因此，在另一个优选的但非限制性方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结构 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中 i)按照Kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列GLEW(或如文定义的GLEW-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q； 并且其中 ii)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义。
在另一个优选而非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以具有下述结构 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 其中FR1-FR4分别是指构架区1-4，并且其中CDR1-CDR3分别是指互补性决定区1-3，并且其中 i)按照Kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列KERE或KQRE(或KERE-样序列)，并且在位置108的氨基酸残基是Q或L，并且优选是Q； 并且其中 ii)CDR1，CDR2和CDR3如本文定义。
在所述其中按照Kabat编号方式在位置43-46的氨基酸残基形成序列KERE或KQRE的纳米抗体中，在位置37的氨基酸残基最优选是F。在所述其中按照Kabat编号方式在位置44-47的氨基酸残基形成序列GLEW的本发明的纳米抗体中，在位置37的氨基酸残基选自由Y，H，I，L，V或F组成的组，并且最优选是V。
因此，但不以任何方式局限于此，基于在上述位置存在的氨基酸残基，纳米抗体可以通常基于下述三组分类 i)“GLEW-组”按照Kabat编号方式在位置44-47具有氨基酸序列GLEW并且按照Kabat编号方式在位置108具有Q的纳米抗体。如本文进一步所述，在这一组内的纳米抗体通常在位置37具有V，并且可以在位置103具有W，P，R或S，并且优选地在位置103具有W。所述GLEW组还包括一些GLEW-样的序列，诸如下表A-3中提及的那些。更具体地，但非限制地，属于GLEW-组的纳米抗体可以定义为在位置44具有G和/或在位置47具有W的纳米抗体，其中位置46通常是E并且其中优选地位置45不是带电的氨基酸残基并且不是半胱氨酸； ii)“KERE-组”按照Kabat编号方式在位置43-46具有氨基酸序列KERE或KQRE(或另一个KERE-样序列)并且按照Kabat编号方式在位置108具有Q或L的纳米抗体。如本文进一步所述，在这一组内的纳米抗体通常在位置37具有F，在位置47具有L或F；并且可以在位置103具有W，P，R或S，并且优选地在位置103具有W。更具体地，但非限制地，属于KERE-组的纳米抗体可以定义为在位置44具有K，Q或R(通常为K)的纳米抗体，其中位置45是带电的氨基酸残基或半胱氨酸，并且位置47如本文进一步定义； iii)“103 P，R，S-组”在位置103具有P，R或S的纳米抗体。这些纳米抗体可以在按照Kabat编号方式的位置44-47具有氨基酸序列GLEW或者在按照Kabat编号方式的位置43-46具有氨基酸序列KERE或KQRE，后者最优选地与位置37的F和位置47的L或F组合(如关于KERE-组所定义)；并且可以在按照Kabat编号方式的位置108具有Q或L，并且优选地具有Q。
此外，在适当的情形中，纳米抗体可以属于这些种类的两种或更多种(即，具有其特征)。例如，一个特别优选的纳米抗体组在位置44-47具有GLEW或GLEW-样序列；在位置103具有P，R或S(并且特别是R)；并且在位置108具有Q(其可以是人源化为L)。
更一般地，应该注意，上述定义涉及上述描述和应用于以天然(即，非人源化的)VHH序列的形式存在的纳米抗体，且这些纳米抗体的人源化的变体可以包含除了上述显示的那些(即，如本文定义的一个或多个人源化的取代)之外的其他氨基酸残基。例如，且不限于，在GLEW-组或103 P，R，S-组的一些人源化的纳米抗体中，在位置108的Q可以被人源化为108L。如本文已经提及的，基于本文的公开内容，其他人源化的取代(及其适当的组合)将为熟练的技术人员所清楚。另外，或备选地，其他潜在有用的人源化取代可以通过将天然存在的VHH序列的构架区序列与一个或多个紧密相关的人VH序列的相对应的构架序列进行比较而确定，之后，可以将因此确定的一个或多个潜在有用的人源化取代(或其组合)引入到所述VHH序列中(使用本文所述的方法之一)，且由此获得的人源化的VHH序列可以检测针对靶标的亲和性、稳定性、表达的容易性和水平、和/或其他需要的性质。以这种方式，本文所述的方法将允许熟练的技术人员通过有效程度的试验和误差，确定具体的纳米抗体的其他适当的人源化取代(或其适当的组合)。此外，基于前述，使用本文所述的方法，纳米抗体(的构架区)可以被部分人源化或完全人源化。
因此，在另一个优选的但非限制性的方面，纳米抗体可以属于GLEW-组(如本文所定义)的纳米抗体。
在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以是属于KERE-组(如本文所定义)的纳米抗体，并且其中CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义。
因此，在另一个优选的但非限制性的方面，本发明的纳米抗体可以是属于103 P，R，S-组(如本文所定义)的纳米抗体，并且其中CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义。
此外，更一般地，并且除了上文提及的108Q，43E/44R和103 P，R，S残基之外，本发明的纳米抗体可以在常规VH结构域中形成(部分)VH/VL界面的一个或多个位置包含一种或多种氨基酸残基，所述氨基酸残基比在相对应的天然存在的VH序列中同一位置天然存在的氨基酸残基更加高度带电荷，并且特别是一个或多个带电荷的氨基酸残基(如表A-2中提及)。这样的取代包括，但不限于下表A-3中提及的GLEW-样序列；以及国际申请WO 00/29004中所述关于所谓的“微体(microbodies)”的取代，例如以获得在位置108具有Q和在位置44-47具有KLEW组合的纳米抗体。基于本发明的公开内容，在这些位置的其它可能的取代对于熟练的技术人员应该是清楚的和/或可以由熟练技术人员使用本文所述的方法来确定。
在一个方面中，在纳米抗体的位置83的氨基酸残基可以选自由L，M，S，V和W组成的组；并且优选地为L。
此外，在一个方面中，纳米抗体的位置83的氨基酸残基可以选自由R，K，N，E，G，I，T和Q组成的组；并且最优选地为K或E(对于与天然存在的VHH结构域相对应的纳米抗体)或R(对于“人源化”纳米抗体，如本文所述)。在一个方面中，位置84的氨基酸残基选自由P，A，R，S，D T，和V组成的组，并且最优选地是P(对于与天然存在的VHH结构域相对应的纳米抗体)或R(对于“人源化”纳米抗体，如本文所述)。
此外，在一个方面中，纳米抗体的位置104的氨基酸残基可以选自由G和D组成的组；并且最优选地是G。
熟练技术人员还将清楚，本文提及的特异性取代(特别是本文提及的人源化取代)也可以作为“特异性突变”在本文所述的方法中使用/引入。
总而言之，在所述纳米抗体中如上文提及的在位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的氨基酸残基在本文中还叫作“标志残基”。所述标志残基以及在最接近的相关的人VH结构域，即VH3的相对应的位置的氨基酸残基总结在表A-3中。
在天然存在的VHH结构域中存在的这些标志残基的一些特别优选但非限制性的组合在表A-4中提及。为了比较，将叫作DP-47的人VH3的相对应氨基酸残基以斜体显示。
从下面的表A-3至A-8中可见，一些可以使用本文所述的方法作为特异性突变引入和测试的适合的(但非限制性的)人源化取代(或人源化取代的组合)或骆驼源化取代(或骆驼源化取代的组合)对于熟练的技术人员也将是清楚的。
可以使用本文所述的方法作为特异性突变引入和测试的一些其他取代(任选地与一种或多种意欲提高亲和性的人源化取代组合和/或与一种或多种特异性突变组合)，例如包括一种或多种保守性取代(如本文所述)和/或其中氨基酸残基被天然存在于另一个VHH结构域的相同位置的另一个氨基酸残基置换的取代(关于所述取代的一些非限制性的实例，参见表A-5到A-8)。更一般地，可以使用本文所述的方法引入和测试意图提高纳米抗体的性质或纳米抗体的需要的性质的平衡或组合的任何一种或多种取代，缺失或插入，或其任意组合，并且基于本文公开内容，熟练的技术人员将通常能够选择所述特异性突变并且设计在步骤a)中使用的寡核苷酸，其将在PCR装配和任选地表达后，提供包含需要的特异性突变的序列或类似物。
如也可以从在上述表A-5到A-8中给出的关于VHH熵和VHH可变性的数据可见，在构架区中的一些氨基酸残基比其它的更保守。一般地，尽管本发明在其最广泛的意义上不限于此，本发明的方法优选地用于在较不保守的位置引入特异性突变。此外，一般地，氨基酸取代优于氨基酸缺失或插入。
表A-3在纳米抗体中的标志残基

在所述纳米抗体中，在除所述标志残基外的任何其它位置的每一氨基酸残基可以是在天然存在的VHH结构域的相应位置(按照Kabat编号方式)天然存在的任何氨基酸残基。
熟练的技术人员对于这样的氨基酸残基应该是清楚的。表A-5至A-8提及一些非限制性的残基，其可以存在于天然存在的VHH结构域的FR1、FR2、FR3和FR4的任一位置(按照Kabat编号方式)。对于任一位置，在天然存在的VHH结构域的任一位置最经常存在的氨基酸残基(并且其在纳米抗体中对于所述位置是最优选的氨基酸残基)以粗体显示；并且对于每一位置的其它优选的氨基酸残基已加下划线(注意在天然存在的VHH结构域的位置26-30发现的氨基酸残基的数目支持Chothia(同前所述)的构成编号方式的基础的假说，即，在这些位置的残基已经形成CDR1的一部分。) 在表A-5至A-8中，还已经提及可以在人VH3结构域的任一位置存在的一些非限制性的残基。此外，对于每一位置，在天然存在的人VH3结构域的每一位置最经常存在的氨基酸残基以粗体显示；并且其它优选的氨基酸残基加下划线。
仅是为了参考，表A-5至A-8还包含对于代表性样品1118 VHH序列关于在每个氨基酸位置的VHH熵(“VHH Ent.”)和VHH可变性(“VHH Var.”)的数据(数据由乌得勒支大学(Utrecht University)的David Lutje Hulsing和TheoVerrips教授馈赠)。关于VHH熵和VHH可变性的数值提供对于被分析的1118VHH序列之间的氨基酸残基的可变性和保守度的量度低数值(即＜1，诸如＜0.5)表示在所述VHH序列之间氨基酸残基是高度保守的(即，几乎没有可变性)。例如，在位置8的G和在位置9的G分别具有0.1和0的VHH熵数值，这表示这些残基是高度保守的，并且具有很小的可变性(并且假设在所分析的所有1118序列中位置9是G)，而对于形成CDR的一部分的残基通常发现1.5或更大的数值(数据未显示)。注意(1)在表A-5至A-8第二栏列出的氨基酸残基是基于比最后两栏引用的为确定VHH熵和VHH可变性而分析的1118 VHH序列大的样品；并且(2)下述数据支持这样的假说在位置27-30的氨基酸残基以及还可能甚至在位置93和94的氨基酸残基已经形成CDR的一部分(尽管本发明不限于任何具体的假说或解释，并且如上文所提及，本发明使用按照Kabat的编号方式)。对于序列熵，序列可变性以及用于确定其的方法的一般解释，参见Oliveira等，蛋白结构，功能和遗传(PROTEINSStructure，Function and Genetics)，52544-552(2003)。
表A-5FR1中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表A-3的脚注)
表A-5FR1中的氨基酸残基的非限制性实例(续表)
表A-6FR2中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表A-3的脚注)
表A-7FR3中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表A-3的脚注)
表A-7FR3中的氨基酸残基的非限制性实例(续表)
表A-8FR4中的氨基酸残基的非限制性实例(关于脚注，参见表A-3的脚注)
因此，在另一个优选的但非限制性的方面中，本发明的纳米抗体可以定义为具有下述(通用)结构的氨基酸序列 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 其中FR1至FR4分别是指构架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补性决定区1至3，并且其中 i)在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的一个或多个氨基酸残基选自表A-3中提及的标志残基； 并且其中 ii)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义。
甚至更特别地，纳米抗体可以是具有下述(通用)结构的氨基酸序列 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 其中FR1至FR4分别是指构架区1至4，并且其中CDR1至CDR3分别是指互补性决定区1至3，并且其中 i)(优选地)在按照Kabat编号的位置11，37，44，45，47，83，84，103，104和108的氨基酸残基的一个或多个选自下表A-3中提及的标志残基； 并且其中 ii)所述氨基酸序列与SEQ ID NO’s1-22中的至少一个氨基酸序列具有至少80％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的程度，忽略形成CDR序列的氨基酸残基(在序列SEQ ID NO’s1-22中用X表示)； 并且其中 iii)CDR1，CDR2和CDR3如本文所定义。


通过本文的公开内容还清楚，本发明的方法还可以用于提供VHH序列或纳米抗体(或如本文所述的其它氨基酸序列)的一部分或片段，并且所述片段还可以适当地组合以形成包含两个以上所述部分或片段的组合的序列。此外，当本发明的方法用于提供VHH序列或纳米抗体(或如本文所述的其它氨基酸序列)时，本发明还包含其适合的部分或片段。一般地，所述部分或片段可以具有这样的氨基酸序列，其中与相应的全长序列相比，在N末端的一种或多种氨基酸残基，在C末端的一种或多种氨基酸残基，一个或多个连续的内部氨基酸残基，或其任何组合已经被删除和/或去除。例如，所述部分或片段可以如WO 06/122825中关于本文所述的纳米抗体的部分或片段所述。
本发明在其最广泛的意义上还包括使用本文所述的方法获得的氨基酸序列的衍生物。所述衍生物可以例如在WO 06/122825中所述(即关于本文所述的纳米抗体的衍生物)。
包括至少一种已经使用本文所述的方法产生的纳米抗体(或其它氨基酸序列)的蛋白或多肽一般可以包括所述纳米抗体(或其它氨基酸序列)，其在其氨基末端，在其羧基末端，或在其氨基末端和其羧基末端两端与至少一种其他的氨基酸序列融合，即从而提供包含所述纳米抗体(或其它氨基酸序列)和一种或多种其它氨基酸序列的融合蛋白。
一种或多种其他氨基酸序列可以是任何适合的和/或需要的氨基酸序列。所述其他氨基酸序列可以或可以不变化，改变或另外影响使用本文所述的方法获得的纳米抗体的(生物学)性质，并且可以或可以不将另外的功能性增加到本发明的纳米抗体或多肽。优选地，所述其它氨基酸序列是这样的，以致其将一种或多种需要的性质或官能性赋予本发明的纳米抗体或多肽。
例如，所述其他氨基酸序列也可以提供第二结合位点，所述结合位点可以针对任何所需的蛋白、多肽、抗原、抗原决定簇或表位(包括但不限于与本发明的纳米抗体所针对的相同的蛋白、多肽、抗原、抗原决定簇或表位，或不同的蛋白、多肽、抗原、抗原决定簇或表位)。
这样的氨基酸序列的实例是熟练的技术人员所清楚的，并且通常可以包括用于基于常规抗体及其片段(包括但不限于ScFv’s和单结构域抗体)的肽融合的所有氨基酸序列。例如，参考Holliger和Hudson，自然生物技术(Nature Biotechnology)，23，9，1126-1136(2005)的综述。
例如，与本发明的纳米抗体本身相比，这样的氨基酸序列可以是这样的氨基酸序列，即，其增加本发明的多肽的半衰期、溶解度、或吸光度，减小本发明的多肽的免疫原性或毒性，消除或减弱本发明的多肽的不理想的副作用，和/或赋予本发明的多肽其它有利的特性和/或减少本发明的多肽的不理想特性。所述氨基酸序列的一些非限制性实例是描述在WO06/122825中的那些(即，对于包含其中所述的一种或多种纳米抗体的多肽)，并且包括可以结合血清蛋白，诸如人血清白蛋白的其它氨基酸序列或纳米抗体。还参考例如WO 91/01743，WO 01/45746，WO 02/076489，WO03/002609，WO 04/003019，EP 0 368 684，以及本文提及的由埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)提交的美国临时申请60/843,349，60/850,774，60/850,775和埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)在2006年12月5日提交的美国临时申请，题为“能够结合血清蛋白的肽(Peptides capable ofbind to serum proteins)”(也在本文提及)。
根据另一个方面，所述一种或多种其它氨基酸序列可以包含常规4-链抗体(和具体地人抗体)和/或重链抗体的一个或多个部分，片段或结构域。还参考WO 06/1228的公开内容以及由本文提及的埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的其它申请。
根据本发明的多肽的一个具体方面，一种或多种本发明的纳米抗体可以与一种或多种抗体部分、片段或结构域连接，其赋予本发明的多肽一种或多种效应子功能，和/或可以赋予与一种或多种Fc受体结合的能力。例如，为了这一目的，并且不限于此，所述一种或多种其它氨基酸序列可以包括抗体、诸如来自重链抗体(如本文所述)并且更优选来自常规人4-链抗体的一个或多个CH2和/或CH3结构域；和/或可以形成Fc区域的(部分)和Fc区域，例如来自IgG，来自IgE或来自另一种人IgFc区域的(部分)和Fc区域。例如，WO 94/04678描述了包括骆驼科动物VHH结构域或其人源化的衍生物的重链抗体(即，纳米抗体)，其中所述骆驼科动物CH2和/或CH3结构域已被人CH2和CH3结构域取代，以提供由2条重链组成的免疫球蛋白，其中每条重链包括纳米抗体和人CH2与CH3结构域(但是无CH1结构域)，所述免疫球蛋白具有由所述CH2和CH3结构域提供的效应子功能，并且所述免疫球蛋白可以在无需任何轻链的存在下行使功能。熟练的技术人员应该清楚可以适当与本发明的纳米抗体连接以提供效应子功能的其它氨基酸序列，并且可以基于所需要的效应子功能进行选择。例如，参考WO 04/058820，WO 99/42077，和WO 05/017148，以及Holliger和Hudson同前所述的综述。与相对应的本发明的纳米抗体相比，本发明的纳米抗体与Fc部分偶联也可以导致增加的半衰期。对于一些应用，使用赋予增加的半衰期而无任何生物学显著效应子功能的Fc部分和/或恒定结构域(即，CH2和/或CH3结构域)也可以是适当的或者甚至是优选的。熟练的技术人员应该清楚包括具有增加的体内半衰期的一种或多种纳米抗体和一种或多种恒定结构域的其它适当的构建体，并且例如，其可以包括与CH3结构域任选地通过接头序列连接的两种纳米抗体。通常，具有增加的半衰期的任何融合蛋白或衍生物将优选具有大于50kD的分子量，50kD是肾吸收的截留值。
所述其它氨基酸序列还可以形成信号序列或前导序列，当合成时其引导本发明的纳米抗体或多肽从宿主细胞中分泌(例如，以提供本发明的多肽的前体-(pre-)、原-(pro-)或前原-(prepro-)形式，这取决于用来表达本发明的多肽的宿主细胞)。此外，参考WO 06/122825的一般公开内容和由本文提及的埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)提交的其它申请。
所述其它氨基酸序列还可以形成这样的序列或信号，即，所述序列或信号允许本发明的纳米抗体或多肽导向和/或透过或进入特定器官、组织、细胞、或者细胞的部分或区室，和/或所述序列或信号允许本发明的纳米抗体或多肽透过或穿过生物屏障诸如细胞膜、细胞层诸如上皮细胞层、包括实体瘤的肿瘤、或血脑屏障。此外，参考WO 06/1228的公开内容和本文提及的埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的其它申请。
对于一些应用，特别是对于意欲杀死表达本发明的纳米抗体所针对的靶标的细胞(例如，在治疗癌症时)，或者意欲减少或减缓所述细胞的生长和/或增殖的那些应用中，本发明的纳米抗体还可以与(细胞)毒性蛋白或多肽连接。例如，可以与本发明的纳米抗体连接以提供本发明的细胞毒性多肽的所述毒性蛋白和多肽的实例对于熟练的技术人员是清楚的，并且例如，可以在上文引用的现有技术和/或本文的进一步描述中找到。一个实例是在WO 03/055527中所述的所谓的ADEPTTM技术。
按照一个优选但非限制性的方面，所述一种或多种其它氨基酸序列包括至少一种其它的纳米抗体，以提供包括至少两种、诸如三种、四种、五种或更多种纳米抗体的本发明的多肽，其中所述纳米抗体可以任选地通过一个或多个接头序列(如本文所定义)连接。包括两种或更多种纳米抗体(其中至少一个是本发明的纳米抗体)的本发明的多肽，在本发明中还将称为本发明的“多价”多肽，并且在所述多肽中存在的纳米抗体还将在本发明中称为处于“多价形式”。例如，本发明的“二价”多肽包括2种纳米抗体，任选地通过一个接头序列连接，而本发明的“三价”多肽包括3种纳米抗体，任选地通过两个接头序列连接；等等；其中在所述多肽中存在的至少一种纳米抗体，并且至多在所述多肽中存在的所有纳米抗体，是本发明的纳米抗体。
在本发明的多价多肽中，所述两种或更多种纳米抗体可以是相同的或不同的，并且可以针对同一抗原或抗原决定簇(例如，针对相同部分或表位或者针对不同部分或表位)，或可以备选地针对不同的抗原或抗原决定簇；或它们的任何适当的组合。例如，本发明的二价多肽可以包括(a)2个相同的纳米抗体；(b)针对蛋白或抗原的第一抗原决定簇的第一纳米抗体，和针对所述蛋白或抗原的同一抗原决定簇的第二纳米抗体，所述第二纳米抗体不同于所述第一纳米抗体；(c)针对所述蛋白或抗原的第一抗原决定簇的第一纳米抗体，和针对所述蛋白或抗原的另一种抗原决定簇的第二纳米抗体；或(d)针对第一蛋白或抗原的第一纳米抗体，和针对第二蛋白或抗原(即，与所述第一抗原不同)的第二纳米抗体。类似地，本发明的三价多肽可以，例如但不限于此，包括(a)3种相同的纳米抗体；(b)针对抗原的第一抗原决定簇的两个相同的纳米抗体，和针对同一抗原的不同抗原决定簇的第三纳米抗体；(c)针对抗原的第一抗原决定簇的两种相同的纳米抗体，和针对不同于所述第一抗原的第二抗原的第三纳米抗体；(d)针对第一抗原的第一抗原决定簇的第一纳米抗体，针对所述第一抗原的第二抗原决定簇的第二纳米抗体，和针对不同于所述第一抗原的第二抗原的第三纳米抗体；或(e)针对第一抗原的第一纳米抗体，针对不同于所述第一抗原的第二抗原的第二纳米抗体，和针对不同于所述第一和第二抗原的第三抗原的第三纳米抗体。再次，参考WO 06/122825的公开内容和本文提及的埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的其它申请。
包含至少两种纳米抗体的本发明的多肽，其中至少一个纳米抗体针对第一抗原，并且至少一种纳米抗体针对第二抗原，还叫作本发明的“多特异性”多肽，并且存在于所述多肽中的纳米抗体还叫作处于“多特异性形式”。
对于多价和多特异性构建体的一般描述，再次参考WO 06/1228的公开内容和本文提及的埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的其它申请，以及Conrath等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，卷276，10.7346-7350，2001；Muyldermans，分子生物技术综述(Reviews in MolecularBiotechnology)74(2001)，277-302；以及例如，WO 96/34103和WO99/23221。如上提及，本发明的多特异性多肽的一个优选但非限制性的实例包括至少一种本发明的纳米抗体和至少一种提供增加的半衰期的纳米抗体。再次参考WO 06/1228的一般公开内容和本文提及的埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的其它申请。
本发明的多特异性多肽的另一个优选，但非限制性的实例包括至少一种本发明的纳米抗体，和至少一种这样的纳米抗体，其允许本发明的多肽导向和/或允许本发明的多肽透过或进入特定器官、组织、细胞、或者细胞的部分或区室，和/或允许纳米抗体透过或穿过生物屏障诸如细胞膜、细胞层诸如上皮细胞层、包括实体瘤的肿瘤、或血脑屏障。此外，参考WO06/1228的公开内容和本文提及的埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的其它申请。
在本发明的多肽中，所述一种或多种纳米抗体和所述一种或多种多肽可以直接彼此连接(例如在WO 99/23221中所述)和/或可以通过一个或多个适宜的间隔臂或接头或其任意组合而彼此连接。用于多价和多特异性多肽的适宜的间隔臂或接头应该是熟练的技术人员所清楚的，并且通常可以是本领域用来连接氨基酸序列的任何接头或间隔臂。优选地，所述接头或间隔臂适合用于构建意欲药用的蛋白或多肽。
再次参考WO 06/1228的一般公开内容和本文提及的埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的其它申请。
本发明还包括“基本上由”本发明的多肽“组成”的蛋白或多肽(其中措辞“基本上由......组成”具有基本如上文所示相同的意思)。
按照本发明的一个方面，本发明的多肽基本上以分离的形式存在，如本发明所定义。
本发明的氨基酸序列、纳米抗体、多肽和核酸可以以本身已知的方式制备，熟练的技术人员应该从本文的进一步描述中而清楚。例如，本发明的纳米抗体和多肽可以以本身已知用于制备抗体且特别是用于制备抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)的任何方式制备。制备所述氨基酸序列、纳米抗体、多肽和核酸的一些优选但非限制性的方法包括本发明所述的方法和技术。
熟练的技术人员应该清楚，用于制备本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽的一种特别有用的方法通常包括下列步骤 i)在适宜的宿主细胞或宿主生物(本文还叫作“本发明的宿主”)中或在另一种适宜的表达系统中，表达编码本发明的所述氨基酸序列、纳米抗体或多肽的核酸(本文还叫作“本发明的核酸”)，任选地接着进行 ii)分离和/或纯化这样获得的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。特别地，这样的方法可以包括下列步骤 i)在某种条件下培养和/或维持本发明的宿主，所述条件是这样的，以致本发明的所述宿主表达和/或生产至少一种本发明的氨基酸序列、纳米抗体和/或多肽；任选地接着进行 ii)分离和/或纯化这样获得的本发明的氨基酸序列、纳米抗体或多肽。
对于用于制备和表达纳米抗体的方法，技术，宿主细胞，表达系统，纯化技术等的一般描述，再次参考WO 06/122825的公开内容和本文提及的埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的其它申请。
本发明的核酸可以是单链或双链DNA或RNA的形式，并且优选地是双链DNA形式。例如，本发明的核苷酸序列可以是基因组DNA、cDNA或合成的DNA(诸如具有特别适用于在要用的宿主细胞或宿主生物体中表达的密码子使用的DNA)。
根据本发明的一个方面，本发明的核酸基本上以分离的形式存在，如本文定义。
本发明的核酸还可以是这样的形式，存在于和/或是载体的一部分，诸如例如质粒、黏端质粒或YAC，其也可以是基本上分离的形式。本发明的核酸还可以以遗传构建体的形式存在，其可以例如包含一种或多种适合的调节元件。再次参考WO 06/122825的公开内容和本文提及的埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的其它申请。
本发明的核酸可以使用本文所述的方法制备，或可以备选地以本身已知的方式，从序列和/或基于使用本文所述的方法获得的序列信息进行制备。对于所述方法和技术，再次参考WO 06/122825的公开内容和本文提及的埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的其它申请。
本发明还涉及本文所述的氨基酸序列和多肽的应用。所述应用可以例如取决于氨基酸序列和多肽所针对的抗原。例如，针对治疗相关靶标或抗原的氨基酸序列和多肽可以用于治疗目的，即用于预防和/或治疗需要其的受试者的疾病或病症。
本发明还涉及包括至少一种如本文所述的氨基酸序列或多肽，和任选地本身已知的所述组合物的一种或多种其它成分。对于治疗应用，所述组合物可以是药物制剂或制剂，其包含至少一种如本文所述的针对治疗相关靶标或抗原的氨基酸序列或多肽，和任选地至少一种药用载体，稀释剂或赋形剂和/或佐剂，和任选地一种或多种其他药物学活性多肽和/或化合物。再次参考WO 06/1228的一般公开内容和本文提及的埃博灵克斯股份有限公司(Ablynx N.V.)的其它申请。
现在，本发明将通过下列非限制性的实施例和附图来进一步描述，其中 -图1-A到1-C示意性举例说明本文所述的方法。
-图2给出用于装配纳米抗体32C9(SEQ ID No49)的71个人源化变体(SEQ ID NO’s50-212)的集合的26个重叠寡核苷酸(SEQ ID NO’s23到48)的组的序列。
-图3-A和3-B给出使用在图2中显示的26个重叠寡核苷酸(SEQ IDNO’s23到48)的组，通过PCR装配获得的纳米抗体32C9(SEQ ID No49)的71个人源化变体(SEQ ID NO’s50到212)的序列比对。
-图4纳米抗体IL6R65的CDR1/2文库(文库a和b)和CDR3文库(文库c)的氨基酸组成。在CDR3(文库c)中引入若干另外的替代从而将多样性增加到1x10e6。在CDR区下划线。
-图5在猕猴血浆效价测定中评价IL6R65和5亲和力成熟变体。
-图6在人血浆效价测定中评估IL6R65和5亲和力成熟的变体。
-图7抑制TF-1细胞的IL6-依赖性增殖。将细胞在2ng/ml人IL6和各种浓度的纳米抗体存在下培养。通过3H-胸腺嘧啶核苷掺入来测量增殖。
优选的方面 1.一种提供编码可用作(和/或意欲用作)单抗原结合结构域的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸的组、集合或文库的方法，该方法至少包括下列步骤 a)提供寡核苷酸的集合体，其包含(i)可以通过PCR装配的方式装配成编码可用作单抗原结合结构域的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸的至少两个寡核苷酸的系列，并且此外包含(ii)形成该系列的一部分的至少两个寡核苷酸中的至少一个的至少一种变体，其中所述至少一种变体区别于所述寡核苷酸(也区别于存在于该集合体中的所述寡核苷酸的其它变体，如果有的话)，所述区别之处在于它编码在一种或多种特异性突变存在上不同的氨基酸序列；和 b)将所述寡核苷酸的集合体进行PCR装配。
2.根据方面1的方法，其中提供的核苷酸序列或核酸的文库是下述核苷酸序列的文库，所述核苷酸序列每种编码作为预定氨基酸序列的类似物的氨基酸序列(并且其中所述组、集合或文库可以任选地还包含编码预定氨基酸序列的核苷酸序列)。
3.根据方面1或2的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码包含免疫球蛋白折叠或能够形成免疫球蛋白折叠的氨基酸序列。
4.根据方面1或2的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成。
5.根据方面4的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述构架区中存在一种或多种特异性突变。
6.根据方面4的方法， 其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述互补性决定区中或其邻近存在一种或多种特异性突变(优选CDR1，CDR2和/或CDR3中或其邻近的所有寡核苷酸及其变体被突变)；并且其中 c)任选地其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括按照i)或ii)中所述规则产生的互补性决定区中或其邻近的至少一种特异性突变或基本由其组成，所述突变更加优选90％的特异性突变，或最优选一种或多种特异性突变的全部，其中对于 i)通过取代原始核苷酸序列来产生互补性决定区(CDRs)中或其邻近处的一种或多种特异性突变，从而产生具有下列预定氨基酸残基的氨基酸残基 -如果原始氨基酸残基是K，用R取代； -如果原始氨基酸残基是R，用K取代； -如果原始氨基酸残基是A，用S或T或二者取代， -如果原始氨基酸残基是S，用A或T或二者取代， -如果原始氨基酸残基是T，用A或S或二者取代， -如果原始氨基酸残基是I，用L或V或二者取代； -如果原始氨基酸残基是L，用I或V或二者取代； -如果原始氨基酸残基是V，用I或L或二者取代； -如果原始氨基酸残基是F，用Y取代； -如果原始氨基酸残基是Y，用F取代； -如果原始氨基酸残基是N，用D取代； -如果原始氨基酸残基是D，用N取代； -如果原始氨基酸残基是Q，用E取代； -如果原始氨基酸残基是E，用Q取代； -如果原始氨基酸残基是G，用A取代； -如果原始氨基酸残基是M，用L取代；或 -如果原始氨基酸残基是H，C，W或P，不取代原始氨基酸残基；并且其中对于 ii)利用如上i)中的规则产生CDR3中的一种或多种特异性突变，并通过取代原始核苷酸序列从而产生具有下列预定氨基酸残基的氨基酸残基来产生CDR 1和2中或其邻近处的一种或多种特异性突变 -如果要突变在位置27上的原始氨基酸残基，用F，G，R，和S中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置28上的原始氨基酸残基，用A，I，S，T中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置29上的原始氨基酸残基，用F，G，L，S中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置30上的原始氨基酸残基，用D，G，S，T中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置31上的原始氨基酸残基，用D，I，N，S，T中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置32上的原始氨基酸残基，用D，N，Y中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置33上的原始氨基酸残基，用A，G，T，V中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置34上的原始氨基酸残基，用I，M中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置35上的原始氨基酸残基，用A，G，S中的任意一种来取代它； -并且如果原始氨基酸序列在CDR2中的位置52a上具有氨基酸序列，则使用下列规则 -如果要突变在位置50上的原始氨基酸残基，用A，C，G，S，T中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置51上的原始氨基酸残基，用I来取代它； -如果要突变在位置52上的原始氨基酸残基，用N，R，S，T中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置上的原始氨基酸残基52a，用R，S，T，W中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置53上的原始氨基酸残基，用D，G，N，S，T中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置54上的原始氨基酸残基，用D，G中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置55上的原始氨基酸残基，用D，G，S中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置56上的原始氨基酸残基，用I，N，R，S，T中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置57上的原始氨基酸残基，用T来取代它； -如果要突变在位置58上的原始氨基酸残基，用D，H，N，S，Y中的任意一种来取代它；或 -如果原始氨基酸序列在CDR2中的位置52a上不具有氨基酸序列，则使用下列规则 -如果要突变在位置50上的原始氨基酸残基，用A，G，R，S，T中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置51上的原始氨基酸残基，用I来取代它； -如果要突变在位置52上的原始氨基酸残基，用N，S，T中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置53上的原始氨基酸残基，用N，R，S，T，Y中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置54上的原始氨基酸残基，用D，G，R，S中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置55上的原始氨基酸残基，用任意G来取代它； -如果要突变在位置56上的原始氨基酸残基，用G，N，R，S，T中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置57上的原始氨基酸残基，用T来取代它； -如果要突变在位置58上的原始氨基酸残基，用D，N，T，Y中的任意一种来取代它。
7.根据方面4的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的，以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述构架区中存在一种或多种特异性突变以及在所述互补性决定区中存在一种或多种特异性突变；并且其中 c)任选地其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括按照i)或ii)中所述规则产生的互补性决定区中的至少一种特异性突变或基本由其组成，所述突变更加优选90％的特异性突变，或最优选一种或多种特异性突变的全部，其中对于 i)通过取代原始核苷酸序列从而产生具有下列预定氨基酸残基的氨基酸残基来产生互补性决定区(CDRs)中的一种或多种特异性突变 -如果原始氨基酸残基是K，用R取代； -如果原始氨基酸残基是R，用K取代； -如果原始氨基酸残基是A，用S或T或二者取代， -如果原始氨基酸残基是S，用A或T或二者取代， -如果原始氨基酸残基是T，用A或S或二者取代， -如果原始氨基酸残基是I，用L或V或二者取代； -如果原始氨基酸残基是L，用I或V或二者取代； -如果原始氨基酸残基是V，用I或L或二者取代； -如果原始氨基酸残基是F，用Y取代； -如果原始氨基酸残基是Y，用F取代； -如果原始氨基酸残基是N，用D取代； -如果原始氨基酸残基是D，用N取代； -如果原始氨基酸残基是Q，用E取代； -如果原始氨基酸残基是E，用Q取代； -如果原始氨基酸残基是G，用A取代； -如果原始氨基酸残基是M，用L取代；或 -如果原始氨基酸残基是H，C，W或P，不取代原始氨基酸残基；并且其中对于 ii)利用如上i)中的规则产生CDR3中的一种或多种特异性突变，并通过取代原始核苷酸序列从而产生具有下列预定氨基酸残基的氨基酸残基来产生CDR 1和2中的一种或多种特异性突变 -如果要突变在位置27上的原始氨基酸残基，用F，G，R，和S中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置28上的原始氨基酸残基，用A，I，S，T中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置29上的原始氨基酸残基，用F，G，L，S中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置30上的原始氨基酸残基，用D，G，S，T中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置31上的原始氨基酸残基，用D，I，N，S，T中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置32上的原始氨基酸残基，用D，N，Y中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置33上的原始氨基酸残基，用A，G，T，V中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置34上的原始氨基酸残基，用I，M中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置35上的原始氨基酸残基，用A，G，S中的任意一种来取代它； -并且如果原始氨基酸序列在CDR2中的位置52a上具有氨基酸序列，则使用下列规则 -如果要突变在位置50上的原始氨基酸残基，用A，C，G，S，T中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置51上的原始氨基酸残基，用I取代它； -如果要突变在位置52上的原始氨基酸残基，用N，R，S，T中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置52a上的原始氨基酸残基，用R，S，T，W中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置53上的原始氨基酸残基，用D，G，N，S，T中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置54上的原始氨基酸残基，用D，G中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置55上的原始氨基酸残基，用D，G，S中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置56上的原始氨基酸残基，用I，N，R，S，T中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置57上的原始氨基酸残基，用T取代它； -如果要突变在位置58上的原始氨基酸残基，用D，H，N，S，Y中的任意一种来取代它；或 -如果原始氨基酸序列在CDR2中的位置52a上不具有氨基酸序列，则使用下列规则 -如果要突变在位置50上的原始氨基酸残基，用A，G，R，S，T中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置51上的原始氨基酸残基，用I取代它； -如果要突变在位置52上的原始氨基酸残基，用N，S，T中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置53上的原始氨基酸残基，用N，R，S，T，Y中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置54上的原始氨基酸残基，用D，G，R，S中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置55上的原始氨基酸残基，用G任意一种来取代它； -如果要突变在位置56上的原始氨基酸残基，用G，N，R，S，T中的任意一种来取代它； -如果要突变在位置57上的原始氨基酸残基，用T取代它； -如果要突变在位置58上的原始氨基酸残基，用D，N，T，Y中的任意一种来取代它。
8.根据方面4-7中的任一种方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括免疫球蛋白可变结构域序列或其适合的片段，或基本由其组成。
9.根据方面8的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括结构域抗体或适于用作结构域抗体的氨基酸序列，单结构域抗体或适于用作单结构域抗体的氨基酸序列，“dAb”或适于用作dAb的氨基酸序列，或纳米抗体TM或其任何合适片段，或基本由其组成。
10.根据方面9的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括纳米抗体TM或基本由其组成。
11.利用根据方面1-10中任一项的方法可以获得的核苷酸序列或核酸的组、集合或文库。
12.产生可以用作(和/或意欲用作)单抗原结合结构域的氨基酸序列的组、集合或文库的方法，所述方法包括将根据方面11和/或利用方面1-10中任一项的方法获得的核苷酸序列或核酸的组、集合或文库进行翻译和/或表达。
13.利用方面12的方法可以获得的氨基酸序列的组、集合或文库。
14.利用根据方面1-10中任一项的方法和/或由根据方面11的组、集合或文库可以获得的核苷酸序列或核酸。
15.可以通过表达根据方面14的核苷酸序列或核酸而获得的氨基酸序列。
16.根据方面1-10中任一项的方法，其进一步包括以下步骤 c)筛选通过步骤a)和b)获得的核苷酸序列或核酸的组、集合或文库，获得编码具有一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸，以及任选地分离一种或多种编码具有所述一种或多种需要的性质的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸。
17.根据方面16的方法，其中被筛选的核苷酸序列或核酸的组、集合或文库编码预定氨基酸序列类似物的氨基酸序列组、集合或文库，其中所述核苷酸序列或核酸的组、集合或文库任选地还包括编码预定氨基酸序列的核苷酸序列或核酸。
18.根据方面17的方法，其中对被筛选的核苷酸序列的组、集合或文库筛选这样的核苷酸序列或核酸，其编码与预定氨基酸序列相比具有一种或多种改善性质的类似物。
19.根据方面1-10中任一项的方法，其进一步包括以下步骤 c)对来自通过步骤a)和b)获得的核苷酸序列或核酸的组、集合或文库的一种或多种核苷酸序列或核酸进行测试，测试它们是否编码具有一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)的氨基酸序列。
20.根据方面19的方法，其中被测试的一种或多种核苷酸序列或核酸编码作为预定氨基酸序列类似物的氨基酸序列，任选地还编码预定氨基酸序列。
21.根据方面20的方法，其中对被测试的一种或多种核苷酸序列或核酸进行测试，以便鉴定和/或提供这样的核苷酸序列或核酸，其编码与预定氨基酸序列相比具有一种或多种改善性质的类似物。
22.根据方面16-21的方法，其中所述一种或多种性质是由被筛选或测试的核苷酸序列或核酸编码的氨基酸序列的下列性质的一种或多种对目标抗原的亲和性或特异性，效能或活性，选择性，溶解度，稳定性，聚集倾向性，“黏着性”，氨基酸序列的折叠，与最接近的人类种系序列的序列同一性程度，可能被人免疫系统识别的表位的存在，潜在的免疫原性，除了与目标抗原的相互作用之外允许氨基酸序列经历一种或多种相互作用的一种或多种氨基酸残基或氨基酸残基序列的存在，在所需宿主或宿主细胞中的表达水平，半衰期，可以修饰的位点的存在或缺失，可以进行氧化作用的位点或氨基酸残基的存在或缺失，可以形成二硫键的半胱氨酸残基的存在或缺乏，和/或穿过生物膜或屏障的能力；或以上任何性质的任何所需组合。
23.根据方面22的方法，其中所述一种或多种性质是由被筛选或测试的核苷酸序列或核酸编码的氨基酸序列的下列性质的一种或多种对目标抗原的亲和性或特异性，效能或活性和/或选择性。
24.根据方面23的方法，其中所述一种或多种性质至少包括对于由被筛选或测试的核苷酸序列或核酸编码的氨基酸序列的目标抗原的亲和性或特异性。
25.根据方面22或23的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列或核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述互补性决定区中存在一种或多种特异性突变。
26.根据方面22的方法，其中所述一种或多种性质是由被筛选或测试的核苷酸序列或核酸编码的氨基酸序列的下列性质的一种或多种稳定性，聚集倾向性，“黏着性”，氨基酸序列的折叠，和/或在所需宿主或宿主细胞中的表达水平。
27根据方面27的方法，其中所述一种或多种性质至少包括由所述核苷酸序列或核酸编码的氨基酸序列的稳定性，聚集倾向性和/或“黏着性”。
28.根据方面26或27的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述构架区中存在一种或多种特异性突变。
29.根据方面22的方法，其中所述一种或多种性质至少包括由被筛选或测试的核苷酸序列或核酸编码的氨基酸序列与最接近人类种系序列的序列同一性程度。
30.根据方面29的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列或核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述构架区中存在一种或多种特异性突变。
31.根据方面22的方法，其中所述一种或多种性质至少包括在具有由被筛选或测试的核苷酸序列或核酸所编码的氨基酸序列中可以被人免疫系统识别的表位的存在，和/或至少包括被筛选或测试的核苷酸序列或核酸所编码的氨基酸序列的潜在免疫原性(如果有的话)。
32.根据方面31的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列或核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列彼此不同在于在对应于可以被人免疫系统识别的表位的氨基酸残基中存在一种或多种特异性突变。
33.可以通过根据方面16-32中任一种的方法获得的核苷酸序列或核酸。
34.可以通过表达根据方面33的核苷酸序列或核酸而获得的氨基酸序列。
35.提供编码可用作(和/或意欲用作)单抗原结合结构域和具有一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)的氨基酸序列的一种或多种核苷酸序列或核酸的方法，该方法包括筛选根据方面11的核苷酸序列或核酸的组、集合或文库，获得编码具有一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)的氨基酸序列的核苷酸序列，以及任选地分离一种或多种编码具有所述一种或多种需要的性质的氨基酸序列的核苷酸序列。
36.根据方面35的方法，其中所筛选的核苷酸序列或核酸的组、集合或文库编码作为预定氨基酸序列的类似物的氨基酸序列的组、集合或文库，其中所述核苷酸序列或核酸的组、集合或文库任选地还包括编码预定氨基酸序列的核苷酸序列或核酸。
37.根据方面36的方法，其中对所筛选的核苷酸序列的组、集合或文库筛选编码类似物的核苷酸序列或核酸，所述类似物与预定氨基酸序列相比具有一种或多种提高的性质。
38.提供编码可用作(和/或意欲用作)单抗原结合结构域和具有一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)的氨基酸序列的一种或多种核苷酸序列或核酸的方法，该方法包括对来自根据方面11的核苷酸序列的组、集合或文库的一种或多种核苷酸序列或核酸和/或根据方面12的一种或多种核苷酸序列或核酸进行测试，测试其是否编码具有一种或多种需要的性质的氨基酸序列。
39.根据方面38的方法，其中被测试的一种或多种核苷酸序列或核酸编码预定氨基酸序列的类似物的氨基酸序列，并且任选地还编码预定氨基酸序列。
40.根据方面39的方法，其中对被测试的一种或多种核苷酸序列或核酸进行测试，以便鉴定和/或提供核苷酸序列或核酸，所述核苷酸序列或核酸编码与预定氨基酸序列相比具有一种或多种改善性质的类似物。
41.根据方面35-40中任一项的方法，其中所述一种或多种性质是由被筛选或测试的核苷酸序列或核酸编码的氨基酸序列的下列性质的一种或多种对目标抗原的亲和性或特异性，效能或活性，选择性，溶解度，稳定性，聚集倾向性，“黏着性”，氨基酸序列的折叠，与最接近人类种系序列的序列同一性程度，可能被人免疫系统识别的表位的存在，潜在的免疫原性，除了与目标抗原的相互作用之外允许氨基酸序列经历一种或多种相互作用的一种或多种氨基酸残基或氨基酸残基序列的存在，在所需宿主或宿主细胞中的表达水平，半衰期，可以修饰的位点的存在或缺乏，可以进行氧化作用的位点或氨基酸残基的存在或缺乏，可以形成二硫键的半胱氨酸残基的存在或缺乏，和/或穿过生物膜或屏障的能力；或以上任何性质的任何所需组合。
42.根据方面41的方法，其中所述一种或多种性质是由被筛选或测试的核苷酸序列或核酸编码的氨基酸序列的下列性质的一种或多种对目标抗原的亲和性或特异性，效能或活性和/或选择性。
43.根据方面42的方法，其中所述一种或多种性质至少包括对于由被筛选或测试的核苷酸序列或核酸编码的氨基酸序列的目标抗原的亲和性或特异性。
44.根据方面42或43的方法，其中被筛选的核苷酸序列或核酸的组、集合或文库编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述互补性决定区中存在一种或多种特异性突变；和/或其中被测试的核苷酸序列或核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述互补性决定区中存在一种或多种特异性突变。
45.根据方面41的方法，其中所述一种或多种性质是由被筛选或测试的核苷酸序列或核酸编码的氨基酸序列的下列性质的一种或多种稳定性，聚集倾向性，“黏着性”，氨基酸序列的折叠，和/或在所需宿主或宿主细胞中的表达水平。
46.根据方面45的方法，其中所述一种或多种性质至少包括氨基酸序列的稳定性，聚集倾向性和/或“黏着性”，所述氨基酸序列是由被筛选或测试的核苷酸序列或核酸编码的。
47.根据方面45或46的方法，其中被筛选的核苷酸序列或核酸的组、集合或文库编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述构架区中存在一种或多种特异性突变；和/或其中被测试的核苷酸序列或核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述构架区中存在一种或多种特异性突变。
48.根据方面41的方法，其中所述一种或多种性质至少包括与由被筛选或测试的核苷酸序列或核酸编码的氨基酸序列与最接近人类种系序列的序列同一性程度。
49.根据方面48的方法，其中被筛选的核苷酸序列或核酸的组、集合或文库编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述构架区中存在一种或多种特异性突变；和/或其中被测试的核苷酸序列或核酸编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述构架区中存在一种或多种特异性突变。
50.根据方面41的方法，其中所述一种或多种性质至少包括可以被人免疫系统识别的表位的存在，和/或至少包括被筛选或测试的核苷酸序列或核酸所编码的氨基酸序列的潜在免疫原性(如果有的话)。
51.根据方面48的方法，其中被筛选的核苷酸序列或核酸的组、集合或文库编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于在对应于可以被人免疫系统识别的表位的氨基酸残基中存在一种或多种特异性突变；和/或其中被测试的核苷酸序列或核酸的组、集合或文库编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于在对应于可以被人免疫系统识别的表位的氨基酸残基中存在一种或多种特异性突变。
52.可以利用根据方面35-51中任一项的方法获得的核苷酸序列或核酸。
53.可以通过表达根据方面52的核苷酸序列或核酸而获得的氨基酸序列。
54.提供可用作(和/或意欲用作)单抗原结合结构域的氨基酸序列的组、集合或文库的方法，该方法至少包括步骤 a)提供寡核苷酸的集合体，其包含(i)可以通过PCR装配的方式装配成编码可用作单抗原结合结构域的氨基酸序列的核苷酸序列的至少两个寡核苷酸的系列，并且此外包含(ii)形成该系列的一部分的至少两个寡核苷酸的至少一个的至少一种变体，其中所述至少一种变体区别于所述寡核苷酸(也区别于存在于该集合体中的所述寡核苷酸的其它变体，如果有的话)之处在于它编码区别在于存在一种或多种特异性突变的氨基酸序列；和 b)将寡核苷酸的集合体进行PCR装配； 和 c)将由此获得的(两种或多种)经装配的寡核苷酸序列以其本身适合的方式进行翻译和/或表达。
55.根据方面54的方法，其中在步骤c)后提供的氨基酸的组、集合或文库是预定氨基酸序列的类似物的组、集合或文库(该组、集合或文库还可以任选地包含预定氨基酸序列)。
56.根据方面1或2的方法，其中用于步骤a)的寡核苷酸及其变体是这样的，以致在步骤c)后提供的氨基酸序列包含免疫球蛋白折叠，或能够形成免疫球蛋白折叠。
57.根据方面1或2的方法，其中用于步骤a)的寡核苷酸及其变体是这样的，以致在步骤c)后提供的氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区，或基本由其组成。
58.根据方面4的方法，其中用于步骤a)的寡核苷酸及其变体是这样的，以致在步骤c)后提供的氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区，或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于在构架区中存在一种或多种特异性突变。
59.根据方面4的方法，其中用于步骤a)的寡核苷酸及其变体是这样的，以致在步骤c)后提供的氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区，或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于在所述互补性决定区中存在一种或多种特异性突变。
60.根据方面4的方法，其中用于步骤a)的寡核苷酸及其变体是这样的，以致在步骤c)后提供的氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区，或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于在构架区中存在一种或多种特异性突变以及在所述互补性决定区中存在一种或多种特异性突变。
61.根据方面4-7任一项的方法，其中用于步骤a)的寡核苷酸及其变体是这样的，以致在步骤c)后提供的氨基酸序列包括免疫球蛋白可变结构域序列或其适合的片段或基本由其组成。
62.根据方面8的方法，其中用于步骤a)的寡核苷酸及其变体是这样的，以致在步骤c)后提供的氨基酸序列包括结构域抗体或适于用作结构域抗体的氨基酸序列，单结构域抗体或适于用作单结构域抗体的氨基酸序列，“dAb”或适于用作dAb的氨基酸序列，或纳米抗体TM或其任何合适片段，或基本由其组成。
63.根据方面9的方法，其中用于步骤a)的寡核苷酸及其变体是这样的，以致在步骤c)后提供的氨基酸序列包括纳米抗体TM或基本由其组成。
64.可以利用根据方面54-63中任一项的方法获得的氨基酸序列的组、集合或文库。
65.可以利用根据方面54-63中任一项的方法而获得的氨基酸序列和/或来自根据方面64的组、集合或文库的氨基酸序列。
66.根据方面54-63中任一项的方法，其进一步包括以下步骤 d)筛选通过步骤a)到c)获得的氨基酸序列的组、集合或文库，获得具有一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)的氨基酸序列，以及任选地分离一种或多种具有所述一种或多种需要的性质的氨基酸序列。
67.根据方面66的方法，其中筛选的氨基酸序列的组、集合或文库是作为预定氨基酸序列类似物的氨基酸序列的组、集合或文库，其中所述组、集合或文库任选地还包括预定氨基酸序列。
68.根据方面67的方法，其中对被筛选的氨基酸序列的组、集合或文库筛选类似物，所述类似物与预定氨基酸序列相比具有一种或多种提高的性质。
69.根据方面54-63中任一项的方法，其进一步包括步骤 d)测试来自通过步骤a)到c)获得的氨基酸序列的组、集合或文库的一种或多种氨基酸序列，所述测试关于它们是否具有一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)进行。
70.根据方面69的方法，其中被测试的一种或多种氨基酸序列是作为预定氨基酸序列类似物的氨基酸序列，任选地加之预定氨基酸序列。
71.根据方面70的方法，其中对被测试的一种或多种氨基酸序列进行测试，以便鉴定和/或提供与预定氨基酸序列相比具有一种或多种改善性质的类似物。
72.根据方面66-71中任一项的的方法，其中所述一种或多种性质是被筛选或测试的氨基酸序列的下列性质的一种或多种对目标抗原的亲和性或特异性，效能或活性，选择性，可溶性，稳定性，聚集倾向性，“黏着性”，氨基酸序列的折叠，与最接近人类种系序列的序列同一性程度，可能被人免疫系统识别的表位的存在，潜在的免疫原性，除了与目标抗原的相互作用之外允许氨基酸序列经历一种或多种相互作用的一种或多种氨基酸残基或氨基酸残基序列的存在，在所需宿主或宿主细胞中的表达水平，半衰期，可以修饰的位点的存在或缺乏，可以进行氧化作用的位点或氨基酸残基的存在或缺乏，可以形成二硫键的半胱氨酸残基的存在或缺乏，和/或穿过生物膜或屏障的能力；或以上任何性质的任何所需组合。
73.根据方面72的方法，其中所述一种或多种性质是被筛选或测试的氨基酸序列的下列性质的一种或多种对目标抗原的亲和性或特异性，效能或活性和/或选择性。
74.根据方面73的方法，其中所述一种或多种性质至少包括对于被筛选或测试的氨基酸序列的目标抗原的亲和性或特异性。
75.根据方面72或73的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致在步骤c)后所获得的氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述互补性决定区中存在一种或多种特异性突变。
76.根据方面72的方法，其中所述一种或多种性质是由被筛选或测试的核苷酸序列或核酸编码的氨基酸序列的下列性质的一种或多种稳定性，聚集倾向性，“黏着性”，氨基酸序列的折叠，和/或在所需宿主或宿主细胞中的表达水平。
77.根据方面27的方法，其中所述一种或多种性质至少包括由所述核苷酸序列或核酸编码的氨基酸序列的稳定性，聚集倾向性和/或“黏着性”。
78.根据方面26或27的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致在步骤c)后所获得的氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述构架区中存在一种或多种特异性突变。
79.根据方面72的方法，其中所述一种或多种性质至少包括与由被筛选或测试的氨基酸序列与最接近人类种系序列的序列同一性程度。
80.根据方面79的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致在步骤c)后所获得的氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述构架区中存在一种或多种特异性突变。
81.根据方面72的方法，其中所述一种或多种性质至少包括可以被人免疫系统识别的表位的存在，其具有被筛选或测试的氨基酸序列，和/或至少包括被筛选或测试的氨基酸序列的潜在免疫原性(如果有的话)。
82.根据方面81的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致在步骤c)后所获得的氨基酸序列彼此不同在于在对应于可以被人免疫系统识别的表位的氨基酸残基中存在一种或多种特异性突变。
83.可以通过根据方面66-82中任一种的方法获得的氨基酸序列。
84.提供可用作(和/或意欲用作)单抗原结合结构域和具有一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)的一种或多种氨基酸序列的方法，该方法包括筛选根据方面64的氨基酸序列的组、集合或文库，获得编码具有一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)的氨基酸序列的核苷酸序列，以及任选地分离一种或多种编码具有所述一种或多种需要的性质的氨基酸序列的核苷酸序列。
85.根据方面84的方法，其中所筛选的氨基酸序列的组、集合或文库是预定氨基酸序列的类似物的氨基酸序列的组、集合或文库，其中所述组、集合或文库任选地还包括预定氨基酸序列。
86.根据方面85的方法，其中对被筛选的氨基酸序列的组、集合或文库筛选与预定氨基酸序列相比具有一种或多种改善性质的类似物。
87.提供可用作(和/或意欲用作)单抗原结合结构域和具有一种或多种需要的性质(或需要的性质的组合)的一种或多种氨基酸序列的方法，该方法包括测试来自根据方面64的组、集合或文库的一种或多种氨基酸序列和/或根据方面65的一种或多种氨基酸序列是否具有所述一种或多种需要的性质。
88.根据方面87的方法，其中被测试的一种或多种氨基酸序列是预定氨基酸序列的类似物，并且任选地还包括预定氨基酸序列。
89.根据方面88的方法，其中对被测试的一种或多种氨基酸序列进行测试，以便鉴定和/或提供与预定氨基酸序列相比具有一种或多种改善性质的类似物。
90.根据方面84-89的方法，其中所述一种或多种性质是被筛选或测试的氨基酸序列的下列性质的一种或多种对目标抗原的亲和性或特异性，效能或活性，选择性，可溶性，稳定性，聚集倾向性，“黏着性”，氨基酸序列的折叠，与最接近人类种系序列的序列同一性程度，可能被人免疫系统识别的表位的存在，潜在的免疫原性，除了与目标抗原的相互作用之外允许氨基酸序列经历一种或多种相互作用的一种或多种氨基酸残基或一段氨基酸残基的存在，在所需宿主或宿主细胞中的表达水平，半衰期，可以修饰的位点的存在或缺乏，可以进行氧化作用的位点或氨基酸残基的存在或缺乏，可以形成二硫键的半胱氨酸残基的存在或缺乏，和/或穿过生物膜或屏障的能力；或以上任何性质的任何所需组合。
91.根据方面90的方法，其中所述一种或多种性质是被筛选或测试的氨基酸序列的下列性质的一种或多种对目标抗原的亲和性或特异性，效能或活性和/或选择性。
92.根据方面91的方法，其中所述一种或多种性质至少包括对于被筛选或测试的氨基酸序列的目标抗原的亲和性或特异性。
93.根据方面91或92的方法，其中被筛选的氨基酸序列的组、集合或文库是这样的氨基酸序列的组、集合或文库，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述互补性决定区中存在一种或多种特异性突变；和/或其中被测试的氨基酸序列是这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述互补性决定区中存在一种或多种特异性突变。
94.根据方面90的方法，其中所述一种或多种性质是被筛选或测试的氨基酸序列的下列性质的一种或多种稳定性，聚集倾向性，“黏着性”，氨基酸序列的折叠，和/或在所需宿主或宿主细胞中的表达水平。
95.根据方面94的方法，其中所述一种或多种性质至少包括被筛选或测试的氨基酸序列的稳定性，聚集倾向性和/或“黏着性”。
96.根据方面94或95的方法，其中被筛选的氨基酸序列的组、集合或文库是这样的氨基酸序列的组、集合或文库，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述构架区中存在一种或多种特异性突变；和/或其中被测试的氨基酸序列是这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述构架区中存在一种或多种特异性突变。
97.根据方面90的方法，其中所述一种或多种性质至少包括与被筛选或测试的氨基酸序列与最接近人类种系序列的序列同一性程度。
98.根据方面91的方法，其中被筛选的核苷酸序列或核酸的组、集合或文库是这样的氨基酸序列的组、集合或文库，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述构架区中存在一种或多种特异性突变；和/或其中被测试的氨基酸序列是这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述构架区中存在一种或多种特异性突变。
99.根据方面90的方法，其中所述一种或多种性质至少包括在被筛选或测试的氨基酸序列中存在可以被人免疫系统识别的表位，和/或至少包括被筛选或测试的氨基酸序列的潜在免疫原性(如果有的话)。
100.根据方面48的方法，其中被筛选的核苷酸序列或核酸的组、集合或文库是这样的氨基酸序列的组、集合或文库，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于在对应于可以被人免疫系统识别的表位的氨基酸残基中存在一种或多种特异性突变；和/或其中被测试的核苷酸序列或核酸的组、集合或文库编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于在对应于可以被人免疫系统识别的表位的氨基酸残基中存在一种或多种特异性突变。
101.可以利用根据方面84-100中任一项的方法获得的氨基酸序列。
102.选自由具有如SEQ ID NO50-121中所示序列的氨基酸序列和由SEQ ID NO123-176所示序列的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。
103.选自由具有如SEQ ID NO50-121中所示序列的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。
104.选自由具有如SEQ ID NO74，SEQ ID NO93，SEQ ID NO94，SEQID NO104，SEQ ID NO105，SEQ ID NO116-120中所示序列的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。
105.选自由具有如SEQ ID NO123-176中所示序列的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。
106.选自由具有如SEQ ID NO123，SEQ ID NO149，SEQ ID NO152，SEQ ID NO156，SEQ ID NO169中所示序列的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。
实验部分 实施例1纳米抗体32C9 (在WO2008020079A1中也称作IL6R04和SEQ ID NO440)基于文库的人源化作用 使用一组26个重叠的寡核苷酸(在图2和SEQ ID NO23-48中显示)进行纳米抗体32C9(IL6R04，SEQ ID NO49)的人源化变体文库的装配 将所述寡核苷酸溶于水并且随后以每种寡核苷酸0.4uM的终浓度进行合并。使用5和1ul这种混合物在50ul的反应体积中进行装配PCR。利用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化全长产物。随后用SfiI和BsteEII消化纯化的PCR产物并连接入表达载体pAX51的相应位点。用2ul的连接混合物转化大肠杆菌(E.coli)TG1细胞并铺平板在LB琼脂+100ug/ml氨苄青霉素+2％葡萄糖上。将平板在37℃下温育过夜。挑取单个克隆并在2xYT+100ug/ml氨苄青霉素+2％葡萄糖中培养过夜。用M13正向和反向引物直接从这些培养物中扩增克隆的纳米抗体基因。纯化PCR产物并随后进行测序。平行地将相同组纳米抗体以1ml规模在37℃下表达4小时。制备周质提取物并且未经进一步纯化在Biacore上分析其结合人IL6R的能力。将以此方式获得的71种IL6R04变体的测序结果显示于图3-A和3-B和SEQ ID NO50-121中。在下面表B-1中给出了这71种变体的解离速率(off-rate)。基于这些结果得出结论残基14，30，44，71，78，83，84和108可以进行人源化而对纳米抗体32C9的解离速率无显著影响(＜2倍)。相反地，残基94的人源化作用完全消除了对IL6R的结合，而残基37，45和47的人源化作用分别与解离速率的5，10和12倍的减小相关。
表B-1.对于纳米抗体32C9野生型及其人源化变体的人源化选择的位置上的解离速率和氨基酸组成 在上部所示的编号是根据Kabat。纳米抗体32C9野生型以黑体显示。“N.d”表示未测定解离速率。
14 30 37 44 45 47 71 78 83 84 94 108 解离 速率 (s-1) 32C9 WTADFERGSVKPAQ 1,62 E-04 32C9PMP1_G5PDFELGRLRPAL 1,16 E-03 32C9PMP2_E2PSFELGSLKAAQ 1,21 E-03 32C9PMP2_E1PDFELGSVRPAQ 1,66 E-03 32C9PMP2_A12 ADFELGSVKAAQ 2,90 E-03 32C9PMP1_B3PDVELGSLRPAL 3,46 E-03 32C9PMP1_C5ADVELGSVRPAL 5,20 E-03 32C9PMP2_D10 PSVELGSVRPAL 7,07 E-03 32C9PMP1_F3ASVELGSVKAAQ N.d. 32C9PMP2_H6PDVELGSLKAAL N.d. 32C9PMP1_E7ADFGRGSLKAAL 1,87 E-04 32C9PMP1_H4PSFGRGSLKAAQ 1,87 E-04 32C9PMP2_A2PSFGRGRLKAAQ 1,92 E-04 32C9PMP1_D4ASFGRGSLKAAQ 1,96 E-04 32C9PMP2_G12 ASFGRGRLKAAQ 1,97 E-04 32C9PMP1_G11 ASFGRGSVRPAL 2,04 E-04 32C9PMP1_E1ASFGRGRLKAAL 2,05 E-04 32C9PMP2_E12 ADFGRGRVRPAL 2,47 E-04 32C9PMP2_B3ASFERGRVKAAL 3,08 E-04 32C9PMP2_D6PSFGRGSVKAAL n.d. 表B-1(续) 14 30 37 44 45 47 71 78 83 84 94 108 解离 速率 (s-1) 32C9PMP2_F12 ADVGRGSLRPAL5,84 E-04 32C9PMP2_G4 ADVGRGRLKAAQ7,00 E-04 32C9PMP2_A7 ASVGRGRLKAAL7,92 E-04 32C9PMP2_B5 ASVGRGSVRPAL8,03 E-04 32C9PMP2_F3 ADVGRGSVKAAL8,04 E-04 32C9PMP1_E6 ASVGRGSVKAAL9,82 E-04 32C9PMP2_A8 ADFELWRVRPALn.d. 32C9PMP1_H12 ASVELWSLKAALn.d. 32C9PMP1_F8 ASFERWSLKAAL1,89 E-03 32C9PMP1_B5 PSFERWRLRPAQ1,96 E-03 32C9PMP2_B12 PSFERWSVKAAQ5,64 E-03 32C9PMP2_C6 ASVGRWSLRPAQ4,26 E-03 32C9PMP1_A1 ASVERWSLRPAL5,15 E-03 32C9PMP2_B11 ADVERWSLRPAQ7,68 E-03 32C9PMP2_C3 ASVERWSLKAAQ1,38 E-02 32C9PMP1_B7 ADVERWSLKAALn.d. 32C9PMP1_F10 PSVERWSLKAAQn.d. 32C9PMP1_F5 PSVERWSLKAAQn.d. 32C9PMP1_F7 ASVERWSLRPALn.d. 32C9PMP1_H5 PDVERWSLRPALn.d. 32C9PMP2_C8 ADVERWSVKAAQn.d. 32C9PMP2_G10 ADVERWRVRPALn.d. 表B-1 (续) 14 30 37 44 45 47 71 78 83 84 94 108 解离 速率 (s-1) 32C9PMP1_A3 ASVGRGRVKARQn.d. 32C9PMP1_B11 ASFGRGRVKARQn.d. 32C9PMP1_B4 PSFGRGSLKARQn.d. 32C9PMP1_D5 PDVGRGSLRPRLn.d. 32C9PMP1_E2 ASVGRGRLKARLn.d. 32C9PMP1_G3 PSFGRGRLRPRQn.d. 32C9PMP1_G8 PSFGRGSVKARLn.d. 32C9PMP1_G9 PDVELGSVKARLn.d. 32C9PMP1_H1 PSVGRGRVKARQn.d. 32C9PMP1_H6 PDFELGRLKARQn.d. 32C9PMP1_H8 ADVGRGRLRPRLn.d. 32C9PMP2_A10 ASVGRGRLKARQn.d. 32C9PMP2_A5 PDVGRGSVRPRLn.d. 32C9PMP2_B4 PDFELGSVRPRQn.d. 32C9PMP2_B7 ASFGRGRLKARLn.d. 32C9PMP2_C10 PDVGRGSLKARLn.d. 32C9PMP2_C9 ADFGRGSLKARLn.d. 32C9PMP2_D5 PDVELGRVKARLn.d. 32C9PMP2_D8 PSFERGRVKARQn.d. 32C9PMP2_D9 PSFGRGSVRPRLn.d. 32C9PMP2_E6 PSFERGRVKARLn.d. 32C9PMP1_A11 PSVERWSVKARLn.d. 表B-1(续)14 30 37 44 45 47 71 78 83 84 94 108 解离速率(s-1) 32C9PMP1_A2 PDVERWSVKARLn.d. 32C9PMP1_A4 PDFERWSLRPRQn.d. 32C9PMP1_D7 PDVERWRLKARLn.d. 32C9PMP1_F9 PSFERWRVKARLn.d. 32C9PMP2_C12 ADVERWSLKARLn.d. 32C9PMP2_C4 ADFERWSVKARLn.d. 32C9PMP2_E7 ASFERWRLRPRLn.d. 32C9PMP2_F2 ADVERWSLRPRLn.d. 32C9PMP2_F5 PDFERWSLKARLn.d. 实施例2抗人IL6R纳米抗体IL6R65(在WO2008020079A1中也称作SEQ ID NO613)的亲和力成熟 文库设计 为了提高纳米抗体IL6R65(SEQ ID NO121)对其靶标人IL6R的亲和性，由在抗原结合CDR区中包含一种或多种替代的IL6R65变体制成文库。使用两种不同的策略进行CDR的多样化 i.根据下列方案用具有相似侧链化学性质的氨基酸取代每个CDR残基 a. b. C. d. e. f. g.G→A h.M→L i.H，C，W，P保持不变 ii.通过一组在给定位置上天然存在的氨基酸来取代每个CDR残基。在纳米抗体位置27-35(CDR1)和50-58(CDR2)上最常出现的氨基酸列于表B-2(根据Kabat编号)中。在每个位置上的实际组成可能由于该类型残基可以被单一简并密码子所编码而有所偏差。每个位置上不同氨基酸的数目可以减少以限制文库的总体多样性。
表B-2.基于＞350个独特纳米抗体的分析，在CDR1和CDR2中最常出现的氨基酸。对位置52a上有和无插入的CDR2序列进行分别分析 使用上述2种策略对CDR1和CDR2进行诱变，而CDR3只使用策略1单独进行诱变，产生总共3种文库。文库组成的概览显示于图4中。每种文库的理论多样性为大约1x10e6。
文库构建 使用简并寡核苷酸，通过PCR重叠延伸产生编码诱变CDR区的DNA片段。在用XmaI/XbaI(文库a和b)或BspeI/NotI(文库c)(来自新英格兰生物实验室(New England Biolabs)的酶)消化后将片段克隆入经剪切pAX50噬菌体展示载体的相应限制性位点中。这些载体已经包含了部分的和移码的IL6R65基因片段，并被设计来在克隆后恢复阅读框并产生全长IL6R65基因。所有3种文库的实际大小为1x10e8左右(100x理论多样性)。
选择 利用在溶液中减小浓度的生物素化的IL6R(10nM-1pM)(Peprotech)对噬菌体文库进行最大数目为3轮的淘选。噬菌体和bio-IL6R之间的复合物被捕获在磁性链霉抗生物素蛋白珠(Invitrogen)上1分钟并随后用PBS-吐温洗涤5x。通过在37℃下用1mg/ml胰蛋白酶孵育30min来洗脱结合的噬菌体。通过用不同稀释度的洗脱噬菌体来感染大肠杆菌TG1细胞(对数期)来测定噬菌体滴度(TG1电穿孔感受态细胞来自Stratagene的细胞，目录号200123，5x0.1-ml)。产生高于对照样品(无生物素化IL6R)的噬菌体滴度的选择条件被选取作进一步分析。
选择结果的分析 通过挑取个别克隆并在1ml 2xYT(酵母蛋白胨)培养基+100ug/ml羧苄西林中于37℃下将它们培养过夜来分析选择的结果。制备包含周质提取物的纳米抗体，在PBS中1/10稀释并随后在ELISA中测试抗原结合。对具有最高ELISA信号的克隆进行测序并在Biacore上分析。在ELISA中最高的50个克隆显示了介于1.4x10e-3和1.2x10e-4s-1之间的解离速率。来自CDR3文库最优克隆的解离速率是7x10e-4s-1。纳米抗体序列和解离速率列于表B-3中。
表B-3.显示最高ELISA信号的50种纳米抗体的氨基酸序列和解离速率。还显示了CDR3文库的最高的50个克隆。
选定IL6R65变体的表征 将具有范围在2.6x10e-4至4.4x10e-4s-1的提高的解离速率的来自文库b的五种纳米抗体在大肠杆菌中表达并通过IMAC色谱法进行纯化。将纯化的纳米抗体在不同浓度下的结合曲线记录在Biacore上并用于计算ka，kd和Kd值(表B-4)。这5种克隆的Kd值在0.34和0.95nM之间，对于最优变体而言，这对应于相对于母体分子13倍的提高。
表B-4.IL6R65和5种亲和力成熟变体的动力学参数的比较 还将全部5种纳米抗体和母体纳米抗体在血浆效价测定中进行测试。在此测定中将不同浓度的纳米抗体与可溶性IL6R混合，所述可溶性IL6R包含来自人或猕猴(cynomolgus monkey)的血浆和固定浓度的人IL6。温育1小时后将混合物转移到包被了抗IL6R MAb BN-12(Diaclone)的Maxisorp板上。通过随后添加生物素化的抗IL6多克隆抗体(R&D系统)和链霉抗生物素蛋白-HRP来测定结合的IL6的量。使用TMB作为底物。在450nm下测量底物转化。
表B-5.在猕猴血浆效价测定中IL6R65和5种亲和力成熟变体的评估(还参见图5)。
表B-6.在人血浆效价测定中IL6R65和5种亲和力成熟变体的评估(还参见图6)。
还对亲和力成熟纳米抗体测试其抑制TF-1细胞的IL6依赖性增殖的能力(ECACC no.93022307；细胞生理学杂志(J Cell Physiol)1989；140323；Exp Cell Res 199320835)，所述抑制是由于阻断了IL6与在细胞表面上的IL6R的结合。为此，将连续稀释的纳米抗体与固定量的TF-1细胞一起在37℃下预温育2小时。随后加入IL6至终浓度2ng/ml。让IL6依赖性细胞增殖，持续72小时并通过掺入氚标记的胸腺嘧啶核苷来进行测量。
表B-7.TF-1细胞的IL6依赖性增殖的抑制。将细胞在2ng/ml人IL6和各种浓度的纳米抗体存在下培养。通过3H胸腺嘧啶核苷掺入来测量增殖(还参见图7)。

序列表
<110>埃博灵克斯股份有限公司
<120>提供改进的免疫球蛋白序列的方法
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<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<220>
<221>misc_feature
<222>(87)..(91)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<400>17
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Val Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
65 70 75 80
Val Tyr Tyr Cys Val Lys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ser Gln Gly Thr
85 90 95
Gln Val Thr Val Ser Ser
100
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<212>PRT
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<220>
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<222>(87)..(91)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<400>18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Cys Val Ser Ser Gly Cys Thr Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Glu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Lys Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
50 55 60
Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Gly Pro Glu Asp Thr Ala
65 70 75 80
Met Tyr Tyr Cys Gln Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Gly Gln Gly Thr
85 90 95
Gln Val Thr Val Ser Ser
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<212>PRT
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<220>
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<220>
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<222>(87)..(91)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<400>19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ala Leu Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Val Phe Ser Gly Ser Thr Phe Ser Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg His Thr Pro Gly Lys Ala Glu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
50 55 60
Asn Thr Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Ser Pro Glu Asp Thr Ala
65 70 75 80
Met Tyr Tyr Cys Gly Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Ser Lys Gly Ile
85 90 95
Gln Val Thr Val Ser Ser
100
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<211>102
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
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<220>
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<220>
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<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<400>20
Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Trp Phe Arg Gln Ala ProGly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
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65 70 75 80
Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Gly Gln Gly Thr
85 90 95
Gln Val Thr Val Ser Ser
100
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<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<220>
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<222>(31)..(35)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<220>
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<222>(50)..(54)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<220>
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<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<400>21
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asp Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Trp Leu Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
50 55 60
Asn Met Leu Tyr Leu His Leu Asn Asn Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala
65 70 75 80
Val Tyr Tyr Cys Arg Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Gly Gln Gly Thr
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Gln Val Thr Val Ser Ser
100
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<211>102
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<220>
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<222>(31)..(35)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<220>
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<222>(50)..(54)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<220>
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<222>(87)..(91)
<223>Xaa可以是任何天然出现的氨基酸
<400>22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Cys Val Ser Ser Gly Cys Thr Xaa Xaa
20 25 30
Xaa Xaa Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Glu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Phe Lys Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
50 55 60
Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Gly Pro Glu Asp Thr Ala
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Met Tyr Tyr Cys Gln Arg Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Gly Gln Gly Thr
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<213>人工的
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gggaggttac tgaggcccag ccggccatgg ccgaggtgca gctggtg 47
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<212>DNA
<213>人工的
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ttgaaccaga cctccgccag actccaccag ctgcacctc39
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<213>人工的
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ggaggtctgg ttcaagcagg cgggagcttg cgtctgagtt gcgctgcg 48
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ggaggtctgg ttcaaccggg cgggagcttg cgtctgagtt gcgctgcg 48
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<212>DNA
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tccgatgtcg tagtcatcaa atgtgaaacc gctcgcagcg caactcag 48
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<212>DNA
<213>人工的
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<223>纳米抗体或纳米抗体片段
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tccgatgtcg tagtcgctaa atgtgaaacc gctcgcagcg caactcag 48
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
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gactacgaca tcggatggtt tcgtcaggct ccgggcaaa39
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<212>DNA
<213>人工的
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<223>纳米抗体或纳米抗体片段
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gactacgaca tcggatgggt tcgtcaggct ccgggcaaa 39
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<211>48
<212>DNA
<213>人工的
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<223>纳米抗体或纳米抗体片段
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agaacttgaa atgccggaca caccttcgcg acctttgccc ggagcctg 48
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<212>DNA
<213>人工的
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<223>纳米抗体或纳米抗体片段
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agaacttgaa atgccggaca caccttcgag ttctttgccc ggagcctg 48
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<212>DNA
<213>人工的
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agaacttgaa atgccggaca cccattcgcg ttctttgccc ggagcctg 48
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ggcatttcaa gttctgacgg caacacttat tac33
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<212>DNA
<213>人工的
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acctttaacg ctgtctgcgt aataagtgtt gcc33
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<212>DNA
<213>人工的
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<212>DNA
<213>人工的
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<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>37
gacagcgtta aaggtcgttt caccatttcg cgtgataacg caaagaat 48
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<212>DNA
<213>人工的
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<223>纳米抗体或纳米抗体片段
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taagctattc atttgaaggt atacggtatt ctttgcgtta tc 42
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<211>42
<212>DNA
<213>人工的
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<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>39
taagctattc atttgaaggt acagggtatt ctttgcgtta tc 42
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<211>48
<212>DNA
<213>人工的
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<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>40
caaatgaata gcttacgccc ggaagatacc gccgtttact attgtgcc 48
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<211>48
<212>DNA
<213>人工的
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<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>41
caaatgaata gcttaaaagc tgaagatacc gccgtttact attgtgcc 48
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<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>42
cagataccac gagctatctg gcggttccgc ggcacaatag taaac 45
<210>43
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>43
cagataccac gagctatctg gcggttcgcg ggcacaatag taaac 45
<210>44
<211>48
<212>DNA
<213>人工的
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<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>44
agctcgtggt atctggatgg ctctcctgaa ttctttaaat attggggt 48
<210>45
<211>48
<212>DNA
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<400>45
gttgtgagga gacggtgacc tgcgtaccct gaccccaata tttaaaga 48
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<212>DNA
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<220>
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<400>46
gttgtgagga gacggtgacc agcgtaccct gaccccaata tttaaaga 48
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<400>47
gggaggttac tgaggc16
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>48
gttgtgagga gacggtg17
<210>49
<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Ser Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
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100 105 110
Phe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>50
<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Ser Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Pro Pro Asp Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Gly Ser Pro Glu
100 105 110
Phe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>51
<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>51
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Asp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Leu Glu Gly Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Ser Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Pro Pro Asp Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Gly Ser Pro Glu
100 105 110
Phe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>52
<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>52
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Asp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Ser Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Pro Pro Asp Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Gly Ser Pro Glu
100 105 110
Phe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>53
<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>53
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Asp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Ser Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Pro Pro Asp Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Gly Ser Pro Glu
100 105 110
Phe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>54
<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>54
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Asp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Ser Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Pro Pro Asp Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Gly Ser Pro Glu
100 105 110
Phe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>55
<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>55
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Asp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Ser Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Pro Pro Asp Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Gly Ser Pro Glu
100 105 110
Phe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>56
<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Ser Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Glu Pro Pro Asp Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Gly Ser Pro Glu
100 105 110
Phe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>57
<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>57
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Asp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Ser Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Pro Pro Asp Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Gly Ser Pro Glu
100 105 110
Phe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>58
<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>58
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Asp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Ser Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Pro Pro Asp Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Gly Ser Pro Glu
100 105 110
Phe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>59
<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Asp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Ser Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>86
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>87
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
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<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>88
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>89
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<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>90
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<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>91
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<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>92
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<400>93
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<220>
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<400>94
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<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>95
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<400>98
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<400>99
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<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>100
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<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>101
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<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>102
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<212>PRT
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<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>103
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<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>104
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<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>105
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<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>106
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<210>107
<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>107
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Phe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>108
<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>108
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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Phe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>109
<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>109
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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Ala Arg Glu Pro Pro Asp Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Gly Ser Pro Glu
100 105 110
Phe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>110
<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>110
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val
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Ala Arg Glu Pro Pro Asp Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Gly Ser Pro Glu
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Phe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>111
<211>127
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>111
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
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Asp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Glu Pro Pro Asp Ser Ser Trp Tyr Leu Asp Gly Ser Pro Glu
100 105 110
Phe Phe Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>112
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<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>112
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
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Ser Gly Ile Ser Ser Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>113
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Asp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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<220>
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
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Asp Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val
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<220>
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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Asp Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Gly Val
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<220>
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<400>128
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<212>PRT
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<220>
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<400>129
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<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>130
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<212>PRT
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<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>131
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<400>133
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<211>121
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<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>134
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1 5 10 15
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65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Phe Val Thr Thr Asn Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>135
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>135
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Arg Leu Asn
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Phe Val Thr Thr Asn Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>136
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>136
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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100 105 110
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115 120
<210>137
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>137
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1 5 10 15
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115 120
<210>138
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>138
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>139
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>139
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Ala Ala Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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<210>140
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>140
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Thr Phe Lys Ile Asn
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<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>141
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Val Phe Lys Val Asn
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<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>142
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1 5 10 15
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20 25 30
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<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>143
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<212>PRT
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<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>144
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<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>145
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<220>
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<400>146
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<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>147
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<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>148
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<220>
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<400>149
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<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>150
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1 5 10 15
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<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>151
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<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>152
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<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>153
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<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>154
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>155
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Ile Phe Lys Ile Asn
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<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>156
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<211>121
<212>PRT
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<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>157
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<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>158
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<210>159
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>159
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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<210>160
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>160
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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115 120
<210>161
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>161
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>162
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>162
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>163
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>163
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu His Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Ile Phe Lys Ile Asn
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115 120
<210>164
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>164
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Thr Phe Lys Val Asn
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100 105 110
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115 120
<210>165
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>165
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Asn Gly Ser Val Tyr Lys Val Asn
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Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
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Ala Gly Ile Val Thr Gly Gly Thr Ser Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Phe Val Thr Thr Asn Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Asp Tyr Trp Gly
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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>166
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>166
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Thr Phe Lys Ile Asn
20 25 30
Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ile Thr Gly Gly Thr Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
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100 105 110
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115 120
<210>167
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>167
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Arg Ile Asn
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120
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<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>168
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Lys Ile Asn
20 25 30
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35 40 45
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<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>169
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Thr Phe Lys Ile Asn
20 25 30
Ile Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
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<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>170
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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<211>121
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<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>171
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Thr Val Phe Lys Ile Asn
20 25 30
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115 120
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<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>172
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1 5 10 15
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<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>173
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<211>121
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<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>174
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Lys Val Asn
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Ala Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
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100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>175
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>175
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Lys Val Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Phe Ile Ala Ser Asn Ser Glu Tyr Asp Leu Gly Arg Arg Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>176
<211>121
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>纳米抗体或纳米抗体片段
<400>176
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15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Lys Val Asn
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85 90 95
Phe Ile Thr Ala Asp Thr Glu Tyr Asp Leu Gly Lys Arg Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
权利要求
1.一种提供编码可用作单抗原结合结构域的氨基酸序列的核苷酸序列的文库的方法，该方法至少包括以下步骤
a)提供寡核苷酸的集合体，其包含(i)一系列可以通过PCR装配的方式装配成编码可用作单抗原结合结构域的氨基酸序列的核苷酸序列或核酸的至少两个寡核苷酸，并且此外包含(ii)形成该系列的一部分的至少两个寡核苷酸中的至少一个的至少一种变体，其中所述至少一种变体区别于所述寡核苷酸(也区别于存在于该集合体中的所述寡核苷酸的其它变体，如果有的话)之处在于它编码区别在于存在一种或多种特异性突变的氨基酸序列；和
b)将所述寡核苷酸的集合体进行PCR装配。
2.根据权利要求1的方法，其中提供的核苷酸序列或核酸的文库是下述核苷酸序列的文库，所述核苷酸序列每种编码作为预定氨基酸序列的类似物的氨基酸序列(并且其中所述组、集合或文库可以任选地还包含编码预定氨基酸序列的核苷酸序列)。
3.根据权利要求1或2的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码包含免疫球蛋白折叠或能够形成免疫球蛋白折叠的氨基酸序列。
4.根据权利要求1或2的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成。
5.根据权利要求4的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述构架区中存在一种或多种特异性突变。
6.根据权利要求4的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述互补性决定区中存在一种或多种特异性突变；并且其中
c)任选地其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括按照i)或ii)中所述规则生成的在互补性决定区中或其邻近处的一种或多种特异性突变或基本由其组成，其中对于
i)通过取代原始核苷酸序列从而产生具有下列预定氨基酸残基的氨基酸残基，产生在互补性决定区(CDRs)中或其邻近处的一种或多种特异性突变
-如果原始氨基酸残基是K，用R取代；
-如果原始氨基酸残基是R，用K取代；
-如果原始氨基酸残基是A，用S或T或二者取代，
-如果原始氨基酸残基是S，用A或T或二者取代，
-如果原始氨基酸残基是T，用A或S或二者取代，
-如果原始氨基酸残基是I，用L或V或二者取代；
-如果原始氨基酸残基是L，用I或V或二者取代；
-如果原始氨基酸残基是V，用I或L或二者取代；
-如果原始氨基酸残基是F，用Y取代；
-如果原始氨基酸残基是Y，用F取代；
-如果原始氨基酸残基是N，用D取代；
-如果原始氨基酸残基是D，用N取代；
-如果原始氨基酸残基是Q，用E取代；
-如果原始氨基酸残基是E，用Q取代；
-如果原始氨基酸残基是G，用A取代；
-如果原始氨基酸残基是M，用L取代；或
-如果原始氨基酸残基是H，C，W或P，不取代原始氨基酸残基；并且其中
ii)利用如上i)中的规则产生在CDR3中或邻近CDR3的一种或多种特异性突变，并通过取代原始核苷酸序列从而产生具有下列预定氨基酸残基的氨基酸残基，产生在CDR1和2中或其邻近处的一种或多种特异性突变
-如果要突变在位置27上的原始氨基酸残基，用F，G，R，和S中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置28上的原始氨基酸残基，用A，I，S，T中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置29上的原始氨基酸残基，用F，G，L，S中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置30上的原始氨基酸残基，用D，G，S，T中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置31上的原始氨基酸残基，用D，I，N，S，T中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置32上的原始氨基酸残基，用D，N，Y中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置33上的原始氨基酸残基，用A，G，T，V中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置34上的原始氨基酸残基，用I，M中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置35上的原始氨基酸残基，用A，G，S中的任意一种来取代它；
-并且如果原始氨基酸序列在CDR2中的位置52a上具有氨基酸序列，则使用下列规则
-如果要突变在位置50上的原始氨基酸残基，用A，C，G，S，T中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置51上的原始氨基酸残基，用I来取代它；
-如果要突变在位置52上的原始氨基酸残基，用N，R，S，T中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置上的原始氨基酸残基52a，用R，S，T，W中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置53上的原始氨基酸残基，用D，G，N，S，T中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置54上的原始氨基酸残基，用D，G中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置55上的原始氨基酸残基，用D，G，S中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置56上的原始氨基酸残基，用I，N，R，S，T中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置57上的原始氨基酸残基，用T来取代它；
-如果要突变在位置58上的原始氨基酸残基，用D，H，N，S，Y中的任意一种来取代它；或
-如果原始氨基酸序列在CDR2中的位置52a上不具有氨基酸序列，则使用下列规则
-如果要突变在位置50上的原始氨基酸残基，用A，G，R，S，T中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置51上的原始氨基酸残基，用I来取代它；
-如果要突变在位置52上的原始氨基酸残基，用N，S，T中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置53上的原始氨基酸残基，用N，R，S，T，Y中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置54上的原始氨基酸残基，用D，G，R，S中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置55上的原始氨基酸残基，用任意G来取代它；
-如果要突变在位置56上的原始氨基酸残基，用G，N，R，S，T中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置57上的原始氨基酸残基，用T来取代它；
-如果要突变在位置58上的原始氨基酸残基，用D，N，T，Y中的任意一种来取代它。
7.根据权利要求4的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括4个构架区和3个互补性决定区或基本由其组成，所述氨基酸序列彼此不同之处在于所述构架区中存在一种或多种特异性突变以及在所述互补性决定区中或其邻近处存在一种或多种特异性突变；并且其中
c)任选地其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括按照i)或ii)中所述规则产生的在互补性决定区中或其邻近处的一种或多种特异性突变或基本由其组成，其中对于
i)通过取代原始核苷酸序列从而产生具有下列预定氨基酸残基的氨基酸残基，产生互补性决定区(CDRs)中或其邻近处的一种或多种特异性突变
-如果原始氨基酸残基是K，用R取代；
-如果原始氨基酸残基是R，用K取代；
-如果原始氨基酸残基是A，用S或T或二者取代，
-如果原始氨基酸残基是S，用A或T或二者取代，
-如果原始氨基酸残基是T，用A或S或二者取代，
-如果原始氨基酸残基是I，用L或V或二者取代；
-如果原始氨基酸残基是L，用I或V或二者取代；
-如果原始氨基酸残基是V，用I或L或二者取代；
-如果原始氨基酸残基是F，用Y取代；
-如果原始氨基酸残基是Y，用F取代；
-如果原始氨基酸残基是N，用D取代；
-如果原始氨基酸残基是D，用N取代；
-如果原始氨基酸残基是Q，用E取代；
-如果原始氨基酸残基是E，用Q取代；
-如果原始氨基酸残基是G，用A取代；
-如果原始氨基酸残基是M，用L取代；或
如果原始氨基酸残基是H，C，W或P，不取代原始氨基酸残基；并且其中对于
ii)利用如上i)中的规则产生CDR3中的一种或多种特异性突变，并通过取代原始核苷酸序列从而产生具有下列预定氨基酸残基的氨基酸残基，产生CDR1和2中的一种或多种特异性突变
-如果要突变在位置27上的原始氨基酸残基，用F，G，R，和S中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置28上的原始氨基酸残基，用A，I，S，T中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置29上的原始氨基酸残基，用F，G，L，S中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置30上的原始氨基酸残基，用D，G，S，T中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置31上的原始氨基酸残基，用D，I，N，S，T中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置32上的原始氨基酸残基，用D，N，Y中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置33上的原始氨基酸残基，用A，G，T，V中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置34上的原始氨基酸残基，用I，M中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置35上的原始氨基酸残基，用A，G，S中的任意一种来取代它；
-并且如果原始氨基酸序列在CDR2中的位置52a上具有氨基酸序列，则使用下列规则
-如果要突变在位置50上的原始氨基酸残基，用A，C，G，S，T中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置51上的原始氨基酸残基，用I取代它；
-如果要突变在位置52上的原始氨基酸残基，用N，R，S，T中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置52a上的原始氨基酸残基，用R，S，T，W中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置53上的原始氨基酸残基，用D，G，N，S，T中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置54上的原始氨基酸残基，用D，G中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置55上的原始氨基酸残基，用D，G，S中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置56上的原始氨基酸残基，用I，N，R，S，T中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置57上的原始氨基酸残基，用T取代它；
-如果要突变在位置58上的原始氨基酸残基，用D，H，N，S，Y中的任意一种来取代它；或
-如果原始氨基酸序列在CDR2中的位置52a上不具有氨基酸序列，则使用下列规则
-如果要突变在位置50上的原始氨基酸残基，用A，G，R，S，T中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置51上的原始氨基酸残基，用I取代它；
-如果要突变在位置52上的原始氨基酸残基，用N，S，T中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置53上的原始氨基酸残基，用N，R，S，T，Y中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置54上的原始氨基酸残基，用D，G，R，S中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置55上的原始氨基酸残基，用任意G来取代它；
-如果要突变在位置56上的原始氨基酸残基，用G，N，R，S，T中的任意一种来取代它；
-如果要突变在位置57上的原始氨基酸残基，用T取代它；
-如果要突变在位置58上的原始氨基酸残基，用D，N，T，Y中的任意一种来取代它。
8.根据权利要求4-7中任一项的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括免疫球蛋白可变结构域序列或其适合的片段或基本由其组成。
9.根据权利要求8的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括结构域抗体或适于用作结构域抗体的氨基酸序列，单结构域抗体或适于用作单结构域抗体的氨基酸序列，“dAb”或适于用作dAb的氨基酸序列，或纳米抗体，或它们的任何合适片段，或基本由其组成。
10.根据权利要求9的方法，其中在步骤a)中使用的寡核苷酸及其变体是这样的以致作为步骤b)中PCR装配的结果所获得的核苷酸序列编码氨基酸序列，所述氨基酸序列包括纳米抗体或基本由其组成。
11.根据权利要求6-10任一项的方法，其中c)是强制性的。
12.根据权利要求1-10任一项的方法，其中所述寡核苷酸编码在CDR1，CDR2或CDR3中或其邻近处具有突变的氨基酸序列。
13.可以利用根据权利要求1-11任一项的方法获得的核苷酸序列的文库。
14.可以利用根据权利要求1-11任一项的方法获得的氨基酸序列。
15.选自由具有SEQ ID NO50-121中所示序列的氨基酸序列和由SEQ
ID NO123-176所示序列的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。
16.选自由具有如SEQ ID NO50-121中所示序列的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。
17.选自由具有SEQ ID NO74，SEQ ID NO93，SEQ ID NO94，SEQ IDNO104，SEQ ID NO105，SEQ ID NO116-120中所示序列的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。
18.选自由具有SEQ ID NO123-176中所示序列的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。
19.选自由具有SEQ ID NO123，SEQ ID NO149，SEQ ID NO152，SEQID NO156，SEQ ID NO169中所示序列的氨基酸序列组成的组的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及提供改进的氨基酸序列的方法和技术，所述改进的氨基酸序列可以用作单抗原结合结构域。特别地，本发明涉及用于提供可以用作单抗原结合结构域的改进的氨基酸序列的方法和技术，所述单抗原结合结构域包括至少一种免疫球蛋白序列或基本由至少一种免疫球蛋白序列组成。更加具体地，本文提供的氨基酸序列可以包括至少一种可变结构域序列或其适合的片段或基本由其组成，如至少一种轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)或其适合的片段，或至少一种重链可变结构域序列(例如，VH-序列或VHH序列)或其适合的片段。
文档编号C07K16/28GK101802009SQ200880105407
公开日2010年8月11日 申请日期2008年7月3日 优先权日2007年7月3日
发明者约斯特·亚历山大·科尔克曼 申请人:埃博灵克斯股份有限公司