专利名称：幽门螺杆菌AhpC基因工程多价亚单位疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物制药领域，涉及用于人幽门螺杆菌感染免疫和治疗的基因工程疫苗及其多价亚单位疫苗制备方法。
背景技术：
幽门螺杆菌(helicobacter pylori，H.pylori)是定植于人胃粘膜并引起胃、十二指肠疾病的革兰阴性杆菌，全世界约50％以上的人口胃部感染幽门螺杆菌，并且大多在儿童时期获得，如不治疗将持续感染，引发慢性胃炎、消化性溃疡，甚至导致胃癌。自1983年Warren和Marshall发现幽门螺杆菌以来，人们一直致力于这一细菌的研究，世界卫生组织和美国国立卫生研究院经过多年的分析研究，正式将H.pylori列为胃癌的首要致癌因子。现在临床多以质子泵抑制剂加抗生素或铋盐的三联疗法、四联疗法治疗，这种治疗方案具有一定效果但也必须面对引发的一些问题，诸如治疗费用昂贵、不良反应大、病人的依从性及抗生素的耐药性和再次感染等。因此研制一种有效的疫苗可能是预防和治疗幽门螺杆菌感染所致消化道疾病的有效途径。
但是Hp菌体培养条件苛刻，难以进行大规模培养。细菌抗原组分复杂，且含量较低，直接从全菌中分离纯化出保护性抗原的难度较大，方法繁琐，不利于疫苗的产业化制备。利用基因工程技术将菌体有效的保护性抗原进行克隆表达使Hp疫苗研制的可行性大大提高，其中基因工程尿素酶亚单位疫苗已进入III期临床试验阶段。与此同时，多亚单位融合蛋白疫苗也越来越受到人们的关注。Ruggiero等认为在细菌感染过程中，由于宿主和致病菌之间有着复杂的作用机制，单一抗原组分构建的疫苗难以产生完全有效的保护作用，在Hp单个保护性抗原疫苗研究基础上，构建的多亚单位疫苗具有Hp多个抗原组分，能够激发机体产生比单一亚单位成分更强的免疫反应，抗原成分相对于全菌疫苗更为简单，能够减少机体变态反应的发生。
革兰氏阴性细菌外膜蛋白具有良好的抗原活性，这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主要靶标，可以介导对细菌最直接有效的杀灭作用，是决定免疫反应是否对人体具有保护性的关键因素。新近研究证明，在Hp所有炎性作用因子中，氧化应激是造成胃部炎症的重要致病因子。Hp诱导的氧化应激可以造成宿主细胞的损伤，同时也要面对宿主吞噬细胞释放的氧自由基的攻击。Hp必须具有一种保护机制防御氧化应激，烷基过氧化氢还原酶(AhpC)就是一种重要的抗氧化酶，预防Hp在氧冲击下带来的损伤。
胃黏膜感染Hp以中性粒细胞和单核细胞浸润为特征，其损害程度与中性粒细胞浸润密切相关(Bayerdorffer E，Lehn N，Hatz R，et al.Difference in expressionof Helicobacter pylori gastritis inantrum and body.Gastroen-terology，1992，1021575-1582)。早期研究发现，Hp水提取物中有一种或几种蛋白成分具有直接吸引和激活中性粒细胞及其他炎症细胞的作用。由此提纯一相对分子质量为15KDa，具有促进中性粒细胞粘附内皮细胞及诱导中性粒细胞产生反应性氧自由基的物质，命名为NAP(Evans DJ Jr，Evans DG，Takemura T，et al.Characterization of aHelicobacter pylorineutrophil activating protein.Infect Immun，1995，632213-2220)。HP-NAP位于Hp菌体内，通过自溶释放后，结合于细菌表面，起到粘附素的作用，介导与粘蛋白的结合(Namavar F，Sparrius M，Veerman EC，et al.Neutrophil-activating protein mediates adhesion of Helicobacter pylori to sulfatedcarbohydrates on high molecular weight salivary mucin.Infect Immun，1998，66444-447.)，或者与多形核白细胞神经鞘磷脂结合。亦可促进单核细胞组织因子合成和纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂-2的分泌。通过诱导细胞前凝血质和抗纤溶活性的协同表达，HP-NAP可促进纤维蛋白沉积和由Hp引起的胃黏膜炎症反应(Montemurro P，Barbuti G，Dundon WG，et al.Helicobacter pylori neutrophilactivating protein stimulates tissue factor and plas minogen activator inhibitor production by human bloodmononu clear cells.J Infect Dis，2001，1831055-1062.)。
AhpC和NapA都是Hp的外膜蛋白成分，其编码基因具有高度保守性，是Hp疫苗重要的候选抗原。目前尚未见使用幽门螺杆菌外膜抗原AhpC作为免疫原性材料，特别是使用AhpC和NapA的融合蛋白作为免疫原性材料制备幽门螺杆菌多价疫苗的报道。
发明内容
本发明的目的针对现有疫苗存在的不足，旨在提供一种高效安全的Hp基因工程多价亚单位疫苗及其制备方法。
该疫苗采用烷基过氧化氢酶AhpC及其与中性粒细胞激活蛋白NapA的融合蛋白，获得单个重组蛋白和融合重组蛋白，再与佐剂成分，如大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)、霍乱毒素B亚单位CTB或铝盐佐剂等，以不同组合方式(蛋白物理性混合或基因水平融合等)制备出不同类型(分子外佐剂或分子内佐剂)的Hp基因工程疫苗。
为了得到本发明的幽门螺杆菌AhpC基因工程疫苗，可以针对Hp保护性抗原成分烷基过氧化氢酶AhpC进行单基因克隆，获得单个重组蛋白。以其作为基本活性成分，再以不同的组合方式与佐剂成分，如大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位LTB、霍乱毒素B亚单位CTB等，以适当比例进行物理性混合制备出Hp多价组合疫苗，用于粘膜途径免疫接种。动物试验结果显示不同类型疫苗以不同接种方式免疫后均激发较强的系统免疫和粘膜免疫，获得较好的免疫保护效果。
或者，将烷基过氧化氢酶AhpC、NapA进行基因水平连接，构建表达重组融合蛋白，并在此基础上与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位LTB、霍乱毒素B亚单位CTB及铝盐佐剂等佐剂成分按照适当比例物理混合制备出不同分子外佐剂的基因工程重组多价融合蛋白疫苗。该疫苗适用于粘膜途径免疫接种，可激发产生较强的粘膜免疫和系统免疫应答，达到免疫预防和治疗Hp感染的目的。
因此，作为本发明幽门螺杆菌AhpC基因工程疫苗的活性成分，其可以是幽门螺杆菌单一抗原组分烷基过氧化氢还原酶(AhpC)。或者是将幽门螺杆菌抗原组分AhpC与NapA通过接头序列连接在一起所得到的融合蛋白质。或者是将幽门螺杆菌抗原组分AhpC或其与NapA的融合基因与佐剂成分LTB或CTB在基因水平上通过接头序列融合在一起形成的分子内佐剂基因工程重组融合蛋白质。
可以使用本领域技术人员熟知的方法(参见Sambrook，ed.Molecular CloningA Laboratory Manul(2nd.ed.)，Vols.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory(1998)；Current Protocols In Molrcular Biology，Ausubel，ed.John wiley & Sons，Inc.New York(1997))，制备本发明的加有分子内佐剂的幽门螺杆菌AhpC基因工程疫苗。例如，可以将烷基过氧化氢酶AhpC、NapA在接头序列的连接下，于基因水平上融合佐剂成分大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)或霍乱毒素B亚单位CTB，构建表达重组融合蛋白，制备出分子内佐剂多价融合蛋白疫苗。简单的说，该方法包括以下步骤(1)提供幽门螺杆菌AhpC、NapA保护性抗原以及大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位LTB、霍乱毒素B亚单位CTB目的基因的PCR扩增、基因克隆与序列分析；(2)将步骤(1)的幽门螺杆菌AhpC或其与NapA、大肠杆菌不耐热肠毒B亚单位LTB、霍乱毒素B亚单位CTB全基因或各自的功能片段连接到原核表达质粒或多基因融合表达质粒中；(3)用步骤(2)的得到的重组表达质粒转化转化适当的宿主细菌细胞，得到基因过程重组菌株，(4)在适于表达所需蛋白质的条件下，大规模发酵培养步骤(3)的基因工程重组菌株；(5)分离并纯化步骤(4)产生的重组蛋白质，即得到幽门螺杆菌AbpC基因工程疫苗。
根据本发明的一个优选实施方案，所说的步骤1中克隆AhpC、NapA、LTB、CTB基因所使用的引物分别是AhpCP15’-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3’Nde I
P25’-CGCTCGAGAAGCTTAATGGAAT-3’XhoIP2’ 5’-GCTACCTCCGCCTCCAAGCTTAATGGAATLinkerNapAP35’-CATATGAAAACATTTGAAATT-3’NdeIP3’ 5’-TGGAGGCGGAGGTAGCAAAACATTTGAAATT-3linkerP45’-CTCGAGAGCCAAATGGGCTTCTAG-3’XhoIP4’ 5’-GCTACCTCCTCCACTTCCGCCTCCAGCCAAATGGGCTTCTAG-3’linkerLTB P55’-CCATGGCTCCCCAGTCTATTAC-3’NcoIP5’ 5’-GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCGCTCCCCAGTCTATT-3’linkerP5” 5’-GGAGGCGGAGGTAGCGCTCCCCAGTCTATT-3’linkerP65’-CTCGAGGTTTTCCATGCTGATTGC-3’XhoICTB P75’-CATATGATTAAATTAAAATTTG-3’NcoIP7’ 5’-GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCATTAAATTAAAATTTGGT-3’linkerP7” 5’-GGAGGCGGAGGTAGCATTAAATTAAAATTTGGT-3’linkerP85’CTCGAGATTTGCCATACTAATTGCG-3’XhoI根据本发明的一个另优选实施方案，所说的步骤2中构建融合基因所使用的合成引物分别是P15’-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3’NdeIAhpCP25’-CGCTCGAGTTAAAGCTTAATGGAAT-3’XhoIP35’-CATATGAAAACATTTGAAATT-3’NdeINapAP45’-CTCGAGAGCCAAATGGGCTTCTAG-3’XhoIP55’-CCATGGCTCCCCAGTCTATTAC-3’NcoILTBP65’-CTCGAGGTTTTCCATGCTGATTGC-3’XhoICTBP75’-CATATGATTAAATTAAAATTTG-3’NcoI
P85’-CTCGAGATTTGCCATACTAATTGCG-3’XhoIP15’-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3’Nde IAhpC-LTBP65’-CTCGAGGTTTTCCATGCTGATTGC-3’XhoIP15’-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3’Nde IAhpC-CTBP85’-CTCGAGATTTGCCATACTAATTGCG-3’XhoIP15’-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3’Nde IAhpC-NapAP45’-CTCGAGAGCCAAATGGGCTTCTAG-3’XhoIP15’-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3’Nde IAhpC-NapA-LTBP65’-CTCGAGGTTTTCCATGCTGATTGC-3’XhoIP15’-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3’Nde IAhpC-NapA-CTBP85’-CTCGAGATTTGCCATACTAATTGCG-3’XhoI根据本发明的再一个优选实施方案，所说的步骤4中纯化融合蛋白所用的阴离子填料选自Q Sepharose HP、Q Sepharose FF或Q Sepharose XL；镍离子亲和纯化填料选自ChelatingSepharose HP或Chelating Sepharose FF；凝胶过滤层析柱填料选自Superdex 75、Superdex 200或Superdex HR 10/30。
本发明的疫苗可通过粘膜途径(胃肠粘膜、鼻粘膜等)进行免疫接种，激发机体产生高滴度sIgA和较强的粘膜免疫应答以及一定的系统免疫应答。
我们的动物试验结果表明，本发明的单价或多价疫苗具有良好的抗Hp感染的免疫预防效果和清除Hp感染的免疫治疗作用。
本发明的基因工程重组蛋白的表达与基本特性①本发明中所构建的重组表达质粒均在原核表达系统-大肠杆菌中诱导表达。②重组蛋白AhpC的表达率约为37％；重组融合蛋白AhpC-LTB表达率约34％，重组融合蛋白AhpC-NapA-LTB表达率约30％，重组融合蛋白AhpC-CTB表达率约31％，重组融合蛋白AhpC-NapA-CTB表达率约25％；③各重组蛋白均以包涵体形式表达，纯化后的纯度大于80％。④各重组蛋白均能够诱导动物产生较高滴度的特异抗体。
本发明采用基因工程技术克隆表达保护性抗原成分，表达量高，便于分离纯化，而且高效安全。该重组蛋白可以直接与佐剂(LTB、CTB)结合，制备出多种分子外佐剂或分子内佐剂疫苗，形式灵活多样，适用于不同免疫接种方法和途径。
图1显示基因组抽提琼脂糖电泳结果。核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2为Hp基因组DNA。
图2显示ahpC基因PCR扩增结果。泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2为目的基因ahpC的PCR扩增产物(594bp)。图示结果表明，目的基因ahpC的PCR扩增是成功的。
图3显示克隆载体pMD-18-ahpC的切鉴定结果。泳道1为核酸(DNA)分子量标准(Marker)；泳道2为阴性克隆子酶切结果；泳道3、4为阳性克隆子酶切结果(594bp)。图示结果表明，酶切的ahpC基因片段大小与预计一致，表明T载体克隆成功。
图4显示表达载体pET22b-ahpC的切鉴定结果。泳道1为pET22b阳性克隆子；泳道2为核酸(DNA)分子量标准(Marker)。图示结果表明，酶切的ahpC基因片段大小与预计一致，表明表达载体的克隆是成功的。
图5显示SDS-PAGE检测rAhpC蛋白表达。其中泳道1为种子菌；泳道2为pET22b/BL21；泳道3为重组pET22b-ahpC/BL21诱导2小时；泳道4为重组pET22b-ahpC/BL21诱导4小时(h)；泳道5为重组pET22b-ahpC/BL21诱导6h；泳道6为重组pET22b-ahpC/BL21诱导8h；泳道7为蛋白分子量标准。图示结果显示，经UVP扫描分析目的蛋白表达量为37.6％。
图6显示SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定rAhpC蛋白的表达形式。其中泳道1为重组工程菌；泳道2为工程菌超声沉淀；泳道3为工程菌超声上清；泳道4至7为包涵体洗涤；泳道8为AhpC包涵体；泳道9为蛋白分子量标准。
图7显示napA、ahpC、ltB基因PCR扩增结果。其中泳道1为核酸分子量标准(Marker)；泳道2为目的基因napA的PCR扩增产物(432bp)；泳道3为目的基因ahpC的PCR扩增产物(594bp)；泳道4为目的基因ltB的PCR扩增产物(309bp)。图示的结果表明，目的基因napA，ahpC和ltB的PCR克隆扩增效果良好。
图8显示融合基因ahpC-ltB重叠延伸PCR电泳结果(918bp)。其中泳道1为核酸分子量标准(Marker)；泳道2为融合基因ahpC-ltB的PCR扩增产物。由图示结果可以看出，融合基因片段大小与预计一致，表明重叠延伸得到融合基因。
图9显示ahpC基因片段、napA-ltB融合基因PCR电泳结果。其中泳道1为核酸分子量标准(Marker)；泳道2为目的基因ahpC的PCR扩增产物；泳道3为融合基因napA-ltB的PCR扩增产物。
图10显示融合基因ahpC-napA-ltB重叠延伸PCR电泳结果。其中泳道1为融合基因ahpC-napA-ltB的PCR扩增产物；泳道2为核酸分子量标准(Marker)。由图示结果可以看出，融合基因片段大小与预计一致，表明重叠延伸得到融合基因。
图11显示重组质粒pMD18-T-ANL的切鉴定结果。其中泳道1为核酸分子量标准(Marker)；泳道2、4为阴性克隆子酶切结果；泳道3为阳性克隆子酶切结果。由图示结果可以看出，酶切基因片段大小与理论值一致，表明T载体克隆成功。
图12显示重组质粒pET22b-ANL的切鉴定结果。其中泳道1为阳性克隆子酶切结果。其中泳道2为核酸分子量标准(Marker)。图中显示酶切基因片段大小与理论值一致，表明表达载体克隆成功。
图13显示以SDS-PAGE方法检测rANL蛋白表达。其中泳道1为种子菌；泳道2为pET22b/BL21；泳道3为重组pET22b-ANL/BL21诱导2小时；泳道4为重组pET22b-ANL/BL21诱导4小时；泳道5为重组pET22b-ANL/BL21诱导6小时；泳道6为蛋白分子量标准。结果显示经UVP扫描分析目的蛋白表达量为32.7％。
图14显示rANL表达形式鉴定实验结果。其中泳道1为重组工程菌；泳道2为工程菌超声沉淀；泳道3为工程菌超声上清；泳道4-7为包涵体洗涤；泳道8为rANL包涵体；泳道9为蛋白分子量标准。
图15显示蛋白抗原质量鉴定图(SDS-PAGE)。其中泳道1为蛋白分子量标准；泳道2为rAhpC；泳道3为rANL。
具体实施例方式
下面结合附图及实施例对本发明作详细描述本发明。
实施例1 幽门螺杆菌AhpC、NapA编码基因及分子外佐剂LTB、CTB基因的克隆1.幽门螺杆菌来源于西南医院消化科病人临床分离株(菌株编号CQ9803)2.液氮罐中取出保存的Hp菌株(CQ 9803)涂布于Hp专用固体培养基上，于37℃，含5％O2，85％N2，10％CO2条件下培养72h。基因组抽提试剂盒抽提Hp基因组(附图1所示)。
3.采用PCR方法自Hp基因组分别扩增AhpC和NapA的编码基因。
1)引物设计合成如下(下划线示酶切位点及接头(linker)碱基序列)根据GenBank公布的基因序列及引物设计原则，设计相应的引物，引入酶切位点。在中间引入下列接头(linker)序列。
P15’-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGC-3’Nde IAhpCP25’-CGCTCGAGTTAAAGCTTAATGGAAT-3’XhoINapAP35’-CATATGAAAACATTTGAAATT-3’NdeI
P45’-CTCGAGAGCCAAATGGGCTTCTAG-3’XhoIP55’-CCATGGCTCCCCAGTCTATTAC-3’NcoILTBP65’-CTCGAGGTTTTCCATGCTGATTGC-3’XhoIP75’-CATATGATTAAATTAAAATTTG-3’NcoICTBP85’-CTCGAGATTTGCCATACTAATTGCG-3’XhoI2)目的基因的PCR扩增以幽门螺杆菌基因组DNA为模板，P1和P2，P3和P4引物分别扩增AhpC、NapA基因，以野生型产毒大肠杆菌H44815基因组DNA为模板以P5和P6引物扩增LTB基因，以霍乱弧菌(埃尔托生物型)基因组DNA为模板，P7和P8引物扩增CTB基因，采用如下PCR体系和程序(PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司产品)模板DNA 1μl；10×PCR缓冲液(含氯化镁)5μl；dNTPs(10mmol/L)4μl；上、下游引物(0.025mmol/L)各1μl；Taq DNA聚合酶(5u/μl)0.5μl，加去离子水至终体积50μl。
将反应体系混匀，离心处理后，加入30μl石蜡油。94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火40秒，72℃延伸40秒，35个循环，72℃完全延伸10分钟。反应完毕后取1μl反应产物，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。
3)PCR产物的回收(回收试剂盒购自北京天为时代公司，按试剂盒使用说明书操作)(1)灌制1.0％的琼脂糖凝胶；(2)将PCR扩增产物加入电泳上样孔中，指示剂迁移至适当位置时停止电泳；(3)在紫外线灯下分离含目的片段的凝胶，移入1.5ml EP管；(4)加入DNA结合缓冲液(北京天为时代公司回收试剂盒)，65℃水浴使凝胶完全溶化并保持溶液pH在5.0～6.0之间；(5)将溶胶液移入分离管，12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；(6)加入500μl洗涤缓冲液(北京天为时代公司回收试剂盒)，12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体；(7)重复步骤(6)；(8)12000g离心1分钟，分离管移置另一干净1.5ml EP管，加入20μl的TE缓冲液，65℃孵育10分钟，12000g离心1分钟，取2μl电泳，UVP紫外扫描检查回收效果。
4.PCR产物的克隆1)连接反应根据PCR回收产物浓度分别与pMD18-T载体按外源片段与载体摩尔数比为1∶2～10的原则，设计连接反应体系如下(PCR试剂盒和pMD18-T载体试剂盒均购自大连TaKaRa公司，按试剂盒使用说明书操作)目的片段连接回收片段(200ng/μl 1μlpMD18-T(50ng/μl)1μlddH2O 3μl连接溶液(大连TaKaRa公司pMD18-T载体试剂盒)5μl总体积 10μl对照插入段(Control insert)DNA的连接对照插入物DNA(50ng/μl 1μlpMD18-T(50ng/μl)1μlddH2O 3μl连接溶液(大连TaKaRa公司pMD18-T载体试剂盒)5μl总体积 10μl16℃连接3小时。
2)连接产物转化及重组子的筛选、鉴定(1)大肠杆菌DH5α感受态菌的制备(CaCl2法)无菌接种环蘸取-70℃冻存的DH5α保种液，三线法划线接种于LB平板，37℃培养12～16小时。
挑取单个菌落接种于2ml LB培养液中，37℃摇床培养12～16小时。
将过夜培养的DH5α按1％比例转种至LB培养液中，37℃摇床培养至OD600为0.2～0.4时，800g离心5分钟收集细菌。
加入1ml预冷的0.1M CaCl2重悬沉淀，冰水浴3小时。4℃800g离心5分钟，弃上清。加入100μl预冷的0.1M CaCl2悬浮沉淀，冰水浴1小时，备用。
(2)含有X-Gal、IPTG的Amp+LB平板的制备LB固体培养基用前熔化，待温度降至50℃左右加入Amp至终浓度为100mg/L，混匀后倾到平板，自然凝固。使用前2～3小时取Amp+LB平板，加入40μl X-Gal(20mg/ml)、5μlIPTG(200mg/ml)，用L棒涂布均匀，置于37℃孵箱备用。
(3)连接产物转化同时分别取三管感受态菌液各100μl，第一管加入连接反应产物，第二管加入对照插入段(control insert)DNA连接产物，作为阳性对照，第三管不加外源DNA，作为阴性对照，冰水浴60分钟。42℃水浴热休克90秒，迅速放置冰水浴1～2分钟。每管各加700μl LB培养液，37℃摇床培养1小时。各管以800g离心1分钟，吸弃400μl上清后混匀沉淀，各取50μl涂布Amp+LB平板，37℃孵箱培养过夜。
(4)目的重组子的筛选与鉴定①挑取连接产物转化平板上分隔良好的蓝、白斑菌落分别接种Amp+LB平板，37℃培养12～16小时。转种于Amp+LB培养液中，37℃摇床培养过夜。
②质粒DNA抽提(使用Omega公司质粒抽提试剂盒)分别抽提蓝白斑质粒取菌液分装于1.5ml离心管中，12000g离心3分钟，留取沉淀。
每管加100μl溶液I(Omega公司质粒抽提试剂盒)悬浮，充分振荡混匀。
加入100μl溶液II(Omega公司质粒抽提试剂盒)，轻柔混匀，冰水浴5分钟。
加入250μl溶液III(Omega公司质粒抽提试剂盒)，轻振混匀，室温放置10分钟。
4℃、12000g离心10分钟，将上清移至分离管中。
12000g离心1分钟，倾倒收集管中的废液。
加入500μl洗涤缓冲液(Omega公司质粒抽提试剂盒)于分离管中，同上离心并弃去收集管中的废液。
重复步骤7。
12000g离心1分钟，使乙醇完全挥发。
将分离管置于另一干净EP管中并加入一定量的TE缓冲液(Omega公司质粒抽提试剂盒)，65℃水浴5分钟，12000g离心1分钟。
取一定量洗脱液进行电泳，其余置于-20℃保存备用。
③酶切鉴定分别对蓝斑质粒DNA和白斑质粒DNA进行双酶切。(限制性内切酶购自大连TaKaRa公司)蓝斑质粒DNA1μlBamHI 1μl10×缓冲液(K) 1μlddH2O 7μl总体积 10μl重组质粒DNA5μlNdeI或NcoI 0.5μlXhoI 0.5μl10×缓冲液(K) 1μl
ddH2O 3μl总体积 10μl混匀后，37℃水浴4小时。
5.PCR产物的序列分析将TA克隆阳性转化菌株送至公司，按常规方法提取质粒，采用双脱氧末端终止法，对插入片段进行序列测定。PCR扩增效果如附图2、3、4、7、11所示。
实施例2 分子内佐剂融合基因AhpC-LTB(AL)的获得引物设计与合成AhpC P15’-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3’Nde IP2’ 5’-GCTACCTCCGCCTCCAAGCTTAATGGAATLinkerLTB P5” 5’-GGAGGCGGAGGTAGCGCTCCCCAGTCTATT-3’linkerP65’-CTCGAGGTTTTCCATGCTGATTGC-3’XhoI分别以实施例1回收的AhpC和LTB为模板，用P1和P2’、P5”和P6引物分别扩增AhpC和LTB基因，细菌基因组抽提按天为时代离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒进行。PCR扩增体系为模板DNA1μl；10×PCR缓冲液5μl；dNTPs(10mmol/L)4μl；引物(0.025mmol/L)各1μl；Taq DNA聚合酶(5u/μl)0.5μl；加去离子水至终体积50μl。
将反应体系混匀，离心处理后，加入30μl石蜡油。94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火40秒，72℃延伸40秒，35个循环，72℃完全延伸10分钟。反应完毕后取1μl反应产物，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。
以回收的带有Linker的AhpC和LTB基因为模板，P1和P6为引物进行重叠延伸PCR反应。PCR扩增体系为同前。
重叠延伸PCR扩增反应94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸70秒，35个循环，72℃完全延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。
PCR产物的克隆及序列分析同前。重叠延伸PCR结果见附图8所示。
实施例3 分子内佐剂融合基因AhpC-CTB(AC)的获得引物设计与合成AhpC P15’-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3’Nde IP2’ 5’-GCTACCTCCGCCTCCAAGCTTAATGGAATLinkerCTBP7” 5’-GGAGGCGGAGGTAGCATTAAATTAAAATTTGGT-3’
linkerP85’-CTCGAGATTTGCCATACTAATTGCG-3’XhoI分别以实施例1回收的AhpC和CTB为模板，用P1和P2’、P7”和P8为引物，分别扩增AhpC和CTB基因，细菌基因组抽提按天为时代离心柱型细菌基因组DNA提取试剂盒进行。PCR扩增体系为模板DNA 1μl；10×PCR缓冲液(含氯化镁)5μl；dNTPs(10mmol/L)4μl；引物(0.025mmol/L)各1μl；Taq DNA聚合酶(5u/μl)0.5μl，加去离子水至终体积50μl。
将反应体系混匀，离心处理后，加入30μl石蜡油。94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火40秒，72℃延伸40秒，35个循环，72℃完全延伸10分钟。反应完毕后取1μl反应产物，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。
以回收的带有Linker的AhpC和CTB基因为模板，P1和P8为引物进行重叠延伸PCR反应。PCR扩增体系为同前。
重叠延伸PCR扩增反应94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸70秒，35个循环，72℃完全延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。PCR产物的克隆及序列分析同前。
实施例4 融合基因AhpC-NapA(AN)的获得引物设计与合成AhpCP15’-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3’Nde IP2’ 5’-GCTACCTCCGCCTCCAAGCTTAATGGAATLinkerNapAP3’ 5’-TGGAGGCGGAGGTAGCAAAACATTTGAAATT-3linkerP45’-CTCGAGAGCCAAATGGGCTTCTAG-3’XhoI以实施例1回收的AhpC和NapA基因为模板，分别以P1和P2’、P3’和P4为引物进行重叠延伸PCR反应。PCR扩增体系为模板DNA 1μl；10×PCR缓冲液5μl；dNTPs(10mmol/L)4μl；引物(0.025mmol/L)各1μl；Taq DNA聚合酶(5u/μl)0.5μl，加去离子水至终体积50μl。
将反应体系混匀，离心处理后，加入30μl石蜡油。94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火40秒，72℃延伸40秒，35个循环，72℃完全延伸10分钟。反应完毕后取1μl反应产物，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。
以回收的带有Linker的AhpC和NapA基因为模板，P1和P4为引物进行重叠延伸PCR反应。PCR扩增体系同前。
重叠延伸PCR扩增反应94℃预变性5分钟，94℃变性30秒s，60℃退火30秒，72℃延伸70秒，35个循环，72℃完全延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。
PCR产物的克隆及序列分析同前。
实施例5 分子内佐剂融合基因AhpC-NapA-LTB(AUL)的获得引物设计与合成AhpC-NapA P15’-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3’Nde IP4’ 5’-GCTACCTCCTCCACTTCCGCCTCCAGCCAAATGGGCTTCTAG-3’linkerLTB P5’ 5’-GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCGCTCCCCAGTCTATT-3’linkerP65’-CTCGAGGTTTTCCATGCTGATTCC-3’XhoI以实施例4回收的AhpC-NapA基因和实施例1回收的LTB基因组为模板，以P1和P4’、P5’和P6为引物扩增AhpC-NapA和LTB基因。PCR扩增体系为模板DNA1μl；10×PCR缓冲液5μl；dNTPs(10mmol/L)4μl；引物(0.025mmol/L)各1μl；Taq DNA聚合酶(5u/μl)0.5μl，加去离子水至终体积50μl。
将反应体系混匀，离心处理后，加入30μl石蜡油。94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火40秒，72℃延伸70秒，35个循环，72℃完全延伸10分钟。反应完毕后取1μl反应产物，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。
以回收的带有接头的AhpC-NapA融合基因和LTB为模板，P1和P6为引物进行重叠延伸PCR反应。PCR扩增体系同前。
重叠延伸PCR扩增反应94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸90秒，35个循环，72℃完全延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。
PCR产物的克隆及序列分析同前。重叠延伸结果见附图9、10所示。
实施例6 分子内佐剂融合基因AhpC-UreB414-CTB(AUC)的获得引物设计与合成AhpC-NapAP15’-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3’Nde IP4’ 5’-GCTACCTCCTCCACTTCCGCCTCCAGCCAAATGGGCTTCTAG-3’linkerCTB P7’ 5’-GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCATTAAATTAAAATTTGGT-3’linkerP85’-CTCGAGATTTGCCATACTAATTGCG-3’XhoI以实施例4回收的AhpC-NapA基因和实施例1回收的CTB基因组为模板，以P1和P4’、P7’和P8为引物扩增AhpC-NapA和CTB基因。PCR扩增体系为
模板DNA 1μl；10×PCR缓冲液5μl；dNTPs(10mmol/L)4μl；引物(0.025mmol/L)各1μl；Taq DNA聚合酶(5u/μl)0.5μl，加去离子水至终体积50μl。
将反应体系混匀，离心处理后，加入30μl石蜡油。94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火40秒，72℃延伸70秒，35个循环，72℃完全延伸10分钟。反应完毕后取1μl反应产物，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR效果。
以回收的带有Linker的AhpC-NapA融合基因和CTB为模板，P1和P8为引物进行重叠延伸PCR反应。PCR扩增体系同前。
重叠延伸PCR扩增反应94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸90秒，35个循环，72℃完全延伸10分钟。琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段。
PCR产物的克隆及序列分析同前。
实施例7 重组基因表达质粒及高效表达工程菌的构建及筛选1.重组质粒的构建将含目的基因的pMD-18T载体及表达载体pET-28a(+)或pET-22b(+)(购自美国Novagen公司，本室保存)双酶切，酶切产物经1.0％琼脂糖电泳、目的片段胶回收纯化后，用连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，双酶切，1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
有关操作具体步骤如下1)质粒DNA抽提(使用Omega公司质粒抽提试剂盒，按试剂盒使用说明书操作)(1)挑取平板上分隔良好的菌落转种于带相应抗生素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜；(2)取菌液分装于1.5mL离心管中，12000g离心3分钟，留取沉淀；(3)每管加100μL溶液I(Omega公司质粒抽提试剂盒)悬浮，充分振荡混匀；(4)加入100μL溶液II(Omega公司质粒抽提试剂盒)，轻柔混匀，冰水浴5分钟；(5)加入250μL溶液III(Omega公司质粒抽提试剂盒)，轻振混匀，室温放置10分钟；(6)4℃、12000g离心10分钟，将上清移至分离管中；(7)12000g离心1分钟，倾倒收集管中的废液；(8)加入500μL洗涤缓冲液(Omega公司质粒抽提试剂盒)于分离管中，同上离心并弃去收集管中的废液，重复洗涤一次；(9)12000g离心1分钟，使乙醇完全挥发；(10)将分离管置于另一干净EP管中并加入一定量的TE缓冲液(Omega公司质粒抽提试剂盒)，65℃水浴5分钟，12000g离心1分钟；(11)取一定量洗脱液进行电泳，其余置于-20℃保存备用。
2)琼脂糖凝胶电泳
1.0％琼脂糖凝胶，1×TAE缓冲液，120-150mA，电泳20-40分钟。
50×TAE储存液配方2.0mol/L Tris碱，1.0mol/L NaAc，0.1mol/L Na2EDTA；用冰醋酸调节pH8.3。
3)质粒DNA的酶切反应1μg质粒DNA1μl 10×缓冲液(TaKaRa内切酶试剂)1μl限制性内切酶Nco I/XhoI或NdeI/XhoI(10u/μl)用双蒸水补至10μl混合后37℃温育1-2小时。
4)琼脂糖电泳胶的目的DNA回收纯化在紫外灯下观察并切下琼脂糖凝胶上的目的DNA电泳带，移入1.5mL EP管。
加入Omega公司胶回收试剂盒的DNA结合缓冲液，65℃水浴使凝胶完全溶化并保持溶液pH在5.0～6.0之间。将溶胶液移入分离管，12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体。
加入配套的洗涤缓冲液(Omega公司质粒抽提试剂盒)，12000g离心1分钟，弃去收集管中的液体。重复洗涤1次。
12000g离心1分钟，分离管移置另一干净1.5mL EP管，加入一定体积的TE缓冲液，65℃孵育10分钟，12000g离心1分钟，取一定量电泳，UVP紫外扫描仪检测回收纯化效果。
5)连接反应(使用上海生工公司连接试剂盒)通过紫外分光光度计检测目的DNA片段和载体片段的浓度，根据外源片段与载体摩尔数比一般为1∶2～10的原则，设计连接反应体系如下目的DNA 1μl；质粒载体1～2μl；连接溶液5μl；ddH2O 2～3μl，总体积10μl。22℃连接12-16小时。
6)感受态菌的制备(CaCl2法)(1)无菌接种环蘸取-70℃冻存的细菌保种液，三线法划线接种于LB平板，37℃培养12～16h。
(2)挑取单个菌落接种于2mL LB培养液中，37℃摇床培养12～16h。
(3)将过夜培养的DH5a按1％比例转种至LB培养液中，37℃摇床培养至OD600至0.2～0.4时，8000g离心5分钟收集细菌。
(4)加入1ml预冷的0.1mol/L CaCl2重悬沉淀，冰水浴3小时。4℃ 8000g离心5分钟，弃上清。加入100μl预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮沉淀，冰水浴1小时，备用。
7)连接产物转化(1)取感受态菌液100μl，加入连接反应产物；冰水浴60分钟，42℃水浴热休克100s，迅速放置冰水浴1～2分钟。
(2)加100μl LB培养液，37℃摇床培养1小时。
(3)以8000g离心10分钟，吸弃100μl上清后混匀沉淀，各取50μl涂布平板，37℃孵箱培养过夜。
2.高效表达融合蛋白工程菌的构建及筛选将含目的融合基因的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态菌中，经Amp+或K+LB平板筛选，提取质粒酶切鉴定。
取经鉴定的重组菌接种于3ml含Kan或Amp的LB培养液中，37℃摇床培养过夜。次日将过夜培养的重组工程菌按1％的比例转种于20ml含Kan或Amp的LB培养液中，37℃摇床培养2.5小时，以IPTG诱导5小时，SDS-PAGE检测融合蛋白的表达形式和表达量，筛选高效表达菌株。
构建及诱导表达结果见附图4、5、12、13所示。
实施例8 基因重组表达工程菌的发酵发酵工艺如下采用德国B.Braun 10L发酵罐，发酵过程中种子菌10％比例接种，保持45％溶氧、温度37℃、pH7.4，待葡萄糖浓度降为0.1％时加入IPTG 500μmol/L诱导4～6小时收菌。
发酵过程在级联溶氧控制的分批培养基础上，流加补料。
发酵过程所用培养基为改良M9-CAA培养基，在M9-CAA的基础上添加0.6％酵母浸出液和2mg/L ZnCl2·4H2O、2mg/LCoCl2·4H2O、4mg/L FeSO4·16H2O、5mg/L H3BO3、1.6mg/LMnCl2·4H2O、4mg/L CuSO4而成。
发酵后回收菌液，4℃离心(8000g)15分钟。吸弃上清，收集细菌，称重后冻存备用。
结果10L发酵菌液可以收获细菌湿重600克左右。
实施例9 重组目的蛋白的纯化及剂型制备1.可溶性上清和包涵体提取将高效表达的菌体200-500g以TE缓冲液(20mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，pH 8.0)1∶10(W/V)比例悬浮，4℃预冷后采用细胞匀浆机使其混合均匀。采用高压均质机在压力为70Mpa的条件下进行破菌(共破菌4～6次)，破菌完毕后，取少量菌液涂片染色，显微镜下观察细胞的完整性，确保细胞破碎完全，随后以500×g离心30分钟，弃沉淀，再以15,000×g离心40分钟，收集沉淀即为包涵体。包涵体以1∶10(W/V)的比例分别用洗涤液A(20mmol/L Tris，5mmol/LEDTA，pH 8.0)和洗涤液B(20mmol/L Tris、2mol/L尿素，pH 8.0)各洗涤2次。洗涤条件为4℃搅拌20分钟，15,000×g离心40分钟，收集包涵体沉淀；最后将包涵体用包涵体溶解液(1mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、8mol/L尿素pH 8.0)以1∶10(W/V)的比例混合，4℃搅拌3小时，15,000×g离心45分钟，取上清作为下一步纯化的原料。
包涵体提取所用缓冲液1)TE缓冲液20mmol/L Tris，5mmol/L EDTA，pH 8.02)包涵体洗涤液A5mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、1％Triton X-100，pH 8.03)包涵体洗涤液B20mmol/L Tris、2mol/L尿素，pH 8.04)包涵体溶解液1mmol/L EDTA、20mmol/L Tris、8mol/L尿素(pH 8.0)2.金属离子螯合层析选择亲和层析柱Chelating Sepharose进行纯化，使用20mmol/L Tris，5mmol/LEDTA，pH7.0～9.0对目的蛋白进行纯化，采用咪唑梯度洗脱。
3.阴离子柱纯化选择阴离子柱HiTrap Q进行纯化，使用20mmol/L Tris，5mmol/LEDTA，pH7.0～9.0对目的蛋白进行纯化，采用NaCl梯度洗脱。
4.Superdex凝胶过滤层析脱盐步骤3所获目标蛋白经葡聚糖PEG透析袋内浓缩或超滤浓缩后用凝胶过滤柱Superdex过滤脱盐，脱尿素及咪唑。
5.纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE，检定其纯度。Lowry法检测蛋白浓度。
其中，步骤2所述镍离子亲和纯化填料包括Chelating Sepharose HP、Chelating SepharoseFF；步骤3所述阴离子纯化填料包括Q Sepharose HP、Q Sepharose FF、Q Sepharose XL；步骤4所述凝胶过滤层析柱包括Superdex 75、Superdex 200、Superdex HR 10/30。
纯化结果如附图3所示。
6.上述方法获得的重组蛋白分别被制备成冷冻干燥剂型或胶囊剂。其中冷冻干燥剂型加纯化水或注射用水溶解后供口服。冷冻干燥剂型制备方法为向纯化所获得的目的蛋白中加入适当比例(5％～20％)的稳定剂甘露醇(果糖或山梨醇)，混匀，除菌过滤分装后冷冻干燥；胶囊剂型制备方法为首先向纯化所获得的目的蛋白中加入适当比例(5％～20％)的稳定剂甘露醇，混匀，除菌过滤分装后冷冻干燥，再装填入肠溶胶囊。
目的蛋白表达形式鉴定见附图6、14所示实施例10 加有分子外佐剂(LTB、CTB)的幽门螺杆菌AhpC基因工程疫苗的制备1.以LTB为佐剂的幽门螺杆菌AhpC基因工程疫苗的制备纯化的Hp重组抗原蛋白(rAhpC或rAhpC-NapA)以不同组合形式与粘膜佐剂rLTB物理混合，制备出幽门螺杆菌AhpC基因工程疫苗。该疫苗以rLTB作为粘膜佐剂，适用于粘膜途径(胃肠道、鼻粘膜等)的免疫接种。
2.以CTB为佐剂的幽门螺杆菌AhpC基因工程疫苗的制备纯化的Hp重组抗原蛋白(rAhpC或rAhpC-NapA)以不同组合形式与粘膜佐剂CTB物理混合，制备出幽门螺杆菌AhpC基因工程疫苗。该疫苗以CTB作为粘膜佐剂，适用于粘膜途径(胃肠道、鼻粘膜等)的免疫接种。
3.剂型制备同实施例9。
实施例11 加有分子内佐剂(LTB、CTB)的幽门螺杆菌AhpC基因工程疫苗的制备1.以LTB为佐剂的幽门螺杆菌AhpC基因工程疫苗的制备纯化的Hp重组抗原蛋白rAhpC-NapA-LTB作为幽门螺杆菌AhpC基因工程疫苗。该疫苗适用于粘膜途径(胃肠道、鼻粘膜等)的免疫接种。
2.以CTB为佐剂的幽门螺杆菌AhpC基因工程疫苗的制备纯化的Hp重组抗原蛋白rAhpC-NapA-CTB作为幽门螺杆菌AhpC基因工程疫苗。该疫苗适用于粘膜途径(胃肠道、鼻粘膜等)的免疫接种。
3.剂型制备同实施例9。
目的蛋白纯化结果见附图15所示实施例12 生物学活性实验1、BALB/c小鼠免疫后特异性免疫应答将不同剂型基因工程疫苗口服免疫BALB/c小鼠，150μg/只，分别于第0，1，2，4周各免疫一次，于末次免疫后1周采集血液、胃肠道冲洗液和粪便抽提物，ELISA检测血清中特异性抗体IgG、IgA及胃肠道冲洗液和粪便抽提物中特异性抗体sIgA水平。同时，设立对照组。
结果免疫4次后不同组合的幽门螺杆菌AhpC基因工程疫苗试验组小鼠特异性抗体IgG、IgA和sIgA水平与PBS对照组相比较相差极显著(P＜0.001)，提示不同疫苗口服免疫后激发小鼠产生粘膜局部免疫应答和系统性免疫应答。同时从不同的免疫指标的检测结果认为口服后激发小鼠的以Th1、Th2平衡的特异性的免疫应答。
2、蒙古沙鼠口服免疫攻毒保护实验将不同剂型基因工程疫苗免疫蒙古沙鼠，分别于第0、1、2、4周各免疫一次，末次免疫后10天，以幽门螺杆菌适应株M13攻毒，攻毒后30天剖杀动物，取胃组织进行细菌培养、PCR检查和病理切片检查。结果对照组感染率为100％，各组免疫保护效果如表1所示表1 口服免疫蒙古沙鼠后攻毒免疫保护效果
结果显示，rAhpC单亚单位免疫组仅获得13.3％的免疫保护率，而AhpC和NapA物理混合或融合免疫组的免疫保护率提高到46.7％和50.0％。证明一种抗原免疫很难在人体诱导出足够的保护性免疫，多种抗原组合似乎能引起更有效地保护性免疫。
rAhpC与粘膜佐剂LTB或CTB混合或融合后，免疫保护率与单亚单位免疫组相比，保护率提高到34.5％、25.0％和36.7％、27.6％，AhpC和NapA与粘膜佐剂LTB或CTB物理混合或融合免疫组的免疫保护率提高到72.4％、65.6％和83.3％、76.7％，以上结果证明LTB和CTB具有良好的免疫原性和强效佐剂效应，可加强对免疫原的免疫应答能力。但是CTB激活Th2可产生IL-4，IL-4则能选择性地促进IgE合成，因而认为CTB有可能引起变态反应，而LTB基本上不诱生IgE，却能有效地启动机体局部和全身的体液和细胞免疫。在实验中，粘膜佐剂LTB或CTB在物理混合组和融合组之间比较，LTB免疫组的保护率高于CTB免疫组，且融合组保护率高于物理混合组。同样抗原不同组合方式之间差异经统计分析，相差不显著，多抗原组较单一或双亚单位组的免疫保护率高，且相差显著。
结论融合疫苗抗原AUL免疫蒙古沙鼠较其他各组可产生针对Hp全菌攻击有效的保护作用，同时融合方式的疫苗具有简便、便于操作等优点，避免了多个亚单位分别纯化的缺点，使纯化工艺更加简便易行。同时，融合后的蛋白更好的发挥其免疫保护效果，较单亚单位和多亚单位物理混合组产生更好的免疫保护效果。
序列表<110>中国人民解放军第三军医大学<120>一种人幽门螺杆菌感染预防和治疗用AhpC多价亚单位疫苗及其制备方法<160>594<210>1<211>594<212>DNA<213>E.coli BL21(DE3)ahpC<220>
<221>gene<222>(1)...(594)<400>
ATGTTAGTTACAAAACTTGCCCCCGATTTTAAAGCACCTGCCGTTTTAGG 50AAACAATGAGGTTGATGAACACTTTGAGCTTTCTAAAAATTTAGGCAAAA 100ATGGTGCGATTCTTTTCTTTTGGCCAAAAGATTTTACTTTTGTATGCCCT 150ACAGAAATCATTGCGTTTGACAAAAGAGTGAAAGACTTTCACGAAAAAGG 200CTTTAATGTGATTGGCGTGTCTATTGACAGCGAGCAAGTGCATTTCGCAT 250GGAAAAACACCCCTGTGGAAAAAGGCGGTATCGGTCAAGTGTCTTTCCCT 300ATGGTGGCTGATATTACTAAGAGCATTTCCAGAGATTATGATGTGCTGTT 350TGAAGAAGCGATCGCTTTGAGAGGCTCTTTTTTGATTGACAAAAACATGA 400AAGTAAGACACGCAGTGGTCAATGATTTGCCATTAGGTAGGAATGCAGAC 450GAGATGCTTCGCATGGTAGACGCTCTCTTACACTTTGAAGAACATGGTGA 500AGTGTGCCCAGCAGGCTGGAGAAAAGGCGATAAAGGCATGAAAGCGACTC 550ACCAAGGCGTTGCAGAGTATCTCAAAGAAAATTCCATTAAGCTT 594<160>198<210>1<211>198<212>PRT<213>E.coli BL21(DE3)AhpC
<220>
<221>CDS<222>(1)...(198)<400>
MLVTKLAPDFKAPAVLGNNEVDEHFELSKNLGKNGAILFFWPKDFTFVCP 50TEIIAFDKRVKDFHEKGFNVIGVSIDSEQVHFAWKNTPVEKGGIGQVSFP 100MVADITKSISRDYDVLFEEAIALRGSFLIDKNMKVRHAVVNDLPLGRNAD 150EMLRMVDALLHFEEHGEVCPAGWRKGDKGMKATHQGVAEYLKENSIKL. 198<160>918<210>1<211>918<212>DNA<213>E.coli BL21(DE3)ahpC-ltB<220>
<221>gene<222>(1)...(918)<400>
ATGTTAGTTACAAAACTTGCCCCCGATTTTAAAGCACCTGCCGTTTTAGG 50AAACAATGAGGTTGATGAACACTTTGAGCTTTCTAAAAATTTAGGCAAAA 100ATGGTGCGATTCTTTTCTTTTGGCCAAAAGATTTTACTTTTGTATGCCCT 150ACAGAAATCATTGCGTTTGACAAAAGAGTGAAAGACTTTCACGAAAAAGG 200CTTTAATGTGATTGGCGTGTCTATTGACAGCGAGCAAGTGCATTTCGCAT 250GGAAAAACACCCCTGTGGAAAAAGGCGGTATCGGTCAAGTGTCTTTCCCT 300ATGGTGGCTGATATTACTAAGAGCATTTCCAGAGATTATGATGTGCTGTT 350TGAAGAAGCGATCGCTTTGAGAGGCTCTTTTTTGATTGACAAAAACATGA 400AAGTAAGACACGCAGTGGTCAATGATTTGCCATTAGGTAGGAATGCAGAC 450GAGATGCTTCGCATGGTAGACGCTCTCTTACACTTTGAAGAACATGGTGA 500AGTGTGCCCAGCAGGCTGGAGAAAAGGCGATAAAGGCATGAAAGCGACTC 550ACCAAGGCGTTGCAGAGTATCTCAAAGAAAATTCCATTAAGCTTGGAGGC 600GGAGGTAGCGCTCCCCAGTCTATTACAGAACTATGTTCGGAATATCGCAA 650CACACAAATATATACGATAAATGACAAGATACTATCATATACGGAATCGA 700TGGCAGGTAAAAGAGAAATGGTTATCATTACATTTAAGAGCGGGGCAACA 750
TTTCAGGTCGAAGTCCCGGGCAGTCAACATATAGACTCCCAAAAAAAAGC 800CATTGAAAGGATGAAGGACACATTAAGAATCACATATCTGACCGAGACCA 850AAATTGATAAATTATGTGTATGGAATAATAAAACCCCCAATTCAATTGCG 900GCAATCAGTATGGAAAAC 918<160>978<210>1<211>978<212>DNA<213>E.coli BL21(DE3)ahpC-ctB<220>
<221>gene<222>(1)...(978)<400>
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<210>1<211>1371<212>DNA<213>E.coli BL21(DE3)ahpC-napA-ltB<220>
<221>gene<222>(1)...(1371)<400>
ATGTTAGTTACAAAACTTGCCCCAGATTTTAAAGCACCTGCCGTTTTAGG 50AAAGAATGAGGTTGATGAACACTTTGAGCTTTCTAAAAATTTAGGCAAAA 100ATGGTGCGATTCTTTTCTTTTGGCCAAAAGATTTTACTTTTGTATGCCCT 150ACAGAAATCATTGCGTTTGACAAAAGAGTGAAAGACTTTCACGAAAAAGG 200CTTTAATGTGATTGGCGTGTCTATTGACAGCGAGCAAGTGCATTTCGCAT 250GGAAAAACACCCCTGTGGAAAAAGGCGGTATCGGTCAAGTGTCTTTCCCT 300ATGGTGGCTGATATTACTAAGAGCATTTCTAGAGATTATGATGTGCTGTT 350TGAAGAAGCGATCGCTTTGAGAGGCTCTTTTTTGATTGACAAAAACATGA 400AAGTAAGACACGCAGTGGTCAATGATTTGCCATTAGGTAGGAATGCAGAC 450GAGATGCTTCGCATGGTAGACGCTCTCTTACACTTTGAAGAACATGGTGA 500AGTGTGCCCAGCAGGCTGGAGAAAAGGCGATAAAGGCATGAAAGCGACTC 550ACCAAGGCGTTGCAGAGTATCTTAAAGAAAATTCCATTAAGCTTGGAGGC 600GGAGGTAGCAAAACATTTGAAATTTTAAAACATTTGCAAGCGGATGCGAT 650CGTGTTATTTATGAAAGTGCATAACTTCCATTGGAATGTGAAAGGCACCG 700ATTTTTTCCATGTGCATAAAGCCACTGAAGAAATTTATGAAGAATTTGCG 750GACATGTTTGATGATCTCGCTGAAAGGATTGTTCAATTAGGACACCACCC 800ATTAGTCACTTTATCCGAAGCGCTCAAACTCACTCGCGTCAAAGAAGAAA 850CTAAAACAAGCTTCCACTCTAAAGACATCTTTAAAGAAATTCTAGGCGAT 900TACAAACACCTAGAAAAAGAATTTAAAGAGCTCTCTAACACCGCTGAAAA 950AGAAGGCGATAAAGTAACCGTAACTTATGCGGACGATCAATTAGCCAAGT 1000TGCAAAAATCCATTTGGATGCTAGAAGCCCATTTGGCTGGAGGCGGAAGT 1050GGAGGAGGTAGTGCACCCCAGTCTATTACAGAACTATGTTCGGAATATCG 1100CAACACACAAATATATACGATAAATGACAAGATACTATCATATACGGAAT 1150CGATGGCAGGTAAAAGAGAAATGGTTATCATTACATTTAAGAGCGGCGCA 1200ACATTTCAGGTCGAAGTCCCGGGCAGTCAACATATAGACTCCCAAAAAAA 1250AGCCATTGAAAGGATGAAGGACACATTAAGAATCACATATCTGACCGAGA 1300CCAAAATTGATAAATTATGTGTATGGAATAATAAAACCCCCAATTCAATT 1350GCGGCAATCAGTATGGAAAAC 1371<160>1431
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1.幽门螺杆菌AhpC基因工程多价亚单位疫苗，其特征在于该疫苗的活性成分是幽门螺杆菌抗原组分烷基过氧化氢还原酶(AhpC)。
2.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌AhpC基因工程多价亚单位疫苗，其特征在于该疫苗的活性成分是将幽门螺杆菌抗原组分AhpC与中性粒细胞激活蛋白NapA通过接头序列连接在一起而得到的融合蛋白质。
3.根据权利要求1所述的幽门螺杆菌AhpC基因工程多价亚单位疫苗，其特征在于该疫苗的活性成分是将幽门螺杆菌抗原组分AhpC或其与中性粒细胞激活蛋白NapA的融合基因与佐剂成分LTB或CTB在基因水平上通过接头序列融合在一起形成的分子内佐剂基因工程重组融合蛋白质。
4.采用幽门螺杆菌AhpC基因制备的疫苗制剂，其特征在于该疫苗由根据权利要求1-3中任一项的基因工程疫苗活性成分以及一种或多种疫苗制剂中可接受的稀释剂和载体组成。
5.制备权利要求1-4中的基因工程多价亚单位疫苗的方法，主要包括以下步骤(1)提供幽门螺杆菌AhpC、NapA保护性抗原以及大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位LTB、霍乱毒素B亚单位CTB目的基因的PCR扩增、基因克隆与序列分析；(2)将步骤(1)的幽门螺杆菌AhpC或其与NapA、大肠杆菌不耐热肠毒B亚单位LTB、霍乱毒素B亚单位CTB全基因或各自的功能片段连接到原核表达质粒或多基因融合表达质粒中；(3)用步骤(2)的得到的重组表达质粒转化适当的宿主细菌细胞，得到基因过程重组菌株；(4)在适于表达所需蛋白质的条件下，大规模发酵培养步骤(3)的基因工程重组菌株；(5)分离并纯化步骤(4)产生的重组蛋白质，即得到幽门螺杆菌AhpC基因工程疫苗。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是在步骤1中，克隆AhpC、NapA、LTB、CTB基因使用的引物是AhpC P15’-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3’Nde IP25’-CGCTCGAGAAGCTTAATGGAAT-3’XhoIP2’ 5’-GCTACCTCCGCCTCCAAGCTTAATGGAATLinkerNapA P35’-CATATGAAAACATTTGAAATT-3’NdeIP3’ 5’-TGGAGGCGGAGGTAGCAAAACATTTGAAATT-3linkerP45’-CTCGAGAGCCAAATGGGCTTCTAG-3’XhoIP4’ 5’-GCTACCTCCTCCACTTCCGCCTCCAGCCAAATGGGCTTCTAG-3’linkerLTB P55’-CCATGGCTCCCCAGTCTATTAC-3’NcoIP5’ 5’-GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCGCTCCCCAGTCTATT-3’linkerP5” 5’-GGAGGCGGAGGTAGCGCTCCCCAGTCTATT-3’linkerP65’-CTCGAGGTTTTCCATGCTGATTGC-3’XhoICTB P75’-CATATGATTAAATTAAAATTTG-3’NcoIP7’ 5’-GGAGGCGGAAGTGGAGGAGGTAGCATTAAATTAAAATTTGGT-3’linkerP7” 5’-GGAGGCGGAGGTAGCATTAAATTAAAATTTGGT-3’linkerP85’-CTCGAGATTTGCCATACTAATTGCG-3’XhoI
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是步骤2中构建融合基因使用的合成引物是P15’-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3’Nde IAhpC P25’-CGCTCGAGTTAAAGCTTAATGGAAT-3’XhoIP35’-CATATGAAAACATTTGAAATT-3’NdeINapA P45’-CTCGAGAGCCAAATGGGCTTCTAG-3’XhoIP55’-CCATGGCTCCCCAGTCTATTAC-3’NcoILTB P65’-CTCGAGGTTTTCCATGCTGATTGC-3’XhoIP75’-CATATGATTAAATTAAAATTTG-3’NcoICTB P85’-CTCGAGATTTGCCATACTAATTGCG-3’XhoIP15’-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3’Nde IAhpC-LTB P65’-CTCGAGGTTTTCCATGCTGATTGC-3’XhoIP15’-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3’AhpC-CTB Nde IP85’-CTCGAGATTTGCCATACTAATTGCG-3’XhoIP15’-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3’Nde IAhpC-NapAP45’-CTCGAGAGCCAAATGGGCTTCTAG-3’XhoIP15’-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3’Nde IAhpC-NapA-LTBP65’-CTCGAGGTTTTCCATGCTGATTGC-3’XhoIP15’-CGCATATGTTAGTTACAAAACTTGCC-3’Nde IAhpC-NapA-CTBP85’-CTCGAGATTTGCCATACTAATTGCG-3’XhoI
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于步骤4中，所述阴离子纯化填料选自QSepharose HP、Q Sepharose FF或Q Sepharose XL；镍离子亲和纯化填料选自ChelatingSepharose HP或Chelating Sepharose FF；凝胶过滤层析柱选自Superdex 75、Superdex 200或Superdex HR 10/30。
全文摘要
本发明公开了一种幽门螺杆菌AhpC基因工程多价亚单位疫苗及其制备方法。该疫苗选用烷基过氧化氢还原酶(AhpC)或其与中性粒细胞激活蛋白NapA的融合基因作为活性成分，辅以分子内或分子外佐剂，如大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位LTB、霍乱毒素B亚单位CTB等，构建获得基因工程重组多价组合疫苗。该基因工程疫苗构建方法独特，制备工艺简捷、容易放大、重复性好，所获疫苗蛋白纯度高，动物试验证明可有效刺激机体产生较高的免疫应答和免疫保护作用。
文档编号A61P1/04GK1864746SQ200610054358
公开日2006年11月22日 申请日期2006年6月14日 优先权日2006年6月14日
发明者邹全明, 张卫军, 杨珺, 毛旭虎, 郭刚, 童文德, 吴超, 郭鹰, 刘开云, 解庆华 申请人:中国人民解放军第三军医大学