具有肽合成活性的突变型蛋白质的制作方法

专利名称：具有肽合成活性的突变型蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有肽合成活性的突变型蛋白质，更具体而言，涉及具有优良的肽合成活性的突变型蛋白质和使用该蛋白质制造肽的方法。
背景技术：
肽被用于医药品食品等各领域。例如，由于L-丙氨酰基-L谷氨酰胺比L-谷氨酰胺稳定，水溶性也高，被广泛用作输液、无血清培养基的成分。
一直以来，都采用化学合成法制造肽，然而，该制造方法在简便、效率方面，并不令人满意。
此外，也开发了利用酶制造肽的方法(例如，专利文献1、2等)。然而，以往利用酶制造肽的方法，存在肽生成速度非常慢，肽生成收率低等缺陷，尚需进一步改进。在此背景下，工业化高效制造肽的方法的开发，为人们所期待。
本发明人已经发现来源于鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium)的酶具有优良的肽合成活性(专利文献3～6)。
专利文献1EP 0278787A1专利文献2EP 359399 A1专利文献3WO 2004/011653专利文献4JP 2005-040037A专利文献5JP 2005-058212A专利文献6JP 2005-168405A发明内容发明要解决的问题本发明的目的在于提供更加优良的肽合成用蛋白质和高效制造肽的方法等。
解决问题的手段本发明人经过锐意研究，其结果是，发现通过改变来源于鞘氨醇杆菌属的细菌的具有肽合成活性的蛋白质的氨基酸序列或碱基序列的特定部位，进而可得到具有优良的肽合成活性的蛋白质，从而完成了本发明。即，本发明提供下述蛋白质和使用该蛋白质的肽制造方法等。
(1)具有如下氨基酸序列的突变型蛋白质，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中含有选自下述突变型1～68的任意1种或2种以上的突变的氨基酸序列；突变型1F207V，突变型2Q441E，突变型3K83A，突变型4A301V，突变型5V257I，突变型6A537G，突变型7A324V，突变型8N607K，突变型9D313E，突变型10Q229H，突变型11M208A，突变型12E551K，突变型13F207H，突变型14T72A，突变型15A137S，突变型16L439V，突变型17G226S，突变型18D619E，突变型19Y339H，突变型20W327G，突变型21V184A，突变型22V184C，突变型23V184G，突变型24V184I，突变型25V184L，突变型26V184M，突变型27V184P，突变型28V184S，突变型29V184T，突变型30Q441K，突变型31N442K，突变型32D203N，突变型33D203S，突变型34F207A，突变型35F207S，突变型36Q441N，突变型37F207T，突变型38F207I，突变型39T210K，突变型40W187A，突变型41S209A，突变型42F211A，突变型43F211V，突变型44V257A，突变型45V257G，突变型46V257H，突变型47V257M，突变型48V257N，突变型49V257Q，突变型50V257S，突变型51V257T，突变型52V257W，突变型53V257Y，突变型54K47G，突变型55K47E，突变型56N442F，突变型57N607R，突变型58P214T，突变型59Q202E，突变型60Y494F，突变型61R117A，突变型62F207G，突变型63S209D，突变型64S209G，突变型65Q441D，突变型66R445D，突变型67R445F，突变型68N442D。
(2)根据上述(1)所述的突变型蛋白质，其具有如下氨基酸序列，并具有肽合成活性，所述氨基酸序列是在含有选自上述突变型1～68的任意1种或2种以上的突变的氨基酸序列的突变部位之外的部位，还含有选自取代、缺失、插入、添加和倒位的1个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。
(3)根据上述(1)或(2)所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型2。
(4)根据上述(1)～(3)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型14。
(5)具有如下氨基酸序列的突变型蛋白质，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中含有选自下述突变型239～290、324～377之中任意1种或2种以上的突变；突变型239F207V/Q441E，突变型240F207V/K83A，突变型241F207V/E551K，突变型242K83A/Q441E，突变型243M208A/E551K，突变型244V257I/Q441E，突变型245V257I/A537G，突变型246F207V/S209A，突变型247K83A/S209A，突变型248K83A/F207V/Q441E，突变型249L439V/F207V/Q441E，突变型250A537G/F207V/Q441E，突变型251A301V/F207V/Q441E，突变型252G226S/F207V/Q441E，突变型253V257I/F207V/Q441E，突变型254D619E/F207V/Q441E，突变型255Y339H/F207V/Q441E，突变型256N607K/F207V/Q441E，突变型257A324V/F207V/Q441E，突变型258Q229H/F207V/Q441E，突变型259W327G/F207V/Q441E，突变型260A301V/L439V/A537G/N607K，突变型261K83A/Q229H/A301V/D313E/A324V/L439V/A537G/N607K，突变型262Q229H/V257I/A301V/A324V/Q441E/A537G/N607K，突变型263Q229H/A301V/A324V/Q441E/A537G/N607K，突变型264Q229H/V257I/A301V/D313E/A324V/Q441E/A537G/N607K，
突变型265T72A/A137S/A301V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型266T72A/A137S/A301V/Q441E/A537G/N607K，突变型267T72A/A137S/Q229H/A301V/A324V/L439V/A537G/N607K，突变型268T72A/A137S/Q229H/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型269T72A/Q229H/V257I/A301V/D313E/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型270T72A/Q229H/V257I/A301V/D313E/A324V/Q441E/A537G/N607K，突变型271T72A/A137S/Q229P/A301V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型272T72A/A137S/Q229L/A301V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型273T72A/A137S/Q229G/A301V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型274T72A/Q229L/V257L/A301V/D313E/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型275T72A/A137S/I228G/Q229P/A301V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型276T72A/A137S/I228L/Q229P/A301V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型277T72A/A137S/I228D/Q229P/A301V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型278T72A/A137S/Q229P/I230D/A301V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型279T72A/A137S/Q229P/I230V/A301V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型280T72A/I228S/Q229H/V257I/AA301V/D313E/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型281T72A/Q229H/S256C/V257I/A301V/D313E/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型282T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型283T72A/A137S/Q229P/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型284T72A/Q229P/V257I/A301G/D313E/A324V/Q441E/A537G/N607K，突变型285T72A/Q229P/V257I/A301V/D313E/A324V/Q441E/A537G/N607K，突变型286T72A/A137S/V184A/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型287T72A/A137S/V184G/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型288T72A/A137S/V184N/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型289T72A/A137S/V184S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型290T72A/A137S/V184T/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型324V184A/V257Y，突变型325V184A/W187A，突变型326V184A/N442D，突变型327V184P/N442D，突变型328V184A/N442D/L439V，突变型329A301V/L439V/A537G/N607K/V184A，突变型330A301V/L439V/A537G/N607K/V184P，突变型331A301V/L439V/A537G/N607K/V257Y，突变型332A301V/L439V/A537G/N607K/W187A，突变型333A301V/L439V/A537G/N607K/F211A，突变型334A301V/L439V/A537G/N607K/Q441E，突变型335A301V/L439V/A537G/N607K/N442D，突变型336A301V/L439V/A537G/N607K/V184A/F207V，突变型337A301V/L439V/A537G/N607K/V184A/A182G，突变型338T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/A537G/N607K/V184A/N442D，突变型339T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/A537G/N607K/V184A/N442D/T185F，突变型340T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/K83A，突变型341T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/W187A，突变型342T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/F211A，突变型343T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/V178G，突变型344T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185A，突变型345T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/A182G，突变型346T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/K314R，突变型347T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/A515V，突变型348T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/L66F，突变型349T72A/A137S/Q229P/V257IA301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/S315R，突变型350T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/K484I，突变型351T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/V213A，突变型352T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/A245S，突变型353T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/P214H，突变型354T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/L263M，突变型355T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/P183A，突变型356T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185K，突变型357T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185D，突变型358T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185C，突变型359T72A/A137S/Q229P/V257/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185S，突变型360T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185F，突变型361T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185P，突变型362T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185N，突变型363T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/P183A/A182G，突变型364T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/P183A/A182S，突变型365T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185F/N442D，突变型366T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/L66F/E80K/I157L/A182G/P214H/L263M，突变型367T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/L66F/E80K/I157L/A182G/P214H/L263M/Y328F，突变型368T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/L66F/Y81A/I157L/A182G/P214H/L263M/Y328F，突变型369T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/L66F/E80K/I157L/A182G/T210L/L263M/Y328F，突变型370A301V/L439V/A537G/N607K/Q441K，突变型371T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/I157L，突变型372T72A/A137S/Q229P/V257/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/G161A，突变型373T72A/A137S/Q229P/V257/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/Y328F，突变型374F207V/G226S，突变型375F207V/W327G，突变型376F207V/Y339H，突变型377F207V/D619E。
(6)根据上述(5)所述的突变型蛋白质，其具有如下氨基酸序列，并具有肽合成活性，所述氨基酸序列是在含有选自上述突变型239～290和324～377之中的任意1种或2种以上的突变的氨基酸序列的突变部位之外的部位，还含有选自取代、缺失、插入、添加和倒位的1个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。
(7)根据上述(5)或(6)所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型260。
(8)根据上述(5)～(7)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型286。
(9)编码具有上述(1)～(8)任一项所述的突变型蛋白质的氨基酸序列的多核苷酸。
(10)含有上述(9)所述的多核苷酸的重组多核苷酸。
(11)含有上述(10)所述的重组多核苷酸的经过转化的微生物。
(12)突变型蛋白质的制造方法，其特征在于，在培养基中培养上述(11)中所述的经过转化的微生物，使上述突变型蛋白质在培养基和/或微生物中积累。
(13)肽的制造方法，其特征在于，在上述(1)～(8)任一项所述的突变型蛋白质存在下，进行肽生成反应。
(14)肽的制造方法，其特征在于，在培养基中培养上述(11)中所述的经过转化的微生物，使上述突变型蛋白质在培养基中和/或经过转化的微生物中积累，进行肽生成反应。
(15)α-L-天门冬氨酰基-L-苯丙氨酸-β-酯的制造方法，其特征在于，在上述(1)～(8)任一项所述的突变型蛋白质存在下，进行L-天门冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸之间的反应。
(16)α-L-天门冬氨酰基-L-苯丙氨酸-β-酯的制造方法，其特征在于，在培养基中培养上述(11)所述的经过转化的微生物，使上述突变型蛋白质在培养基和/或经过转化的微生物中积累，进行L-天门冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸之间的反应。
(17)设计和制造具有肽合成活性的突变型蛋白质的方法，其包括基于用X射线晶体结构分析得到的具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构，推测该蛋白质的底物结合部位，取代、插入或缺失位于底物结合部位的氨基酸残基。
(18)在具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构中，在上述序列中的第67～70、72～88、100、102、103、106、107、113～117、130、155～163、165、166、180～188、190～195、200～235、259、273、276、278、292～294、296、298、299、300～304、325～328、330～340和437～447位氨基酸残基的存在位置，至少有1个或1个以上氨基酸残基被取代、插入或缺失得到的，并具有肽合成活性的突变型蛋白质。
(19)具有肽合成活性的蛋白质的突变型蛋白质，经穿引法(Threading Method)鉴定，该蛋白质的三维结构和具有SEQ IDNO209所示的氨基酸序列的蛋白质的三维结构类似，在该鉴定得到的序列比对中，在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第67～70、72～88、100、102、103、106、107、113～117、130、155～163、165、166、180～188、190～195、200～235、259、273、276、278、292～294、296、298、299、300～304、325～328、330～340和437～447位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，所述突变型蛋白质具有肽合成活性。
(20)具有肽合成活性的蛋白质的突变型蛋白质，在将该蛋白质和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的一级序列比对，或将该蛋白质和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的三维结构比对时，一级序列的同源性大于等于25％，在对应于SEQ IDNO209所示的氨基酸序列的第67～70、72～88、100、102、103、106、107、113～117、130、155～163、165、166、180～188、190～195、200～235、259、273、276、278、292～294、296、298、299、300～304、325～328、330～340和437～447位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，并且该突变型蛋白质具有肽合成活性。
(21)在具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构中，发生1种或2种以上选自下述(a)～(i)的立体结构变化，并具有肽合成活性的突变型蛋白质；(a)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第79～82位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(b)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第84、88、89和92位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(c)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第72、75和77位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(d)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第159、161、162、184、187和276位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(e)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第70、106、113、115、193、207、209～212、216和259位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(f)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第200、202～205、207和228位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(g)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第233、234和439位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(h)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第328、339、340、445和446位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(i)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第87、155、157和160位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失。
(22)具有肽合成活性的蛋白质的突变型蛋白质，经穿引法鉴定，该蛋白质的三维结构和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的三维结构类似，由该鉴定得到的序列比对可知该突变型蛋白质中发生了1种或2种以上选自下述(a’)～(i’)的变化，所述突变型蛋白质具有肽合成活性；(a’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第79～82位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(b’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第84、88、89和92位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(c’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第72、75和77位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(d’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第159、161、162、184、187和276位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(e’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第70、106、113、115、193、207、209～212、216和259位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(f’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第200、202～205、207和228位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(g’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第233、234和439位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(h’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第328、339、340、445和446位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(i’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第87、155、157和160位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失。
(23)具有肽合成活性的蛋白质的突变型蛋白质，在将该蛋白质和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的一级序列比对，或将该蛋白质和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的三维结构比对时，一级序列的同源性大于等于25％，所述突变型蛋白质中发生了1种或2种以上选自下述(a”)～(i”)的变化，所述突变型蛋白质具有肽合成活性；(a”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第79～82位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(b”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第84、88、89和92位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(c”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第72、75和77位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(d”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第159、161、162、184、187和276位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(e”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第70、106、113、115、193、207、209～212、216和259位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(f”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第200、202～205、207和228位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(g”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第233、234和439位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，
(h”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第328、339、340、445和446位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(i”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第87、155、157和160位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失。
(24)在具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构中，该序列的第67、69、70、72～85、103、106、107、113～116、165、182、183、185、187、188、190、200、202、204～206、209～211、213～235、301、328、338～340、440～442和446位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，并具有肽合成活性的突变型蛋白质。
(25)在具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构中，该序列的第67、69、70、72～84、106、107、114、116、183、185、187、188、202、204～206、209、211、213～233、235、328、338～442和446位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，并具有肽合成活性的突变型蛋白质。
(26)在具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构中，该序列的第67、70、72～75、77～79、81～84、114、116、185、188、202、204、206、209、211、213～215、218～224、226～233、235、328、338～441和446位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，并具有肽合成活性的突变型蛋白质。
(27)具有如下氨基酸序列的突变型蛋白质，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的下述突变型L1～L335之中的任意1个或1个以上的突变；突变型L1N67K，突变型L2N67L，突变型L3N67S，突变型L4T69I，突变型L5T69M，突变型L6T69Q，
突变型L7T69R，突变型L8T69V，突变型L9P70G，突变型L10P70N突变型L11P70S，突变型L12P70T，突变型L13P70V，突变型L14A72C，突变型L15A72D，突变型L16A72E，突变型L17A72I，突变型L18A72L，突变型L19A72M，突变型L20A72N，突变型L21A72Q，突变型L22A72S，突变型L23A72V，突变型L24V73A，突变型L25V73I，突变型L26V73L，突变型L27V73M，突变型L28V73N，突变型L29V73S，突变型L30V73T，突变型L31S74A，突变型L32S74F，突变型L33S74K，突变型L34S74N，突变型L35S74T，突变型L36S74V，突变型L37P75A，突变型L38P75D，
突变型L39P75L，突变型L40P75S，突变型L41Y76F，突变型L42Y76H，突变型L43Y76I，突变型L44Y76V，突变型L45Y76W，突变型L46G77A，突变型L47G77F，突变型L48G77K，突变型L49G77M，突变型L50G77N，突变型L51G77P，突变型L52G77S，突变型L53G77T，突变型L54Q78F，突变型L55Q78L，突变型L56N79D，突变型L57N79L，突变型L58N79R，突变型L59N79S，突变型L60E80D，突变型L61E80F，突变型L62E80L，突变型L63E80P，突变型L64E80S，突变型L65Y81A，突变型L66Y81C，突变型L67Y81D，突变型L68Y81E，突变型L69Y81F，突变型L70Y81H，
突变型L71Y81K，突变型L72Y81L，突变型L73Y81N，突变型L74Y81S，突变型L75Y81T，突变型L76Y81W，突变型L77K82D，突变型L78K82L，突变型L79K82P，突变型L80K82S，突变型L81K83D，突变型L82K83F，突变型L83K83L，突变型L84K83P，突变型L85K83S，突变型L86K83V，突变型L87S84D，突变型L88S84F，突变型L89S84K，突变型L90S84L，突变型L91S84N，突变型L92S84Q，突变型L93L85F，突变型L94L85I，突变型L95L85P，突变型L96L85V，突变型L97N87E，突变型L98N87Q，突变型L99F88E，突变型L100V103I，突变型L101V103L，突变型L102K106A，
突变型L103K106F，突变型L104K106L，突变型L105K106Q，突变型L106K106S，突变型L107W107A，突变型L108W107Y，突变型L109F113A，突变型L110F113W，突变型L111F113Y，突变型L112E114A，突变型L113E114D，突变型L114D115E，突变型L115D115Q，突变型L116D115S，突变型L117I116F，突变型L118I116K，突变型L119I116L，突变型L120I116M，突变型L121I116N，突变型L122I116T，突变型L123I116V，突变型L124I157K，突变型L125I157L，突变型L126Y159G，突变型L127Y159N，突变型L128Y159S，突变型L129P160G，突变型L130G161A，突变型L131F162L，突变型L132F162Y，突变型L133Y163I，突变型L134T165V，
突变型L135Q181F，突变型L136A182G，突变型L137A182S，突变型L138P183A，突变型L139P183G，突变型L140P183S，突变型L141T185A，突变型L142T185G，突变型L143T185V，突变型L144W187A，突变型L145W187F，突变型L146W187H，突变型L147W187Y，突变型L148Y188F，突变型L149Y188L，突变型L150Y188W，突变型L151G190A，突变型L152G190D，突变型L153F193W，突变型L154H194D，突变型L155F200A，突变型L156F200L，突变型L157F200S，突变型L158F200V，突变型L159L201Q，突变型L160L201S，突变型L161Q202A，突变型L162Q202D，突变型L163Q202F，突变型L164Q202S，突变型L165Q202T，突变型L166Q202V，
突变型L167D203E，突变型L168A204G，突变型L169A204L，突变型L170A204S，突变型L171A204T，突变型L172A204V，突变型L173F205L，突变型L174F205Q，突变型L175F205V，突变型L176F205W，突变型L177T206F，突变型L178T206K，突变型L179T206L，突变型L180F207I，突变型L181F207W，突变型L182F207Y，突变型L183M208A，突变型L184M208L，突变型L185S209F，突变型L186S209K，突变型L187S209L，突变型L188S209N，突变型L189S209V，突变型L190T210A，突变型L191T210L，突变型L192T210Q，突变型L193T210V，突变型L194F211A，突变型L195F211I，突变型L196F211L，突变型L197F211M，突变型L198F211V，
突变型L199F211W，突变型L200F211Y，突变型L201G212A，突变型L202V213D，突变型L203V213F，突变型L204V213K，突变型L205V213S，突变型L206P214D，突变型L207P214F，突变型L208P214K，突变型L209P214S，突变型L210R215A，突变型L211R215I，突变型L212R215K，突变型L213R215Q，突变型L214R215S，突变型L215R215T，突变型L216R215Y，突变型L217P216D，突变型L218P216K，突变型L219K217D，突变型L220P218F，突变型L221P218L，突变型L222P218Q，突变型L223P218S，突变型L224I219D，突变型L225I219F，突变型L226I219K，突变型L227T220A，突变型L228T220D，突变型L229T220F，突变型L230T220K，
突变型L231T220L，突变型L232T220S，突变型L233P221A，突变型L234P221D，突变型L235P221F，突变型L236P221K，突变型L237P221L，突变型L238P221S，突变型L239D222A，突变型L240D222F，突变型L241D222L，突变型L242D222R，突变型L243Q223F，突变型L244Q223K，突变型L245Q223L，突变型L246Q223S，突变型L247F224A，突变型L248F224D，突变型L249F224G，突变型L250F224K，突变型L251F224L，突变型L252K225D，突变型L253K225G，突变型L254K225S，突变型L255G226A，突变型L256G226F，突变型L257G226L，突变型L258G226N，突变型L259G226S，突变型L260K227D，突变型L261K227F，突变型L262K227S，
突变型L263I228A，突变型L264I228F，突变型L265I228K，突变型L266I228S，突变型L267P229A，突变型L268P229D，突变型L269P229K，突变型L270P229L，突变型L271P229S，突变型L272I230A，突变型L273I230F，突变型L274I230K，突变型L275I230S，突变型L276K231F，突变型L277K231L，突变型L278K231S，突变型L279E232D，突变型L280E232F，突变型L281E232G，突变型L282E232L，突变型L283E232S，突变型L284A233D，突变型L285A233F，突变型L286A233H，突变型L287A233K，突变型L288A233L，突变型L289A233N，突变型L290A233S，突变型L291D234L，突变型L292D234S，突变型L293K235D，突变型L294K235F，
突变型L295K235L，突变型L296K235S，突变型L297K259Y，突变型L298R276A，突变型L299R276Q，突变型L300A298S，突变型L301D300N，突变型L302V301M，突变型L303Y328F，突变型L304Y328H，突变型L305Y328M，突变型L306Y328W，突变型L307W332H，突变型L308E336A，突变型L309N338A，突变型L310N338F，突变型L311Y339K，突变型L312Y339L，突变型L313Y339T，突变型L314L340A，突变型L315L340I，突变型L316L340V，突变型L317V439P，突变型L318I440F，突变型L319I440V，突变型L320E441F，突变型L321E441M，突变型L322E441N，突变型L323N442A，突变型L324N442L，突变型L325R443S，突变型L326T444W，
突变型L327R445G，突变型L328R445K，突变型L329E446A，突变型L330E446F，突变型L331E446Q，突变型L332E446S，突变型L333E446T，突变型L334Y447L，突变型L335Y447S。
(28)根据上述(20)所述的突变型蛋白质，其具有如下氨基酸序列，并具有肽合成活性，所述氨基酸序列是在含有上述突变型L1～L335之中的任意1种或2种以上的突变的氨基酸序列的突变部位之外的部位，还含有选自取代、缺失、插入、添加或倒位的1个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。
(29)根据上述(27)或(28)所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L124或突变型L125。
(30)根据上述(27)～(29)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L303。
(31)根据上述(27)～(30)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L12。
(32)根据上述(27)～(31)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L127。
(33)根据上述(27)～(32)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L195或L199。
(34)根据上述(27)～(33)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L130。
(35)根据上述(27)～(34)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L115。
(36)根据上述(27)～(35)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L316。
(37)根据上述(27)～(36)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L99。
(38)根据上述(27)～(37)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L15或L16。
(39)根据上述(27)～(38)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L131。
(40)根据上述(27)～(39)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L284。
(41)根据上述(27)～(40)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L191。
(42)根据上述(27)～(41)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L65。
(43)根据上述(27)～(42)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L265。
(44)根据上述(27)～(43)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L317。
(45)根据上述(27)～(44)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L255。
(46)根据上述(27)～(45)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L52。
(47)根据上述(27)～(46)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L155。
(48)根据上述(27)～(47)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L298。
(49)根据上述(27)～(48)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L201。
(50)根据上述(27)～(49)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L145。
(51)根据上述(27)～(50)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L170。
(52)根据上述(27)～(51)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L87。
(53)根据上述(27)～(52)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L60。
(54)根据上述(27)～(53)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L110。
(55)具有如下氨基酸序列的突变型蛋白质，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO208所述的氨基酸序列中含有下述突变型M1～M642之中的任意1种或2种以上的突变；突变型M1T69N/1157L，突变型M2T69Q/1157L，突变型M3T69S/1157L，突变型M4P70A/1157L，突变型M5P70G/1157L，突变型M6P70/1157L，突变型M7P70/1157L，突变型M8P70N/1157L，突变型M9P70S/1157L，突变型M10P70T/1157L，突变型M11P70T/T210L，突变型M12P70T/Y328F，突变型M13P70V/1157L，突变型M14A72E/G77S，突变型M15A72E/E80D，突变型M16A72E/Y81A，突变型M17A72E/S84D，突变型M18A72E/F113W，突变型M19A72E/I157L，突变型M20A72E/G161A，突变型M21A72E/F162L，突变型M22A72E/A184G，突变型M23A72E/W187F，突变型M24A72E/F200A，突变型M25A72E/A204S，突变型M26A72E/T210L，突变型M27A72E/F211L，
突变型M28A72E/F211W，突变型M29A72E/G226A，突变型M30A72E/I228K，突变型M31A72E/A233D，突变型M32A72E/Y328F，突变型M33A72S/I157L，突变型M34A72V/Y328F，突变型M35V73A/I157L，突变型M36V73I/I157L，突变型M37S74A/I157L，突变型M38S74N/I157L，突变型M39S74T/I157L，突变型M40S74V/I157L，突变型M41G77A/I157L，突变型M42G77F/I157L，突变型M43G77M/I157L，突变型M44G77P/I157L，突变型M45G77S/E80D，突变型M46G77S/Y81A，突变型M47G77S/S84D，突变型M48G77S/F113W，突变型M49G77S/I157L，突变型M50G77S/Y159N，突变型M51G77S/Y159S，突变型M52G77S/G161A，突变型M53G77S/F162L，突变型M54G77S/A184G，突变型M55G77S/W187F，突变型M56G77S/F200A，突变型M57G77S/A204S，突变型M58G77S/T210L，突变型M59G77S/F211L，
突变型M60G77S/F211W，突变型M61G77S/I228K，突变型M62G77S/A233D，突变型M63G77S/R76A，突变型M64G77S/Y328F，突变型M65E80D/Y81A，突变型M66E80D/F113W，突变型M67E80D/I157L，突变型M68E80D/Y159N，突变型M69E80D/G161A，突变型M70E80D/A184G，突变型M71E80D/F211W，突变型M72E80D/Y328F，突变型M73E80S/I157L，突变型M74Y81A/F113W，突变型M75Y81A/I157L，突变型M76Y81A/Y159N，突变型M77Y81A/Y159S，突变型M78Y81A/G161A，突变型M79Y81A/A184G，突变型M80Y81A/W187F，突变型M81Y81A/F200A，突变型M82Y81A/T210L，突变型M83Y81A/F211W，突变型M84Y81A/F211Y，突变型M85Y81A/G226A，突变型M86Y81A/I228K，突变型M87Y81A/A233D，突变型M88Y81A/Y328F，突变型M89Y81H/I157L，突变型M90Y81N/I157L，突变型M91K83P/I157L，
突变型M92S84A/I157L，突变型M93S84D/F113W，突变型M94S84D/I157L，突变型M95S84D/Y159N，突变型M96S84D/G161A，突变型M97S84D/A184G，突变型M98S84D/Y328F，突变型M99S84E/I157L，突变型M100S84F/I157L，突变型M101S84K/I157L，突变型M102L85F/I157L，突变型M103L85I/I157L，突变型M104L85P/I157L，突变型M105L85V/I157L，突变型M106N87A/I157L，突变型M107N87D/I157L，突变型M108N87E/I157L，突变型M109N87G/I157L，突变型M110N87Q/I157L，突变型M111N87S/I157L，突变型M112F88A/I157L，突变型M113F88D/I157L，突变型M114F88E/I157L，突变型M115F88E/Y328F，突变型M116F88L/I157L，突变型M117F88T/I157L，突变型M118F88V/I157L，突变型M119F88Y/I157L，突变型M120K106H/I157L，突变型M121K106L/I157L，突变型M122K106M/I157L，突变型M123K106Q/I157L，
突变型M124K106R/I157L，突变型M125K106S/I157L，突变型M126K106V/I157L，突变型M127W107A/I157L，突变型M128W107A/Y328F，突变型M129W107Y/I157L，突变型M130W107Y/T206Y，突变型M131W107Y/K217D，突变型M132W107Y/P218L，突变型M133W107Y/T220L，突变型M134W107Y/P221D，突变型M135W107Y/Y328F，突变型M136F113A/I157L，突变型M137F113H/I157L，突变型M138F113N/I157L，突变型M139F113V/I157L，突变型M140F113W/I157L，突变型M141F113W/Y159N，突变型M142F113W/Y159S，突变型M143F113W/G161A，突变型M144F113W/F162L，突变型M145F113W/A184G，突变型M146F113W/W187F，突变型M147F113W/F200A，突变型M148F113W/T206Y，突变型M149F113W/T210L，突变型M150F113W/F211L，突变型M151F113W/F211W，突变型M152F113W/F211Y，突变型M153F113W/V213D，突变型M154F113W/K217D，突变型M155F113W/T220L，
突变型M156F113W/P221D，突变型M157F113W/G226A，突变型M158F113W/I228K，突变型M159F113W/A233D，突变型M160F113W/R276A，突变型M161F113Y/I157L，突变型M162F113Y/F211W，突变型M163E114D/I157L，突变型M164D115A/I157L，突变型M165D115E/I157L，突变型M166D115M/I157L，突变型M167D115N/I157L，突变型M168D115Q/I157L，突变型M169D115S/I157L，突变型M170D115V/I157L，突变型M171I157L/Y159I，突变型M172I157L/Y159L，突变型M173I157L/Y159N，突变型M174I157L/Y159S，突变型M175I157L/Y159V，突变型M176I157L/P160A，突变型M177I157L/P160S，突变型M178I157L/G161A，突变型M179I157L/F162L，突变型M180I157L/F162M，突变型M181I157/F162N，突变型M182I157L/F162Y，突变型M183I157L/T165L，突变型M184I157L/T165V，突变型M185I157L/Q181A，突变型M186I157L/Q181F，突变型M187I157L/Q181N，
突变型M188I157L/A184G，突变型M189I157L/A184L，突变型M190I157L/A184M，突变型M191I157L/A184S，突变型M192I157L/A184T，突变型M193I157L/W187F，突变型M194I157L/W187Y，突变型M195I157L/F193H，突变型M196I157L/F193I，突变型M197I157L/F193W，突变型M198I157L/F200A，突变型M199I157L/F200H，突变型M200I157L/F200L，突变型M201I157L/F200Y，突变型M202I157L/A204G，突变型M203I157L/A204I，突变型M204I157L/A204L，突变型M205I157L/A204S，突变型M206I157L/A204T，突变型M207I157L/A204V，突变型M208I157L/F205A，突变型M209I157L/F207I，突变型M210I157L/F207M，突变型M211I157L/F207V，突变型M212I157L/F207W，突变型M213I157L/F207Y，突变型M214I157L/M208A，突变型M215I157L/M208K，突变型M216I157L/M208L，突变型M217I157L/M208T，突变型M218I157L/M208V，突变型M219I157L/S209F，
突变型M220I157L/S209N，突变型M221I157L/T210A，突变型M222I157L/T210L，突变型M223I157L/F211I，突变型M224I157L/F211L，突变型M225I157L/F211V，突变型M226I157L/F211W，突变型M227I157L/G212A，突变型M228I157L/G212D，突变型M229I157L/G212S，突变型M230I157L/R215K，突变型M231I157L/R215L，突变型M232I157L/R215T，突变型M233I157L/R15Y，突变型M234I157L/T220L，突变型M235I157L/G226A，突变型M236I157L/G226F，突变型M237I157L/I228K，突变型M238I157L/A233D，突变型M239I157L/R276A，突变型M240I157L/Y328A，突变型M241I157L/Y328F，突变型M242I157L/Y328H，突变型M243I157L/Y328I，突变型M244I157L/Y328L，突变型M245I157L/Y328P，突变型M246I157L/Y328V，突变型M247I157L/Y328W，突变型M248I157L/L340F，突变型M249I157L/L340I，突变型M250I157L/L340V，突变型M251I157L/V439A，
突变型M252I157L/V439P，突变型M253I157L/R445A，突变型M254I157L/R445F，突变型M255I157L/R445G，突变型M256I157L/R445K，突变型M257I157L/R445V，突变型M258Y159N/G161A，突变型M259Y159N/A184G，突变型M260Y159N/A204S，突变型M261Y159N/T210L，突变型M262Y159N/F211W，突变型M263Y159N/F211Y，突变型M264Y159N/G226A，突变型M265Y159N/I228K，突变型M266Y159N/A233D，突变型M267Y159N/Y328F，突变型M268Y159S/G161A，突变型M269Y159S/F211W，突变型M270G161A/F162L，突变型M271G161A/A184G，突变型M272G161A/W187F，突变型M273G161A/F200A，突变型M274G161A/A204S，突变型M275G161A/T210L，突变型M276G161A/F211L，突变型M277G161A/F211W，突变型M278G161A/G226A，突变型M279G161A/I228K，突变型M280G161A/A233D，突变型M281G161A/Y328F，突变型M282F162L/A184G，突变型M283F162L/F211W，
突变型M284F162L/A233D，突变型M285P183A/Y328F，突变型M286A184G/W187F，突变型M287A184G/F200A，突变型M288A184G/A204S，突变型M289A184G/T210L，突变型M290A184G/F211L，突变型M291A184G/F211W，突变型M292A184G/I228K，突变型M293A184G/A233D，突变型M294A184G/R276A，突变型M295V184G/Y328F，突变型M296T185A/Y328F，突变型M297T185N/Y328F，突变型M298W187F/F211W，突变型M299W187F/Y328F，突变型M300F193W/F211W，突变型M301F200A/F211W，突变型M302F200A/Y328F，突变型M303L201Q/Y328F，突变型M304L201S/Y328F，突变型M305A204S/F211W，突变型M306A204S/Y328F，突变型M307T210L/F211W，突变型M308T210L/Y328F，突变型M309F211L/A233D，突变型M310F211L/Y328F，突变型M311F211W/I228K，突变型M312F211W/A233D，突变型M313F211W/Y328F，突变型M314R215A/Y328F，突变型M315R215L/Y328F，
突变型M316T220L/A233D，突变型M317T220L/D300N，突变型M318P221L/A233D，突变型M319P221L/Y328F，突变型M320F224A/A233D，突变型M321G226A/Y328F，突变型M322G226F/A233D，突变型M323G226F/Y328F，突变型M324I228K/Y328F，突变型M325A233D/K235D，突变型M326A233D/Y328F，突变型M327R276A/Y328F，突变型M328Y328F/Y339F，突变型M329A27T/Y81A/S84D，突变型M330P70T/A72E/I157L，突变型M331P70T/G77S/I157L，突变型M332P70T/E80D/F88E，突变型M333P70T/Y81A/I157L，突变型M334P70T/S84D/I157L，突变型M335P70T/F88E/Y328F，突变型M336P70T/F113W/I57L，突变型M337P70T/I157L/A204S，突变型M338P70T/I157L/T210L，突变型M339P70T/I157L/A233D，突变型M340P70T/I157L/Y328F，突变型M341P70T/I157L/V439P，突变型M342P70T/I157L/I440F，突变型M343P70T/G161A/T210L，突变型M344P70T/G161A/Y328F，突变型M345P70T/A184G/W187F，突变型M346P70T/A204S/Y328F，突变型M347P70T/F211W/Y328F，
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突变型M540P70T/I157L/T210L/V439P，突变型M541P70T/I157L/Y328F/V439P，突变型M542P70T/G161A/T210L/Y328F，突变型M543P70T/G161A/A233D/Y328F，突变型M544A72E/S74T/I157L/Y328F，突变型M545A72E/G77S/F113W/I157L，突变型M546A72E/Y81H/I157L/Y328F，突变型M547A72E/K83P/I157L/Y328F，突变型M548A72E/F88E/F113W/I157L，突变型M549A72E/F88E/I157L/Y328F，突变型M550A72E/F88E/G161A/Y328F，突变型M551A72E/F113W/I157L/Y328F，突变型M552A72E/F113W/G161A/Y328F，突变型M553A72E/F113Y/I157L/Y328F，突变型M554A72E/F113Y/G161A/Y328F，突变型M555A72E/F113Y/G226A/Y328F，突变型M556A72E/I157L/G161A/Y328F，突变型M557A72E/I157L/F162L/Y328F，突变型M558A72E/I157L/A184G/Y328F，突变型M559A72E/I157L/F200A/Y328F，突变型M560A72E/I157L/A204T/Y328F，突变型M561A72E/I157L/F211W/Y328F，突变型M562A72E/I157L/F211Y/Y328F，突变型M563A72E/I157L/A233D/Y328F，突变型M564A72E/I157L/Y328F/L340V，突变型M565A72E/G161A/A204T/Y328F，突变型M566A72E/G161A/T210L/Y328F，突变型M567A72E/G161A/F211W/Y328F，突变型M568A72E/G161A/F211Y/Y328F，突变型M569A72E/G161A/A233D/Y328F，突变型M570A72E/G161A/Y328F/L340V，突变型M571A72E/A184G/W187F/Y328F，
突变型M572A72E/T210L/Y328F/L340V，突变型M573A72V/I157L/W187F/Y328F，突变型M574G77P/I157L/T210L/Y328F，突变型M575Y81A/S84D/I157L/Y328F，突变型M576Y81A/F88E/I157L/Y328F，突变型M577Y81A/F113W/I157L/Y328F，突变型M578Y81A/I157L/G161A/Y328F，突变型M579Y81A/I157L/W187F/Y328F，突变型M580Y81A/I157L/A204S/Y328F，突变型M581Y81A/I157L/T210L/Y328F，突变型M582Y81A/I157L/A233D/Y328F，突变型M583Y81A/I157L/Y328F/V439P，突变型M584Y81A/A184G/W187F/Y328F，突变型M585F88E/I157L/T210L/Y328F，突变型M586F88E/I157L/A233D/Y328F，突变型M587F113W/I157L/A204T/T210L，突变型M588F113W/I157L/T210L/Y328F，突变型M589I157/G161A/A184G/W187F，突变型M590I157L/G161A/T210L/Y328F，突变型M591I157L/A184G/W187F/T210L，突变型M592I157L/A204S/T210L/Y328F，突变型M593I157L/A204T/T210L/Y328F，突变型M594I157L/T210L/A233D/Y328F，突变型M595G161A/A184G/W187F/Y328F，突变型M596P70T/A72E/S84D/I157L/Y328F，突变型M597P70T/A72E/A204S/I157L/Y328F，突变型M598P70T/A72E/T210L/I157L/Y328F，突变型M599P70T/A72E/G226A/I157L/Y328F，突变型M600P70T/A72E/A233D/I157L/Y328F，突变型M601P70T/Y81A/I157L/T210L/Y328F，突变型M602P70T/Y81A/I157L/A233D/Y328F，突变型M603P70T/Y81A/I157L/T210L/Y328F，
突变型M604P70T/Y81A/A233D/I157L/Y328F，突变型M605P70T/S84D/I157L/T210L/Y328F，突变型M606P70T/F113W/I157L/T210L/Y328F，突变型M607P70T/I157L/A184G/W187F/A233D，突变型M608P70T/I157L/W187F/T210L/Y328F，突变型M609P70T/I157L/A204S/T210L/Y328F，突变型M610P70T/G161A/A184G/W187F/Y328F，突变型M611P70V/A72E/F113Y/I157L/Y328F，突变型M612P70V/A72E/I157L/F211W/Y328F，突变型M613A72E/S74T/F113Y/I157L/Y328F，突变型M614A72E/S74T/I157L/F211W/Y328F，突变型M615A72E/Y81H/I157L/F211W/Y328F，突变型M616A72E/K83P/F113Y/I157L/Y328F，突变型M617A72E/W17F/F113Y/I157L/Y328F，突变型M618A72E/F113Y/D115Q/I157L/Y328F，突变型M619A72E/F113Y/I157L/Y328F/L340V，突变型M620A72E/F113Y/I157L/Y328F/V439P，突变型M621A72E/F113Y/G161A/I157L/Y328F，突变型M622A72E/F113Y/A204S/I157L/Y328F，突变型M623A72E/F113Y/A204T/I157L/Y328F，突变型M624A72E/F113Y/T210L/I157L/Y328F，突变型M625A72E/F113Y/A233D/I157L/Y328F，突变型M626A72E/I157L/G161A/F162L/Y328F，突变型M627A72E/I157L/W187F/F211W/Y328F，突变型M628A72E/I157L/A204S/F211W/Y328F，突变型M629A72E/I157L/A204T/F211W/Y328F，突变型M630A72E/I157L/F211W/Y328F/L340V，突变型M631A72E/I157L/F211W/Y328F/V439P，突变型M632P70E/I157L/G226A/F211W/Y328F，突变型M633A72E/I157L/A233D/F211W/Y328F，突变型M634Y81A/S84D/I157L/T210L/Y328F，突变型M635Y81A/I157L/A184G/W187F/Y328F，
突变型M636Y81A/I157L/A184G/W187F/T210L，突变型M637Y81A/I157L/A233D/T210L/Y328F，突变型M638F88E/I157L/A184G/W187F/T210L，突变型M639F113Y/I157L/Y159N/F211W/Y328F，突变型M640I157L/A184G/W187F/T210L/Y328F，突变型M641P70T/I157L/A184G/W187F/T210L/Y328F，突变型M642Y81A/I157L/A184G/W187F/T210L/Y328F。
(56)根据上述(55)所述的突变型蛋白质，其具有如下氨基酸序列，并具有肽合成活性，所述氨基酸序列是在含有选自上述突变型M1～M642之中的任意1种或2种以上的突变的氨基酸序列的突变部位之外的部位，还含有选自取代、缺失、插入、添加和倒位的1个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。
(57)根据上述(55)或(56)任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型M241。
(58)根据上述(55)～(57)之中任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型M340。
(59)根据上述(55)～(58)之中任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型M412。
(60)根据上述(55)～(59)之中任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型M491。
(61)根据上述(55)～(60)之中任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型M496。
(62)根据上述(55)～(61)之中任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型M581。
(63)根据上述(55)～(62)之中任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型M582。
(64)根据上述(55)～(63)之中任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型M594。
(65)编码含有上述(18)～(64)之中任一项所述的突变型蛋白质的氨基酸序列的核苷酸。
(66)含有上述(65)所述的多核苷酸的重组多核苷酸。
(67)含有上述(66)所述的重组多核苷酸的经过转化的微生物。
(68)突变型蛋白质的制造方法，其特征在于，在培养基中培养上述(67)所述的经过转化的微生物，使上述突变型蛋白质在培养基中和/或微生物中积累。
(69)肽制造方法，其特征在于，在上述(18)～(64)之中任一项所述的突变型蛋白质存在下，进行肽生成反应。
(70)肽制造方法，其特征在于，在培养基中培养上述(67)所述的经过转化的微生物，使上述突变型蛋白质在培养基中和/或经过转化的微生物中积累，进行肽生成反应。
(71)α-L-天门冬氨酰基-L-苯丙氨酸-β-酯的制造方法，其特征在于，在上述(18)～(64)之中任一项所述的突变型蛋白质存在下，进行L-天门冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸之间的反应。
(72)α-L-天门冬氨酰基-L-苯丙氨酸-β-酯的制造方法，其特征在于，在培养基中培养上述(67)所述的经过转化的微生物，使上述突变型蛋白质在培养基和/或经过转化的微生物中积累，进行L-天门冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸之间的反应。
发明效果根据本发明，可提供具有优良的肽合成活性的蛋白质和高效的肽制造方法。
具体实施例方式
以下，连同本发明的最佳实施方式一起，对本发明的实施方式进行说明。
以下列举的各种基因工程学操作方法，诸如Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press(1989)；Saibo Kogaku Handbook(Cellular Engineering Handbook)edited by Toshio Kuroda et al.，Yodosha(1992)；and Shin Idenshi Kogaku Handbook(New GeneticEngineering Handbook)revised 3rd version，edited by Muramatsu et al.，Yodosha(1999)等多个标准实验手册中均有记载，本领域的技术人员通过参考这些文献，是可以实施的。
本说明书中的氨基酸、肽、核酸、碱基序列等的简称是遵照IUPACA(国际纯应用化学联合会)、IUBMB(国际生物化学和分子生物学联合会)的规定、《含有碱基序列或氨基酸序列的说明书等的撰写指南》(日本国特许厅编)和本领域的惯用记号命名的。本说明书中，除特殊指明外，序列号均表示序列表中的序列号。此外，对于非甘氨酸的氨基酸，在没有明确指明是D-氨基酸或L-氨基酸的情况下，均表示L-氨基酸。
1.本发明的具有肽合成活性的蛋白质(基于SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的突变型蛋白质)本发明的蛋白质是具有如下氨基酸序列，并具有肽合成活性的突变型蛋白质，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中导入选自下述突变型1～68的任意1种或2种以上的突变后得到的氨基酸序列以下，也称为突变型蛋白质(I)。突变型1～68示于表1-1和表1-2。
表1-1突变型

表1-2突变型

本说明书中的各突变型，如表1-1和表1-2所示，均由氨基酸残基的简称和SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中的位置来表示。例如，F207V(突变型1)表示以缬氨酸取代SEQ ID NO2的序列中的第207位氨基酸残基，即，苯丙氨酸。也就是说，突变型是由野生型(SEQ ID NO2所示的氨基酸)的氨基酸残基的种类、SEQ IDNO2所示的氨基酸序列中的氨基酸残基的位置、突变导入后的氨基酸残基种类表示的。其他突变型的标记方式也一样。
可以只导入突变型1～68中的1种，也可以将2种或2种以上组合导入。此外，也可以将1种或2种以上突变型1～68中的突变和表1-1和表1-2以外的突变型，例如，选自V184N、Q229P、Q229L、Q229G、Q229I、I228G、I228L、I228D、I228S、I230D、I230V、I230S、S256C、A301G、L66F、E80K、Y81A、I157L、V178G、A182G、A182S、P183A、V184P、T185F、T185A、T185K、T185D、T185C、T185S、T185P、T185N、T210L、V213A、P214T、P214H、A245S、L263M、K314R、S315R、Y328F、K484I和A515V的1种或2种以上的突变组合导入。具体而言，优选下述表1-3和表1-4所示的组合。此外，从增强肽合成活性方面考虑，至少含有突变型2，即Q441E的突变型蛋白质和至少含有突变型14，即T72A的突变型蛋白质是优选的。进而，含有M7-35和M35-4+V184A(A1)的组合的突变型蛋白质，在增强肽合成活性方面，也是优选的。
表1-3突变型(2种或2种以上的突变的组合)

表1-4突变型(2种或2种以上的突变型的组合)

M7-35                 A301V+L439V+A837G+N607KM35-4/N154A    *A1    TT2A+A1375+Q229P+V257I+A301V+A324V+L4339V+Q441E+A537G+N607K+V118A本发明的突变型蛋白质，具有优良的肽合成活性。即，和具有SEQID NO2的氨基酸序列的野生型蛋白质相比，具有优良的肽生成反应催化功能。更具体而言，本发明的突变型蛋白质，在由特定羧基成分和胺成分合成肽时的反应速度、收率、底物特异性、pH特性、温度稳定性等肽生成反应所需各种特性上，均比野生型蛋白质具有更优良的性能(具体参见下述实施例)。因而，本发明的突变型蛋白质，可用于肽的工业化生产。在由野生型蛋白质获得的肽生成浓度为1，作为优选的突变型蛋白质的实施方式，例如可以举出，具有使获得的肽生成浓度优选为1.3倍，更优选为1.5倍或以上，尤其优选为2倍或以上的能力的突变型蛋白质。
此外，本说明书中，肽合成活性是指，由2种或2种以上物质形成肽键，合成具有肽键的新化合物的活性，更具体而言，例如是指，由2种氨基酸或其酯等，合成至少增加了1个肽键的肽化合物的活性。
突变型1～68、突变型239～290和324～377所示的突变导入，例如，可通过定点突变法，使得编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质的基因的特定位点的氨基酸被取代，从而改变碱基序列，来实现。对应于SEQ ID NO2的氨基酸序列中的突变位点的碱基序列，通过参照SEQ ID NO1，可容易地得到确认。此外，由如上改变后的碱基序列编码得到的多肽，也可通过传统的突变处理获得，例如，用羟胺等体外处理编码蛋白质(A)的DNA的方法，由Error-prone PCR导入突变的方法，和在突变修复体系缺失的宿主中扩增该DNA，回收该突变DNA的方法等。
此外，根据本发明，还提供和含有上述突变型1～68、突变型239～290和324～377所示的1种或2种以上的突变的突变型蛋白质基本上相同的蛋白质。即，本发明还提供含有如下氨基酸序列的具有肽合成活性的突变型蛋白质，所述氨基酸序列除含有选自突变型1～68、突变型239～290和324～377所示的1种或2种以上的突变型外，还在上述突变部位以外的部位，含有选自取代、缺失、插入、添加和倒位的1种或数种突变以下，也称为突变型蛋白质(II)。即，本发明的突变型蛋白质，允许突变发生在SEQ ID NO2所示氨基酸的突变型1～68、突变型239～290和324～377突变部位之外的部位。因而，在突变型1～68、突变型239～290和324～377突变部位之外的部位导入缺失、插入等突变后，从突变型1～68、突变型239～290和324～377表示的部位到N末端或C末端的氨基酸残基数，有时会不同于导入突变前的状态。
这里所说的“数种”，会因氨基酸残基在蛋白质的立体结构中的位置和种类而有所不同，应在氨基酸残基不会对蛋白质立体结构、活性造成很大影响的范围内，具体而言，为2～50个，优选为2～30个，更优选为2～10个。然而，对于含有突变型1～68、突变型239～290和324～377以外的突变部位的突变型蛋白质而言，在50℃、pH8的条件下，优选保持含有选自突变型1～68、突变型239～290和324～377的1种或2种以上的突变的蛋白质即，突变型蛋白质(I)的约一半以上，更优选80％或以上，尤其优选90％或以上的肽合成活性。
突变型1～68、突变型239～290和324～377以外的突变，例如，也可通过定点突变法，改变碱基序列，使编码当前蛋白质的基因的特定部位的氨基酸被取代、缺失、插入、添加、倒位等实现。此外，如上述改变得到的碱基序列编码得到的多肽，也可通过传统的突变处理获得，例如可以举出，以苯胺等体外处理编码突变型蛋白质(I)的DNA的方法，通过紫外照射、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸等人工突变常用突变剂对携带有编码突变型蛋白质(I)的DNA的大肠杆菌属细菌进行处理的方法。
此外，上述碱基取代、缺失、插入、添加和倒位等突变，也包含微生物种类或菌株差异等所致的自然突变。通过在适当细胞内表达具有上述突变的DNA，调节表达产物的酶活性，可得到编码和SEQ IDNO2所示的蛋白质基本上相同的蛋白质的DNA。
2.基于SEQ ID NO208所示的氨基酸序列，设计和制备突变型蛋白质本发明人通过在上述突变型蛋白质中进一步增加突变，发现可以设计和制备具有更为优良的肽合成活性的突变型蛋白质。尤其是发现，通过进一步增加M35-4/V184A突变型(A1)(突变型286，参见表1-3)的突变，可得到可发挥显著的肽合成活性的突变型蛋白质。本发明还提供基于这样的M35-4/V184A突变型(A1)的突变型蛋白质的设计和制备方法。
对应于M35-4/V184A的氨基酸序列，如序列表中的SEQ IDNO208所示。即，SEQ ID NO208所示的氨基酸序列，是将SEQ IDNO2所示的氨基酸序列中对应于M35-4/V184A突变型(参见表1-3)的11处氨基酸残基用其他氨基酸残基取代后得到的。
突变型蛋白质的设计和制备，可基于X射线晶体结构分析确定的蛋白质的立体结构和得到的结构信息来实施。即，以蛋白质X射线结构分析得到的立体结构为基础，推定底物结合部位，通过使该蛋白质的底物结合部位的至少一部分发生变化，从而设计和制备具有肽合成活性的突变型蛋白质。
由X射线晶体结构分析确定蛋白质的立体结构，例如，可依照以下顺序进行。
(1)形成蛋白质结晶。结晶，不但对确定立体结构而言是必不可少的，而且作为高纯度蛋白质的纯化法、高密度且强蛋白酶抗性的蛋白质保存法，具有工业上的可利用性。
(2)以X射线照射制得的结晶，收集衍射数据。蛋白质结晶常常会被X射线照射损伤，使衍射性能受损。为避免这种现象，将结晶迅速冷却到约-173℃，在该状态下收集衍射数据的低温测量技术最近已经普及。为最终收集确定结构用的高分辨率数据，可采用高辉度的同步辐射光。
(3)接着，进行晶体结构分析。除衍射数据外，相位信息对于晶体结构分析而言，也是不可或缺的。例如，具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质，由于其类似蛋白质，即，α-氨基酸酯水解酶的S205A突变体(Protein Data Bank的录入号1NX9)的晶体结构已经公知，因而可采用分子置换法确定其结构。使蛋白质模型匹配由此确定的相位计算得到的电子密度。该过程采用MSI公司(美国)的QUANTA等程序，运用计算机图形学来进行。此后，用MSI公司的CNX等程序，使结构精密化，从而完成结构分析。
基于上述处理结果分析得到的立体结构，可推定蛋白质的底物结合部位。此处，底物结合部位是指，蛋白质表面上和底物(例如是，在蛋白质具有肽合成活性的情况下，氨基酸、氨基酸酯等)相互作用的部位，一般存在于蛋白质活性中心周围。
本发明的设计和制备方法中，以具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质，作为晶体结构分析对象。具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质是指，如前说述，突变型蛋白质M35-4/V184A.即，SEQ ID NO208所示的氨基酸序列，是在其他保持不变的情况下，将SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中对应于表1-3所示的M35-4/V184A的11处氨基酸残基替换成规定的氨基酸残基得到的。
此外，SEQID NO209所示的氨基酸序列和SEQ ID NO208所示的氨基酸序列具有非常高的相似性，只有4个氨基酸被替换。因而，参考具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的晶体结构分析得到的立体结构，可推定具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的底物结合部位。依据上述具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的结构分析结构，具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的底物结合部位为距离活性残基丝氨酸(SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的第158位，以下有时简称为“Ser158”，参见图5中的“活性部位”)15埃以内的区域。
本发明的设计和制备方法中，通过改变如上推定得到的底物结合部位的至少一部分，可得到肽合成活性增强的突变体。此处，改变底物结合部位的至少一部分，是指以改变后的突变型蛋白质具有肽合成活性为条件，改变1个或1个以上构成底物结合部位的氨基酸残基，尤其是指，取代、插入或缺失，优选取代成其他氨基酸残基。作为改变对象的氨基酸的数目，可以因氨基酸残基的位置、种类而有所不同，可在对得到的突变型蛋白质的立体结构、活性不会产生明显损伤的范围内适宜地确定。
例如，为从具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质，得到具有肽合成活性的突变型蛋白质，可将该蛋白质上的距离活性残基Ser158在15埃以内的至少一部分氨基酸残基，例如，SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第67～70、72～88、100、102、103、106、107、113～117、130、155～163、165、166、180～188、190～195、200～235、259、273、276、278、292～294、296、298、299、300～ 304、325～328、330～340和437～447位氨基酸残基中的至少1个或1个以上的氨基酸残基取代、插入或缺失得到。具体而言，可通过将上述氨基酸残基中的至少1个残基替换成其他氨基酸残基，从而得到所希望的突变型蛋白质。
尤其是，将SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第67、69、70、72～85、103、106、107、113～116、165、182、183、185、187、188、190、200、202、204～206、209～211、213～235、301、328、338～340、440～442和446位氨基酸残基中的至少1个或1个以上的氨基酸残基取代、插入或缺失得到的突变型蛋白质，肽合成活性高，尤其是AMP生成活性增强。具体而言，相对于A1突变型蛋白质，AMP收率增加大于等于20％。
将SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第67、69、70、72～84、106、107、114、116、183、185、187、188、202、204～206、209、211、213～233、235、328、338～442和446位氨基酸残基中的至少1个或1个以上的氨基酸残基取代、插入或缺失得到的具有肽合成活性的突变型蛋白质，肽合成活性高，尤其是AMP生成活性增强。具体而言，相对于A1突变型蛋白质，AMP收率增加大于等于30％。
进而，将SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第67、70、72～85、77～79、81～84、114、116、185、188、202、204、206、209、211、213～215、218～224、226～233、235、328、338～441和446位氨基酸残基中的至少1个或1个以上的氨基酸残基取代、插入或缺失得到的突变型蛋白质，肽合成活性高，尤其是AMP生成活性增强。具体而言，相对于A1突变型蛋白质，AMP收率增加大于等于40％。
此外，所设计的突变型蛋白质，优选其一级序列(即，氨基酸序列)和A1突变型蛋白质具有一定程度的同源性。同源性的程度，例如可以是，大于等于25％，更优选大于等于50％，进而优选大于等于80％，尤其优选大于等于90％。
通过改变上述范围的氨基酸残基的至少一部分，即，将1个或1个以上氨基酸残基取代，可发现肽合成活性增强的突变型蛋白质。此外，通过将引起活性增强的各突变组合，借助它们的协同效应，可创造出活性更为增强的突变型蛋白质。另一方面，突变引起的肽合成活性增强的程度，有时会因氨基酸残基侧链的仅仅1个原子发生变化，而出现巨大变化，因而，其最适化有多种可能性。例如，如果发现某个部位的突变，可增高活性，则通过对在立体结构上临接该部位的数个氨基酸残基施以随机突变，有可能得到活性进一步增强的突变体。即，通过改变构成在立体结构上与如下氨基酸残基接续的表面的部位中的至少一部分，可得到具有肽合成活性的突变型蛋白质，所述氨基酸残基的突变可增强肽合成活性。
蛋白质表面，在其构成原子以范德瓦尔斯半径的球表示的时候，为暴露于溶剂的部分的信封型表面(envelope surface)，例如，可由图4所示的空间充满图描绘。此处，具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质中，构成在立体结构上与其突变可增强肽合成活性的氨基酸残基接续的表面的部位是指，在上述说明的蛋白质表面上构成连续的膜片(patch)的部分，例如，SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第67～70、72～88、100、102、103、106、107、113～117、130、155～163、165、166、180～188、190～195、200～235、259、273、276、278、292～294、296、298、299、300～304、325～328、330～340和437～447号部位中的2个或2个以上部位。具体而言，例如，SEQ IDNO208所示的氨基酸序列中第79～82位氨基酸残基的存在部位，相当于图4中以灰色表示的部分。具体而言，通过使立体结构发生选自下述(a)～(i)中1种或2种以上的变化，可得到具有肽合成活性的突变型蛋白质；(a)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第79～82位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(b)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第84、88、89和92位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(c)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第72、75和77位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(d)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第159、161、162、184、187和276位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(e)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第70、106、113、115、193、207、209～212、216和259位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(f)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第200、202～205、207和228位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(g)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第233、234和439位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(h)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第328、339、340、445和446位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(i)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第87、155、157和160位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失。
3.由SEQ ID NO208所示的突变型蛋白质以外的蛋白质设计和制备突变型蛋白质上述X射线晶体结构分析得到的具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构，也可应用于由具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质以外的蛋白质设计和制备突变型蛋白质。本发明还提供来源于如上其他蛋白质，并且其肽合成活性超过或等于具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的突变型蛋白质。
由具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质以外的蛋白质设计和制备突变型蛋白质的操作如下采用穿引法，与具有SEQ IDNO209所示的氨基酸序列的蛋白质的三维结构比对，施以和具有SEQID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质相同的氨基酸突变。此外，如上所述，具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质和具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质之间，只有3处氨基酸残基不同，因而，可以认为它们的三维结构基本上相同。
作为利用穿引法导入突变的对象的蛋白质，是和具有SEQ IDNO208所示的氨基酸序列的蛋白质不同的蛋白质，尤其优选具有肽合成活性的蛋白质。进而，优选使用氨基酸序列已知的蛋白质。此外，作为突变导入对象的蛋白质，优选具有和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的突变型蛋白质类似的立体结构。此处，立体结构类似是指，蛋白质的二维结构、三维结构类似，具体而言是指，氨基酸残基间的距离、构成肽的主链、侧链的角度类似。
具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质以外的蛋白质，可利用穿引法判断其是否具有和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质类似的立体结构。穿引法是指，基于和数据库中已知的立体结构的类似性，评估、预测某氨基酸序列为何种立体结构的方法Science，第253卷，第164～170页(1991)。
基于穿引法，评估和判断立体结构的类似性的操作如下将对象蛋白质的氨基酸序列和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构比对，计算定量两者结构匹配度的目的函数，例如，获得二级结构的难易度等，将其结果进行比较讨论。具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)数据(坐标)，可使用图6-1～图6-134记载的数据。
穿引法可采用INSIGHT II、LIGRA等程序来实施。INSIGHT II，可从美国AcceIrys公司购入。在用INSIGHT II实施穿引法时，可采用该程序中的SeqFold模块。此外，可用互联网登陆DDBJ的主页(http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/libra_i-j.html)，使用LIBRA。
作为判断某蛋白质是否具有和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质类似的立体结构的基准，例如，在使用INSIGHT II-SeqFold时，优选使用穿引法得到的所有评估函数总和计算得到的总评估值(SeqFold Total Score(bits))。通过计算SeqFold Total Score(bits)，可判断蛋白质的立体结构总体是否类似。采用程序SeqFold实施穿引法，可计算SeqFold(LIB)P-Value、SeqFold(LIB)P-Value、SeqFold(LEN)P-Value、SeqFold(LOW)P-Value、SeqFold(High)P-Value、SeqFold Total Score(raw)、SeqFold Alignment Score(raw)等各种评估值，但SeqFold Total Score(bits)是将所有这些评估值总和得到总评估值，SeqFold Total Score(bits)的值越大，则表示对比的2个蛋白质的立体结构类似性越高。例如，用INSIGHT II实施穿引法时，判断和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质具有类似的立体结构的蛋白质时，比较合理的阈值是，SeqFold Total Score(bits)值在90左右。即，若SeqFold Total Score(bits)大于等于90，则可判定具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构和其他蛋白质的立体结构具有类似性。优选的阈值是，SeqFold TotalScore(bits)值大于等于110，更优选大于等于130，尤其优选大于等于150。
当已判定其他蛋白质具有和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质具有类似的立体结构时，在该其他蛋白质的氨基酸序列中，表示对应于具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质中距离活性残基Ser158在15埃以内的氨基酸残基的氨基酸残基。可通过上述利用穿引法判断三维结构的类似性过程中得到的比对，表示目的氨基酸残基，所述比对是目的蛋白质和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的三维结构的比对。
本发明的设计和制备方法中，对于具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的肽以外的肽，同样也可以通过改变如上推定得到的底物结合部位的至少一部分，从而发现肽合成活性增强的突变型蛋白质。通过将活性增强的各突变组合，借助协同效应，可创造出活性进一步增强的突变体。此处，改变底物结合部位的至少一部分是指，在改变后的突变型蛋白质具有肽合成活性的前提下，改变1个或1个以上构成底物结合部位的氨基酸残基，尤其是指，取代、插入或缺失，优选取代为其他氨基酸残基。作为改变对象的氨基酸的数目，可以因氨基酸残基的位置、种类而有所不同，可在对得到的突变型蛋白质的立体结构、活性不会产生很大损伤的范围内，适宜确定。
例如，在用穿引法判定时得到的该蛋白质和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的三维结构比对中，可在对应于SEQ IDNO209所示的氨基酸序列的第67～70、72～88、100、102、103、106、107、113～117、130、155～163、165、166、180～188、190～195、200～235、259、273、276、278、292～294、296、298、299、300～304、325～328、330～340和437～447位氨基酸残基的存在位置，取代、插入或缺失至少1个或1个以上氨基酸残基。具体而言，通过将比对后的与上述氨基酸残基对应(重合)位置上的氨基酸残基中的至少1个取代成其他氨基酸残基，可得到所希望的突变型蛋白质。
此外，所设计的突变型蛋白质，优选其一级序列和具有SEQ IDNO207所示的氨基酸序列的蛋白质的突变型蛋白质有某种程度的同源性。同源性的程度，例如可以是，大于等于25％，更优选大于等于50％，进而优选大于等于80％，尤其优选大于等于90％。
通过改变上述范围内的氨基酸残基的存在位置的至少一部分，即，取代1个或1个以上氨基酸残基，可发现肽合成活性增强的突变型蛋白质。此外，通过将活性增强的各突变组合，借助它们的协同效应，可创造出活性进一步增强的突变型蛋白质。另一方面，突变引起的肽合成活性增强的程度，有时会因氨基酸残基侧链的仅仅1个原子发生变化，而出现巨大变化，因而，其最适化有多种可能性。例如，如果发现某个部位的突变，可增高活性，则通过对在立体结构上临接该部位的数个氨基酸残基施以随机突变，有可能得到活性进一步增强的突变体。即，通过改变构成在立体结构上与如下氨基酸残基接续的表面的部位中的至少一部分，可得到具有肽合成活性的突变型蛋白质，所述氨基酸残基的突变可增强肽合成活性。
在具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质以外的蛋白质中，构成在立体结构上与其突变可增强肽合成活性的氨基酸残基接续的表面的部位是指，在将该蛋白质和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的三维结构比对后，以对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列中第67～70、72～88、100、102、103、106、107、113～117、130、155～163、165、166、180～188、190～195、200～235、259、273、276、278、292～294、296、298、299、300～304、325～328、330～340和437～447位氨基酸残基的氨基酸残基的存在位置为基准，构成面向底物结合方向的表面(平面)的部位。具体而言，通过发生1种或2种以上选自下述(a’)～(i’)中的变化，可得到具有肽合成活性的突变型蛋白质；(a’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第79～82位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(b’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第84、88、89和92位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(c’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第72、75和77位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(d’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第159、161、162、184、187和276位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(e’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第70、106、113、115、193、207、209～212、216和259位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(f’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第200、202～205、207和228位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(g’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第233、234和439位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，
(h’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第328、339、340、445和446位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(i’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第87、155、157和160位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失。
此外，通过使如下蛋白质发生1种或2种以上选自下述(a”)～(i”)的变化，也可得到具有肽合成活性的突变型蛋白质，其中，所述蛋白质是在将其和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的一级序列比对，或将其和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的三维结构比对时，一级序列的同源性大于等于25％的蛋白质；(a”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第79～82位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(b”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第84、88、89和92位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(c”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第72、75和77位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(d”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第159、161、162、184、187和276位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(e”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第70、106、113、115、193、207、209～212、216和259位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(f”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第200、202～205、207和228位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(g”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第233、234和439位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，
(h”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第328、339、340、445和446位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(i”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第87、155、157和160位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失。
4.本发明的具有肽合成活性的蛋白质(基于SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的突变型蛋白质)本发明的蛋白质是基于上述2，3项中说明的设计和制备方法设计和制备的突变型蛋白质，具体而言，是具有如下氨基酸序列的具有肽合成活性的突变型蛋白质，说述氨基酸序列是在SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中导入选自下述突变型L1～L335的任意1种或2种以上的突变，导入选自下述突变型M1～M642后得到的氨基酸序列以下，也称为具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的突变型蛋白质(I’)。突变型L1～L335和突变型M1-M64等各突变型如表2-1～2-19所示。
表2-1

表2-2

表2-3

表2-4

表2-5

表2-6

表2-7

表2-8

表2-9

表2-10

表2-11

表2-12

表2-13

表2-14

表2-15

表2-16

表2-17

表2-18

表2-19

本说明书中，和上述基于SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的突变型蛋白质一样，像表2-1～表2-19所示的那样，根据氨基酸残基的简称和SEQ ID NO208所示氨基酸序列中的部位表示各突变型。例如，N67K(突变型L1)表示的是SEQ ID NO208的序列中第67位氨基酸残基天门冬氨酸已被替换成赖氨酸。即，突变型的标记，表示M35-4/V184A突变型(SEQ ID NO208表示的氨基酸)的氨基酸残基的种类、SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中的氨基酸残基的位置、突变导入后的氨基酸残基种类。其他突变型的标记方式也一样。
突变型L1～L335的突变，可以仅导入1种，也可以将2种或2种以上组合导入。此外，可以将突变型L1～L335之中的1种或2种以上的突变，和表2-1～2-7以外的突变型，例如，选自后述表33所示的突变型的1种或2种以上组合导入。具体而言，如上述表2-8～2-19所示的组合M1～M642是适宜的。尤其是，含有任意下述突变的突变型蛋白质，在增强肽合成活性方面，是优选的；突变型L125I157L，突变型L124I157K，突变型L303Y328F，突变型L12P70T，突变型L127Y159N，突变型L199F211W，突变型L195F211I，突变型L130G161A，突变型L115D115Q，突变型L316L340V，突变型L99F88E，突变型L16A72E，突变型L15A72D，突变型L131F162L，突变型L284A233D，突变型L191T210L，突变型L65Y81A，突变型L265I228K，突变型L317V439P，突变型L255G226A，突变型L52G77S，突变型L155F200A，突变型L298R276A，突变型L201G212A，突变型L145W187F，突变型L170A204S，突变型L87S84D，突变型L60E80D，突变型L110F113W，突变型M241I157L/Y328F，突变型M340P70T/I157L/Y328F，突变型M412Y81A/I157L/Y328F，突变型M491I157L/T210L/Y328F，突变型  M496I157L/A233D/Y328F，突变型M581Y81A/I157L/T210L/Y328F，突变型M582Y81A/I157L/A233D/Y328F，突变型M594I157L/T210L/A233D/Y328F。
本发明的突变型蛋白质，具有非常好的肽合成活性。即，和具有SEQ ID NO208的氨基酸序列的蛋白质(M35-4/V184突变型蛋白质)相比，在催化肽生成反应方面具有更优良的性能。更具体而言，本发明的突变型蛋白质，在由特定羧基成分和胺成分合成肽时的反应速度、收率、底物特异性、pH特性、温度稳定性等进行肽生成反应所需各种特性上，均比SEQ ID NO208所示的蛋白质具有更优良的性能(具体参见下述实施例)。因而，本发明的突变型蛋白质，适宜用于肽的工业化生产。
突变型L1～L335、突变型M1～M642所示的突变导入，例如，可通过定点突变法，使得编码具有SEQ ID NO208的氨基酸序列的蛋白质的基因的特定位点的氨基酸被取代，从而改变碱基序列，来实现。对应于SEQ ID NO208的氨基酸序列中的突变位点的碱基序列，通过参见SEQ ID NO207，可容易地得到确认。
此外，根据本发明，还提供和含有上述突变型L1～L335或突变型M1～M642所示的1种或2种以上的突变的突变型蛋白质基本上相同的蛋白质。即，本发明还提供含有如下氨基酸序列的具有肽合成活性的突变型蛋白质，所述氨基酸序列除含有选自突变型L1～L335和突变型M1～M642所示的1种或2种以上的突变型外，还在上述突变部位以外的部位，含有选自取代、缺失、插入、添加和倒位的1种或数种突变以下，也称为突变型蛋白质(II’)。即，本发明的突变型蛋白质，允许突变发生在SEQ ID NO208所示氨基酸的突变型L1～L335和突变型M1～M642之外的部位。因而，在突变型L1～L335和突变型M1～M642突变部位之外的部位导入缺失、插入等突变后，从突变型L1～L335和突变型M1～M642表示的部位到N末端或C末端的氨基酸残基数，有时会不同于导入突变前的状态。
这里所说的“数种氨基酸”，会因氨基酸残基在蛋白质的立体结构中的位置和种类而有所不同，应在氨基酸残基不会对蛋白质立体结构、活性造成很大影响的范围内，具体而言，为2～50个，优选为2～30个，更优选为2～10个。该突变型蛋白质优选保持含有选自突变型L1～L335和突变型MI～M642的1种或2种以上的突变的蛋白质即，含有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的突变型蛋白质(I’)的约一半以上，更优选80％或以上，进而优选90％或以上，尤其优选95％或以上的肽合成活性。
突变型L1～L335和突变型M1～M642以外的突变，例如，也可通过定点突变法，改变碱基序列，使编码当前蛋白质的基因的特定部位的氨基酸被取代、缺失、插入、添加、倒位等实现。此外，如上述改变得到的碱基序列编码得到的多肽，也可通过传统的突变处理获得。传统的突变处理、碱基取代、缺失、插入、添加和倒位等突变的含义和上述项目1中的一样。通过在适当细胞内表达具有上述突变的DNA，调节表达产物的酶活性，可得到编码和SEQ ID NO208所示的蛋白质基本上相同的蛋白质的DNA。
4.本发明的多核苷酸本发明提供编码含有上述本发明突变型蛋白质的氨基酸序列的多核苷酸。通过密码简并，可得到多个限定1个氨基酸序列的碱基序列。即，本发明的多核苷酸包含下述多核苷酸；(i)编码具有如下氨基酸序列的突变型蛋白质的多核苷酸，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中含有的上述突变型1～68、突变型239～290和324～377中的任意1种或2种以上的突变；(ii)编码具有如下氨基酸序列，并具有肽合成活性的突变型蛋白质的多核苷酸，所述氨基酸序列是在含有上述突变型1～68、突变型239～290和324～377中的任意1种或2种以上的突变的氨基酸序列中，在突变部位以外的部位，还含有选自取代、缺失、插入、添加和倒位的1个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。
SEQ ID NO2的氨基酸序列，例如，可由SEQ ID NO1所示的碱基序列编码。
此外，本发明还提供编码上述本发明的具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的突变型蛋白质的氨基酸序列的多核苷酸。通过密码简并，可得到多个限定1个氨基酸序列的碱基序列。即，本发明的多核苷酸包含下述多核苷酸；(i’)编码具有如下氨基酸序列的突变型蛋白质的多核苷酸，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中含有上述突变型L1～L335和突变型M1～M642中的任意1种或2种以上的突变；(ii’)编码具有如下氨基酸序列，并具有肽合成活性的突变型蛋白质的多核苷酸，所述氨基酸序列是在含有上述突变型L1～L335和突变型M1～M642中的任意1种或2种以上的突变的氨基酸序列中，在突变部位以外的部位，还含有选自取代、缺失、插入、添加和倒位的1个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。
SEQ ID NO208的氨基酸序列，例如，可由SEQ ID NO207所示的碱基序列编码。
和具有SEQ ID NO1所示碱基序列基本上相同的多核苷酸，例如有，如下多核苷酸。通过从编码具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸或携带有该多核苷酸的细胞等，分离出在严格条件下和由SEQ ID NO1所示的碱基序列互补的碱基序列组成的多核苷酸或由该碱基序列制备的探针杂交，并编码具有肽合成活性的蛋白质的多核苷酸，可得到和具有SEQ ID NO1所示的碱基序列的多核苷酸基本上相同的多核苷酸。
另一方面，和具有SEQ ID NO207所示碱基序列的DNA基本上相同的多核苷酸，也可和上述SEQ ID NO1所示的DNA的情形一样，从编码具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸或携带有该多核苷酸的细胞等分离得到。
同样，本发明提供和编码本发明的突变型蛋白质的多核苷酸基本上相同的下述(iii)或(iv)所示多核苷酸。
(iii)在严格条件下和具有和上述(i)多核苷酸的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸杂交，具有选自突变型1～68、突变型239～290和324～377中的1种或2种以上的突变，并编码具有肽合成活性的蛋白质的多核苷酸。
(iv)在严格条件下和具有和上述(ii)多核苷酸的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸杂交，具有选自突变型1～68、突变型239～290和324～377中的1种或2种以上的突变，并编码具有肽合成活性的蛋白质的多核苷酸。
同样，本发明提供和编码本发明的突变型蛋白质的多核苷酸基本上相同的下述(iii’)或(iv’)所示多核苷酸。
(iii’)在严格条件下和具有和上述(i’)多核苷酸的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸杂交，具有选自上述突变型L1～L335和突变型M1～M642中的1种或2种以上的突变，并编码具有肽合成活性的蛋白质的多核苷酸。
(iv’)在严格条件下和具有和上述(ii’)多核苷酸的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸杂交，具有选自上述突变型L1～L335和突变型M1～M642中的1种或2种以上的突变，并编码具有肽合成活性的蛋白质的多核苷酸。
用于得到基本上相同的多核苷酸的探针，例如，可基于SEQ IDNO1、SEQ ID NO207所示的碱基序列或编码突变型蛋白质的碱基序列，采用标准方法制备。使用探针，获取与其杂交的多核苷酸，从而分离出目的多核苷酸的方法，可依据标准方法实施。例如，通过扩增克隆到质粒、噬菌体载体的碱基序列，用限制性酶剪切出预用作探针的碱基序列，提取该碱基序列，可制备DNA探针。剪切位点可根据目的DNA调节。
此处所说的“严格条件”是指，形成所谓的特异性杂交，而不形成非特异性杂交的条件。尽管很难以数值的形式表示该条件，但如果举一个例子的话，例如，同源性高的DNA之间，例如同源性大于等于50％，更优选大于等于80％，进而优选大于等于90％，尤其优选大于等于95％的DNA之间杂交，比其同源性低的DNA之间不杂交的条件，或者是，在通常southern杂交的清洗条件，即，在60℃相当于1×SSC、0.1％SDS，优选0.1×SSC、0.1％SDS的盐浓度下杂交的条件。在这种条件下杂交的基因之中，尽管有可能包含在序列中含有中止密码子的基因、因活性中心突变而丧失活性的基因，然而，通过连接到市售表达载体，在适当宿主中表达，并用后述方法测定表达产物的酶活性，可容易地将这些基因去除。
如上，对于上述(ii)和(iii)的多核苷酸，它们编码的蛋白质，在50℃、pH8的条件下，有望保持上述突变型蛋白质(I)的约一半以上，更优选80％或以上，进而优选90％或以上的肽合成活性。另一方面，对于上述(ii’)、(iii’)和(iv’)多核苷酸，它们编码的蛋白质，在22℃、pH8.5的条件下，有望保持上述突变型蛋白质(I)的约一半以上，更优选80％或以上，进而优选90％或以上的肽合成活性。
5.本发明的具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白质和具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质如上，突变型蛋白质(I)和具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的突变型蛋白质(I’)，可通过分别改变具有SEQ ID NO2和SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质获得。以下，针对本发明蛋白质的源头蛋白质，进行说明。本发明的突变型蛋白质，并不局限于蛋白质来源。
具有SEQ ID NO1所示的DNA和SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白质，以及具有SEQ ID NO207所示的DNA和SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质，来源于多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)FERM BP-10163菌株(保藏人附加的用于鉴定的描述Sphingobacterium multivorum AJ2458)。FERM编号所示的菌株，已保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，邮政编码305-8566)，可参照保藏号索取。
和具有SEQ ID NO2或SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质同种的蛋白质，可从鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)FERMBP-8124菌株分离得到。具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白质中第439位氨基酸残基亮氨酸被取代成缬氨酸后得到的蛋白质，可从鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)FERM BP-8124菌株分离得到。鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)FERM BP-8124(保藏人附加的用于识别的表示Sphingobacterium sp.AJ11003)，于2002年7月22日保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心，获得保藏号。FERM编号所示的菌株，已保藏于独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，邮政编码305-8566)，可参照保藏号索取。
上述多食鞘氨醇杆菌菌株，通过以上分类实验，被认定为多食鞘氨醇杆菌。上述菌株具有如下性质杆菌(0.6～0.7×1.2～1.5μm)，革兰氏阴性，无孢子形成，无运动性，菌落形态为圆形、全缘光滑、呈低凸状、有光泽、黄色，在30℃生长，过氧化氢酶阳性，氧化酶阳性，OF试验(葡萄糖)阴性，因而被认定为是鞘氨醇杆菌属细菌。进而根据如下性质硝酸盐还原阴性，吲哚产生阴性，葡萄糖产酸阴性，精氨酸双水解酶阴性，尿激酶阳性，七叶甙水解阳性，明胶水解阴性，β-半乳糖苷酶阳性，葡萄糖利用阳性，L-阿拉伯糖利用阳性，D-甘露糖利用阳性，D-甘露醇利用阴性，N-乙酰-D-葡萄糖胺利用阳性，麦芽糖利用阳性，葡萄糖酸钾利用阴性，n-癸酸利用阴性，己二酸利用阴性，dl-苹果酸利用阴性，柠檬酸钠利用阴性，乙酸苯酯利用阴性和细胞色素氧化酶阳性，证实与多食鞘氨醇杆菌性状类似。进而，16sRNA基因碱基序列同源性分析结果显示，和多食鞘氨醇杆菌具有最高同源性(98.5％)，认定其为多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium multivorum)。
由SEQ ID NO1所示的第61～1917位碱基的碱基序列构成的DNA，是密码子序列部分。在第61～1917位碱基的碱基序列中，包含信号序列区域和成熟蛋白质区域。信号序列区域是第61～120位碱基区域，成熟蛋白质区域是第121～1917位碱基区域。即，本发明提供包含信号序列的肽酶蛋白质基因，和作为成熟的蛋白质的肽酶蛋白质基因。SEQ ID NO1所示的序列中所含的信号序列是前导序列类序列，该前导序列区域编码的前导肽的主要功能被推测为从细胞膜内分泌到细胞膜外。第121～1917位碱基的碱基序列编码的蛋白质，即去除前导肽的部位被推测是成熟蛋白质，具有很高的肽合成活性。
具有SEQ ID NO1所示的碱基序列的DNA，可通过PCR 参考多聚酶链式反应，White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989)或杂交法从多食鞘氨醇杆菌染色体DNA获得。PCR使用的探针，例如，可基于具有肽合成活性的纯化蛋白质所确定的内部氨基酸序列来设计。此外，也可以基于SEQ ID NO1所示的碱基序列，设计探针或杂交用探针，或者也可用探针来分离。若使用具有对应于5’非翻译区域和3’非翻译区域的序列的探针作为PCR用探针，则可扩增该蛋白质的全部密码子区域。若以扩增包含SEQ ID NO1所示的前导序列和成熟蛋白质编码序列的区域为例，具体而言，可以举出，以具有SEQ ID NO1中第61位碱基上游区域的碱基序列的探针作为5’侧探针，具有和SEQID NO1中第1917位碱基下游区域的碱基序列互补的探针作为3’侧探针。
探针可根据传统方法合成，例如，使用Applied Biosystems公司生产的DNA合成仪型号380B，采用亚磷酰胺(phosphoamidite)法进行。PCR反应，例如，可使用Gene Amp PCR System 9600(PERKINELMER公司生产)和TaKaRa LA PCR体外Cloning Kit(宝酒造公司生产)，依据各生产厂家指定的方法进行。
6.本发明的突变型蛋白质的制造方法接着，针对本发明的蛋白质的制造方法，即，其中使用的重组体和转化体的制备方法，进行说明。
表达上述突变型蛋白质的转化体，例如，通过将选自突变型1～68、突变型239～290和324～377的任意突变导入到具有SEQ ID NO1所示碱基序列的表达载体等重组DNA中，再导入适当宿主，表达突变型蛋白，从而可得到具有肽合成活性的突变型蛋白质。另一方面，表达具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的突变型蛋白质的转化体，通过将选自突变型L1～L335和突变型M1～M642的任意突变导入到具有SEQ ID NO207所示碱基序列的表达载体等重组DNA中，再导入适当宿主，表达突变型蛋白，从而可得到具有肽合成活性的突变型蛋白质。用于表达由具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO207的碱基序列的DNA表示的突变型蛋白质的宿主，例如可以使用，大肠杆菌(Escherichia coli)等埃希氏菌属(Escherichia)细菌、短稳杆菌属(Empedobacter)细菌、鞘氨醇杆菌属细菌、黄杆菌属(Flavobacterium)和枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)等各种原核细胞，以及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、树干毕赤酵母(Pichia stiitis)和米曲霉(Aspergillus oryzae)等各种真核细胞。
用于将外源DNA导入宿主的重组DNA的制备可通过如下方式制备，即，在根据宿主种类挑选的载体中，插入预先确定的DNA，并使得该DNA编码的蛋白质能够表达。在编码短稳杆菌产生的蛋白质的基因的固有启动子可在宿主细胞中发挥作用的情况下，可使用该启动子作为使蛋白质表达的启动子。此外，根据需要，也可以将在宿主细胞中发挥作用的其他启动子连接于编码突变型蛋白质的DNA，在该启动子控制下，进行表达。
将重组DNA导入宿主细胞的转化法，例如，可以举出，D.M.Morrison的方法Methods in Enzymology 68，326(1979)，或者是用氯化钙处理受体细胞，增加DNA通透性的方法Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970)等。
在采用重组DNA技术大量生成蛋白质时，其中的一个优选的实施方式可以是，在生产该蛋白质的转化体内，使该蛋白质凝集形成蛋白质的包涵体(inclusion body)。该表达生产方法的优点在于，保护目的蛋白不被菌体内存在的蛋白酶消化，和破碎菌体后，通过离心可简单的纯化目的蛋白等方面。
如上得到的蛋白质包涵体，在蛋白变性剂溶解后，主要通过去除该变性剂重新获得活性，从而转换成折叠正确的具有生理活性的蛋白质。这样的例子有很多，例如，人白介素-2的活性再生(特开昭61-257931号公报)等。
为从蛋白质包涵体得到活性蛋白质，需要进行可溶化和活性再生等一系列操作，操作比直接生产活性蛋白质复杂。但是，若在菌体内大量生产会影响菌体生长的蛋白质的情况下，通过在菌体内积累无活性蛋白质包涵体，可抑制该作用。
将目的蛋白质作为包涵体大量生产的方法，除了在强效启动子控制下，单独表达目的蛋白质的方法外，还有将目的蛋白质以和已知的大量表达的蛋白质形成的融合蛋白的形成表达的方法。
以下，以制备转化后的大肠杆菌，用其制造突变型蛋白质的方法为例，更具体地说明。在用大肠杆菌等微生物制备突变型蛋白质时，可以合并入包含前导序列的前导蛋白质编码基因作为蛋白质的编码序列，也可以仅合并入不含前导序列的成熟蛋白质区域的DNA作为蛋白质的编码序列，可根据要制备的酶的制造条件、形态、使用条件等适宜选择。
使编码突变型蛋白质的DNA表达的启动子，可以使用通常用于大肠杆菌生产特异性蛋白质的启动子，例如，T7启动子、lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子和lambda噬菌体的PR启动子、PL启动子等强效启动子。载体可使用pUC19、pUC18、pBR32、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等。也可以使用噬菌体DNA的载体。还可使用包含启动子的能够表达DNA插入序列的表达载体。
为了以融合蛋白质包涵体的形式生产突变型蛋白质，在突变型蛋白质的上游或下游连接编码其他蛋白质，优选亲水性肽的基因，作为融合蛋白质基因。像这样的编码其他蛋白质的基因，只要是可增加融和蛋白质的积累量，变性、再生工程后可提高融合蛋白质的溶解性就可以，例如可举出T7gene 10、β-半乳糖苷酶基因、二氢叶酸还原酶基因、γ-干扰素基因、白介素-2基因和凝乳酶(prochymosin)基因等候选基因。
在将这些基因和编码突变型蛋白质的基因连接的时候，密码子的阅读框要匹配。可以连接在适当的限制性酶切位点，也可以利用具有适当序列的合成DNA。
此外，为增大产量，有时优选将转录终止序列，即，终止子连接到融合蛋白质基因的下游。该终止子，例如可以举出，T7终止子、fd噬菌体终止子、T4终止子、四环素耐受性基因终止子和大肠杆菌trp基因终止子等。
将编码突变型蛋白质或突变型蛋白质和其他蛋白质的融合蛋白质的基因导入大肠杆菌的载体，优选所说的多复制型，例如pUC系列的质粒、pBR322系列的质粒或其衍生物等具有ColE1来源的复制起始位点的质粒。“衍生物”是指，通过碱基取代、缺失、插入、添加和/或倒位等对质粒进行修饰后得到的产物。所说的修饰，也包含突变剂、UV照射等突变处理或自然突变等引起的改变。
此外，挑选转化体时，优选该载体含有氨苄青霉素等标识。携带有强效启动子的表达载体(pUC系列(宝酒造株式会社生产)、pPROK系列和pKK233-2(Clontech公司生产)等)作为这样的质粒，已经在市场上销售。
将如下DNA片段和载体DNA连接得到重组DNA，所述DNA片段是顺次连接有启动子、编码突变型蛋白质或突变型蛋白质和其他蛋白质的融和蛋白的基因、某些情况下还连接有终止子的DNA片段。
以得到的重组DNA转化大肠杆菌，培养该大肠杆菌，可表达产生突变型蛋白质或突变型蛋白质和其他蛋白质的融合蛋白质。被转化的宿主，可以使用突变基因表达时常用的菌株，优选大肠杆菌K12的亚种，即E.coli JM109菌株等。转化方法以及转化体的挑选方法在Molecular Cloning，2nd edition，Cold Spring Harbor Press(1989)等中有记载。
在表达成融合蛋白时，可以将融合蛋白设计成如下形式，即，可用识别血液凝固因子Xa、激肽释放酶(Kallikrein)等肽合成酶内没有的序列的限制性蛋白质，剪切出肽合成酶。
可以使用M9-酪蛋白氨基酸培养基、LB培养基等培养大肠杆菌常用培养基。培养条件、生产诱导条件，根据使用的载体标识、启动子、宿主菌等的种类适宜选择。
突变型蛋白质或突变型蛋白质和其他蛋白质的融合蛋白质的回收方法，例如有以下方法等。将突变型蛋白质或其融合蛋白质在菌体内溶解，回收菌体后，破碎菌体或溶菌得到粗酶液。进而，根据需要，采用传统的沉淀、过滤、柱层析等手段，可将粗酶液纯化得到纯化的突变型蛋白质或其融合蛋白质。这种情况下，也可使用突变型蛋白质或融合蛋白质的抗体进行纯化。
在形成蛋白质包涵体的情况下，用变性剂将其溶解。尽管可以和菌体蛋白质一起溶解，但考虑到以后的纯化操作，优选取出包涵体后，再将其溶解。从菌体回收包涵体的方法，可以依据以往公知的方法进行。例如，通过破菌、离心分离等回收包涵体。溶解蛋白质包涵体的变性剂，例如可以举出，盐酸胍(例如，6M、pH5～8)、尿素(例如8M)等。
通过透析等将这些变性剂去除，再生得到具有活性的蛋白质。透析使用的透析溶液，例如可以使用，tris盐酸缓冲液、磷酸缓冲液等，浓度为20mM～0.5M、pH为pH5～8。
再生步骤时的蛋白质浓度，优选控制在大约500μg/ml或以下。为抑制再生得到的肽生成酶自我桥联，优选透析温度在5℃或以下。变性剂去除方法，例如有稀释法、超滤法等，使用其中任何方法，均可期待活性再生。
7.肽的制造方法本发明的肽制造方法是使用上述突变型蛋白质，合成肽的方法。即，在本发明的肽制造方法，在下述(I)和(II)所示蛋白质中的至少1种存在下，使胺成分和羧基成分反应，从而合成肽。
(I)具有如下氨基酸序列的突变型蛋白质，所述氨基酸序列是包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的上述突变型1～68、突变型239～290和324～377中的任意1种或2种以上的突变的氨基酸序列。
(II)根据上述(I)所述的突变型蛋白质，具有如下氨基酸序列，并具有肽合成活性的突变型蛋白质，所述氨基酸序列是在上述突变型1～68、突变型239～290和324～377中的任意1种或2种以上的突变部位之外的部位，还含有选自取代、缺失、插入、添加和倒位的1个或多个氨基酸的突变的氨基酸序列。
本发明的肽制造方法，也可使用具有上述SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的突变型蛋白质，合成肽。即，在本发明的肽制造方法，在下述(I’)和(II’)所示蛋白质中的至少1种存在下，使胺成分和羧基成分反应，从而合成肽。
(I’)具有如下氨基酸序列的突变型蛋白质，所述氨基酸序列是包含SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的上述突变型L1～L335和突变型M1～M642中的任意1种或2种以上的突变的氨基酸序列。
(II’)根据上述(I’)所述的突变型蛋白质，具有如下氨基酸序列，并具有肽合成活性的突变型蛋白质，所述氨基酸序列是在上述突变型L1～L335和突变型M1～M642中的任意1种或2种以上的突变部位之外的部位，还含有选自取代、缺失、插入、添加和倒位的1个或多个氨基酸的突变的氨基酸序列。
本发明的肽制造方法中，突变型蛋白质可以存在于肽生成反应体系内。上述突变型蛋白质，例如可以作为混合物(以下，称为“突变型蛋白质含有物”)的形式提供，所述混合物是在生化学允许的溶剂中含有蛋白质(I)和/或(II)，或者是含有蛋白质(I’)和/或(II’)而成的混合物。具体而言，例如，使用选自转化后的可表达本发明突变型蛋白质的微生物的培养物、从该培养物分离得到的微生物菌体和该微生物的菌体处理物的1种或2种以上，可以由胺成分和羧基成分合成肽。
本说明书中，“突变型蛋白质含有物”是指，含有本发明的突变型蛋白质的物质，就其具体形态而言，包括生产突变型蛋白质的微生物的培养物、从该微生物培养物分离得到的微生物菌体，和菌体处理物等。微生物的培养物是指，培养微生物得到的物质，更具体是指，微生物菌体、培养该微生物使用的培养基和培养的微生物产生的物质的混合物等。此外，可以将微生物菌体洗净，作为洗净的菌体使用。菌体处理物，包括将菌体破碎、溶菌、冷冻干燥后得到的物质等，进而包括将菌体等处理回收得到的粗纯化蛋白质，和进一步纯化后的纯化蛋白质。纯化处理后的蛋白质，可以使用通过各种纯化法得到的部分纯化蛋白质，也可以使用通过共价键法、吸附法和包埋法等将这些固定后得到的固定化蛋白质。此外，依赖于使用的微生物的种类，有时会在培养过程中发生部分溶菌，因此，在这种情况下，也可以使用培养液上清作为突变型蛋白质含有物。
含有本发明的突变型蛋白质的微生物，可以使用表达突变型蛋白质的基因重组菌株，也可以使用丙酮处理菌体、冷冻干燥菌体等菌体处理物，还可以使用将这些通过共价键法、吸附法、包埋法等固定得到的固定化菌体、固定化菌体处理物。
在使用培养物、培养菌体、洗净的菌体、菌体破碎或溶菌得到的菌体处理物时，由于这些物质常常含有不参与肽生成反应、并且还有分解生成的肽的酶，因此，在这种情况下，有时优选加入乙二胺四乙酸等金属蛋白酶抑制剂。添加量在0.1mM～300mM范围内，优选为1mM～100mM。
通过将突变型蛋白质或其含有物、羧基成分和胺成分混合，可使突变型蛋白质或其含有物作用于数基成分和胺成分。更具体而言，可以将本发明的突变型蛋白质或其含有物添加到含有羧基成分和胺成分的溶液中反应，在使用生产突变型蛋白质的微生物的情况下，也可以先培养生产突变型蛋白质的微生物，使该酶在微生物中或微生物培养液中生成并积累，再在培养液中添加羧基成分和胺成分等。生成的肽，可通过标准方法回收，根据需要进行纯化。
为得到微生物菌体(即，微生物的细胞)，可以根据微生物的种类用适当的培养基培养，使其增殖。上述培养基，只要是该微生物能够增殖就可以，并没有特殊限制，可以是含有通常碳源、氮源、磷源、硫源、无机离子，根据需要还含有有机营养源的传统培养基。
例如，碳源，只要是上述微生物可以利用，可以使用任何碳源，具体而言，可使用葡萄糖、果糖、麦芽糖和淀粉等糖，山梨醇、乙醇和甘油等醇，富马酸、柠檬酸、醋酸、丙酸等有机酸和它们的盐，石蜡等碳水化合物，或它们的混合物等。
氮源可以使用硫酸铵、氯化铵等无机酸的铵盐，富马酸铵和柠檬酸铵等有机酸的铵盐，硝酸钠和硝酸钾等硝酸盐，蛋白胨、酵母提取物、肉类提取物、玉米浆(corn steep liquor)等有机氮化合物，或它们的混合物等。
根据需要，可以适当混合入其他无机盐、微量金属盐、维生素等培养基中常用的营养源。
培养条件也没有特别限制，例如，可以在好氧条件下，pH5～9、温度约在15～55℃范围内，一边适当控制pH和温度，一边培养约12～48小时。
本发明的肽制造方法的优选实施方式，例如可以举出，在培养基中培养上述经过转化的微生物，使突变型蛋白质在培养基中和/或微生物中积累的方法。通过使用转化体，由于可简便、大量地生产突变型蛋白质，因此还可大量且快速生产肽。
突变型蛋白质或其含有物的使用量，可以是发挥目的效果的量(有效量)，本领域的技术人员通过简单预试验，可很容易确定该有效量，例如，在使用酶的情况下，为0.01～100单位(Unit)左右；在使用洗净的菌体的情况下，为0.1～500g/L左右。
只要羧基成分可以和另一底物，即，胺成分缩合生成肽，则可以使用任何羧基成分。作为羧基成分，例如可以举出，L-氨基酸酯、D-氨基酸酯、L-氨基酸酰胺、D-氨基酸酰胺和不含氨基的有机酸酯等。此外，作为氨基酸酯，例如，不仅可以是对应于天然氨基酸的氨基酸酯，还可以是对应于非天然氨基酸或其衍生物的氨基酸酯等。作为氨基酸酯，例如，除α-氨基酸酯外，还可以举出具有不同的氨基酸结合位点的β-、γ-、ω-等氨基酸酯。氨基酸酯的代表例有，氨基酸的甲酯、乙酯、n-丙酯、异丙酯、n-丁酯、异丁酯和叔丁酯等。
作为初始原料的羧基成分和胺成分的浓度，分别为1mM～10M，优选为0.05M～2M，有时优选胺成分的添加量等于或超过羧基成分的添加量。此外，在高浓度底物抑制反应的情况下，可在反应液中逐次添加上述成分，使它们的浓度保持在一定水平，从而避免反应被抑制。
反应温度在0～60℃范围内，在该温度下，可合成肽，优选为5～40℃。此外，反应pH在pH6.5～10.5范围内，在该pH下，可合成肽，优选为pH7.0～10.0。
本发明的肽制造方法，适用作各种肽的制造方法。作为肽，例如可以举出，α-L-天门冬氨酰基-L-苯丙氨酸-β-甲酯(例如，α-L-(β-o-甲基天门冬氨酰基)-L-苯丙氨酸(简称α-AMP)，L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺(Ala-Gln)，L-丙氨酰基-L-苯丙氨酸(Ala-Phe)，L-苯丙氨酰基-L-蛋氨酸(Phe-Met)，L-亮氨酰基-L蛋氨酸(Leu-Met)，L-异亮氨酰基-L-蛋氨酸(Ile-Met)，L-蛋氨酰基-L-蛋氨酸(Met-Met)，L-脯氨酰基-L-蛋氨酸(Trp-Met)，L-缬氨酰基-L-蛋氨酸(Val-Met)，L-天冬酰胺酰基-L-蛋氨酸(Asn-Met)，L-半胱氨酰基-L-蛋氨酸(Cys-Met)，L-谷氨酰胺酰基-蛋氨酸(Gln-Met)，甘氨酰基-L-蛋氨酸(Gly-Met)，L-丝氨酰基-L-蛋氨酸(Ser-Met)，L-苏氨酰基-L-蛋氨酸(Thr-Met)，L-酪氨酰基-L-蛋氨酸(Tyr-Met)，L-天门冬氨酰基-L-蛋氨酸(Asp-Met)，L-精氨酰基-L-蛋氨酸(Arg-Met)，L-组氨酰基-L-蛋氨酸(His-Met)，L-赖氨酰基-L-蛋氨酸(Lys-Met)，L-丙氨酰基-L-甘氨酸(Ala-Gly)，L-丙氨酰基-L-苏氨酸(Ala-Thr)，L-丙氨酰基-L-谷氨酸(Ala-Glu)，L-丙氨酰基-L-丙氨酸(Ala-Ala)，L-丙氨酰基-L-天门冬氨酸(Ala-Asp)，L-丙氨酰基-L-丝氨酸(Ala-Ser)，L-丙氨酰基-L-蛋氨酸(Ala-Met)，L-丙氨酰基-L-缬氨酸(Ala-Val)，L-丙氨酰基-L-赖氨酸(Ala-Lys)，L-丙氨酰基-L-天冬酰胺(Ala-Asn)，L-丙氨酰基-L-半胱氨酸(Ala-Cys)，L-丙氨酰基-L-酪氨酸(Ala-Tyr)，L-丙氨酰基-L-异亮氨酸(Ala-Ile)，L-精氨酰基-L-谷氨酰胺(Arg-Gln)，甘氨酰基-L-丝氨酸(Gly-Ser)，甘氨酰基L-(t-丁基)丝氨酸(Gly-Ser(tBu))，和(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酰基-苯丙氨酸(HIL-Phe)，以及L-丙氨酰基-L-苯丙氨酰基-L-丙氨酸(AFA)、L-丙氨酰基-L-甘氨酰基-L-丙氨酸(AGA)、L-丙氨酰基-L-组氨酰基-L-丙氨酸(AHA)、L-丙氨酰基-L-亮氨酰基-L-丙氨酸(ALA)、L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酸(AAA)、L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-甘氨酸(AAG)、L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-脯氨酸(AAP)、L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-谷氨酸(AAQ)，L-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-酪氨酸(AAY)、甘氨酰基-L-苯丙氨酰基-L-丙氨酸(GFA)、L-丙氨酰基-甘氨酰基-丙氨酸(AGG)、L-苏氨酰基-甘氨酰基-甘氨酸(TGG)、甘氨酰基-甘氨酰基-甘氨酸(GGG)和L-丙氨酰基-L-苯丙氨酰基-甘氨酸(AFG)等三肽，和甘氨酰基-甘氨酰基-L-苯丙氨酰基-L-蛋氨酸(GGFM)等四肽，以及L-酪氨酰基-甘氨酰基-甘氨酰基-L-苯丙氨酰基-L-蛋氨酸(YGGFM)等五肽。
本发明的肽制造方法，也适用于，例如，α-L-天门冬氨酰基-L-苯丙氨酸-β-甲酯(例如，α-L-(β-o-甲基天门冬氨酰基)-L-苯丙氨酸(简称α-AMP))。α-AMP是制造需求量很大的甜味剂α-L-天门冬氨酰基-L-苯丙氨酸-α-甲酯(商品名阿斯巴甜)的重要的中间体。
实施例以下，通过实施例对本发明进行进一步详细说明，本发明并不局限于下述实施例。
(实施例1)肽生成酶基因在大肠杆菌中的表达以多食鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium mnultivorum)FERM BP-10163菌株的柒色体DNA为模板，序列5、6所示的多核苷酸为引物，通过PCR扩增编码具有肽合成活性的蛋白质的目的基因。将扩增后的DNA片段用NdeI/XbaI处理后，将得到的DNA片段和经过NdeI/XbaI处理的pTrpT连接。用含有该连接产物的溶液转化大肠杆菌JM109，以氨苄青霉素耐受性为指标，挑选具有目的质粒的菌株，将其命名为pTrpT_Sm_Aet。此外，携带pTrpT_Sm_Aet的大肠杆菌JM109也被表示为pTrpT_Sm_Aet/JM109。
将1铂金环的pTrpT_Sm_Aet/JM109菌株接种于装有3mL  培养基(2g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、10g/L酪蛋白氨基酸、5g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、1g/L磷酸氢二钾、0.5g/L七水硫酸镁、100mg/L氨苄青霉素)的普通试管中，25℃培养20小时。结果发现，每毫升培养液具有2.1U的AMP生成活性，由此确认克隆得到的基因在大肠杆菌中表达。在只导入了pTrpT的作为对照的转化体中，未检测到活性。
(实施例2)使用pKF载体构建合理的突变株(1)构建pKF_Sm_Aet以pTrpT_Sm_Aet质粒为模板，序列3、4所示多核苷酸为引物，通过PCR扩增目的基因。将该DNA片段用EcoRI/PstI处理后，将得到的DNA片段和经过EcoRI/PstI处理的pKF18k2(宝酒造公司生产)连接。用含有该连接产物的溶液转化大肠杆菌JM109，以氨苄青霉素耐受性为指标，挑选具有目的质粒的菌株，将其命名为pKF_Sm_Aet。此外，携带pKF_Sm_Aet的大肠杆菌JM109也被表示为pKF_Sm_Aet/JM109。
(2)将合理突变导入pKF_Sm_Aet为构建突变型Aet，将pKF_Sm_Aet质粒用作采用ODA法的定点诱变法的模板。使用宝酒造公司(日本)的“Site Directed MutagenesisSystem Mutan Super Express Kit”，依据生产厂家的操作说明，采用对应于各种突变型酶的引物(SEQ ID NO12～33)，导入突变。使用的引物事先用宝酒造公司生产的T4多核苷酸激酶将其5’末端磷酸化。引物的磷酸化条件如下将100μmolDNA(引物)和T4多核苷酸激酶10个单位，添加到含有ATP 0.5mM、氯化镁10mM和DTT 5mM的50mMTris盐缓冲液(pH8.0)20μL中，37℃保温30分钟后，70℃加热5分钟，进行磷酸化。将本反应液1μL(5pmol)用于PCR，导入突变。PCR的反应条件如下将ds DNA(pKF_Sm_Aet质粒)模板10ng、作为引物的Selection Primer和上述5’磷酸化后的Mutagenic多核苷酸各5pmol和40个单位的LA-Taq酶，添加到含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP各250μM的LA-Taq缓冲液II(含有Mg2+)50μL中，重复25次下述循环94℃、1分钟，55℃、1分钟，72℃、3分钟。在用PCR导入突变后，通过乙醇沉淀，回收DNA片段，用得到的DNA片段转化大肠杆菌MV1184菌株，以卡那霉素耐受性为指标，挑选出具有目的质粒pKF_Sm_AetM的菌株，该目的质粒含有突变型Aet基因。
此外，本说明书中，具有pKF_Sm_AetM的大肠杆菌MV1184菌株也被表示成pKF_Sm_AetM/MV1184株。当表示pKF_Sm_AetM的具体突变型时，可通过将“AetM”替换成突变的类型来表示，例如，pKF_Sm_F207V。当含有2种或2种以上的突变时，可将突变用“/”连续区隔列举表示，例如，pKF_Sm_F207V/Q441E，表示的是pKF_Sm_Aet质粒携带的Aet基因中导入了F207V和Q441E突变。
(3)构建pHSG_Sm_Aet以pHSG_Sm_Aet质粒为模板，序列3、4所示多核苷酸为引物，通过PCR扩增目的基因。将该DNA片段用EcoRI/PstI处理后，将得到的DNA片段和经过EcoRI/PstI处理的pHSG298(宝酒造公司生产)连接。用含有该连接产物的溶液转化大肠杆菌MV1184，以卡那霉素耐受性为指标，挑选具有目的质粒的菌株，将其命名为pHSG_Sm_Aet。此外，携带pHSG_Sm_Aet的大肠杆菌MV1184也被表示为pHSG_Sm_Aet/MV1184。
(4)获取菌体A将菌株  pKF_Sm_Aet/JM109、pKF_Sm_AetM/MV1184  和pHSG_Sm_Aet/MV1184分别在LB琼脂培养基(10g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、5g/L氯化钠、20g/L琼脂、pH7.0)上，于30℃预培养24小时。将1铂金环的预培养后的各菌体接种于装有3mL的LB培养基(在未添加琼脂的上述培养基中，添加有0.1mM IPTG、20mg/L卡那霉素)的普通试管中，于25℃、以150往复/分钟振荡培养20小时。
(5)使用微生物菌体生产肽(AMP的合成)将实施例2(4)得到的培养液400μL离心，回收菌体后，混悬于含有10mM EDTA、50mM天冬氨酸二甲酯和100mM苯丙氨酸的100mM硼酸缓冲液(pH9.0)200μL，25℃反应30分钟。在该反应中，野生型酶表达株(以下，称为“野生株”)产生的α-AMP的浓度示于表3。各种突变型酶表达株(以下，称为“突变株”)的二肽生成浓度，相对于野生株产生的二肽的比率示于表3。
(6)使用微生物菌体生产肽(Ala-Gln的合成)将实施例2(4)得到的培养液100μL离心，回收菌体后，混悬于含有10mM EDTA、100mM L-丙氨酸甲酯和200mM谷氨酰胺的100mM硼酸缓冲液(pH9.0)200μL，25℃反应30分钟。在该反应中，野生株产生的L-丙氨酰基-L-谷氨酰胺(以下，Ala-Gln)的浓度示于表3。各种突变株的二肽生成浓度，相对于野生株产生的二肽的比率示于表3。
(7)使用微生物菌体生产肽(Phe-Met、Leu-Met的合成)将实施例2(4)得到的培养液800μL离心，回收菌体后，混悬于含有10mM EDTA、50mM L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐或L-酪氨酸甲酯盐酸盐、和100mM L-蛋氨酸的100mM硼酸缓冲液(pH9.0)400μL，25℃反应20分钟。在该反应中，野生株产生的L-苯丙氨酰基-L-蛋氨酸(以下，Phe-Met)或L-亮氨酰基-L-蛋氨酸(以下，Leu-Met)的浓度示于表3。各种突变株的二肽生成浓度，相对于野生株产生的二肽的比率示于表3。
表3

*在以野生株的二肽生成浓度为”1”的情况下，不同突变株的二肽生成浓度比率(实施例3)随机筛选1(8)制备pTrpT_Sm_Aet随机文库为构建突变型Aet，使用pTrpT_Sm_Aet质粒作为采用易错PCR法(ErFor probe PCR)的随机突变诱导法的模板。使用Strategene公司(美国)生产的“GeneMorph PCR Mutagenesis Kit”，依据生产厂家的操作说明，进行突变。
以序列表中序列5、6所示寡核苷酸为引物，进行PCR。将ds DNA(pTrpT_Sm_Aet或pTrpT_Sm_F207V质粒)模板500ng、引物各125ng和Mutazyme DNA聚合酶2.5个单位添加到含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM的Mutazyme反应缓冲液50μL中，重复30次下述循环95℃、30秒，52℃、30秒，72℃、2分钟，进行PCR反应。
将PCR反应生成物用NdeI/XbaI处理后，将得到的DNA片段和经过NdeI/XbaI处理的pTrpT连接。采用标准方法，用该含有连接产物的溶液转化大肠杆菌JM109(宝酒造生产)。将其平铺于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养基，制备导入有随机突变的文库。
(9)从pTrpT_Sm_Aet随机文库筛选A将导入有分别含有各突变型Aet基因的质粒(pTrpT_Sm_AetM)的大肠杆菌JM109菌株和导入有含有野生型Aet的质粒的大肠杆菌JM109菌株，接种于含有100μg/L氨苄青霉素的培养基150μL(2g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、10g/L酪蛋白氨基酸、5g/L硫酸铵、1g/L磷酸二氢钾、3g/L磷酸氢二钾、0.5g/L七水硫酸镁，pH7.5、100mg/L氨苄青霉素)(分装于96孔板)，25℃振荡培养16小时。使用TITEC公司的生物振荡器(M/BR-1212FP)，以1000转/分的转速振荡培养。
(10)初筛用实施例3(9)得到的培养液进行初筛，筛选方法如下。首先，在得到的培养液5μL中，添加含有10mM苯酚、6mM AP、5mM天冬氨酸二甲酯、7.5mM苯丙氨酸、3.6U/ml过氧化物酶、0.16U/ml醇氧化酶、10mM EDTA和100mM硼酸盐的反应液(pH8.2)200μL，25℃反应约20分钟。反应后，测定500nm的吸光度，计算甲醇的释放量。此处，挑选出甲醇释放量大的，作为APM生成活性高的酶。
(11)菌体的获得将1铂金环初筛挑选出的菌株于LB琼脂培养基25℃预培养16小时。将1铂金环各酵母表达株接种于装有2mL的极端培养基(12g/L蛋白胨、24g/L酵母提取物、2.3g/L磷酸二氢钾、12.5g/L磷酸氢二钾、4g/L丙三醇、100mg/L氨苄青霉素)的普通试管中，于25℃，以150往复/分的速度振荡培养18小时。
(12)复筛将得到的培养肉汤(broth)25μL混悬于含有10mM EDTA和50mM天冬氨酸二甲酯和75mM苯丙氨酸的100mM硼酸缓冲液(pH8.5或pH9.0)500μL，于20℃或25℃反应10分钟或15分钟，测定AMP生成量。从复筛的菌株中，挑选出比活性提高的菌株，进行突变位点分析，结果是，表示出以下突变位点。从以野生株为亲本菌株(模板)的文库，获得具有突变型4、5、6、7、8、9、10、14、15、16的突变株，从以F207V突变株为亲本菌株的文库，获得具有突变型17、18、19、20的突变株。
(13)使用微生物菌体生产肽上述反应中野生株产生的AMP的浓度示于表4(反应时间10分钟)，F207V突变株产生的AMP的浓度示于表5(反应时间15分钟)。此外，各突变株的二肽生成浓度相对于亲本菌株产生的二肽的比率示于表4、5。AMP生成反应的其他条件和上述实施例2(5)一样。
表4

*在以野生株的二肽生成浓度为”1”的情况下，不同突变株的二肽生成浓度比率表5

*在以亲本菌株(F207V突变株)的二肽生成浓度为”1”的情况下，不同突变株的二肽生成浓度比率(实施例4)通过将表示的突变位点导入pKF，评价该突变位点(14)构建表示的突变位点已经导入pKF的菌株将实施例3(12)得到的突变位点和以往构建的pKF_Sm_F207V/Q441E组合，构建3重突变株。使用pKF_Sm_F207V/Q441E为模板，和对应于各种突变型酵母的引物(序列表中序列34～44和77)，采用和实施例2(2)相同的方法导入突变。得到的菌株和以往构建的菌株均采用和实施例2(4)相同的方法培养。
(15)(5)使用微生物菌体生产肽(AMP的合成)将实施例4(14)得到的培养液500μL离心，回收菌体后，混悬于含有10mM EDTA、50mM天冬氨酸二甲酯和100mM苯丙氨酸的100mM硼酸缓冲液(pH8.5或pH9.0)500μL，25℃反应30分钟。在该反应中，野生株产生的AMP的浓度示于表6。突变株的二肽生成浓度，相对于野生株产生的二肽的比率示于表6。
(6)使用微生物菌体生产肽(Ala-GlD的合成)将实施例4(14)得到的培养液100μL离心，回收菌体后，混悬于含有10mM EDTA、100mM L-丙氨酸甲酯和200mM谷氨酰胺的100mM硼酸缓冲液(pH8.5或pH9.0)1000μL，25℃反应10分钟。在该反应中，野生株产生的Ala-Gln的浓度示于表6。各种突变株的二肽生成浓度，相对于野生株产生的二肽的比率示于表6。
(7)使用微生物菌体生产肽(Phe-Met、Leu-Met的合成)将实施例4(14)得到的培养液800μL离心，回收菌体后，混悬于含有10mM EDTA、50mM L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐或L-酪氨酸甲酯盐酸盐、和100mM L-蛋氨酸的100mM硼酸缓冲液(pH8.5或pH9.0)400μL，25℃反应20分钟。在该反应中，野生株产生的Phe-Met或Leu-Met的浓度示于表6。各种突变株的二肽生成浓度，相对于野生株产生的二肽的比率示于表6。
表6

*在以野生株的二肽生成浓度为”1”的情况下，不同突变株的二肽生成浓度比率(实施例5)随机筛选2(18)制备pSTV_Sm_Aet随机文库为构建突变型Aet，使用pSTV_Sm_Aet质粒作为采用易错PCR法(Error prone PCR)的随机突变诱导法的模板。使用Strategene公司(美国)生产的“GeneMorph PCR Mutagenesis Kit”，依据生产厂家的操作说明，进行突变。
以序列表中序列3、4所示寡核苷酸为引物，进行PCR。将ds DNA(pHSG_Sm_Aet质粒)模板100ng、引物1、2(参见序列3、4)各1.25pmol和Mutazyme DNA聚合酶2.5个单位添加到含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP各200μM的Mutazyme反应缓冲液50μL中，95℃加热30秒后，重复25次下述循环95℃、30秒，52℃、30秒，72℃、2分钟，进行PCR反应。
将PCR反应生成物用EcoRI/PstI处理后，将得到的DNA片段和经过EcoRI/PstI处理的pSTV28(宝酒造公司)连接。采用标准方法，用该含有连接产物的溶液转化大肠杆菌JM109(宝酒造生产)。将其平铺于含有50μg/mL氯霉素和0.1mM IPTG的M9琼脂培养基(200ml/L的5×M9、1ml/L的0.1M氯化钙、1ml/L的1M硫酸镁、10ml/L的50％葡萄糖、10g/L的酪蛋白氨基酸、15g/L的琼脂，制备导入了随机突变的文库。此时，为简化其后的筛选操作，涂布成每板100个左右的菌落。上述“5×M9”为含有七水磷酸氢二钠64g/L、磷酸二氢钾15g/L、氯化钠2.5g/L、氯化铵5g/L的溶液。
(19)从基于pSTV的随机文库，初筛为从得到的转化体(突变型酶表达株文库)高效挑选出活性增强的菌株，分析各转化体的Phe-pNA水解活性。在实施例5(18)制备的转化体生长平板上，覆盖5mL反应液(10mM Phe-pNA、10mM OPT、20mM Tris盐酸(pH8.2)、0.8％琼脂)，分析Phe-pNA水解产生的pNA的颜色形成(pNA的释放使菌体变为黄色)。挑选出着色重的菌落，作为活性增强株。
(20)获取菌体将挑选出的菌株于LB琼脂培养基30℃培养24小时。将1铂金环的该各菌株接种于装有3mL LB培养基(在不含琼脂的上述培养基中，含有0.1mM IPTG、50mg/L氯霉素)的普通试管中，于25℃，以150往复/分的转速培养20小时。
(21)复筛从实施例5(20)得到的培养肉汤400μL，收集菌体后，混悬于含有10mM EDTA和50mM Phe-OMe和100mM Met的100mM硼酸缓冲液(pH9.0)400μL，于25℃反应30分钟，测定Phe-Met产生量，挑选出反应初速度快的菌株。针对此处挑选出的活性增强株，进行突变位点分析，表示出突变位点11、12。
(22)使用微生物菌体，生产肽(Phe-Met，Leu-Met的合成)将实施例5(20)得到的800μL培养液离心，回收菌体后，混悬于含有10mM EDTA、50mM L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐或L-酪氨酸甲酯盐酸盐、和50mM L-蛋氨酸的100mM硼酸缓冲液(pH9.0)400μL，25℃反应20分钟。在该反应中，野生株产生的Phe-Met或Leu-Met的浓度示于表7。各种突变株的二肽生成浓度，相对于野生株产生的二肽的比率示于表7。
表7

*在以野生株的二肽生成浓度为”1”的情况下，不同突变株的二肽生成浓度比率(实施例6)肽合成酶基因在pSF_Sm_Aet中的高表达(23)构建高表达质粒通过PCR，在产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)来源的酸性磷酸酶的经过修饰后的启动子和信号肽的下游，连接鞘氨醇杆菌属来源的成熟型肽合成酶基因。
以pTrpT_Sm_Aet质粒(实施例1)为模板、和Esp-S1(5’-CCG TAAGGA GGA ATG TAG ATG AAA AAT ACA ATT ACA ATT TCG TGCC；SEQ ID NO121)和S-AS1(5’-GGC TGC AGT TTG CGG GAT GGAAGG CCG GC；SEQ ID NO122)寡核苷酸各0.4mM为引物，在KODplus缓冲液(TOYOBO公司生产)，以及含有dATP、dCTP、dGTP、dTTP各0.2mM、硫酸镁1mM和KOD plus聚合酶(TOYOBO公司生产)1个单位的50μL反应液中，94℃加热处理30秒后，重复进行下述循环25次94℃、15秒，55℃、30秒，68℃、2分30秒，扩增肽合成酶基因部分。以外，以pEAP130质粒(参见下述参考例1，相关专利申请JP2004-83481)为模板，E-S1(5’-CCT CTA GAA TTT TTTCAA TGT GAT TT；SEQ ID NO123)和Esp-AS1(5’-GCA GGA AATTGT ATT TTT CAT CTA CAT TCC TCC TTA CGG TGT TAT；SEQID NO124)寡核苷酸为引物，在相同条件下，进行PCR反应，扩增酸性磷酸酶的启动子和信号肽序列部分。将反应液进行琼脂糖电泳，扩增后各DNA片段用Microspin column(Amersham pharmacia Biotech公司生产)。
接着，以该扩增片段混合物为模板，E-S1和S-AS1寡核苷酸为引物，在和上述相同组成的反应液中，重复进行下述循环25次94℃、1 5秒，55℃、30秒，68℃、2分30秒，进行PCR，构建嵌合型酶基因。将扩增得到的各DNA片段用Microspin column(Amersham pharmaciaBiotech公司生产)回收后，用XbaI和PstI消化。将其连接于pUC18质粒的XbaI-PstI位点。用荧光染料链终止测序试剂盒(DNASequencing kit Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction)(PERKIN ELMER公司生产)，通过荧光染料链终止法(DyeTerminator)，用ABI310遗传分析仪确定碱基序列，确认导入有目的基因的质粒，将其命名为pSF_Sm_Aet质粒。
(24)构建pSF_Sm_Aet适当突变导入株为构建突变型Aet，将pSF_Sm_Aet用作采用了PCR的定点诱变法的模板。使用Stratagene公司(美国)的“QuikChange定点突变试剂盒(Quik change Site-Directed Mutagenesis Kit)”，依照生产厂家的操作说明，使用对应于各种突变型酶的引物(序列45～78)，导入突变。用PCR反应产物转化大肠杆菌JM109，以氨苄青霉素耐受性为指标，挑选出具有目的质粒的菌株。具有pSF_Sm_Aet的大肠杆菌JM109株，也被表示成pS_Sm_Aet/JM109株。
(25)获取菌体将实施例6(24)获得的各种突变株，在LB琼脂培养基中，于25℃预培养16小时。将1铂金环各酵母表达株接种于装有2mL的极端培养基(terrific medium)(12g/L蛋白胨、24g/L酵母提取物、2.3g/L磷酸二氢钾、12.5g/L磷酸氢二钾、4g/L丙三醇、100mg/L氨苄青霉素)的普通试管中，于25℃，以150往复/分的速度振荡培养18小时。
(26)使用微生物菌体生产肽(Ala-Gln的合成)将(25)得到的培养肉汤5μL离心，添加到含有50mM L-丙氨酸甲酯盐酸盐(Ala-OMe·HCl)和100mM L-谷氨酰胺、10mM EDTA的硼酸缓冲液(pH8.5或pH9.0)500μL，25℃反应10分钟。在该反应中，野生株产生的Ala-Gln的浓度示于表8。各种突变株的二肽生成浓度，相对于野生株产生的二肽的比率示于表8。
(27)使用微生物菌体生产肽(AMP的合成)将上述培养肉汤25μL，混悬于含有10mM EDTA、50mM天冬氨酸二甲酯和75mM苯丙氨酸的100mM硼酸缓冲液(pH8.5或pH9.0)500μL，20℃或25℃反应15分钟。在该反应中，野生株产生的AMP的浓度示于表8。突变株的二肽生成浓度，相对于野生株产生的二肽的比率示于表8。
(28)使用微生物菌体生产肽(Phe-Met、Leu-Met的合成)将上述培养肉汤25μL，混悬于含有10mM EDTA、25mM L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐或L-酪氨酸甲酯盐酸盐、和50mM L-蛋氨酸的100mM硼酸缓冲液(pH8.5或pH9.0)500μL，25℃反应15分钟。在该反应中，野生株产生的Phe-Met或Leu-Met的浓度示于表8。各种突变株的二肽生成浓度，相对于野生株产生的二肽的比率示于表8。
表8

*在以野生株的二肽生成浓度为”1”的情况下，不同突变株的二肽生成浓度比率(实施例7)构建随机筛选突变位点组合株为构建组合有各种突变的菌株，将pSF_Sm_Aet用作采用了PCR的定点诱变法的模板。
使用Stratagene公司(美国)的“QuikChange Multi”，依照生产厂家的操作说明，使用对应于各种突变型酶的引物(序列99～120)，导入突变。使用的引物被事先用宝酒造公司生产的T4多核苷酸激酶将其5’-末端磷酸化。引物的磷酸化条件如下将100μmol DNA(引物)和T4多核苷酸激酶10个单位，添加到含有ATP 0.5mM、氯化镁10mM和DTT5mM的50mM Tris盐缓冲液(pH8.0)20μL中，37℃保温30分钟后，70℃加热5分钟，进行磷酸化。
PCR的反应条件如下将ds DNA(pSF_Sm_Aet质粒)模板50ng、作为引物的上述5’磷酸化后的Mutagenic寡核苷酸各50或100ng(组合引物在小于等于3种的情况下，在反应体系中添加100ng；在大于等于4种的情况下，添加50ng)，和Quik solution 0.375μL和Quik changeMulti酶混合物1.25个单位，添加到含有dNTP Mix 0.5μL的Quikchange Multi反应缓冲液12.5μL中，重复30次下述循环95℃、1分钟，53.5℃、1分钟，65℃、10分钟。
在PCR产物中(总量12.5μL)中，添加DpnI 5个单位，于37℃处理1小时，用2μL该反应液转化大肠杆菌JM109株。将转化后的菌体平铺于含有100μg/mL的氨苄青霉素的LB培养基，得到氨苄青霉素耐受性菌株，即，随机组合株文库。
(30)从组合突变文库筛选将导入有分别含有各突变型Aet基因的质粒(pSF_Sm_AetM)的大肠杆菌JM109菌株和导入有含有野生型Aet的质粒的大肠杆菌JM109菌株，接种于含有100μg/L氨苄青霉素的培养基150μL(分装于96孔板)，25℃振荡培养16小时。使用TITEC公司的生物振荡器(M/BR-1212FP)，以1000转/分的转速振荡培养。用得到的培养液进行筛选来挑选。
(31)初筛在得到的培养液5μL中，添加含有10mM苯酚、6mM AP、5mM天冬氨酸二甲酯、7.5mM苯丙氨酸、3.6U/ml过氧化物酶、0.16U/ml醇氧化酶、10mM EDTA和100mM硼酸盐的反应液(pH8.2)200μL，25℃反应约20分钟。反应后，测定500nm的吸光度，计算甲醇的释放量。此处，挑选出甲醇释放量大的，作为APM生成活性高的酶。
(12)复筛将上述方法中初筛挑选得到的菌株，采用实施例6(25)所述的方法，进行培养，将该培养肉汤10μL或50μL混悬于含有10mM EDTA和50mM天冬氨酸二甲酯和75mM苯丙氨酸的100mM硼酸缓冲液(pH8.5)1mL，于20℃或25℃反应10分钟，测定AMP产量，挑选出产量高的菌株。通过排序，表示挑选出的菌株的突变位点的组合。获得的菌株和为获得其使用的引物的组合示于表9。
表9

(33)使用微生物菌体生产肽对上述得到的组合株进行评价。将上述培养肉汤25μL，混悬于含有10mM EDTA、50mM天冬氨酸二甲酯和75mM苯丙氨酸的100mM硼酸缓冲液(pH8.5)500μL，25℃反应15分钟。在该反应中，野生株产生的AMP的浓度示于表10。在以野生株的比活性为1的情况下，各突变株的二肽产生的二肽的比活性，相对于野生株产生的二肽的比率示于表10。
表10                        20℃

(实施例8)底物特性的研究(34)用突变型酶研究底物特性使用各种L-氨基酸甲酯作为羧基成分，L-蛋氨酸作为氨基成分，研究肽的产生情况。将以实施例6(25)所述的方法培养得到的培养肉汤25μL，加入到含有表11所示25mM L-氨基酸甲酯盐酸盐(X-OMe·HCl)、50mM L-蛋氨酸和10mM EDTA的硼酸缓冲液(pH8.5)500μL，于25℃反应15分钟、3个小时。该反应中，野生株在反应中生产的各种肽的产量示于表11-1和表11-2。表中以“+”表示的二肽的产量是，在假定HPLC面积值8000为1时，估计的峰的参考值。各突变株中二肽的产生浓度，相对于野生株的二肽的比率示于表11-1和表11-2。
表11-1

*在以野生株的二肽生成浓度为”1”的情况下，不同突变株的二肽生成浓度比率表11-2(接于表11-1)   +    ++    ++

*在以野生株的二肽生成浓度为”1”的情况下，不同突变株的二肽生成浓度比率
(实施例9)随即筛选(35)自pTrpT_Sm_Aet随机文库筛选依照与实施例3(9)相同的方法培养实施例3(8)中制备的文库。利用所述培养基进行两种类型的筛选。
(36)初筛A在得到的菌液5μL中，添加含有10mM苯酚、6mM AP、5mM天冬氨酸二甲酯、5mM Ala-OEt、7.5mM苯丙氨酸、3.6U/ml过氧化物酶、0.16U/ml醇氧化酶、10mM EDTA和100mM硼酸盐的反应液(pH8.2)200μL，25℃反应约20分钟后，测定500nm的吸光度，计算甲醇的释放量。此处，挑选出甲醇释放量大的，作为APM生成活性比Ala-Phe高的酶。
(37)初筛B同样地，在得到的菌液5μL中，添加含有10mM苯酚、6mM AP、5mM天冬氨酸二甲酯、7.5mM A(M)、3.6U/ml过氧化物酶、0.16U/ml醇氧化酶、10mM EDTA和100mM硼酸盐的反应液(pH8.2)200μL，25℃反应约20分钟后，测定500nm的吸光度，计算甲醇的释放量。此处，挑选出甲醇释放量小的，作为不易合成AM(AM)的酶。
(38)复筛将实施例9(36)和(37)挑选得到的菌株，采用和实施例6(25)相同的方法，进行培养，将该培养肉汤50μL，混悬于含有10mM EDTA和50mM天冬氨酸二甲酯和75mM苯丙氨酸的100mM硼酸缓冲液(pH8.5)1mL，于20℃反应10分钟，测定AMP和Ala-Phe的产量，挑选出反应初速度快的菌株。此外，将以同样方法培养的培养肉汤50μL，混悬于含有10mM EDTA和50mM天冬氨酸二甲酯和75mM苯丙氨酸的100mM硼酸缓冲液(pH9.0)1mL，于20℃反应10分钟，测定AMP产量，挑选出高产菌株。挑选出突变型21作为有效突变位点。
(实施例10)通过将表示的突变位点导入pSF，对该突变位点进行评估(39)将突变导入V184将实施例9得到的突变位点V184A导入pSF_Sm_Aet。此外，将其导入已构建的pSF_Sm_M35-4。此外，构建V184被取代成其他氨基酸的V184X株。突变导入方法和(2)相同，用pSF_Sm_Aet或pSF_Sm_M35-4作为模板，采用对应于各种突变型酶的引物(序列79～98)，导入突变。得到的菌株用实施例6(25)所述的方法培养。
(40)使用微生物菌体，生产肽(AMP的合成)将以实施例6(24)所述的方法培养得到的培养肉汤25μL，混悬于含有10mM EDTA、50mM天冬氨酸二甲酯和75mM苯丙氨酸的100mM硼酸缓冲液(pH8.5或pH9.0)500μL，20℃反应10分钟。在该反应中，野生株产生的AMP的浓度示于表12。突变株的二肽生成浓度，相对于野生株产生的二肽的比率示于表12。
表12

*在以野生株的二肽生成浓度为”1”的情况下，不同突变株的二肽生成浓度比率(41)使用微生物菌体，生产肽(AMP的合成)将以实施例6(25)所述的方法培养得到的培养肉汤，混悬于含有10mM EDTA、50mM天冬氨酸二甲酯和75mM苯丙氨酸的100mM硼酸缓冲液(pH8.5或pH9.0)(2.2U/mL反应液)，于20℃进行反应。在该反应中，野生株和各种突变株产生的AMP的收率示于表13。
表13

(实施例11)突变型酶的性质的变化(42)酶的pH稳定性将酶在特定pH孵育一定时间后，进行由L-天冬氨酸二甲酯和L-苯丙氨酸合成AMP的反应，探讨pH稳定性。将以实施例6(25)所述的方法培养得到的培养肉汤10μL和各pH(8.5、9.0、9.5)(对于M9-9、M12-1，也测试了8.0)的缓冲液190μL于20℃混合，孵育30分钟后，添加到含有75mM L-天冬氨酸二甲酯、112.5mM L-苯丙氨酸和15mM EDTA的450mM硼酸缓冲液(pH8.5)400μL中，20℃反应20分钟，生成的AMP的浓度示于图1。
(43)酶的最适反应温度探讨由L-天冬氨酸二甲酯盐酸盐和L-苯丙氨酸合成AMP的反应中，反应温度的影响。将以实施例6(25)所述的方法培养得到的培养肉汤20μL，添加到含有50mM L-天冬氨酸二甲酯、75mM L-苯丙氨酸和10mM EDTA的100mM硼酸缓冲液(pH8.5)980μL中，于各温度(20、25、30、35、40、45、50、55、60℃)反应5分钟，生成的AMP浓度示于图2。结果发现，本酶的最适温度是，248535℃，M9-945℃，M12-150℃。
(44)酶的温度稳定性将酶于特定温度孵育一定时间后，进行由L-天冬氨酸二甲酯和L-苯丙氨酸合成AMP的反应，探讨温度稳定性。将以实施例6(25)所述的方法培养得到的培养肉汤20μL于各温度(35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃)孵育30分钟后，添加到含有50mM L-天冬氨酸二甲酯、100mM L-苯丙氨酸和10mM EDTA的100mM硼酸缓冲液(pH8.5)980μL中，20℃反应5分钟，生成的AMP的浓度示于图3。
(生成物分析)上述实施例中，生成物用下述高速液相色谱法定量。柱InertsiLODS-3(GL科学公司生产)；洗脱液i)含有5.0mM 1-辛烷磺酸钠的磷酸水溶液(pH2.1)∶甲醇＝100∶15～50，ii)含有5.0mM 1-辛烷磺酸钠的磷酸水溶液(pH2.1)∶乙腈＝100∶15～30；流速1.0mL/分；检测210nm。
(参考例1制备pEAP130质粒-产气肠杆菌来源的酸性磷酸酶基因的启动子序列的修饰)采用Journal of Bioscience and Bioengineering(2001)Vo1.92，No.1，50-54(或特开平10-201481号公报)所述的方法，从产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)来源的IFO 12010菌株的染色体DNA，用限制性酶SalI和限制性酶KpnI，剪切出包含酸性磷酸酶基因区域的1.6kbp的DNA片段，将其连接于pUC118，构建质粒DNA，将其命名为pEAP120。pEAP120是重组有编码酸性磷酸酶的启动子和信号肽的碱基序列的质粒。此外，以IFO编号表示的菌株，保藏于财团法人发酵研究所(日本国大阪府大阪市淀川区十三本町2丁目17-85，由于自平成14年6月30日以后，该研究所的业务移交给独立行政法人制品评价技术基础机构(NITE)生物技术本部(DOB)生物遗传资源部门(NBRC)，参照上述IFO编号，可从NBRC获取该菌株。
接着，对本基因上游的启动子序列进行部分修饰，测试活性是否增强。用QuikChange site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司生产)，导入定点突变，将假定的酸性磷酸酶基因的启动子序列-10区域的AAAAAT替换成TATAAT。合成用于导入突变的PCR用寡核苷酸引物EM1(5’-CTT ACA GAT GAC TAT AAT GTG ACT AAAAACSEQ ID NO125)和EMR1(5’-GTT TTT AGT CAC ATT ATAGTC ATC TGT AAGSEQ ID NO126)。依据说明书中的方法，以pEAP120为模板，导入突变。用荧光染料链终止测序试剂盒(DNASequencing kit Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction)(PERKIN ELMER公司生产)，通过荧光染料链终止法(DyeTerminator)，用ABI310遗传分析仪确定碱基序列，确认导入有目的基因的质粒，将其命名为pEAP130质粒。pEAP130是具有编码酸性磷酸酶N末端区域来源的信号肽的碱基序列，和经过修饰的启动子的质粒。
(实施例12)使用pSFN载体，构建合理突变株(45)构建pSFN_Sm_Aet株为构建可通过限制性酶处理剪切出Aet酶基因部分的质粒pSFN_Sm_Aet，使用pSF_Sm_Aet(实施例6)作为采用了PCR的定点诱变法的模板。使用Stratagene公司(美国)的“QuikChange定点突变试剂盒(Quik change Site-Directed Mutagenesis Kit)”，依照生产厂家的操作说明，使用各种引物，导入突变。首先，通过以SEQ IDNO127、128所示寡核苷酸为引物，导入突变，替换pSF_Sm_Aet质粒上第4587位碱基(a→g)，缺失NdeI位点。接着，通过以SEQ IDNO129、130所示寡核苷酸为引物，导入突变，替换pSF_Sm_Aet质粒上第2363位碱基(tag→atg)，导入NdeI位点。用PCR反应生成物转化大肠杆菌JM109，以氨苄青霉素耐受性为指标，挑选出目的质粒，即具有pSFN_Sm_Aet的菌株。
(46)导入pKF_Sm_Aet合理突变为构建突变型Aet，使用pKF_Sm_Aet质粒(实施例2(1))作为使用了ODA法的定点诱变法的模板。采用和实施例2(2)相同的方法，用对应于各种突变型酶的引物(SEQ ID NO131～137)，导入突变，挑选出具有包含突变型Aet基因的目的质粒pKF_Sm_AetM的菌株。
(47)导入进pSFN_Sm_Aet以包含突变型Aet基因的质粒pKF_Sm_AetM为模板，SEQ IDNO129、122所示寡核苷酸为引物，通过PCR，扩增目的基因。以NdeI/PstI处理该DNA片段，将得到的DNA片段和经过NdeI/PstI处理的pSFN_Sm_Aet连接。以该含有连接产物的溶液转化大肠杆菌JM109，以氨苄青霉素为指标，挑选出具有目的质粒的菌株。将得到的菌株和以往构建的菌株，用实施例6(25)所述的方法培养。
(48)使用微生物菌体生产肽(X-Met的合成)将(47)得到的培养肉汤40μL，混悬于含有10mM EDTA、50mM各种氨基酸甲酯和100mM蛋氨酸的100mM硼酸缓冲液(pH8.5或9.0)400μL中，于20℃反应1小时。该反应中，野生株生产的各种二肽的浓度示于表14。此外，各种突变型酶表达株(以下，称为突变株)的二肽生成浓度，相对于野生株的二肽的比率示于表14。
表14

*在以野生株的二肽生成浓度为”1”的情况下，不同突变株的二肽生成浓度比率(实施例13)各种合理突变株的底物特性研究(49)使用微生物菌体生产二肽(Ala-X的合成)探讨使用丙氨酸甲酯为羧基成分、L-氨基酸为胺成分时，二肽的生产情况。突变型酶，使用实施例7(32)、实施例10(39)、实施例12(47)制备的突变株。将以实施例6(25)所述的方法培养得到的培养肉汤20μL，添加到含有50mM丙氨酸甲酯盐酸盐(Ala-OMe·HCl)、100mM L-氨基酸和10mM EDTA的硼酸缓冲液(pH8.5)400μL，于20℃进行反应。该反应中，野生株生产的各种二肽的浓度(mM)示于表15。此外，各种突变株的二肽生成浓度，相对于野生株的二肽的比率示于表15。此外，表15中，Ala-Gly和Ala-Thr的测定结果是反应时间为10分钟时得到的结果，其他二肽的反应时间为15分钟。
表15

*在以野生株的二肽生成浓度为”1”的情况下，不同突变株的二肽生成浓度比率
(50)使用微生物菌体生产二肽(Ala-X的合成)将实施例12(47)得到的培养肉汤20μL，混悬于含有100mMEDTA、50mM丙氨酸甲酯和100mM L-氨基酸的100mM硼酸缓冲液(pH8.5)400μL，20℃反应15分钟。该反应中，野生株生产的各种二肽的浓度(mM/O.D.)示于表16。此外，各种突变株的二肽生成浓度，相对于野生株的二肽的比率示于表16。
表16

*在以野生株的二肽生成浓度为”1”的情况下，不同突变株的二肽生成浓度比率
(实施例14)构建通过突变组合得到的高活性株A(51)构建导入有pSF_Sm_Aet合理突变的菌株为构建突变型Aet，使用pSF_Sm_Aet作为定点诱变法的模板。采用和实施例12(45)相同的方法，使用对应于各种突变型酶的引物(SEQID NO138～157，160～167)，导入突变。用PCR反应生成物转化大肠杆菌JM109，以氨苄青霉素耐受性为指标，挑选出具有目的质粒的菌株。得到的菌株和以往构建的菌株(实施例10(39))，以实施例6(25)所述的方法培养。
(52)使用微生物菌体生产肽(Ala-X的合成)将(51)得到的培养肉汤20μL，混悬于含有50mM L-丙氨酸甲酯盐酸盐(Ala-OMe·HCl)、100mM L-氨基酸和10mM EDTA的硼酸缓冲液(pH8.5)400μL中，于20℃反应15分钟。该反应中，野生株生产的各种二肽(Ala-X)的浓度(mM/O.D.)示于表17。此外，各种突变株的二肽生成浓度，相对于野生株的二肽的比率示于表17。
表17

*在以野生株的二肽生成浓度为”1”的情况下，不同突变株的二肽生成浓度比率
(53)使用微生物菌体生产肽(Ala-X的合成)将(52)中显示效果的突变点V184A和V184P导入pSF_Sm_M7-35。此外，将V257Y导入pSF_Sm_M7-35和pSF_Sm_V184A。采用和(45)相同的方法，以pSF_Sm_M7-35或pSF_Sm_V184A为模板，使用对应于各种突变型酶的引物(序列79、80、93、94、156、157)，导入突变。得到的菌株，采用实施例6(25)所述的方法培养。
(54)使用微生物菌体生产肽(Ala-X的合成)将实施例8(34)表11和实施例13(50)表16中显示效果的突变位点W187A、F211A、Q441E、Q441K、N442D导入以往构建的pSF_Sm_M7-35。此外，构建pSF_Sm_V184A/W187A、V184A/N442D、V184A/N442D/L439V二重取代体、三重取代体。进而，F207V导入pSF_Sm_M7-35/V184A，构建突变株。采用和实施例12(45)相同的方法，以pSF_Sm_M7-35或pSF_Sm_V184A、pSF_Sm_M7-35/V184A为模板，使用对应于各种突变型酶的引物(SEQ ID NO131、158、134、159、14、170、168、169等)，导入突变。得到的菌株和以往构建的菌株，采用实施例6(25)所述的方法培养。
(55)使用微生物菌体生产肽(Ala-X的合成)将(53)、(54)得到的培养肉汤20μL，混悬于含有50mM L-丙氨酸甲酯盐酸盐(Ala-OMe·HCl)、100mM L-氨基酸和10mM EDTA的硼酸缓冲液(pH8.5)400μL中，于20℃反应15分钟。该反应中，野生株生产的各种二肽(Ala-X)的浓度(mM/O.D.)示于表18。此外，各种突变株的二肽生成浓度，相对于野生株的二肽的比率示于表18。
表18

*在以野生株的二肽生成浓度为”1”的情况下，不同突变株的二肽生成浓度比率
(56)使用微生物菌体生产肽(Ala-X的合成)将实施例14(49)中显示效果的突变位点K83A、W187A、F211A、N442D导入pSF_Sm_M35-4/V184A。此外，将突变位点N442D导入pSF_Sm_V184P，构建二重取代体。采用和(45)相同的方法，以pSF_Sm_M35-4/V184A或pSF_Sm_V184P为模板，使用对应于各种突变型酶的引物，导入突变。得到的菌株，采用实施例6(25)所述的方法培养。
(57)使用微生物菌体生产肽(Ala-X的合成)将(56)得到的培养肉汤20μL，混悬于含有50mM L-丙氨酸甲酯盐酸盐(Ala-OMe·HCl)、100mM L-氨基酸和10mM EDTA的硼酸缓冲液(pH8.5)4000μL中，于20℃反应15分钟。该反应中，野生株生产的各种二肽(Ala-X)的浓度(mM)示于表19。此外，各种突变株的二肽生成浓度，相对于野生株的二肽的比率示于表19。
表19

*在以野生株的二肽生成浓度(mM)为”1”的情况下，不同突变株的二肽生成浓度比率※M35-4/V184A内的Q441E突变，是由E返回到Q的突变株。
(实施例15)随机筛选(58)制备pTrpT_Sm_Aet随机文库为构建突变型Aet，使用pTrpT_Sm_Aet或pSF_Sm_M35-4/V184A质粒作为使用了Error prone PCR法的随机突变诱导法的模板。突变导入文库，采用和实施例3(8)相同的方法制备。
(59)从pSFN_Sm_Aet随机文库筛选采用和实施例3(9)相同的方法，培养(58)制备的文库，将得到的培养液，进行选自下述初筛(A)～(C)之中的2种筛选(A/B或A/C)，进行挑选。
(60)初筛A在得到的菌液5μL中，添加含有10mM苯酚、6mM AP、5mM天冬氨酸二甲酯、5mM丙氨酸乙酯、7.SmM苯丙氨酸、3.6U/ml过氧化物酶、0.16U/ml醇氧化酶、10mM EDTA和100mM硼酸盐的反应液(pH8.2)200μL，25℃反应约20分钟后，测定500nm的吸光度，计算甲醇的释放量。此处，挑选出甲醇释放量大的，作为APM生成活性比Ala-Phe高的酶。
(61)初筛B和(60)一样，在得到的菌液5μL中，添加含有10mM苯酚、6mMAP、5mM天冬氨酸二甲酯、5mM A(M)、3.6U/ml过氧化物酶、0.16U/ml醇氧化酶、10mM EDTA和100mM硼酸盐的反应液(pH8.2)200μL，25℃反应约20分钟后，测定500nm的吸光度，计算甲醇的释放量。此处，挑选出甲醇释放量小的，作为不易合成AM(AM)的酶。
(62)初筛C和(61)一样，在得到的菌液5μL中，添加含有10mM苯酚、6mMAP、5mM天冬氨酸二甲酯、3.6U/ml过氧化物酶、0.16U/ml醇氧化酶、10mM EDTA和100mM硼酸盐的反应液(pH8.2)200μL，25℃反应约20分钟后，测定500nm的吸光度，计算甲醇的释放量。此处，挑选出甲醇释放量小的，作为不易分解天冬氨酸二甲酯(Asp(oMe)2)的酶。
(63)复筛将(60)、(61)和(62)中挑选出的菌株，用和实施例6(25)一样的方法培养，将得到的培养肉汤50μL，混悬于含有10mM EDTA、50mM天冬氨酸二甲酯、50mM丙氨酸甲酯和75mM苯丙氨酸的100mM硼酸缓冲液(pH8.5)1mL，于20℃C反应10分钟，测定AMP、Ala-Phe产生量，挑选出反应初速度快的菌株。
此外，将同样培养的培养肉汤混悬于含有10mM EDTA、50mM天冬氨酸二甲酯和75mM苯丙氨酸的100mM硼酸缓冲液(pH9.0)(2.2U/mL反应液)，于20℃进行反应，测定AMP的生成收率，对收率提高的菌株，进行突变位点分析，表示以下突变位点。从以pTrpT_Sm_Aet为模板的文库，获得具有突变型21、22、23(P214T、Q202E、Y494F)的突变株，从以pSF_Sm_M35-4/V184A为模板的文库，获得具有突变型345、346、347、350、351、352、343、354、348、349、353(针对M35-4/V184A，分别组合入A182G、K314R、A515V、K484I、V213A、A245S、V178G、L263M、L66F、S315R、P214H等各突变)的突变株。该反应中，各突变株在反应开始后20分钟、40分钟和70分钟后的AMP收率示于表20-1和表20-2。此外，M35-4/V184A有时表示成“A1”。
表20-1

表20-2

(实施例16)构建随机突变株(64)将突变导入A182、P183、T185鉴于具有V184A突变的菌株的收率提高，因而，构建在184位点附近具有突变的菌株。采用和(45)相同的方法，以pS_Sm_M35-4/V184A为模板，使用对应于各种突变型酶的引物(SEQ ID NO171～192)，导入突变。
(65)使用微生物菌体生产肽(AMP的合成)采用实施例6(25)所述的方法，培养实施例15(63)和上述(64)得到的菌株。将培养肉汤混悬于含有400mM天冬氨酸二甲酯盐酸盐和600mM苯丙氨酸的100mM硼酸缓冲液(pH8.5)(10U/mL反应液)，用氢氧化钠维持pH在8.5，于25℃进行反应，测定反应开始后20分钟、40分钟、80分钟后AMP的生成收率。
表21

(66)使用微生物菌体生产肽(Ala-X的合成)将实施例15(63)和上述(64)得到的菌株，以实施例6(25)所述的方法培养。将培养肉汤20μL，添加到含有50mM丙氨酸甲酯盐酸盐(Ala-OMe·HCl)、100mM L-氨基酸和10mM EDTA的硼酸缓冲液(pH8.5)400μL，于20℃反应15分钟。该反应中，pSF_Sm_M35-4/V184A生产的二肽(Ala-X)的浓度(mM)示于表22。此外，各种突变株的二肽生成浓度，相对于pSF_Sm_M35-4/V184A的二肽的比率示于表22。
表22

*在以M35-4/V184A酶的二肽生成浓度(mM)为”1”的情况下，不同突变株的二肽生成浓度比率(实施例17)通过突变组合，构建高活性株B(67)构建组合突变株将和M35-4/V184A(A1)组合时显示效果的突变位点T185F、A182G导入pSF_Sm_M35-4/V184A、pSF_Sm_M7-35/V184A、pSF_Sm_M35-4/V184A/N442D。采用和(45)相同的方法，使用对应于各种突变型酶的引物(SEQ ID NO185、186、193、194、199、200)，导入突变。得到的菌株以实施例6(25)所述的方法培养。
(68)使用微生物菌体生产肽(Ala-X的合成)将(67)得到的培养肉汤20μL，添加到含有50mM丙氨酸甲酯盐酸盐(Ala-OMe·HCl)、100mM L-氨基酸和10mM EDTA的硼酸缓冲液(pH8.5)400μL，于20℃反应15分钟。该反应中，野生株生产的二肽(Ala-X)的浓度(mM)示于表23。此外，各种突变株的二肽生成浓度，相对于野生株的二肽的比率示于表23。
表23

*在以野生株的二肽生成浓度(mM)为”1”的情况下，不同突变株的二肽生成浓度比率※M35-4+V184A内的Q441E突变，是由E返回到Q的突变株。
(69)底物增加时生产的二肽(Ala-X的合成)以实施例6(25)所示方法培养pSF_Sm_Aet、pSF_Sm_M35-4/V184A、pS_Sm_M7-35/V184A/A182G。将培养肉汤5μL或20μL添加到含有50mM丙氨酸甲酯盐酸盐(Ala-OMe·HCl)、100mM～400mML-氨基酸和10mM EDTA的硼酸缓冲液(pH8.5)400μL，于20℃反应1小时。该反应中生成的二肽(Ala-X)的浓度(mM)示于表24。
表24

(实施例18)底物特性的研究(70)使用各种突变型酶生产各种二肽使用各种L-氨基酸甲酯作为羧基成分，L-氨基酸作为氨基成分，研究肽的产生情况。将以实施例6(25)所述的方法培养得到的培养肉汤20μL或40μL，加入到含有表25所示50mM L-氨基酸甲酯盐酸盐(X-OMe·HCl)、100mM L-氨基酸和10mM EDTA的硼酸缓冲液(pH8.5或pH9.0)400μL，于20℃反应进行。该反应中生产的各种二肽的产量示于表25。酶使用pSF_Sm_Aet、pSF_Sm_M12-1(实施例7(32))、pSF_Sm_M35-4/V184A(实施例10(39))，Val-Met、Met-Met生成反应中，也使用pSF_Sm_F207V(实施例6(24))pSF_Sm_M35-4/V184A/F207V。
表25

                          *1；F207V                          *2；M35-4/V184A/F207V                          *3；Asp(OMe)2(实施例19)Arg-Gln的生产(71)使用微生物菌体生产肽(Arg-Gln的合成)采用实施例6(25)所述的方法，培养pSF_Sm_Aet和pSF_Sm_M35-4/V184A。将培养肉汤1mL，混悬于含有10mM EDTA、100mM或200mM天冬氨酸甲酯、150～300mM谷氨酰胺的100mM硼酸缓冲液(pH9.0)9mL中，20℃反应3小时。由于pH会随着反应的进行而降低，因此，用25％氢氧化钠溶液将pH维持在9.0，进行反应。该反应生成的Arg-Gln浓度和收率示于表26。
表26

反应时间180分钟(实施例20)使用纯化酶生产肽(72)酶的纯化于LB平板上活化(refresh)野生株、pSF_Sm_M35-4/V184A和pS_Sm_M7-35/V184A/A182G菌株，取1铂金环接种于极端培养肉汤50mL，25℃培养18小时。从培养液收集菌体后，混悬于100mM KPB(pH6.5)，Sonicator超声波破碎仪破碎(180W/30分钟)。回收液体，4℃、200,000g超离心20分钟，将上清作为可溶性部分。在没有特别指明的情况下，以下操作均是在4℃或冰上进行。此外，下述柱分离操作，使用的是AKTAe xplorer100。
将得到的可溶性部分，用预先以100mM KPB(pH6.5)平衡后的CHT5-I(5mL、10×64mm)，用100mM KPB缓冲液以1mL钟的流速洗脱非吸附性蛋白质后，用25倍于柱容量的100～500mM KPB缓冲液，以线性浓度梯度洗脱被吸附的蛋白质。
将经羟基磷灰石色谱分离得到的可溶性部分调整为硫酸铵终浓度为2M后，用预先以100mM KPB(pH6.5)、2M硫酸铵平衡后的Hic-resourse-Phe(1mL)，以1mL/分钟的流速洗脱非吸附性蛋白质后，用60倍于柱容量的含有2M～0M硫酸铵的KPB缓冲液，以线性浓度梯度洗脱被吸附的蛋白质。
将经疏水色谱分离后的部分，用预先以20mM Hepes(pH6.5)、500mM氯化钠平衡后的HiLoad 16/60 Supderdex-200pg(柱体积120mL、16mm×600mm)，以0.75mL/分钟的流速洗脱蛋白质，回收活性部分。将活性部分浓缩后，用20mM Hepes(pH6.5)透析。以下所示Unit表示的是Ala-Gln生成反应时的Unit。
(73)使用纯化酶生产肽(HIL-Phe的合成)将pSF_Sm_M35-4/V184A纯化酶0.84或4.2U(1或5μL)，添加到含有50mM的内酯化的HIL((2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酸)、100mM苯丙氨酸和10mM EDTA的硼酸缓冲液(pH9.0)150μL中，20℃反应1小时。该反应中生成的HIL-Phe的浓度示于表27。
表27

(74)使用纯化酶生产肽(Gly-Ser(tBu)的合成)将pSF_Sm_M35-4/V184A纯化酶0.84或4.2U(1或5μL)，添加到含有50mM Gly-OMe、100mM Ser(tBu)和10mM EDTA的硼酸缓冲液(pH8.5)150μL中，于20℃进行反应。该反应中生成的Gly-SeF(tBu)以Gly-Ser换算后的浓度示于表28。
表28

(75)使用纯化酶生产三肽(Ala-X-X的合成)将pSF-Sm_M35-4/V184A或pSF_Sm_M35-4/V184A/A182G纯化酶0.84或4.2U(1或5μL)，添加到含有50mM Ala-OMe、100mM X-X和10mM EDTA的硼酸缓冲液(pH9.0)150μL中，于20℃进行反应。该反应中生成的三肽(Ala-X-X)的浓度示于表29。
表29

(76)使用纯化酶生产三肽将pSF_Sm_M35-4/V184A纯化酶0.84或4.2U(1或5μL)，添加到含有50mM Ala-OMe、50mM X-X和10mM EDTA的硼酸缓冲液(pH9.0)150μL中，于20℃进行反应。该反应中生成的三肽的浓度示于表30。
表30

底物50mM×OMe+50mM XX
(77)使用纯化酶生产肽(Ala-X-X的合成)将pSF_Sm_M35-4/V184A纯化酶0.84或4.2U(1或5μL)，添加到含有100mM Ala-OMe、100mM X-X和10mM EDTA的硼酸缓冲液(pH9.0)150μL中，于20℃进行反应。该反应中生成的三肽的浓度示于表31。
表31

底物100mM AlaOMe+100mM XX(78)使用纯化酶生产四肽(GGFM的合成)将pSF_Sm_M35-4/V184A纯化酶4.2U(5μL)，添加到含有100mMGly-OMe、40mM GFM和10mM EDTA的硼酸缓冲液(pH9.0)150μL中，于20℃进行反应。该反应中生成的四肽(GGFM)的浓度示于表32。
表32

(79)使用纯化酶生产五肽(Met-Enkephalin的合成)将pSF_Sm_M35-4/V184A纯化酶4.2U(5μL)，添加到含有50mMTyr-OMe、5mM GGFM和10mM EDTA的硼酸缓冲液(pH8.5)150μL中，于20℃进行反应。该反应中生成的五肽(YGGFM)的浓度示于表33。
表33

(实施例21)X射线晶体结构分析(1)培养1L高表达具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的大肠杆菌(E.coli)JM109株，从其菌体，以下述顺序纯化上述蛋白质。
(1-1)羟基磷灰石色谱将上述菌体在“100mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)”(缓冲液A)中破碎后，将可溶性部分100mL，用预先以缓冲液A平衡后的羟基磷灰石柱Bio-Scale CHT-1(BioRad生产，CV＝5mL)吸附于载体。用100mM～500mM的线性浓度的磷酸钾缓冲液(25CV)，洗脱被吸附的蛋白质。在280nm吸光度处检测蛋白质的峰，收集该部分。
(1-2)水性色谱将(1-1)中分馏得到的部分，和5倍体积的“添加有2M硫酸铵的100mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)”(缓冲液B)混合。将该溶液，用经缓冲液B平衡后的  水性色谱柱RESOURCE PHE(Amersham生产，CV＝1mL)吸附目的蛋白质于载体。接着，用2M～0M的不断减少的线性浓度的磷酸钾溶液(60CV)，洗脱被吸附的蛋白质，收集该部分。
(1-3)阳离子交换色谱Resource S将(1-2)中分馏得到的部分，用“20mM醋酸钠缓冲液(pH5.0)”(缓冲液C)，透析一夜。将该溶液装于经缓冲液C平衡后的阳离子交换色谱柱RESOURCE S(Amersham生产，CV＝1mL)。用0mM～500mM的线性浓度的氯化钠溶液(50CV)，洗脱被吸附的蛋白质。在280nm吸光度处检测蛋白质的峰，收集该部分。
将纯化各阶段得到的部分通过SDS-PAGE确认后发现，(1-3)之后得到的纯化蛋白质为位于约70kDa处的经CBB染色几乎为单个的条带。将获得的蛋白质溶液，用20mM HEPES缓冲液(pH7.0)于4℃透析一夜。通过上述操作，获得约30mg的纯化蛋白质。
(2)具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的结晶化将(1)得到的纯化蛋白质溶液，用超过滤器AmiconUltra(Millipore生产，截留分子量10kDa)，于4℃浓缩至40mg/mL左右。针对得到的浓缩蛋白质溶液，通过变化蛋白质浓度、沉淀剂、pH、温度、添加剂等各种参数，探索结晶化条件。其结果是，通过气相扩散悬滴法(hanging drop vapor diffusion method)，在将混合有1μL蛋白质溶液和1μL含有0.2％的辛基-β-D-葡萄糖苷的沉淀剂溶液的悬滴和含有12～18％PEG6000、0.1M tris-HCl(pH8.0)的沉淀剂溶液，于20℃平衡化1周左右，获得长成0.2mm×0.2mm×0.2mm的六角柱结晶。
(3)具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的X射线结构分析由于蛋白质的结晶在常温测定时，X射线会损伤结晶，致使分辨率逐渐下降，因而，在低温条件下测定X射线衍射强度。将晶体转移入含有20％丙三醇、20％PEG6000、0.1M tris-HCl(pH8.0)和0.4％辛基-β-D-葡萄糖苷的溶液后，喷洒-173℃的氮气，使其快速冷却。用大学共用利用机构法人高能加速器研究机构(筑波市)发射光研究设施的设置于光束线5的ADSC公司生产的315型CCD检测仪，收集晶体的X射线衍射数据。X射线的波长设定于1.0埃，晶体到CCD检测仪的距离为450mm。对于每个成像框，以1.0°摆动角曝光20秒，采集150个成像框的数据.晶体学参数如下，空间群为P6522，晶胞常数a＝104.324埃、c＝615.931埃。当非对称单位含有2个蛋白质分子时，晶体的含有率为65％。晶体衍射到3.0埃左右。用HKL2000程序(Methods Enzymol.，第276卷，第307～326页(1997)，处理数据。在50.0～3.0埃的分辨率下，作为数据的质的指标的Rmerge值为0.106；在最外层壳层3.11～3.00埃的分辨率下，Rmerge值为0.450.在50.0～3.0埃的分辨率下，数据的完整度为97.2％；在最外层壳层3.11～3.00埃的分辨率下，数据的完整度为81.1％。
通过分子置换法，进行结构分析。使用蛋白质结构分析程序包CCP4(Acta Crystallogr.Sect.D，第50卷，第760～763页(1994))中所含的分子置换法用程序AMORE(Acta Crystallogr.Sect.A，第50卷，第157～163页(1994))。使用α-氨基酸酯水解酶的S205A突变体(蛋白质数据库中的录入号1NX9)作为参照结构。α-氨基酸酯水解酶为四聚体结构，而具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质为二聚体结构。在以α-氨基酸酯水解酶的单体结构为模型的情况下，并不能有效解决问题。可从α-氨基酸酯水解酶四聚体，分割出3种类型的二聚体结构。于是，尝试着使用这3种二聚体，进行分子置换。其结果是，在以1NX9坐标数据中A、D分子构成的二聚体为模型的情况下，从几个观点(在第一解决方案中对比度良好、空间群间差异明显、分子间无不良接触)，问题得到有效解决。基于得到的初期相位，计算分辨率为3.0埃的电子密度图，在Accelrys公司生产的计算机图谱程序QUANTA上描绘电子密度图。通过修正该图谱上的分子模型和用Accelrys公司的CNX程序优化，进行结构分析。
(4)具有Lys残基被二甲基化还原的SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的结晶化据报道，若将蛋白质的Lys残基进行二甲基化还原，则有时可改善结晶性能(Biochemistry，第32卷，第9851～9858页(1993))。依据相同方法，用硼氢化钠、甲醛，二甲基化还原上述得到的纯化蛋白质溶液的Lys残基，用于结晶化试验。其结果是，在将混合有1μL蛋白质溶液和1μL含有0.2％的辛基-β-D-葡萄糖苷的沉淀剂溶液的悬滴和含有15％PEG6000、0.1M tris-HCl(pH8.0)的沉淀剂溶液，平衡化1周左右，获得长成0.4mm×0.2mm×0.1mm的六角柱结晶。
(5)具有Lys残基被二甲基化还原的SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的X射线晶体结构分析将晶体转移入含有20％丙三醇、20％PEG6000、0.1M tris-HCl(pH8.0)和0.4％辛基-β-D-葡萄糖苷的溶液后，喷洒-173℃的氮气，使其快速冷却。用财团法人高辉度光科学研究中心(兵库县佐用郡)的同步加速旗道辐射(Synchroton Orbit Radiation)设施Spring-8的设置于光束线24XU的Rigaku生产的R-AXIS V型成像板检测器，收集晶体的X射线衍射数据。X射线的波长设定于0.827埃，晶体到成像板检测器的距离为500mm。对于每个成像框，以1.0°摆动角曝光90秒，采集180个成像框的数据。晶体学参数如下，空间群为P21，晶胞常数a＝74.476埃、b＝213.892埃、c＝90.427埃。当非对称单位含有4个蛋白质分子时，晶体的含有率为53％。晶体衍射到3.0埃左右。用Rigaku的CrystalClear程序，处理数据。在40.0～3.0埃的分辨率下，作为数据的质的指标的Rmerge值为0.097；在最外层壳层3.11～3.00埃的分辨率下，Rmerge值为0.309。在40.0～3.0埃的分辨率下，数据的完整度为96.8％；在最外层壳层3.11～3.00埃的分辨率下，数据的完整度为95.8％。
通过分子置换法，进行结构分析。使用蛋白质结构分析程序包CCP4(Acta Crystallogr.Sect.D，第50卷，第760～763页(1994))中所含的分子置换法用程序AMORE(Acta Crystallogr.Sect.A，第50卷，第157～163页(1994))。使用α-氨基酸酯水解酶的S205A突变体(蛋白质数据库中的录入号1NX9)作为参照结构。在以α-氨基酸酯水解酶的单体结构为模型的情况下，并不能有效解决问题。可从α-氨基酸酯水解酶四聚体，分割出3种类型的二聚体结构。于是，尝试着使用这3种二聚体，进行分子置换。其结果是，和上述一样，在以1NX9坐标数据中A、D分子构成的二聚体为模型的情况下，问题获得解决。其结果表明，分子置换法取得成功，并且具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的二聚体结构也得到澄清。基于得到的初期相位，计算分辨率为3.0埃的电子密度图，在Accelrys公司生产的计算机图谱程序QUANTA上描绘电子密度图。通过修正该图谱上的分子模型和用Accelrys公司的CNX程序优化，进行结构分析。该晶体结构的原子坐标示于图4和图5。此外，图4中，第79～82号残基以深灰色表示，其他残基以浅灰色表示；图5中，α-L-天门冬氨酰基-L-苯丙氨酸-β-甲酯(例如，α-L-(β-O-甲基天门冬氨酰基)-L-苯丙氨酸(简称α-AMP)被表示成AMP(灰色，以球棒表示)，催化三联体(catalytictriad)被表示成“活性部位”(CPK表示)。
(实施例22)使用立体结构信息制备合理突变株针对SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中接近活性部位的第134号残基(黑色)，依据下述实施例22所述的方法，通过合理突变，制备修饰蛋白。
(1)基于立体结构信息的合理突变法为提高AMP产量，基于立体结构信息，在SEQ ID NO208所示的氨基酸序列(以下，以“pA1”表示)导入定点突变。具有SEQ IDNO209所示的氨基酸序列的蛋白质和具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的同源性高，例如，只进行4个替换。由此，由具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质，推测pA1表达的突变型肽合成酶(以下，以“A1”表示)的立体结构信息，预测距离活性中心催化三联体Ser158在15埃以内的134个氨基酸残基(图5的黑色部分)67～70、72～88、100、102、103、106、107、113～117、130、155～163、165、166、180～188、190～195、200～235、259、273、276、278、292～294、296、298、299、300～304、325～328、330～340、437～447为参与AMP合成的残基，在这些残基导入定点突变。各残基中取代后的氨基酸的种类示于表34-1和表34-2。
表34-1

表34-2

(2)制备各种单个突变株为制备突变型A1，使用pA1作为采用了PCR的定点诱变法的模板。使用Stratagene公司(美国)的“QuikChange定点突变试剂盒(Quikchange Site-Directed Mutagenesis Kit)”，依照生产厂家的操作说明，导入突变。为在各残基导入定点突变，使用包括位于中部的突变密码子，和距该密码子15mer以内的残基的共计33mer的引物。用于各突变位点的引物示于表46。此外，构成表46中各引物的碱基序列，也示于序列表，按照表中由上到下，正向引物和反向引物的顺序，分别对应于SEQ ID NO210～483。在各引物的序列中部的突变密码子“XXX”(SEQ ID NO210～483的碱基序列中的“nnm”部分)部位，导入对应于要取代的各种氨基酸残基的种类的密码子。即，根据希望导入的氨基酸残基的种类，使用在“XXX”部位导入有对应密码子序列的引物。对应于氨基酸残基的各密码子，如表44所示。使用PCR反应的产物，转化大肠杆菌JM109，以氨苄青霉素耐受性为指标，挑选出具有目的质粒的菌株。
(3)菌体的获得将1铂金环各突变株接种于装有2mL的极端培养基(12g/L蛋白胨、24g/L酵母提取物、2.3g/L磷酸二氢钾、12.5g/L磷酸氢二钾、4g/L丙三醇、100mg/L氨苄青霉素)的普通试管中，于25℃，以150往复/分的速度振荡培养18小时。
(4)测定各突变株中的比活性在1mL低浓度反应液(50mM天冬氨酸二甲酯、75mM苯丙氨酸)中添加50μL各突变株的培养肉汤，于20℃，反应初期pH8.5的条件下，进行反应。反应开始15分钟后，通过HPLC定量AMP的产量，计算各单个突变株的比活性(U/mL)。酶的Unit数(U)的定义如下每分钟能够产生1μmol的AMP的酶的量为1U。
(5)测定低浓度反应液中各单个突变株AMP收率首先，基于得到的比活性数据，计算各突变株为2U时所需的培养肉汤的量。接着，将计算量的培养肉汤加入到1mL低浓度反应液，于20℃，反应初期pH8.5的条件下，进行反应。反应开始25分钟、45分钟后，通过HPLC定量AMP的产量，收率比A1高的突变株示于表32-1～35-7。这些被确认是有助于AMP生成反应的重要的突变株。
表35-1

表35-2

表35-3

表35-4

表35-5

表35-6

表35-7

(6)收率提高率的计算从1137种单个突变株，获得335种收率比A1提高的突变株。收率提高率为335×1137＝0.29。此外，各残基收率提高率的结果示于表36和表37。收率提高概率在各残基间差别很大，例如，收率提高概率大于等于40％的部位有47处，大于等于30％的部位有59处，大于等于20％的部位达到71处。收率提高概率超过20％的部位，提高收率的概率可能会很高，因而，可判断其为产业上非常重要的突变位点。
表36-1

表36-2

表37-1

表37-2

(7)制备双重突变株为获得收率进一步提高的菌株，将AMP收率提高的突变位点相互组合，制备双重突变株(表37)。例如，在将收率大大提高的突变位点I157L和Y328F组合的情况下，使用用于将Y328F导入pA1/I157L的引物，通过实施例22(2)所述的方法，进行PCR和转化，以氨苄青霉素耐受性为指标，挑选出具有目的质粒的菌株。
(8)测定各双重突变株的比活性根据实施例22(4)所述的方法，计算各双重突变株的比活性(U/mL)示于表38。
(9)测定低浓度反应液中各双重突变株AMP收率首先，基于得到的比活性数据，计算各突变株为2U时所需的培养肉汤的量。接着，将计算量的培养肉汤加入到1mL低浓度反应液，于20℃，反应初期pH8.5的条件下，进行反应。反应开始25分钟、45分钟后，通过HPLC定量AMP的产量，收率比A1高的突变株示于表38。已确认，通过将2个残基的突变组合，这些突变有助于收率提高。
(10)制备多重突变株为获得收率进一步提高的菌株，将AMP收率提高的可组合的突变位点相互组合，制备多重突变株(表38)。例如，在将收率大大提高的突变位点Y81A/Y328F和I157L组合的情况下，使用用于将I157L导入pA1/Y81A/Y328F的引物，通过实施例22(2)所述的方法，进行PCR和转化，以氨苄青霉素耐受性为指标，挑选出具有目的质粒的菌株。同样地，在反应开始25分钟、45分钟后，通过HPLC定量AMP的产量，收率比A1高的突变株示于表38。已确认，通过将3个残基的突变组合，这些突变有助于收率提高。
表38-1

表38-2

表38-3

表38-4

表38-5

表38-6

表38-7

表38-8

表38-9

表38-10

表38-11

表38-12

(11)测定高浓度反应液中的各突变株AMP收率首先，基于得到的比活性数据，计算各突变株为200U时所需的培养肉汤的量。接着，将计算量的培养肉汤浓缩至5mL。将各突变株的浓缩后的培养肉汤加入到15mL高浓度反应液(400mM天冬氨酸二甲酯、600mM苯丙氨酸)，于22℃，反应初期pH8.5的条件下，进行反应。尽管随着反应的进行，pH会降低，通过添加6M氢氧化钠，将pH维持在8.5。反应开始40分钟、60分钟和80分钟后，通过HPLC定量AMP的产量，收率比A1高的突变株示于表39和表40。
表39

表40-1

表40-2

(实施例23)(F1)利用合理突变生产二肽将实施例22得到的突变株(A1、A1/I157L、A1/G161A、A1/Y328F)用实施例6(25)所述的方法培养。将培养肉汤5μL或10μL加入到含有50mM Ala-OMe·HCl、100mM L-氨基酸和10mM EDTA的硼酸缓冲液(pH9.0)200μL中，20℃反应30分钟。该反应中，反应开始后5分钟、10分钟和30分钟时生成的二肽(Ala-X)的浓度示于表41。
表41

底物50mM AIaOMe+100mM X(实施例24)通过组合构建高活性株(F2)构建随机筛选突变位点组合株为构建组合有各种突变的菌株，使用pSF_Sm_M35-1/V184A/I157L(A1/I157L)作为采用了PCR的定点诱变法的模板。
采用和实施例7(29)相同的方法，使用对应于各种突变型酶的引物(SEQ ID NO193、195～198)，导入突变，得到随机组合株文库。
(F3)从组合突变文库筛选将(F2)制备的文库，采用和实施例3(9)相同的方法培养后，用得到的培养液，实施2种筛选参考下述(F4)和(F5)，进行挑选。
(F4)初筛A在得到的菌液5μL中，添加含有10mM苯酚、6mM AP、5mM天冬氨酸二甲酯、30mM苯丙氨酸、6.12U/ml过氧化物酶、0.21U/ml醇氧化酶、10mM EDTA和100mM硼酸盐的反应液(pH8.2)200μL，25℃反应约20分钟后，测定500nm的吸光度，计算甲醇的释放量。
(F5)初筛8在得到的菌液5μL中，添加含有10mM苯酚、6mM AP、5mM天冬氨酸二甲酯、5mM Ala-OEt、30mM苯丙氨酸、6.12U/ml过氧化物酶、0.21U/ml醇氧化酶、10mM EDTA和100mM硼酸盐的反应液(pH8.2)200μL，25℃反应约20分钟后，测定500nm的吸光度，计算甲醇的释放量。
进行(F4)和(F5)，挑选出(F4)/(F5)的值比亲本菌株(A1+I157L)大的，作为合成AMP比Ala-Phe容易的酶。
(F6)复筛将以上述方法初筛挑选出的菌株，采用实施例6(25)所述的方法培养后，将该培养肉汤2U，混悬于含有10mM EDTA、50mM天冬氨酸二甲酯和75mM苯丙氨酸的100mM硼酸缓冲液(pH8.5)，使得最终体积为1mL，于20℃测定AMP产量。挑选出AMP产量高的菌株，挑选出的菌株依据顺序表示突变位点的组合，其突变位点示于表34。以后，将该挑选出的菌株表示为“F22”，F22株的AMP产量示于表42。
表42

(F7)和合理突变株组合将实施例22中显示效果的突变位点Y328F、Y81A、T210L导入F22株。采用和(45)相同的方法，使用对应于各种突变型酶的引物(SEQID NO201～206)，导入突变。得到的菌株采用实施例6(25)所述的方法培养。将得到的培养肉汤，混悬于含有400mM天冬氨酸二甲酯单甲基硫酸盐、400mM苯丙氨酸的溶液中(18U/mL反应液)，用氢氧化铵维持pH在8.5，于22℃进行反应，测定AMP生产收率。该反应中AMP收率示于表43。
表43


(简称一览表)Asp(OMe)2·HClL-天冬氨酸-α，β-二甲酯盐酸盐Ala-OEtL-丙氨酸乙酯Ala-OMeL-丙氨酸乙酯Tyr-OMeL-酪氨酸甲酯Gly-OMe甘氨酸甲酯Phe-OMeL-苯丙氨酸甲酯AMPα-L-天门冬氨酰基-L-苯丙氨酸-β-酯Ala-GlnL-丙氨酰基-L-谷氨酰胺Ala-PheL-丙氨酰基-L-苯丙氨酸Phe-MetL-苯丙氨酰基-L-蛋氨酸Leu-MetL-亮氨酰基-L-蛋氨酸Ile-MetL-异亮氨酰基-L-蛋氨酸Met-MetL-蛋氨酰基-L-蛋氨酸Pro-MetL-脯氨酰基-L-蛋氨酸Trp-MetL-色氨酰基-L-蛋氨酸Val-MetL-缬氨酰基-L-蛋氨酸Asn-MetL-天冬酰胺酰基-L-蛋氨酸Cys-MetL-半胱氨酰基-L-蛋氨酸Gln-MetL-谷氨酰胺酰基-L-蛋氨酸Gly-Met甘氨酰基-L-蛋氨酸Ser-MetL-丝氨酰基-L-蛋氨酸
Thr-MetL-苏氨酰基-L-蛋氨酸Tyr-MetL-酪氨酰基-L-蛋氨酸Asp-MetL-天门冬氨酰基-L-蛋氨酸Arg-MetL-精氨酰基-L-蛋氨酸His-MetL-组氨酰基-L-蛋氨酸Lys-MetL-赖氨酰基-L-蛋氨酸Ala-GlyL-丙氨酰基-甘氨酸Ala-ThrL-丙氨酰基-L-苏氨酸Ala-GluL-丙氨酰基-L-谷氨酸Ala-AlaL-丙氨酰基-L-丙氨酸Ala-AspL-丙氨酰基-L-天冬氨酸Ala-SerL-丙氨酰基-L-丝氨酸Ala-MetL-丙氨酰基-L-蛋氨酸Ala-ValL-丙氨酰基-L-缬氨酸Ala-LysL-丙氨酰基-L-赖氨酸Ala-AsnL-丙氨酰基-L-天冬酰胺Ala-CysL-丙氨酰基-L-半胱氨酸Ala-TyrL-丙氨酰基-L-酪氨酸Ala-IleL-丙氨酰基-L-异亮氨酸Arg-GlnL-精氨酰基-L-谷氨酰胺Gly-Ser甘氨酰基-L-丝氨酸Gly-Ser(tBu)甘氨酰基-L-(t-丁基)丝氨酸HIL-Phe(2S，3R，4S)-4-羟基异亮氨酰基-苯丙氨酸AFAL-丙氨酰基-L-苯丙氨酰基-L-丙氨酸AGAL-丙氨酰基-L-甘氨酰基-L-丙氨酸AHAL-丙氨酰基-L-组氨酰基-L-丙氨酸ALAL-丙氨酰基-L-亮氨酰基-L-丙氨酸AAAL-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-丙氨酸AAGL-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-甘氨酸AAPL-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-脯氨酸AAQL-丙氨酰基-L-丙氨酰基-谷氨酸AAYL-丙氨酰基-L-丙氨酰基-L-酪氨酸
GFA甘氨酰基-L-苯丙氨酰基-L-丙氨酸AGGL-丙氨酰基-甘氨酰基-丙氨酸TGGL-苏氨酰基-甘氨酰基-甘氨酸GGG甘氨酰基-甘氨酰基-甘氨酸AFGL-丙氨酰基-L-苯丙氨酰基-甘氨酸GGFM甘氨酰基-甘氨酰基-L-苯丙氨酰基-L-蛋氨酸YGGFML-酪氨酰基-甘氨酰基-甘氨酰基-L-苯丙氨酰基-L-蛋氨酸AML-天冬氨酸-β-甲酯盐酸盐AM(AM)L-天门冬氨酰基-L-天冬氨酸-β，β-二甲酯AP4-氨基安替比林OPT1，10-Phenanthoroline mnonohydrate本发明书中突变位点的氨基酸的单个字母标记和对各氨基酸残基进行突变导入时使用的密码子，如下表44所示。
表44

序列表文本引物序列表表45-1引物序列表(表中No.表示的是序列号)

表45-2引物序列表(表中No.表示的是序列号)

表45-3引物序列表(表中No.表示的是序列号)

表45-4引物序列表(表中编号表示的是序列号)

表45-5引物序列表(表中编号表示的是序列号)

表45-6引物序列表(表中编号表示的是序列号)

表45-7引物序列表(表中编号表示的是序列号)

表45-8引物序列表(表中编号表示的是序列号)

表45-9引物序列表(表中编号表示的是序列号)

表46-1

表46-2

表46-3

表46-4



图1是有关pH稳定性的实验结果的示意图。
图2是有关最适反应温度的实验结果的示意图。
图3是有关温度稳定性的实验结果的示意图。
图4是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构的示意图。
图5是具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构的示意图。
图6-1是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-2是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-3是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-4是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-5是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-6是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-7是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-8是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-9是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-10是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-11是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-12是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-13是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-14是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-15是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-16是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-17是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-18是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-19是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-20是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-21是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-22是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-23是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-24是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-25是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-26是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-27是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-2是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-28是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-29是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-30是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-31是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-32是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-33是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-34是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-35是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-36是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-37是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-38是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-39是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-40是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-41是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-42是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-43是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-44是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-45是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-46是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-47是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-48是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-49是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-50是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-51是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-52是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-53是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-54是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-55是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-56是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-57是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-58是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-59是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-60是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-61是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-62是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-63是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-64是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-65是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-66是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-67是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-68是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-69是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-70是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-71是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-72是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-73是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-74是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-75是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-76是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-77是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-78是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-79是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-80是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-81是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-82是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-83是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-84是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-85是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-86是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-87是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-88是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-89是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-90是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-91是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-92是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-93是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-94是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-95是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-96是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-97是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-98是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-99是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-100是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-101是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-102是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-103是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-104是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-105是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-106是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-107是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-108是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-109是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-110是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-111是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-112是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-113是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-114是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-115是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-116是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-117是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-118是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-119是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-120是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-121是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-122是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-123是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-124是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-125是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-126是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-127是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-128是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-129是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-130是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-131是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-132是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-133是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
图6-134是具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构(三维结构)的原子坐标的示意图。
产业上的可利用性本发明可用在涉及肽的制造法等领域。
序列表<110>Ajinomoto co.，inc.
<120>具有肽合成活性的突变型蛋白质<130>PAMA-17692<150>JP2004-368503<151>2004-12-20<150>US60/638370<151>2004-12-27<160>483<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1935<212>DNA<213>鞘氨醇杆菌属某种(Sphingobacterium sp.)<220>
<221>CDS<222>(61)..(1917)<223>编码具有肽合成活性蛋白质的基因<400>1gaaaccaagt gtaaaattat aatttacacc aaagaatgta ctgaacaaat aattatctga    60atg aaa aat aca att tcg tgc cta act tta gcg ctt tta agc gca agc     108Met Lys Asn Thr Ile Ser Cys Leu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Ala Ser1               5                   10                  15cag tta cat gct caa aca gct gcc gac tcg gct tat gtt aga gat cat     156Gln Leu His Ala Gln Thr Ala Ala Asp Ser Ala Tyr Val Arg Asp His            20                  25                  30tat gaa aag acc gaa gta gca att ccc atg cga gat ggg aaa aaa tta     204Tyr Glu Lys Thr Glu Val Ala Ile Pro Met Arg Asp Gly Lys Lys Leu        35                  40                  45ttt act gcg atc tac agt cca aaa gac aaa tcc aag aaa tat cca gtt     252Phe Thr Ala Ile Tyr Ser Pro Lys Asp Lys Ser Lys Lys Tyr Pro Val    50                  55                  60ttg ctc aat aga acg ccc tac acg gtt tca cct tat ggg cag aac gaa     300Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Thr Val Ser Pro Tyr Gly Gln Asn Glu65                  70                  75                  80tat aaa aaa agc ttg gga aac ttt ccc caa atg atg cgt gaa ggc tat     348Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asn Phe Pro Gln Met Met Arg Glu Gly Tyr                85                  90                  95att ttc gtt tac cag gat gtc cgt ggc aag tgg atg agc gaa ggt gat     396Ile Phe Val Tyr Gln Asp Val Arg Gly Lys Trp Met Ser Glu Gly Asp            100                 105                 110ttt gaa gat ata cgt ccg acc acg tac agc aaa gat aaa aaa gca atc     444Phe Glu Asp Ile Arg Pro Thr Thr Tyr Ser Lys Asp Lys Lys Ala Ile        115                 120                 125
gat gaa agt acg gat acc tat gat gcg ctt gaa tgg tta cag aaa aat     492Asp Glu Ser Thr Asp Thr Tyr Asp Ala Leu Glu Trp Leu Gln Lys Asn    130                 135                 140ctc aaa aac tat aat ggc aaa gcc ggg ctc tat ggg att tcc tat cca     540Leu Lys Asn Tyr Asn Gly Lys Ala Gly Leu Tyr Gly Ile Ser Tyr Pro145                 150                 155                 160ggc ttc tat tct acc gtc gga ttg gtc aaa aca cac ccg agc ttg aag     588Gly Phe Tyr Ser Thr Val Gly Leu Val Lys Thr His Pro Ser Leu Lys                165                 170                 175gca gtc tcc cca cag gct ccc gta aca gac tgg tat atc ggc gac gac     636Ala Val Ser Pro Gln Ala Pro Val Thr Asp Trp Tyr Ile Gly Asp Asp            180                 185                 190ttc cac cat aat ggc gta ttg ttt ctt cag gat gca ttt aca ttc atg     684Phe His His Asn Gly Val Leu Phe Leu Gln Asp Ala Phe Thr Phe Met        195                 200                 205tca acc ttt ggt gtc cct cgt cca aaa ccc att aca ccg gat caa ttt     732Ser Thr Phe Gly Val Pro Arg Pro Lys Pro Ile Thr Pro Asp Gln Phe    210                 215                 220aag ggc aaa att cag atc aaa gaa gcc gat aaa tat aac ttt ttt gca     780Lys Gly Lys Ile Gln Ile Lys Glu Ala Asp Lys Tyr Asn Phe Phe Ala225                 230                 235                 240gaa gca gga aca gcg cgg gaa ctc aaa gaa aag tat ttt ggt gac tcc     828Glu Ala Gly Thr Ala Arg Glu Leu Lys Glu Lys Tyr Phe Gly Asp Ser                245                 250                 255gta caa ttt tgg aat gac ctg ttt aag cat ccc gac tat gat gat ttt     876Val Gln Phe Trp Asn Asp Leu Phe Lys His Pro Asp Tyr Asp Asp Phe            260                 265                 270tgg aaa tcg cgt gtg atc acg aat tct tta cag gag gta aaa cca gct     924Trp Lys Ser Arg Val Ile Thr Asn Ser Leu Gln Glu Val Lys Pro Ala        275                 280                 285gtg atg gtg gtt ggt ggt ttc ttt gac gcg gaa gat gct tat gga aca     972Val Met Val Val Gly Gly Phe Phe Asp Ala Glu Asp Ala Tyr Gly Thr    290                 295                 300ttt aag acc tac caa tcg att gag gat aaa agc aaa aaa aac aac tcg    1020Phe Lys Thr Tyr Gln Ser Ile Glu Asp Lys Ser Lys Lys Asn Asn Ser305                 310                 315                 320att tta gtc gcg gga cct tgg tat cat ggc ggt tgg gtt cgt gca gaa    1068Ile Leu Val Ala Gly Pro Trp Tyr His Gly Gly Trp Val Arg Ala Glu                325                 330                 335gga aac tat tta ggt gat atc caa ttt gag aaa aaa acc agt att act    1116Gly Asn Tyr Leu Gly Asp Ile Gln Phe Glu Lys Lys Thr Ser Ile Thr            340                 345                 350tat cag gaa caa ttt gaa caa cca ttt ttc aaa tat tac cta aaa gat    1164Tyr Gln Glu Gln Phe Glu Gln Pro Phe Phe Lys Tyr Tyr Leu Lys Asp
        355                 360                 365gaa gga aac ttc gcc cct tcc gaa gct aac att ttt gtt tca ggc agc    1212Glu Gly Asn Phe Ala Pro Ser Glu Ala Asn Ile Phe Val Ser Gly Ser    370                 375                 380aac gaa tgg aaa cat ttc gaa cag tgg cca cca aaa aat gta gag aca    1260Asn Glu Trp Lys His Phe Glu Gln Trp Pro Pro Lys Asn Val Glu Thr385                 390                 395                 400aaa aaa cta tac ttc caa cct cag ggg aaa ctt gga ttt gac aaa gtt    1308Lys Lys Leu Tyr Phe Gln Pro Gln Gly Lys Leu Gly Phe Asp Lys Val                405                 410                 415caa cgt aca gat tcc tgg gat gaa tat gta aca gac cct aat aaa cct    1356Gln Arg Thr Asp Ser Trp Asp Glu Tyr Val Thr Asp Pro Asn Lys Pro            420                 425                 430gtt ccg cat caa ggt ggg tta att caa aac cga aca cgg gag tat atg    1404Val Pro His Gln Gly Gly Leu Ile Gln Asn Arg Thr Arg Glu Tyr Met        435                 440                 445gta gat gat caa cgt ttc gcg gct agt cgc cct gat gtc atg gtt tat    1452Val Asp Asp Gln Arg Phe Ala Ala Ser Arg Pro Asp Val Met Val Tyr    450                 455                 460caa acg gaa ccg ttg acg gag gac ctg acg ata gta ggc cca atc aaa    1500Gln Thr Glu Pro Leu Thr Glu Asp Leu Thr Ile Val Gly Pro Ile Lys465                 470                 475                 480aac ttt ctc aaa gtt tct tca aca gga aca gac gcg gac tat gtt gtc    1548Asn Phe Leu Lys Val Ser Ser Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr Val Val                485                 490                 495aaa ctg att gac gtt tat ccg aat gat gca gca agt tat caa gga aaa    1596Lys Leu Ile Asp Val Tyr Pro Asn Asp Ala Ala Ser Tyr Gln Gly Lys            500             505                     510aca atg gct gga tat caa atg atg gta cgt ggt gag atc atg gcg ggg    1644Thr Met Ala Gly Tyr Gln Met Met Val Arg Gly Glu Ile Met Ala Gly        515             520                     525aaa tac cga aat ggt ttc gat aaa gcg cag gcc ttg act cca ggt atg    1692Lys Tyr Arg Asn Gly Phe Asp Lys Ala Gln Ala Leu Thr Pro Gly Met    530                 535                 540gtc gaa aag gtg aat ttt gaa atg cca gac gtt gcg cat acc ttc aaa    1740Val Glu Lys Val Asn Phe Glu Met Pro Asp Val Ala His Thr Phe Lys545                 550                 555                 560aaa gga cat cgc att atg gtt cag gta caa aac tca tgg ttt ccg ctg    1788Lys Gly His Arg Ile Met Val Gln Val Gln Asn Ser Trp Phe Pro Leu                565                 570                 575gca gaa cga aat cca cag gtg ttt tta gca cct tat aca gct acc aaa    1836Ala Glu Arg Asn Pro Gln Val Phe Leu Ala Pro Tyr Thr Ala Thr Lys            580                 585                 590gct gat ttc cgc aaa gct acc caa cgt att ttt cac gat gtg aac aat    1884
Ala Asp Phe Arg Lys Ala Thr Gln Arg Ile Phe His Asp Val Asn Asn        595                 600                 605gcc aca tac atc gaa ttt tct gtc ctc aaa gat tagcaggtaa attcgaaa    1935Ala Thr Tyr Ile Glu Phe Ser Val Leu Lys Asp    610                 615<210>2<211>619<212>PRT<213>鞘氨醇属某种<400>2Met Lys Asn Thr Ile Ser Cys Leu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Ala Ser1               5                   10                  15Gln Leu His Ala Gln Thr Ala Ala Asp Ser Ala Tyr Val Arg Asp His            20                  25                  30Tyr Glu Lys Thr Glu Val Ala Ile Pro Met Arg Asp Gly Lys Lys Leu        35                  40                  45Phe Thr Ala Ile Tyr Ser Pro Lys Asp Lys Ser Lys Lys Tyr Pro Val    50                  55                  60Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Thr Val Ser Pro Tyr Gly Gln Asn Glu65                  70                  75                  80Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asn Phe Pro Gln Met Met Arg Glu Gly Tyr                85                  90                  95Ile Phe Val Tyr Gln Asp Val Arg Gly Lys Trp Met Ser Glu Gly Asp            100                 105                 110Phe Glu Asp Ile Arg Pro Thr Thr Tyr Ser Lys Asp Lys Lys Ala Ile        115                 120                 125Asp Glu Ser Thr Asp Thr Tyr Asp Ala Leu Glu Trp Leu Gln Lys Asn    130                 135                 140Leu Lys Asn Tyr Asn Gly Lys Ala Gly Leu Tyr Gly Ile Ser Tyr Pro145                 150                 155                 160Gly Phe Tyr Ser Thr Val Gly Leu Val Lys Thr His Pro Ser Leu Lys                165                 170                 175Ala Val Ser Pro Gln Ala Pro Val Thr Asp Trp Tyr Ile Gly Asp Asp            180                 185                 190Phe His His Asn Gly Val Leu Phe Leu Gln Asp Ala Phe Thr Phe Met    195                     200                 205Ser Thr Phe Gly Val Pro Arg Pro Lys Pro Ile Thr Pro Asp Gln Phe    210                 215                 220Lys Gly Lys Ile Gln Ile Lys Glu Ala Asp Lys Tyr Asn Phe Phe Ala225                 230                 235                 240Glu Ala Gly Thr Ala Arg Glu Leu Lys Glu Lys Tyr Phe Gly Asp Ser                245                 250                 255Val Gln Phe Trp Asn Asp Leu Phe Lys His Pro Asp Tyr Asp Asp Phe            260                 265                 270
Trp Lys Ser Arg Val Ile Thr Asn Ser Leu Gln Glu Val Lys Pro Ala        275                 280                 285Val Met Val Val Gly Gly Phe Phe Asp Ala Glu Asp Ala Tyr Gly Thr    290                 295                 300Phe Lys Thr Tyr Gln Ser Ile Glu Asp Lys Ser Lys Lys Asn Asn Ser305                 310                 315                 320Ile Leu Val Ala Gly Pro Trp Tyr His Gly Gly Trp Val Arg Ala Glu                325                 330                 335Gly Asn Tyr Leu Gly Asp Ile Gln Phe Glu Lys Lys Thr Ser Ile Thr            340                 345                 350Tyr Gln Glu Gln Phe Glu Gln Pro Phe Phe Lys Tyr Tyr Leu Lys Asp        355                 360                 365Glu Gly Asn Phe Ala Pro Ser Glu Ala Asn Ile Phe Val Ser Gly Ser    370                 375                 380Asn Glu Trp Lys His Phe Glu Gln Trp Pro Pro Lys Asn Val Glu Thr385                 390                 395                 400Lys Lys Leu Tyr Phe Gln Pro Gln Gly Lys Leu Gly Phe Asp Lys Val                405                 410                 415Gln Arg Thr Asp Ser Trp Asp Glu Tyr Val Thr Asp Pro Asn Lys Pro            420                 425                 430Val Pro His Gln Gly Gly Leu Ile Gln Asn Arg Thr Arg Glu Tyr Met        435                 440                 445Val Asp Asp Gln Arg Phe Ala Ala Ser Arg Pro Asp Val Met Val Tyr    450                 455                 460Gln Thr Glu Pro Leu Thr Glu Asp Leu Thr Ile Val Gly Pro Ile Lys465                 470                 475                 480Asn Phe Leu Lys Val Ser Ser Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr Val Val                485                 490                 495Lys Leu Ile Asp Val Tyr Pro Asn Asp Ala Ala Ser Tyr Gln Gly Lys            500                 505                 510Thr Met Ala Gly Tyr Gln Met Met Val Arg Gly Glu Ile Met Ala Gly        515                 520                 525Lys Tyr Arg Asn Gly Phe Asp Lys Ala Gln Ala Leu Thr Pro Gly Met    530                 535                 540Val Glu Lys Val Asn Phe Glu Met Pro Asp Val Ala His Thr Phe Lys545                 550                 555                 560Lys Gly His Arg Ile Met Val Gln Val Gln Asn Ser Trp Phe Pro Leu                565                 570                 575Ala Glu Arg Asn Pro Gln Val Phe Leu Ala Pro Tyr Thr Ala Thr Lys            580                 585                 590Ala Asp Phe Arg Lys Ala Thr Gln Arg Ile Phe His Asp Val Asn Asn        595                 600                 605Ala Thr Tyr Ile Glu Phe Ser Val Leu Lys Asp    610                 615
<210>3<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>3 cgcgaattca tgaaaaatac aatttcgtgc           30<210>4<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>4 cgcctgcagc taatctttga ggacagaaaa ttc       33<210>5<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>5gggaattcca tatgaaaaat acaatttcgt            30<210>6<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>6gctctagact aatctttgag gacagaaaa             29<210>7<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>7tgctcaatag aacgcccta                        19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物<400>8ccgagcttga aggcagtct                       19<210>9<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>9acgcggaaga tgcttatgg                       19<210>10<211>18<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>10aagttcaacg tacagatt                        18<210>11<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>11ggtatccgta ctttcatcga                      20<210>12<211>35<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>12gcatttacat tcatggacac ctttggtgtc cctcg     35<210>13<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>13caaggtgggt taattgaaaa ccgaacacgg gag       33
<210>14<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>14caaggtgggt taattaaaaa ccgaacacgg gag            33<210>15<211>36<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>15ggtgggttaa ttcaaaaacg aacacgggag tatatg         36<210>16<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>16caaaaccgaa cagaggagta tatggtagat g              31<210>17<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>17caaaaccgaa catttgagta tatggtagat g              31<210>18<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>18gtattgtttc ttcagaatgc atttacattc atg            33<210>19<211>33<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物<400>19gtattgtttc ttcagtctgc atttacattc atg                33<210>20<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>20caggatgcat ttacagccat gtcaaccttt ggtg               34<210>21<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>21caggatgcat ttacatccat gtcaaccttt ggtg               34<210>22<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>22gcatttacat tcatggcaac ctttggtgtc cctc               34<210>23<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>23caaggtgggt taattaacaa ccgaacacgg gag                33<210>24<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>24caaggtgggt taattgacaa ccgaacacgg gag               33
<210>25<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>25cagaacgaat acaaagcaag tttgggaaac            30<210>26<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>26caggatgcat ttacagtcat gtcaaccttt ggtg       34<210>27<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>27caggatgcat ttacaggcat gtcaaccttt ggtg       34<210>28<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>28caggatgcat ttacaaccat gtcaaccttt ggtg       34<210>29<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>29gatgcattta cattcgcgtc aacctttggt gtc        33<210>30<211>32<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物<400>30gcatttacat tcatgggaac ctttggtgtc cc                32<210>31<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>31caggatgcat ttacaatcat gtcaaccttt ggtg              34<210>32<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>32gattttgaag atatagctcc gaccacgtac agc               33<210>33<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>33caggatgcat ttacagtcat ggcaaccttt ggtg              34<210>34<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>34caaggtgggg taattcaaaa c                            21<210>35<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>35cgataaaggg caggccttg                               19
<210>36<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>36 gcggaagatg tttatggaac                            20<210>37<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>37caatttaaga gcaaaattc                              19<210>38<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>38ggtgactcca tacaattttg                             20<210>39<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>39tttctgtcct caaagaatag                             20<210>40<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>40gaaggaaacc atttaggtg                              19<210>41<211>20<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物<400>41cacgatgtga agaatgccac                                 20<210>42<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>42ttttagtcgt gggaccttg                                  19<210>43<211>21<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>43gcaaaattca tatcaaagaa                                21<210>44<211>19<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>44gcgggacctg ggtatcatg                                19<210>45<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>45caggatgcat ttacagtcat gtcaaccttt ggtg              34<210>46<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>46caccaaaggt tgacatgact gtaaatgcat cctg              34
<210>47<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>47gaacgaatac aaagcaagt ttgggaaac                 28<210>48<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>48gtttcccaaa cttgctttgt attcgttc                 28<210>49<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>49gggcaaaatt catatcaaag aagccg                   26<210>50<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>50cggcttcttt gatatgaatt ttgccc                   26<210>51<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>51ctttggtgac tccatacaat tttgg                    25<210>52<211>25<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物<400>52ccaaaattgt atggagtcac caaag                         25<210>53<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>53gacgcggaag atgtttatgg aacattt                       27<210>54<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>54aaatgttcca taaacatctt ccgcgtc                       27<210>55<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>55ccaatcgatt gaggaaaaaa gcaaaaaaaa c                  31<210>56<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>56gttttttttg cttttttcct caatcgattg g                 31<210>57<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>57ctcgatttta gtcgtgggac cttggtatc                    29
<210>58<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>58gataccaagg tcccacgact aaaatcgag                     29<210>59<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>59gcatcaaggt ggggtaattc aaaaccg                       27<210>60<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>60cggttttgaa ttaccccacc ttgatgc                       27<210>61<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>61ggtgggttaa ttgaaaaccg aacac                         25<210>62<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>62gtgttcggtt ttcaattaac ccacc                         25<210>63<211>26<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物<400>63ggtttcgata aagggcaggc cttgac                      26<210>64<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>64gtcaaggcct gccctttatc gaaacc                      26<210>65<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>65cacgatgtga agaatgccac atacatcg                    28<210>66<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>66cgatgtatgt ggcattcttc acatcgtg                    28<210>67<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>67gaacgcccta cgcggtttct cc                         22<210>68<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>68ggagaaaccg cgtagggcgt tc                         22
<210>69<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>69cggataccta tgattcgctt gaatggttac               30<210>70<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>70gtaaccattc aagcgaatca taggtatccg               30<210>71<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>71aaggtgaatt ttaaaatgcc agacgttgcg               30<210>72<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>72cgcaacgtct ggcattttaa aattcacctt               30<210>73<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>73 catttacatt cgcgtcaacc tttggtgtcc              30<210>74<211>30<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物<400>74ggacaccaaa ggttgacgcg aatgtaaatg                      30<210>75<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>75cggatcaatt taagagcaaa attcag                          26<210>76<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>76ctgaattttg ctcttaaatt gatccg                          26<210>77<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>77aggatgcatt tacacacatg tcaacctttg                      30<210>78<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>78caaaggttga catgtgtgta aatgcatcct                      30<210>79<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>79cacaggctcc cgcaacagac tggtatatc                       29
<210>80<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>80gatataccag tctgttgcgg gagcctgtg                      29<210>81<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>81cacaggctcc ctgcacagac tggtatatc                      29<210>82<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>82gatataccag tctgtgcagg gagcctgtg                      29<210>83<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>83cacaggctcc cggcacagac tggtatatc                      29<210>84<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>84gatataccag tctgtgccgg gagcctgtg                      29<210>85<211>29<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物<400>85cacaggctcc cattacagac tggtatatc                       29<210>86<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>86gatataccag tctgtaatgg gagcctgtg                       29<210>87<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>87cacaggctcc cctaacagac tggtatatc                       29<210>88<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>88gatataccag tctgttaggg gagcctgtg                       29<210>89<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>89cacaggctcc catgacagac tggtatatc                       29<210>90<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>90gatataccag tctgtcatgg gagcctgtg                       29
<210>91<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>91cacaggctcc caacacagac tggtatatc                      29<210>92<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>92gatataccag tctgtgttgg gagcctgtg                      29<210>93<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>93cacaggctcc ccaacagact ggtatatc                       28<210>94<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>94gatataccag tctgttgggg gagcctgtg                      29<210>95<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>95cacaggctcc ctcaacagac tggtatatc                      29<210>96<211>29<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物<400>96gatataccag tctgttgagg gagcctgtg                 29<210>97<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>97cacaggctcc cacaacagac tggtatatc                 29<210>98<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>98gatataccag tctgttgtgg gagcctgtg                 29<210>99<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>99gaacgaatac aaagcaagtt tgggaaac                  28<210>100<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>100gggcaaaatt catatcaaag aagccg                    26<210>101<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>101ctttggtgac tccatacaat tttgg                     25
<210>102<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>102gacgcggaag atgtttatgg aacattt                27<210>103<211>31<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>103ccaatcgatt gaggaaaaaa gcaaaaaaaa c           31<210>104<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>104ctcgatttta gtcgtgggac cttggtatc              29<210>105<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>105gcatcaaggt ggggtaattc aaaaccg                27<210>106<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>106ggtgggttaa ttgaaaaccg aacac                  25<210>107<211>26<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物<400>107ggtttcgata aagggcaggc cttgac                      26<210>108<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>108cacgatgtga agaatgccac atacatcg                    28<210>109<211>22<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>109gaacgcccta cgcggtttct cc                          22<210>110<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>110cggataccta tgattcgctt gaatggttac                  30<210>111<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(11)..(11)<223>a，g，c，和t中的任意一种<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>a，g，c，和t中的任意一种<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)<223>a，g，c，和t中的任意一种<400>111gggcaaaatt nnnatcaaag aagccg                    26<210>112<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(16)<223>a，g，c，和t中的任意一种<220>
<221>misc_feature<222>(17)..(17)<223>a，g，c，和t中的任意一种<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>a，g，c，和t中的任意一种<400>112caatttaagg gcaaannncc tatcaaagaa gccg                34<210>113<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(14)..(14)<223>a，g，c，和t中的任意一种<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>a，g，c，和t中的任意一种<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(16)<223>a，g，c，和t中的任意一种<400>113gggcaaaatt cctnnnaaag aagccg                          26
<210>114<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(16)<223>a，g，c，和t中的任意一种<220>
<221>misc_feature<222>(17)..(17)<223>a，g，c，和t中的任意一种<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>a，g，c，和t中的任意一种<400>114caatttaagg gcaaannnca tatcaaagaa gccg                    34<210>115<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(11)..(11)<223>a，g，c，和t中的任意一种<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>a，g，c，和t中的任意一种<220>
<221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>a，g，c，和t中的任意一种<400>115ctttggtgac nnnatacaat tttggaatg                            29<210>116<211>30<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(15)..(15)<223>a，g，c，和t中的任意一种<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(16)<223>a，g，c，和t中的任意一种<220>
<221>misc_feature<222>(17)..(17)<223>a，g，c，和t中的任意一种<400>116cggataccta tgatnnnctt gaatggttac                          30<210>117<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>117gggcaaaatt cctatcaaag aagccg                              26<210>118<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(17)..(17)<223>a，g，c，和t中的任意一种<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>a，g，c，和t中的任意一种<220>
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<210>119<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(17)..(17)<223>a，g，c，和t中的任意一种<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>a，g，c，和t中的任意一种<220>
<221>misc_feature<222>(19)..(19)<223>a，g，c，和t中的任意一种<400>119ctttgacgcg gaagatnnnt atggaacatt taag            34<210>120<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<220>
<221>misc_feature<222>(19)..(19)<223>a，g，c，和t中的任意一种<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>a，g，c，和t中的任意一种<220>
<221>misc_feature<222>(20)..(20)<223>a，g，c，和t中的任意一种<400>120gaaatggttt cgataaannn caggccttga ctcc            34<210>121<211>40<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物<400>121ccgtaaggag gaatgtagat gaaaaataca atttcgtgcc                           40<210>122<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>122ggctgcagtt tgcgggatgg aaggccggc                                       29<210>123<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>123cctctagaat tttttcaatg tgattt                                          26<210>124<211>45<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>124gcaggaaatt gtatttttca tctacattcc tccttacggt gttat                     45<210>125<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>125cttacagatg actataatgt gactaaaaac                                      30<210>126<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物<400>126gtttttagtc acattatagt catctgtaag                                      30
<210>127<211>36<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物pSFNde-cut-1<400>127cggtatttca caccgcgtat ggtgcactct cagtac                               36<210>128<211>36<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物pSFNde-cut-2<400>128gtactgagag tgcaccatac gcggtgtgaa ataccg                               36<210>129<211>36<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物pSFNde-1<400>129ccgtaaggag gaatgcatat gaaaaataca atttcg                               36<210>130<211>36<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物pSFNde-2<400>130cgaaattgta tttttcatat gcattcctcc ttacgg                               36<210>131<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物W187A/F<400>131gctcccgtaa cagacgcgta tatcggcgac gac                                  33<210>132<211>34<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物S209A/F<400>132gcatttacat tcatggcaac ctttggtgtc cctc                                 34<210>133<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物S209G/F<400>133gcatttacat tcatgggaac ctttggtgtc cc                                   32<210>134<211>38<212>DNA<213>引物F211A/F<400>134gcatttacat tcatgtcaac cgctggtgtc cctcgtcc                             38<210>135<211>35<212>DNA<213>引物T210K/F<400>135gcatttacat tcatgtcaaa gtttggtgtc cctcg                                35<210>136<211>36<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物N442D/F<400>136ggtgggttaa ttcaagaccg aacacgggag tatatg                               36<210>137<211>38<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F211V/F<400>137gcatttacat tcatgtcaac cgttggtgtc cctcgtcc                             38<210>138<211>29<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物2458/V257A/F<400>138ctttggtgac tccgcacaat tttggaatg                                       29<210>139<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物2458/V257A/R<400>139cattccaaaa ttgtgcggag tcaccaaag                                       29<210>140<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物2458/V257G/F<400>140ctttggtgac tccggacaat tttggaatg                                       29<210>141<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物2458/V257G/R<400>141cattccaaaa ttgtccggag tcaccaaag                                       29<210>142<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物2458/V257H/F<400>142ctttggtgac tcccaccaat tttggaatg                                       29<210>143<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物2458/V257H/R<400>143cattccaaaa ttggtgggag tcaccaaag                                       29
<210>144<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物2458/V257M/F<400>144ctttggtgac tccatgcaat tttggaatg                                       29<210>145<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物2458/V257M/R<400>145cattccaaaa ttgcatggag tcaccaaag                                       29<210>146<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物2458/V257N/F<400>146ctttggtgac tccaaccaat tttggaatg                                       29<210>147<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物2458/V257N/R<400>147cattccaaaa ttggttggag tcaccaaag                                       29<210>148<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物2458/V257Q/F<400>148ctttggtgac tcccaacaat tttggaatg                                       29<210>149<211>29<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物2458/V257Q/R<400>149cattccaaaa ttgttgggag tcaccaaag                                       29<210>150<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物2458/V257S/F<400>150ctttggtgac tcctcacaat tttggaatg                                       29<210>151<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物2458/V257S/R<400>151cattccaaaa ttgtgaggag tcaccaaag                                       29<210>152<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物2458/V257T/F<400>152ctttggtgac tccacacaat tttggaatg                                       29<210>153<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物2458/V257T/R<400>153cattccaaaa ttgtgtggag tcaccaaag                                       29<210>154<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物2458/V257W/F<400>154ctttggtgac tcctggcaat tttggaatg                                       29
<210>155<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物2458/V257W/R<400>155cattccaaaa ttgccaggag tcaccaaag                                       29<210>156<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物2458/V257Y/F<400>156ctttggtgac tcctaccaat tttggaatg                                       29<210>157<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物2458/V257Y/R<400>157cattccaaaa ttggtaggag tcaccaaag                                       29<210>158<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物W187A/R<400>158gtcgtcgccg atatacgcgt ctgttacggg agc                                  33<210>159<211>38<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F211A/R<400>159ggacgaggga caccagcggt tgacatgaat gtaaatgc                             38<210>160<211>33<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物K47G/F<400>160atgcgagatg ggaaaggttt atttactgcg atc                                  33<210>161<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物K47G/R<400>161gatcgcagta aataaacctt tcccatctcg cat                                  33<210>162<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物K47E/F<400>162atgcgagatg ggaaagaatt atttactgcg atc                                  33<210>163<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物K47E/R<400>163gatcgcagta aataattctt tcccatctcg cat                                  33<210>164<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物N442F/F<400>164ggtgggttaa ttcaattccg aacacgggag tat                                  33<210>165<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物N442F/R<400>165atactcccgt gttcggaatt gaattaaccc acc                                  33
<210>166<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物N607R/F<400>166atttttcacg atgtgcgtaa tgccacatac atc                                  33<210>167<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物N607R/R<400>167gatgtatgtg gcattacgca catcgtgaaa aat                                  33<210>168<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A+W187A/F<400>168gctcccgcaa cagacgcgta tatcggcgac gac                                  33<210>169<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A+W187A/R<400>169gtcgtcgccg atatacgcgt ctgttgcggg agc                                  33<210>170<211>25<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Q441K/R<400>170gtgttcggtt tttaattaac ccacc                                           25<210>171<211>26<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物V184A/P183A F<400>171ccccacaggc tgcagcaaca gactgg                                          26<210>172<211>26<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/P183A R<400>172ccagtctgtt gctgcagcct gtgggg                                          26<210>173<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/T185A F<400>173caggctcccg cagcagactg gtatatc                                         27<210>174<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/T185A R<400>174gatataccag tctgctgcgg gagcctg                                         27<210>175<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/T185N F<400>175caggctcccg caaacgactg gtatatc                                         27<210>176<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/T185N R<400>176gatataccag tcgtttgcgg gagcctg                                         27
<210>177<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/T185K F<400>177caggctcccg caaaagactg gtatatc                                         27<210>178<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/T185K R<400>178gatataccag tcttttgcgg gagcctg                                         27<210>179<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/T185D F<400>179caggctcccg cagatgactg gtatatc                                         27<210>180<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/T185D R<400>180gatataccag tcatctgcgg gagcctg                                         27<210>181<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/T185C F<400>181caggctcccg catgcgactg gtatatc                                         27<210>182<211>27<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物V184A/T185C R<400>182gatataccag tcgcatgcgg gagcctg                                         27<210>183<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/T185S F<400>183caggctcccg catcagactg gtatatc                                         27<210>184<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/T185S R<400>184gatataccag tctgatgcgg gagcctg                                         27<210>185<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/T185F F<400>185caggctcccg catttgactg gtatatc                                         27<210>186<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/T185F R<400>186gatataccag tcaaatgcgg gagcctg                                         27<210>187<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/T185P F<400>187caggctcccg caccagactg gtatatc                                         27
<210>188<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/T185P R<400>188gatataccag tctggtgcgg gagcctg                                         27<210>189<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/P183A/A182S F<400>189gtctccccac agtcagcagc aacagac                                         27<210>190<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/P183A/A182S R<400>190gtctgttgct gctgactgtg gggagac                                         27<210>191<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/P183A/A182G F<400>191gtctccccac agggtgcagc aacagac                                         27<210>192<211>27<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/P183A/A182G R<400>192gtctgttgct gcaccctgtg gggagac                                         27<210>193<211>23<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物V184A/A182G F<400>193ctccccacag ggtcccgcaa cag                                             23<210>194<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V184A/A182G R<400>194ctgttgcggg accctgtggg gag                                             23<210>195<211>23<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物L66F<400>195ccagttttgt tcaatagaac gcc                                             23<210>196<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物E80K<400>196ccttatgggc agaacaaata caaaaaaag                                       29<210>197<211>24<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P214H<400>197ctttggtgtc catcgtccaa aacc                                            24<210>198<211>29<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物L263M<400>198caattttgga atgacatgtt taagcatcc                                       29
<210>199<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Q441E+N442D/F<400>199caaggtgggt taattgaaga ccgaacacgg gag                                  33<210>200<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Q441E+N442D/R<400>200ctcccgtgtt cggtcttcaa ttaacccacc ttg                                  33<210>201<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y81A-F<400>201tatgggcaga acgaagctaa aaaaagtttg gga                                  33<210>202<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y81A-R<400>202tcccaaactt tttttagctt cgttctgccc ata                                  33<210>203<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物T210L-F<400>203tttacattca tgtcactgtt tggtgtccct cgt                                  33<210>204<211>33<212>DNA<213>人工的
<220>
<223>引物T210L-R<400>204acgagggaca ccaaacagtg acatgaatgt aaa                                 33<210>205<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y328F-F<400>205gtcgtgggac cttggttcca tggcggctgg gtt                                 33<210>206<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y328F-R<400>206aacccagccg ccatggaacc aaggtcccac gac                                 33<210>207<211>1860<212>DNA<213>鞘氨醇属某种<400>207atgaaaaata caatttcctg cctaacttta gcgcttttaa gcgcaagcca gttacatgct    60caaacagctg ccgactcggc ttatgttaga gatcattatg aaaagaccga agtagcaatt    120cccatgcgag atgggaaaaa attatttact gcgatctaca gtccaaaaga caaatccaag    180aaatatccag ttttgctcaa tagaacgccc tacgcggttt ctccttatgg gcagaacgaa    240tacaaaaaaa gtttgggaaa ctttccccaa atgatgcgtg aaggctatat tttcgtttac    300caggatgtcc gtggcaagtg gatgagcgaa ggtgattttg aagatatacg tccgaccacg    360tacagcaaag ataaaaaagc aatcgatgaa agtacggata cctatgattc gcttgaatgg    420ttacagaaaa atctcaaaaa ctataatggc aaagccgggc tctatgggat ttcctatcca    480ggcttctatt ctaccgtcgg attggtcaaa acacacccga gcttgaaggc agtctcccca    540caggctcccg caacagactg gtatatcggc gacgacttcc accataatgg cgtattgttt    600cttcaggatg catttacatt catgtcaacc tttggtgtcc ctcgtccaaa acccattaca    660ccggatcaat ttaagggcaa aattcctatc aaagaagccg ataaatataa cttttttgca    720gaagcaggaa cagcgcggga actcaaagaa aaatactttg gtgactccat acaattttgg    780aatgacctgt ttaagcatcc cgactatgat gatttttgga aatcgcgtgt gatcaccaat    840tctttacagg aggtaaaacc agctgtgatg gtggttggtg gtttctttga cgcggaagat    900gtttatggaa catttaagac ctaccaatcg attgaggata aaagcaaaaa aaacaactcg    960attttagtcg tgggaccttg gtatcatggc ggctgggttc gtgcagaagg aaactattta    1020ggtgatatcc aatttgagaa aaaaaccagt attacttatc aggaacaatt tgaacaaccg    1080tttttcaaat attacctaaa agatgaagga aacttcgccc cttccgaagc caacattttt    1140
gtttcaggca gcaacgaatg gaaacatttc gaacaatggc caccaaaaaa tgtagagaca    1200aaaaaactat acttccaacc tcaggggaaa cttggatttg acaaagttca acgtacagat    1260tcctgggatg aatatgtaac agacccgaat aaacctgttc cgcatcaagg tggggtaatt    1320gaaaaccgaa cacgggagta tatggtagat gatcaacgtt tcgcggctag tcgccctgat    1380gtcatggttt atcaaacgga accgttgacg gaggacctga cgatagtagg cccaatcaaa    1440aactttctca aagtttcttc aacaggaaca gacgcggact atgttgtcaa actgattgac    1500gtttatccga atgatgcagc aagttatcaa ggaaaaacaa tggctggata tcaaatgatg    1560gtacgtggtg agatcatggc ggggaaatac cgaaatggtt tcgataaagg gcaggccttg    1620actccaggta tggtcgaaaa ggtgaatttt gaaatgccag acgttgcgca taccttcaaa    1680aaaggacatc gcattatggt tcaggtacaa aactcatggt ttccgctggc agaacgaaat    1740ccacaggtgt ttttagcacc ttatacagct accaaagctg atttccgcaa agctacccaa    1800cgtatttttc acgatgtgaa gaatgccaca tacatcgaat tttctgtcct caaagattag    1860<210>208<211>619<212>PRT<213>鞘氨醇属某种<400>208Met Lys Asn Thr Ile Ser Cys Leu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Ala Ser1               5                   10                  15Gln Leu His Ala Gln Thr Ala Ala Asp Ser Ala Tyr Val Arg Asp His            20                  25                  30Tyr Glu Lys Thr Glu Val Ala Ile Pro Met Arg Asp Gly Lys Lys Leu        35                  40                  45Phe Thr Ala Ile Tyr Ser Pro Lys Asp Lys Ser Lys Lys Tyr Pro Val    50                  55                  60Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Ala Val Ser Pro Tyr Gly Gln Asn Glu65                  70                  75                  80Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asn Phe Pro Gln Met Met Arg Glu Gly Tyr                85                  90                  95Ile Phe Val Tyr Gln Asp Val Arg Gly Lys Trp Met Ser Glu Gly Asp            100                 105                 110Phe Glu Asp Ile Arg Pro Thr Thr Tyr Ser Lys Asp Lys Lys Ala Ile        115                 120                 125Asp Glu Ser Thr Asp Thr Tyr Asp Ser Leu Glu Trp Leu Gln Lys Asn    130                 135                 140Leu Lys Asn Tyr Asn Gly Lys Ala Gly Leu Tyr Gly Ile Ser Tyr Pro145                 150                 155                 160Gly Phe Tyr Ser Thr Val Gly Leu Val Lys Thr His Pro Ser Leu Lys                165                 170                 175Ala Val Ser Pro Gln Ala Pro Ala Thr Asp Trp Tyr Ile Gly Asp Asp            180                 185                 190Phe His His Asn Gly Val Leu Phe Leu Gln Asp Ala Phe Thr Phe Met        195                 200                 205Ser Thr Phe Gly Val Pro Arg Pro Lys Pro Ile Thr Pro Asp Gln Phe
    210                 215                 220Lys Gly Lys Ile Pro Ile Lys Glu Ala Asp Lys Tyr Asn Phe Phe Ala225                 230                 235                 240Glu Ala Gly Thr Ala Arg Glu Leu Lys Glu Lys Tyr Phe Gly Asp Ser                245                 250                 255Ile Gln Phe Trp Asn Asp Leu Phe Lys His Pro Asp Tyr Asp Asp Phe            260                 265                 270Trp Lys Ser Arg Val Ile Thr Asn Ser Leu Gln Glu Val Lys Pro Ala        275                 280                 285Val Met Val Val Gly Gly Phe Phe Asp Ala Glu Asp Val Tyr Gly Thr    290                 295                 300Phe Lys Thr Tyr Gln Ser Ile Glu Asp Lys Ser Lys Lys Asn Asn Ser305                 310                 315                 320Ile Leu Val Val Gly Pro Trp Tyr His Gly Gly Trp Val Arg Ala Glu                325                 330                 335Gly Asn Tyr Leu Gly Asp Ile Gln Phe Glu Lys Lys Thr Ser Ile Thr            340                 345                 350Tyr Gln Glu Gln Phe Glu Gln Pro Phe Phe Lys Tyr Tyr Leu Lys Asp        355                 360                 365Glu Gly Asn Phe Ala Pro Ser Glu Ala Asn Ile Phe Val Ser Gly Ser    370                 375                 380Asn Glu Trp Lys His Phe Glu Gln Trp Pro Pro Lys Asn Val Glu Thr385                 390                 395                 400Lys Lys Leu Tyr Phe Gln Pro Gln Gly Lys Leu Gly Phe Asp Lys Val                405                 410                 415Gln Arg Thr Asp Ser Trp Asp Glu Tyr Val Thr Asp Pro Asn Lys Pro            420                 425                 430Val Pro His Gln Gly Gly Val Ile Glu Asn Arg Thr Arg Glu Tyr Met        435                 440                 445Val Asp Asp Gln Arg Phe Ala Ala Ser Arg Pro Asp Val Met Val Tyr    450                 455                 460Gln Thr Glu Pro Leu Thr Glu Asp Leu Thr Ile Val Gly Pro Ile Lys465                 470                 475                 480Asn Phe Leu Lys Val Ser Ser Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr Val Val                485                 490                 495Lys Leu Ile Asp Val Tyr Pro Asn Asp Ala Ala Ser Tyr Gln Gly Lys            500                 505                 510Thr Met Ala Gly Tyr Gln Met Met Val Arg Gly Glu Ile Met Ala Gly        515                 520                 525Lys Tyr Arg Asn Gly Phe Asp Lys Gly Gln Ala Leu Thr Pro Gly Met    530                 535                 540Val Glu Lys Val Asn Phe Glu Met Pro Asp Val Ala His Thr Phe Lys545                 550                 555                 560Lys Gly His Arg Ile Met Val Gln Val Gln Asn Ser Trp Phe Pro Leu
                565                 570                 575Ala Glu Arg Asn Pro Gln Val Phe Leu Ala Pro Tyr Thr Ala Thr Lys            580                 585                 590Ala Asp Phe Arg Lys Ala Thr Gln Arg Ile Phe His Asp Val Lys Asn        595                 600                 605Ala Thr Tyr Ile Glu Phe Ser Val Leu Lys Asp    610                 615<210>209<211>619<212>PRT<213>鞘氨醇属某种<400>209Met Lys Asn Thr Ile Ser Cys Leu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Ala Ser1               5                   10                  15Gln Leu His Ala Gln Thr Ala Ala Asp Ser Ala Tyr Val Arg Asp His            20                  25                  30Tyr Glu Lys Thr Glu Val Ala Ile Pro Met Arg Asp Gly Lys Lys Leu        35                  40                  45Phe Thr Ala Ile Tyr Ser Pro Lys Asp Lys Set Lys Lys Tyr Pro Val    50                  55                  60Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Ala Val Ser Pro Tyr Gly Gln Asn Glu65                  70                  75                  80Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asn Phe Pro Gln Met Met Arg Glu Gly Tyr                85                  90                  95Ile Phe Val Tyr Gln Asp Val Arg Gly Lys Trp Met Ser Glu Gly Asp            100                 105                 110Phe Glu Asp Ile Arg Pro Thr Thr Tyr Ser Lys Asp Lys Lys Ala Ile        115                 120                 125Asp Glu Ser Thr Asp Thr Tyr Asp Ala Leu Glu Trp Leu Gln Lys Asn    130                 135                 140Leu Lys Asn Tyr Asn Gly Lys Ala Gly Leu Tyr Gly Ile Ser Tyr Pro145                 150                 155                 160Gly Phe Tyr Ser Thr Val Gly Leu Val Lys Thr His Pro Set Leu Lys                165                 170                 175Ala Val Ser Pro Gln Ala Pro Val Thr Asp Trp Tyr Ile Gly Asp Asp            180                 185                 190Phe His His Asn Gly Val Leu Phe Leu Gln Asp Ala Phe Thr Phe Met        195                 200                 205Ser Thr Phe Gly Val Pro Arg Pro Lys Pro Ile Thr Pro Asp Gln Phe    210                 215                 220Lys Gly Lys Ile His Ile Lys Glu Ala Asp Lys Tyr Asn Phe Phe Ala225                 230                 235                 240Glu Ala Gly Thr Ala Arg Glu Leu Lys Glu Lys Tyr Phe Gly Asp Ser                245                 250                 255
Ile Gln Phe Trp Asn Asp Leu Phe Lys His Pro Asp Tyr Asp Asp Phe            260                 265                 270Trp Lys Ser Arg Val Ile Thr Asn Ser Leu Gln Glu Val Lys Pro Ala        275                 280                 285Val Met Val Val Gly Gly Phe Phe Asp Ala Glu Asp Val Tyr Gly Thr    290                 295                 300Phe Lys Thr Tyr Gln Ser Ile Glu Glu Lys Ser Lys Lys Asn Asn Ser305                 310                 315                 320Ile Leu Val Val Gly Pro Trp Tyr His Gly Gly Trp Val Arg Ala Glu                325                 330                 335Gly Asn Tyr Leu Gly Asp Ile Gln Phe Glu Lys Lys Thr Ser Ile Thr            340                 345                 350Tyr Gln Glu Gln Phe Glu Gln Pro Phe Phe Lys Tyr Tyr Leu Lys Asp        355                 360                 365Glu Gly Asn Phe Ala Pro Ser Glu Ala Asn Ile Phe Val Ser Gly Ser    370                 375                 380Asn Glu Trp Lys His Phe Glu Gln Trp Pro Pro Lys Asn Val Glu Thr385                 390                 395                 400Lys Lys Leu Tyr Phe Gln Pro Gln Gly Lys Leu Gly Phe Asp Lys Val                405                 410                 415Gln Arg Thr Asp Ser Trp Asp Glu Tyr Val Thr Asp Pro Asn Lys Pro            420                 425                 430Val Pro His Gln Gly Gly Val Ile Glu Asn Arg Thr Arg Glu Tyr Met        435                 440                 445Val Asp Asp Gln Arg Phe Ala Ala Ser Arg Pro Asp Val Met Val Tyr    450                 455                 460Gln Thr Glu Pro Leu Thr Glu Asp Leu Thr Ile Val Gly Pro Ile Lys465                 470                 475                 480Asn Phe Leu Lys Val Ser Ser Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr Val Val                485                 490                 495Lys Leu Ile Asp Val Tyr Pro Asn Asp Ala Ala Ser Tyr Gln Gly Lys            500                 505                 510Thr Met Ala Gly Tyr Gln Met Met Val Arg Gly Glu Ile Met Ala Gly        515                 520                 525Lys Tyr Arg Asn Gly Phe Asp Lys Gly Gln Ala Leu Thr Pro Gly Met    530                 535                 540Val Glu Lys Val Asn Phe Glu Met Pro Asp Val Ala His Thr Phe Lys545                 550                 555                 560Lys Gly His Arg Ile Met Val Gln Val Gln Asn Ser Trp Phe Pro Leu                565                 570                 575Ala Glu Arg Asn Pro Gln Val Phe Leu Ala Pro Tyr Thr Ala Thr Lys            580                 585                 590Ala Asp Phe Arg Lys Ala Thr Gln Arg Ile Phe His Asp Val Lys Asn        595                 600                 605
Ala Thr Tyr Ile Glu Phe Ser Val Leu Lys Asp    610                 615<210>210<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物N67-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>210tatccagttt tgctcnnnag aacgccctac gcg                                  33<210>211<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物N67-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>211cgcgtagggc gttctnnnga gcaaaactgg ata                                  33<210>212<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物R68-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>212ccagttttgc tcaatnnnac gccctacgcg gtt                                  33<210>213<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物R68-反向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>213aaccgcgtag ggcgtnnnat tgagcaaaac tgg                                  33<210>214<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物T69-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>214gttttgctca atagannncc ctacgcggtt tct                                  33<210>215<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物T69-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>215agaaaccgcg tagggnnntc tattgagcaa aac                                  33<210>216<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P70-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>216ttgctcaata gaacgnnnta cgcggtttct cct                                  33<210>217<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P70-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>217aggagaaacc gcgtannncg ttctattgag caa                                  33<210>218<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y71-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>218ctcaatagaa cgcccnnngc ggtttctcct tat                                  33<210>219<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y71-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>219ataaggagaa accgcnnngg gcgttctatt gag                                  33<210>220<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物A72-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>220aatagaacgc cctacnnngt ttctccttat ggg                                  33<210>221<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物A72-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>221cccataagga gaaacnnngt agggcgttct att                                  33<210>222<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V73-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>222agaacgccct acgcgnnntc tccttatggg cag                                  33<210>223<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V73-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>223ctgcccataa ggagannncg cgtagggcgt tct                                  33<210>224<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物S74-正向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>224acgccctacg cggttnnncc ttatgggcag aac                                  33<210>225<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物S74-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>225gttctgccca taaggnnnaa ccgcgtaggg cgt                                  33<210>226<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P75-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>226ccctacgcgg tttctnnnta tgggcagaac gaa                                  33<210>227<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P75-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>227ttcgttctgc ccatannnag aaaccgcgta ggg                                  33<210>228<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y76-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>228tacgcggttt ctcctnnngg gcagaacgaa tac                                  33<210>229<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y76-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>229gtattcgttc tgcccnnnag gagaaaccgc gta                                  33<210>230<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G77-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>230gcggtttctc cttatnnnca gaacgaatac aaa                                  33<210>231<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G77-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>231tttgtattcg ttctgnnnat aaggagaaac cgc                                  33<210>232<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Q78-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>232gtttctcctt atgggnnnaa cgaatacaaa aaa                                  33<210>233<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Q78-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>233ttttttgtat tcgttnnncc cataaggaga aac                                  33<210>234<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物N79-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>234tctccttatg ggcagnnnga atacaaaaaa agt                                  33<210>235<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物N79-反向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>235actttttttg tattcnnnct gcccataagg aga                                  33<210>236<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物E80-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>236ccttatgggc agaacnnnta caaaaaaagt ttg                                  33<210>237<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物E80-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>237caaacttttt ttgtannngt tctgcccata agg                                  33<210>238<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y81-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>238tatgggcaga acgaannnaa aaaaagtttg gga                                  33<210>239<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y81-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>239tcccaaactt tttttnnntt cgttctgccc ata                                  33<210>240<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物K82-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>0gggcagaacg aatacnnnaa aagtttggga aac                                  33<210>241<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物K82-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>241gtttcccaaa cttttnnngt attcgttctg ccc                                  33<210>242<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物K83-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>242cagaacgaat acaaannnag tttgggaaac ttt                                  33<210>243<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物K83-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>243aaagtttccc aaactnnntt tgtattcgtt ctg                                  33<210>244<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物S84-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>244aacgaataca aaaaannntt gggaaacttt ccc                                  33<210>245<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物S84-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>245gggaaagttt cccaannntt ttttgtattc gtt                                  33<210>246<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物L85-正向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>246gaatacaaaa aaagtnnngg aaactttccc caa                                  33<210>247<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物L85-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>247ttggggaaag tttccnnnac tttttttgta ttc                                  33<210>248<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G86-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>248tacaaaaaaa gtttgnnnaa ctttccccaa atg                                  33<210>249<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G86-反向<220>
<221>misc_feature<222>16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>249catttgggga aagttnnnca aacttttttt gta                                  33<210>250<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物N87-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>250aaaaaaagtt tgggannntt tccccaaatg atg                                  33<210>251<211>33<212>NA<213>人工的<220>
<223>引物N87-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>251catcatttgg ggaaannntc ccaaactttt ttt                                  33<210>252211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F88-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>252aaaagtttgg gaaacnnncc ccaaatgatg cgt                                   33<210>253<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F88-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>253acgcatcatt tggggnnngt ttcccaaact ttt                                  33<210>254<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y100-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>254ggctatattt tcgttnnnca ggatgtccgt ggc                                  33<210>255<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y100-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>255gccacggaca tcctgnnnaa cgaaaatata gcc                                  33<210>256<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物D102-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>256attttcgttt accagnnngt ccgtggcaag tgg                                  33<210>257<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物D102-反向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>257ccacttgcca cggacnnnct ggtaaacgaa aat                                  33<210>258<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V103-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>258ttcgtttacc aggatnnncg tggcaagtgg atg                                  33<210>259<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V103-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>259catccacttg ccacgnnnat cctggtaaac gaa                                  33<210>260<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物K106-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>260caggatgtcc gtggcnnntg gatgagcgaa ggt                                  33<210>261<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物K106-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>261accttcgctc atccannngc cacggacatc ctg                                  33<210>262<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物W107-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>262gatgtccgtg gcaagnnnat gagcgaaggt gat                                  33<210>263<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物W107-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>263atcaccttcg ctcatnnnct tgccacggac atc                                  33<210>264<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F113-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>264atgagcgaag gtgatnnnga agatatacgt ccg                                  33<210>265<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F113-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>265cggacgtata tcttcnnnat caccttcgct cat                                  33<210>266<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物E114-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>266agcgaaggtg attttnnnga tatacgtccg acc                                  33<210>267<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物E114-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>267ggtcggacgt atatcnnnaa aatcaccttc gct                                  33<210>268<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物D115-正向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>268gaaggtgatt ttgaannnat acgtccgacc acg                                  33<210>269<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物D115-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>269cgtggtcgga cgtatnnntt caaaatcacc ttc                                  33<210>270<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物I116-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>270ggtgattttg aagatnnncg tccgaccacg tac                                  33<210>271<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物I116-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>271gtacgtggtc ggacgnnnat cttcaaaatc acc                                  33<210>272<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物R117-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>272gattttgaag atatannncc gaccacgtac agc                                  33<210>273<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物R117-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>273gctgtacgtg gtcggnnnta tatcttcaaa atc                                  33<210>274<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物E130-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>274aaaaaagcaa tcgatnnnag tacggatacc tat                                  33<210>275<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物E130-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>275ataggtatcc gtactnnnat cgattgcttt ttt                                  33<210>276<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y155-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>276ggcaaagccg ggctcnnngg gatttcctat cca                                  33<210>277<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y155-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>277tggataggaa atcccnnnga gcccggcttt gcc                                  33<210>278<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G156-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>278aaagccgggc tctatnnnat ttcctatcca ggc                                  33<210>279<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G156-反向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>279gcctggatag gaaatnnnat agagcccggc ttt                                  33<210>280<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物I157-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>280gccgggctct atgggnnntc ctatccaggc ttc                                  33<210>281<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物I157-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>281gaagcctgga taggannncc catagagccc ggc                                  33<210>282<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物S158-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>282gggctctatg ggattnnnta tccaggcttc tat                                  33<210>283<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物S158-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>283atagaagcct ggatannnaa tcccatagag ccc                                  33<210>284<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y159-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>284ctctatggga tttccnnncc aggcttctat tct                                  33<210>285<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y159-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>285agaatagaag cctggnnngg aaatcccata gag                                  33<210>286<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P160-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>286tatgggattt cctatnnngg cttctattct acc                                  33<210>287<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P160-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>287ggtagaatag aagccnnnat aggaaatccc ata                                  33<210>288<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G161-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>288gggatttcct atccannntt ctattctacc gtc                                  33<210>289<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G161-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>289gacggtagaa tagaannntg gataggaaat ccc                                  33<210>290<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F162-正向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>290atttcctatc caggcnnnta ttctaccgtc gga                                  33<210>291<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F162-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>291tccgacggta gaatannngc ctggatagga aat                                  33<210>292<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y163-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>292tcctatccag gcttcnnntc taccgtcgga ttg                                  33<210>293<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y163-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>293caatccgacg gtagannnga agcctggata gga                                  33<210>294<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物T165-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>294ccaggcttct attctnnngt cggattggtc aaa                                  33<210>295<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物T165-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>295tttgaccaat ccgacnnnag aatagaagcc tgg                                  33<210>296<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V166-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>296ggcttctatt ctaccnnngg attggtcaaa aca                                  33<210>297<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V166-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>297tgttttgacc aatccnnngg tagaatagaa gcc                                  33<210>298<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P180-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>298ttgaaggcag tctccnnnca ggctcccgca aca                                  33<210>299<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P180-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>299tgttgcggga gcctgnnngg agactgcctt caa                                  33<210>300<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Q181-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>300aaggcagtct ccccannngc tcccgcaaca gac                                  33<210>301<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Q181-反向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>301gtctgttgcg ggagcnnntg gggagactgc ctt                                  33<210>302<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物A182-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>302gcagtctccc cacagnnncc cgcaacagac tgg                                  33<210>303<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物A182-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>303ccagtctgtt gcgggnnnct gtggggagac tgc                                  33<210>304<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P183-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>304gtctccccac aggctnnngc aacagactgg tat                                  33<210>305<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P183-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>305ataccagtct gttgcnnnag cctgtgggga gac                                  33<210>306<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物A184-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>306tccccacagg ctcccnnnac agactggtat atc                                  33<210>307<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物A184-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>307gatataccag tctgtnnngg gagcctgtgg gga                                  33<210>308<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物T185-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>308ccacaggctc ccgcannnga ctggtatatc ggc                                  33<210>309<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物T185-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>309gccgatatac cagtcnnntg cgggagcctg tgg                                  33<210>310<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物D186-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>310caggctcccg caacannntg gtatatcggc gac                                  33<210>311<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物D186-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>311gtcgccgata taccannntg ttgcgggagc ctg                                  33<210>312<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物W187-正向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>312gctcccgcaa cagacnnnta tatcggcgac gac                                  33<210>313<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物W187-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>313gtcgtcgccg atatannngt ctgttgcggg agc                                  33<210>314<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y188-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>314cccgcaacag actggnnnat cggcgacgac ttc                                  33<210>315<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y188-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>315gaagtcgtcg ccgatnnncc agtctgttgc ggg                                  33<210>316<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G190-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>316acagactggt atatcnnnga cgacttccac cat                                  33<210>317<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G190-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>317atggtggaag tcgtcnnnga tataccagtc tgt                                  33<210>318<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物D191-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>318gactggtata tcggcnnnga cttccaccat aat                                  33<210>319<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物D191-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>319attatggtgg aagtcnnngc cgatatacca gtc                                  33<210>320<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物D192-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>320tggtatatcg gcgacnnntt ccaccataat ggc                                  33<210>321<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物D192-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>321gccattatgg tggaannngt cgccgatata cca                                  33<210>322<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F193-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>322tatatcggcg acgacnnnca ccataatggc gta                                  33<210>323<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F193-反向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>323tacgccatta tggtgnnngt cgtcgccgat ata                                  33<210>324<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物H194-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>324atcggcgacg acttcnnnca taatggcgta ttg                                  33<210>325<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物H194-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>325caatacgcca ttatgnnnga agtcgtcgcc gat                                  33<210>326<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物H195-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>326ggcgacgact tccacnnnaa tggcgtattg ttt                                  33<210>327<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物H195-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>327aaacaatacg ccat tnnngt ggaagtcgtc gcc                                 33<210>328<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F200-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>328cataatggcg tattgnnnct tcaggatgca ttt                                  33<210>329<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F200-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>329aaatgcatcc tgaagnnnca atacgccatt atg                                  33<210>330<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物L201-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>330aatggcgtat tgtttnnnca ggatgcattt aca                                  33<210>331<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物L201-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>331tgtaaatgca tcctgnnnaa acaatacgcc att                                  33<210>332<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Q202-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>332ggcgtattgt ttcttnnnga tgcatttaca ttc                                  33<210>333<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物L201-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>333gaatgtaaat gcatcnnnaa gaaacaatac gcc                                  33<210>334<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物D203-正向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>334gtattgtttc ttcagnnngc atttacattc atg                                  33<210>335<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物D203-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>335catgaatgta aatgcnnnct gaagaaacaa tac                                  33<210>336<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物A204-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>336ttgtttcttc aggatnnntt tacattcatg tca                                  33<210>337<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物A204-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>337tgacatgaat gtaaannnat cctgaagaaa caa                                  33<210>338<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F205-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>338tttcttcagg atgcannnac attcatgtca acc                                  33<210>339<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F205-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>339ggttgacatg aatgtnnntg catcctgaag aaa                                  33<210>340<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物T206-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>340cttcaggatg catttnnntt catgtcaacc ttt                                  33<210>341<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物T206-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>341aaaggttgac atgaannnaa atgcatcctg aag                                  33<210>342<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F207-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>342caggatgcat ttacannnat gtcaaccttt ggt                                  33<210>343<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F207-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>343accaaaggtt gacatnnntg taaatgcatc ctg                                  33<210>344<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物M208-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>344gatgcattta cattcnnntc aacctttggt gtc                                  33<210>345<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物M208-反向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>345gacaccaaag gttgannnga atgtaaatgc atc                                  33<210>346<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物S209-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>346gcatttacat tcatgnnnac ctttggtgtc cct                                  33<210>347<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物S209-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>347agggacacca aaggtnnnca tgaatgtaaa tgc                                  33<210>348<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物T210-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>348tttacattca tgtcannntt tggtgtccct cgt                                  33<210>349<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物T210-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>349acgagggaca ccaaannntg acatgaatgt aaa                                  33<210>350<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F211-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>350acattcatgt caaccnnngg tgtccctcgt cca                                  33<210>351<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F211-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>351tggacgaggg acaccnnngg ttgacatgaa tgt                                  33<210>352<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G212-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>352ttcatgtcaa cctttnnngt ccctcgtcca aaa                                  33<210>353<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G212-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>353ttttggacga gggacnnnaa aggttgacat gaa                                  33<210>354<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V213-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>354atgtcaacct ttggtnnncc tcgtccaaaa ccc                                  33<210>355<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V213-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>355gggttttgga cgaggnnnac caaaggttga cat                                  33<210>356<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P214-正向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>356tcaacctttg gtgtcnnncg tccaaaaccc att                                  33<210>357<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P214-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>357aatgggtttt ggacgnnnga caccaaaggt tga                                  33<210>358<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物R215-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>358acctttggtg tccctnnncc aaaacccatt aca                                  33<210>359<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物R215-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>359tgtaatgggt tttggnnnag ggacaccaaa ggt                                  33<210>360<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P216-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>360tttggtgtcc ctcgtnnnaa acccattaca ccg                                  33<210>361<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P216-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>361cggtgtaatg ggtttnnnac gagggacacc aaa                                  33<210>362<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物K217-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>362ggtgtccctc gtccannncc cattacaccg gat                                  33<210>363<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物K217-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>363atccggtgta atgggnnntg gacgagggac acc                                  33<210>364<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P218-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>364gtccctcgtc caaaannnat tacaccggat caa                                  33<210>365<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P218-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>365ttgatccggt gtaatnnntt ttggacgagg gac                                  33<210>366<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物I219-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>366cctcgtccaa aacccnnnac accggatcaa ttt                                  33<210>367<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物I219-反向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>367aaattgatcc ggtgtnnngg gttttggacg agg                                  33<210>368<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物T220-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>368cgtccaaaac ccattnnncc ggatcaattt aag                                  33<210>369<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物T220-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>369cttaaattga tccggnnnaa tgggttttgg acg                                  33<210>370<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P221-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>370ccaaaaccca ttacannnga tcaatttaag ggc                                  33<210>371<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P221-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>371gcccttaaat tgatcnnntg taatgggttt tgg                                  33<210>372<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物D222-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>372aaacccatta caccgnnnca atttaagggc aaa                                  33<210>373<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物D222-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>373tttgccctta aattgnnncg gtgtaatggg ttt                                  33<210>374<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Q223-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>374cccattacac cggatnnntt taagggcaaa att                                  33<210>375<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Q223-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>375aattttgccc ttaaannnat ccggtgtaat ggg                                  33<210>376<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F224-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>376attacaccgg atcaannnaa gggcaaaatt cct                                  33<210>377<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F224-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>377aggaattttg cccttnnntt gatccggtgt aat                                  33<210>378<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物K225-正向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>378acaccggatc aatttnnngg caaaattcct atc                                  33<210>379<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物K225-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>379gataggaatt ttgccnnnaa attgatccgg tgt                                  33<210>380<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G226-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>380ccggatcaat ttaagnnnaa aattcctatc aaa                                  33<210>381<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G226-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>381tttgatagga attttnnnct taaattgatc cgg                                  33<210>382<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物K227-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>382gatcaattta agggcnnnat tcctatcaaa gaa                                  33<210>383<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物K227-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>383ttctttgata ggaatnnngc ccttaaattg atc                                  33<210>384<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物I228-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>384caatttaagg gcaaannncc tatcaaagaa gcc                                  33<210>385<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物I228-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>385ggcttctttg ataggnnntt tgcccttaaa ttg                                  33<210>386<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P229-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>386tttaagggca aaattnnnat caaagaagcc gat                                  33<210>387<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P229-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>387atcggcttct ttgatnnnaa ttttgccctt aaa                                  33<210>388<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物I230-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>388aagggcaaaa ttcctnnnaa agaagccgat aaa                                  33<210>389<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物I230-反向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>389tttatcggct tctttnnnag gaattttgcc ctt                                  33<210>390<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物K231-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>390ggcaaaattc ctatcnnnga agccgataaa tat                                  33<210>391<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物K231-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>391atatttatcg gcttcnnnga taggaatttt gcc                                  33<210>392<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物E232-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>392aaaattccta tcaaannngc cgataaatat aac                                  33<210>393<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物E232-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>393gttatattta tcggcnnntt tgataggaat ttt                                  33<210>394<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物A233-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>394attcctatca aagaannnga taaatataac ttt                                  33<210>395<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物A233-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>395aaagttatat ttatcnnntt ctttgatagg aat                                  33<210>396<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物D234-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>396cctatcaaag aagccnnnaa atataacttt ttt                                  33<210>397<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物D234-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>397aaaaaagtta tatttnnngg cttctttgat agg                                  33<210>398<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物K235-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>398atcaaagaag ccgatnnnta taactttttt gca                                  33<210>399<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物K235-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>399tgcaaaaaag ttatannnat cggcttcttt gat                                  33<210>400<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F259-正向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>400ggtgactcca tacaannntg gaatgacctg ttt                                  33<210>401<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F259-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>401aaacaggtca ttccannntt gtatggagtc acc                                  33<210>402<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物W273-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>402gactatgatg attttnnnaa atcgcgtgtg atc                                  33<210>403<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物W273-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>403gatcacacgc gatttnnnaa aatcatcata gtc                                  33<210>404<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物R276-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>404gatttttgga aatcgnnngt gatcaccaat tct                                  33<210>405<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物R276-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>405agaattggtg atcacnnncg atttccaaaa atc                                  33<210>406<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物R278-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>406tggaaatcgc gtgtgnnnac caattcttta cag                                  33<210>407<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物R278-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>407ctgtaaagaa ttggtnnnca cacgcgattt cca                                  33<210>408<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V292-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>408ccagctgtga tggtgnnngg tggtttcttt gac                                  33<210>409<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V292-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>409gtcaaagaaa ccaccnnnca ccatcacagc tgg                                  33<210>410<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G293-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>410gctgtgatgg tggttnnngg tttctttgac gcg                                  33<210>411<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G293-反向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>411cgcgtcaaag aaaccnnnaa ccaccatcac agc                                  33<210>412<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G294-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>412gtgatggtgg ttggtnnntt ctttgacgcg gaa                                  33<210>413<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G294-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>413ttccgcgtca aagaannnac caaccaccat cac                                  33<210>414<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F296-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>414gtggttggtg gtttcnnnga cgcggaagat gtt                                  33<210>415<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物F296-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>415aacatcttcc gcgtcnnnga aaccaccaac cac                                  33<210>416<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物A298-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>416ggtggtttct ttgacnnnga agatgtttat gga                                  33<210>417<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物A298-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>417tccataaaca tcttcnnngt caaagaaacc acc                                  33<210>418<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物E299-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>418ggtttctttg acgcgnnnga tgtttatgga aca                                  33<210>419<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物E299-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>419tgttccataa acatcnnncg cgtcaaagaa acc                                  33<210>420<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物D300-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>420ttctttgacg cggaannngt ttatggaaca ttt                                  33<210>421<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物D300-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>421aaatgttcca taaacnnntt ccgcgtcaaa gaa                                  33<210>422<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V301-正向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>422tttgacgcgg aagatnnnta tggaacattt aag                                  33<210>423<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V301-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>423cttaaatgtt ccatannnat cttccgcgtc aaa                                  33<210>424<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y302-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>424gacgcggaag atgttnnngg aacatttaag acc                                  33<210>425<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y302-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>425ggtcttaaat gttccnnnaa catcttccgc gtc                                  33<210>426<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G303-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>426gcggaagatg tttatnnnac atttaagacc tac                                  33<210>427<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G303-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>427gtaggtctta aatgtnnnat aaacatcttc cgc                                  33<210>428<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物T304-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>428gaagatgttt atggannntt taagacctac caa                                  33<210>429<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物T304-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>429ttggtaggtc ttaaannntc cataaacatc ttc                                  33<210>430<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G325-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>430tcgattttag tcgtgnnncc ttggtatcat ggc                                  33<210>431<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G325-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>431gccatgatac caaggnnnca cgactaaaat cga                                  33<210>432<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P326-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>432attttagtcg tgggannntg gtatcatggc ggc                                  33<210>433<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物P326-反向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>433gccgccatga taccannntc ccacgactaa aat                                  33<210>434<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物W327-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>434ttagtcgtgg gacctnnnta tcatggcggc tgg                                  33<210>435<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物W327-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>435ccagccgcca tgatannnag gtcccacgac taa                                  33<210>436<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y328-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>436gtcgtgggac cttggnnnca tggcggctgg gtt                                  33<210>437<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y328-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>437aacccagccg ccatgnnncc aaggtcccac gac                                  33<210>438<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物H329-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>438gtgggacctt ggtatnnngg cggctgggtt cgt                                  33<210>439<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物H329-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>439acgaacccag ccgccnnnat accaaggtcc cac                                  33<210>440<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G330-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>440ggaccttggt atcatnnngg ctgggttcgt gca                                  33<210>441<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G330-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>441tgcacgaacc cagccnnnat gataccaagg tcc                                  33<210>442<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G331-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>442ccttggtatc atggcnnntg ggttcgtgca gaa                                  33<210>443<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G331-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>443ttctgcacga acccannngc catgatacca agg                                  33<210>444<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物W332-正向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>444tggtatcatg gcggcnnngt tcgtgcagaa gga                                  33<210>445<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物W332-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>445tccttctgca cgaacnnngc cgccatgata cca                                  33<210>446<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V333-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>446tatcatggcg gctggnnncg tgcagaagga aac                                  33<210>447<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V333-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>447gtttccttct gcacgnnncc agccgccatg ata                                  33<210>448<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物R334-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>448catggcggct gggt tnnngc agaaggaaac tat                                 33<210>449<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物R334-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>449atagtttcct tctgcnnnaa cccagccgcc atg                                  33<210>450<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物A335-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>450ggcggctggg ttcgtnnnga aggaaactat tta                                  33<210>451<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物A335-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>451taaatagttt ccttcnnnac gaacccagcc gcc                                  33<210>452<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物E336-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>452ggctgggttc gtgcannngg aaactattta ggt                                  33<210>453<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物E336-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>453acctaaatag tttccnnntg cacgaaccca gcc                                  33<210>454<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G337-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>454tgggttcgtg cagaannnaa ctatttaggt gat                                  33<210>455<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G337-反向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>455atcacctaaa tagttnnntt ctgcacgaac cca                                  33<210>456<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物N338-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>456gttcgtgcag aaggannnta tttaggtgat atc                                  33<210>457<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物N338-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>457gatatcacct aaatannntc cttctgcacg aac                                  33<210>458<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y339-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>458cgtgcagaag gaaacnnntt aggtgatatc caa                                  33<210>459<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y339-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>459ttggatatca cctaannngt ttccttctgc acg                                  33<210>460<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物L340-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>460gcagaaggaa actatnnngg tgatatccaa ttt                                  33<210>461<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物L340-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>461aaattggata tcaccnnnat agtttccttc tgc                                  33<210>462<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G437-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>462cctgttccgc atcaannngg ggtaattgaa aac                                  33<210>463<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G437-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>463gttttcaatt accccnnntt gatgcggaac agg                                  33<210>464<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G438-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>464gttccgcatc aaggtnnngt aattgaaaac cga                                  33<210>465<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物G438-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>465tcggttttca attacnnnac cttgatgcgg aac                                  33<210>466<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V439-正向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>466ccgcatcaag gtgggnnnat tgaaaaccga aca                                  33<210>467<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物V439-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>467tgttcggttt tcaatnnncc caccttgatg cgg                                  33<210>468<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物I440-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>468catcaaggtg gggtannnga aaaccgaaca cgg                                  33<210>469<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物I440-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>469ccgtgttcgg ttttcnnnta ccccaccttg atg                                  33<210>470<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物E441-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>470caaggtgggg taattnnnaa ccgaacacgg gag                                  33<210>471<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物E441-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>471ctcccgtgtt cggttnnnaa ttaccccacc ttg                                  33<210>472<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物N442-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>472ggtggggtaa ttgaannncg aacacgggag tat                                  33<210>473<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物N442-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t
<400>473atactcccgt gttcgnnntt caattacccc acc                                  33<210>474<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物R443-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>474ggggtaattg aaaacnnnac acgggagtat atg                                  33<210>475<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物R443-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>475catatactcc cgtgtnnngt tttcaattac ccc                                  33<210>476<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物T444-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>476gtaattgaaa accgannncg ggagtatatg gta                                  33<210>477<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物T444-反向
<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>477taccatatac tcccgnnntc ggttttcaat tac                                  33<210>478<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物R445-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>478attgaaaacc gaacannnga gtatatggta gat                                  33<210>479<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物R445-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>479atctaccata tactcnnntg ttcggttttc aat                                  33<210>480<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物E446-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>480gaaaaccgaa cacggnnnta tatggtagat gat                                  33<210>481<211>33
<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物E446-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>481atcatctacc atatannncc gtgttcggtt ttc                                  33<210>482<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y447-正向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>482aaccgaacac gggagnnnat ggtagatgat caa                                  33<210>483<211>33<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物Y447-反向<220>
<221>misc_feature<222>(16)..(18)<223>n是a，c，g，或t<400>483ttgatcatct accatnnnct cccgtgttcg gtt                                  3权利要求
1.具有如下氨基酸序列的突变型蛋白质，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中含有选自下述突变型1～68的任意1种或2种以上的突变的氨基酸序列；突变型1F207V，突变型2Q441E，突变型3K83A，突变型4A301V，突变型5V257I，突变型6A537G，突变型7A324V，突变型8N607K，突变型9D313E，突变型10Q229H，突变型11M208A，突变型12E551K，突变型13F207H，突变型14T72A，突变型15A137S，突变型16L439V，突变型17G226S，突变型18D619E，突变型19Y339H，突变型20W327G，突变型21V184A，突变型22V184C，突变型23V184G，突变型24V184I，突变型25V184L，突变型26V184M，突变型27V184P，突变型28V184S，突变型29V184T，突变型30Q441K，突变型31N442K，突变型32D203N，突变型33D203S，突变型34F207A，突变型35F207S，突变型36Q441N，突变型37F207T，突变型38F207I，突变型39T210K，突变型40W187A，突变型41S209A，突变型42F211A，突变型43F211V，突变型44V257A，突变型45V257G，突变型46V257H，突变型47V257M，突变型48V257N，突变型49V257Q，突变型50V257S，突变型51V257T，突变型52V257W，突变型53V257Y，突变型54K47G，突变型55K47E，突变型56N442F，突变型57N607R，突变型58P214T，突变型59Q202E，突变型60Y494F，突变型61R117A，突变型62F207G，突变型63S209D，突变型64S209G，突变型65Q441D，突变型66R445D，突变型67R445F，突变型68N442D。
2.根据权利要求1所述的突变型蛋白质，其具有如下氨基酸序列，并具有肽合成活性，所述氨基酸序列是在含有选自上述突变型1～68的任意1种或2种以上的突变的氨基酸序列的突变部位之外的部位，还含有选自取代、缺失、插入、添加和倒位的1个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所示的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型2。
4.根据权利要求1～3任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型14。
5.具有如下氨基酸序列的突变型蛋白质，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中含有选自下述突变型239～290、324～377之中任意1种或2种以上的突变；突变型239F207V/Q441E，突变型240F207V/K83A，突变型241F207V/E551K，突变型242K83A/Q441E，突变型243M208A/E551K，突变型244V257I/Q441E，突变型245V257I/A537G，突变型246F207V/S209A，突变型247K83A/S209A，突变型248K83A/F207V/Q441E，突变型249L439V/F207V/Q441E，突变型250A537G/F207V/Q441E，突变型251A301V/F207V/Q441E，突变型252G226S/F207V/Q441E，突变型253V257I/F207V/Q441E，突变型254D619E/F207V/Q441E，突变型255Y339H/F207V/Q441E，突变型256N607K/F207V/Q441E，突变型257A324V/F207V/Q441E，突变型258Q229H/F207V/Q441E，突变型259W327G/F207V/Q441E，突变型260A301V/L439V/A537G/N607K，突变型261K83A/Q229H/A301V/D313E/A324V/L439V/A537G/N607K，突变型262Q229H/V257I/A301V/A324V/Q441E/A537G/N607K，突变型263Q229H/A301V/A324V/Q441E/A537G/N607K，突变型264Q229H/V257I/A301V/D313E/A324V/Q441E/A537G/N607K，突变型265T72A/A137S/A301V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型266T72A/A137S/A301V/Q441E/A537G/N607K，突变型267T72A/A137S/Q229H/A301V/A324V/L439V/A537G/N607K，突变型268T72A/A137S/Q229H/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型269T72A/Q229H/V257I/A301V/D313E/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型270T72A/Q229H/V257I/A301V/D313E/A324V/Q441E/A537G/N607K，突变型271T72A/A137S/Q229P/A301V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型272T72A/A137S/Q229L/A301V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型273T72A/A137S/Q229G/A301V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型274T72A/Q229I/V257I/A301V/D313E/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型275T72A/A137S/I228G/Q229P/A301V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型276T72A/A137S/I228L/Q229P/A301V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型277T72A/A137S/I228D/Q229P/A301V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型278T72A/A137S/Q229P/I230D/A301V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型279T72A/A137S/Q229P/I230V/A301V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型280T72A/I228S/Q229H/V257I/A301V/D313E/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型281T72A/Q229H/S256C/V257I/A301V/D313E/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型282T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型283T72A/A137S/Q229P/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型284T72A/Q229P/V257I/A301G/D313E/A324V/Q441E/A537G/N607K，突变型285T72A/Q229P/V257I/A301V/D313E/A324V/Q441E/A537G/N607K，突变型286T72A/A137S/V184A/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型287T72A/A137S/V184G/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型288T72A/A137S/V184N/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型289T72A/A137S/V184S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型290T72A/A137S/V184T/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K，突变型324V184A/V257Y，突变型325V184A/W187A，突变型326V184A/N442D，突变型327V184P/N442D，突变型328V184A/N442D/L439V，突变型329A301V/L439V/A537G/N607K/V184A，突变型330A301V/L439V/A537G/N607K/V184P，突变型331A301V/L439V/A537G/N607K/V257Y，突变型332A301V/L439V/A537G/N607K/W187A，  突变型333A301V/L439V/A537G/N607K/F211A，突变型334A301V/L439V/A537G/N607K/Q441E，突变型335A301V/L439V/A537G/N607K/N442D，突变型336A301V/L439V/A537G/N607K/V184A/F207V，突变型337A301V/L439V/A537G/N607K/V184A/A182G，突变型338T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/A537G/N607K/V184A/N442D，突变型339T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/A537G/N607K/V184A/N442D/T185F，突变型340T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/K83A，突变型341T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/W187A，突变型342T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/F211A，突变型343T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/V178G，突变型344T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185A，突变型345T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/A182G，突变型346T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/K314R，突变型347T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/A515V，突变型348T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/L66F，突变型349T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/S315R，突变型350T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/K484I，突变型351T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/V213A，突变型352T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/A245S，突变型353T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/P214H，突变型354T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/L263M，突变型355T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/P183A，突变型356T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185K，突变型357T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185D，突变型358T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185C，突变型359T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185S，突变型360T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185F，突变型361T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185P，突变型362T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185N，突变型363T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/P183A/A182G，突变型364T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/P183A/A182S，突变型365T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/T185F/N442D，突变型366T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/L66F/E80K/I157L/A182G/P214H/L263M，突变型367T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/L66F/E80K/I157L/A182G/P214H/L263M/Y328F，突变型368T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/L66F/Y81A/I157L/A182G/P214H/L263M/Y328F，突变型369T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/L66F/E80K/I157L/A182G/T210L/L263M/Y328F，突变型370A301V/L439V/A537G/N607K/Q441K，突变型371T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/I157L，突变型372T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/G161A，突变型373T72A/A137S/Q229P/V257I/A301V/A324V/L439V/Q441E/A537G/N607K/V184A/Y328F，突变型374F207V/G226S，突变型375F207V/W327G，突变型376F207V/Y339H，突变型377F207V/D619E。
6.根据权利要求5所述的突变型蛋白质，其具有如下氨基酸序列，并具有肽合成活性，所述氨基酸序列是在含有选自上述突变型239～290和324～377之中的任意1种或2种以上的突变的氨基酸序列的突变部位之外的部位，还含有选自取代、缺失、插入、添加和倒位的1个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。
7.根据权利要求5或6所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型260。
8.根据权利要求5～7任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型286。
9.编码具有权利要求1～8任一项所述的突变型蛋白质的氨基酸序列的多核苷酸。
10.含有权利要求9所述的多核苷酸的重组多核苷酸。
11.含有权利要求10所述的重组多核苷酸的经过转化的微生物。
12.突变型蛋白质的制造方法，其特征在于，在培养基中培养权利要求11所述的经过转化的微生物，使上述突变型蛋白质在培养基和/或微生物中积累。
13.肽的制造方法，其特征在于，在权利要求1～8任一项所述的突变型蛋白质存在下，进行肽生成反应。
14.肽的制造方法，其特征在于，在培养基中培养权利要求11所述的经过转化的微生物，使上述突变型蛋白质在培养基中和/或经过转化的微生物中积累，进行肤生成反应。
15.α-L-天门冬氨酰基-L-苯丙氨酸-β-酯的制造方法，其特征在于，在权利要求1～8任一项所述的突变型蛋白质存在下，进行L-天门冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸之间的反应。
16.α-L-天门冬氨酰基-L-苯丙氨酸-β-酯的制造方法，其特征在于，在培养基中培养权利要求11所述的经过转化的微生物，使上述突变型蛋白质在培养基和/或经过转化的微生物中积累，进行L-天门冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸之间的反应。
17.设计和制造具有肽合成活性的突变型蛋白质的方法，其包括基于用X射线晶体结构分析得到的具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构，推测该蛋白质的底物结合部位，取代、插入或缺失位于底物结合部位的氨基酸残基。
18.在具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构中，在上述序列中的第67～70、72～88、100、102、103、106、107、113～117、130、155～163、165、166、180～188、190～195、200～235、259、273、276、278、292～294、296、298、299、300～304、325～328、330～340和437～447位氨基酸残基的存在位置，至少有1个或1个以上氨基酸残基被取代、插入或缺失得到的，并具有肽合成活性的突变型蛋白质。
19.具有肽合成活性的蛋白质的突变型蛋白质，经穿引法鉴定，该蛋白质的三维结构和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的三维结构类似，在该鉴定得到的序列比对中，在对应于SEQ IDNO209所示的氨基酸序列的第67～70、72～88、100、102、103、106、107、113～117、130、155～163、165、166、180～188、190～195、200～235、259、273、276、278、292～294、296、298、299、300～304、325～328、330～340和437～447位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，所述突变型蛋白质具有肽合成活性。
20.具有肽合成活性的蛋白质的突变型蛋白质，在将该蛋白质和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的一级序列比对，或将该蛋白质和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的三维结构比对时，一级序列的同源性大于等于25％，在对应于SEQ IDNO209所示的氨基酸序列的第67～70、72～88、100、102、103、106、107、113～117、130、155～163、165、166、180～188、190～195、200～235、259、273、276、278、292～294、296、298、299、300～304、325～328、330～340和437～447位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，并且该突变型蛋白质具有肽合成活性。
21.在具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构中，发生1种或2种以上选自下述(a)～(i)的立体结构变化，并具有肤合成活性的突变型蛋白质；(a)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第79～82位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(b)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第84、88、89和92位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(c)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第72、75和77位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(d)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第159、161、162、184、187和276位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(e)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第70、106、113、115、193、207、209～212、216和259位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(f)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第200、202～205、207和228位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(g)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第233、234和439位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(h)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第328、339、340、445和446位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(i)SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中第87、155、157和160位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失。
22.具有肽合成活性的蛋白质的突变型蛋白质，经穿引法鉴定，该蛋白质的三维结构和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的三维结构类似，由该鉴定得到的序列比对可知该突变型蛋白质中发生了1种或2种以上选自下述(a’)～(i’)的变化，所述突变型蛋白质具有肽合成活性；(a’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第79～82位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(b’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第84、88、89和92位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(c’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第72、75和77位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(d’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第159、161、162、184、187和276位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(e’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第70、106、113、115、193、207、209～212、216和259位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(f’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第200、202～205、207和228位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(g’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第233、234和439位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(h’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第328、339、340、445和446位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(i’)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第87、155、157和160位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失。
23.具有肽合成活性的蛋白质的突变型蛋白质，在将该蛋白质和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的一级序列比对，或将该蛋白质和具有SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的蛋白质的三维结构比对时，一级序列的同源性大于等于25％，所述突变型蛋白质中发生了1种或2种以上选自下述(a”)～(i”)的变化，所述突变型蛋白质具有肽合成活性；(a”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第79～82位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(b”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第84、88、89和92位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(c”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第72、75和77位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(d”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第159、161、162、184、187和276位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(e”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第70、106、113、115、193、207、209～212、216和259位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(f”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第200、202～205、207和228位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(g”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第233、234和439位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(h”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第328、339、340、445和446位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，(i”)在对应于SEQ ID NO209所示的氨基酸序列的第87、155、157和160位氨基酸残基的立体结构中，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失。
24.在具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构中，该序列的第67、69、70、72～85、103、106、107、113～116、165、182、183、185、187、188、190、200、202、204～206、209～211、213～235、301、328、338～340、440～442和446位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，并具有肽合成活性的突变型蛋白质。
25.在具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构中，该序列的第67、69、70、72～84、106、107、114、116、183、185、187、188、202、204～206、209、211、213～233、235、328、338～442和446位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，并具有肽合成活性的突变型蛋白质。
26.在具有SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的蛋白质的立体结构中，该序列的第67、70、72～75、77～79、81～84、114、116、185、188、202、204、206、209、211、213～215、218～224、226～233、235、328、338～441和446位氨基酸残基的位置上，至少有1个或1个以上的氨基酸残基被取代、插入或缺失，并具有肽合成活性的突变型蛋白质。
27.具有如下氨基酸序列的突变型蛋白质，所述氨基酸序列包含SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的下述突变型L1～L335之中的任意1个或1个以上的突变；突变型L1N67K，突变型L2N67L，突变型L3N67S，突变型L4T69I，突变型L5T69M，突变型L6T69Q，突变型L7T69R，突变型L8T69V，突变型L9P70G，突变型L10P70N突变型L11P70S，突变型L12P70T，突变型L13P70V，突变型L14A72C，突变型L15A72D，突变型L16A72E，突变型L17A72I，突变型L18A72L，突变型L19A72M，突变型L20A72N，突变型L21A72Q，突变型L22A72S，突变型L23A72V，突变型L24V73A，突变型L25V73I，突变型L26V73L，突变型L27V73M，突变型L28V73N，突变型L29V73S，突变型L30V73T，突变型L31S74A，突变型L32S74F，突变型L33S74K，突变型L34S74N，突变型L35S74T，突变型L36S74V，突变型L37P75A，突变型L38P75D，突变型L39P75L，突变型L40P75S，突变型L41Y76F，突变型L42Y76H，突变型L43Y76I，突变型L44Y76V，突变型L45Y76W，突变型L46G77A，突变型L47G77F，突变型L48G77K，突变型L49G77M，突变型L50G77N，突变型L51G77P，突变型L52G77S，突变型L53G77T，突变型L54Q78F，突变型L55Q78L，突变型L56N79D，突变型L57N79L，突变型L58N79R，突变型L59N79S，突变型L60E80D，突变型L61E80F，突变型L62E80L，突变型L63E80P，突变型L64E80S，突变型L65Y81A，突变型L66Y81C，突变型L67Y81D，突变型L68Y81E，突变型L69Y81F，突变型L70Y81H，突变型L71Y81K，突变型L72Y81L，突变型L73Y81N，突变型L74Y81S，突变型L75Y81T，突变型L76Y81W，突变型L77K82D，突变型L78K82L，突变型L79K82P，突变型L80K82S，突变型L81K83D，突变型L82K83F，突变型L83K83L，突变型L84K83P，突变型L85K83S，突变型L86K83V，突变型L87S84D，突变型L88S84F，突变型L89S84K，突变型L90S84L，突变型L91S84N，突变型L92S84Q，突变型L93L85F，突变型L94L85I，突变型L95L85P，突变型L96L85V，突变型L97N87E，突变型L98N87Q，突变型L99F88E，突变型L100V103I，突变型L101V103L，突变型L102K106A，突变型L103K106F，突变型L104K106L，突变型L105K106Q，突变型L106K106S，突变型L107W107A，突变型L108W107Y，突变型L109F113A，突变型L110F113W，突变型L111F113Y，突变型L112E114A，突变型L113E114D，突变型L114D115E，突变型L115D115Q，突变型L116D115S，突变型L117I116F，突变型L118I116K，突变型L119I116L，突变型L120I116M，突变型L121I116N，突变型L122I116T，突变型L123I116V，突变型L124I157K，突变型L125I157L，突变型L126Y159G，突变型L127Y159N，突变型L128Y159S，突变型L129P160G，突变型L130G161A，突变型L131F162L，突变型L132F162Y，突变型L133Y163I，突变型L134T165V，突变型L135Q181F，突变型L136A182G，突变型L137A182S，突变型L138P183A，突变型L139P183G，突变型L140P183S，突变型L141T185A，突变型L142T185G，突变型L143T185V，突变型L144W187A，突变型L145W187F，突变型L146W187H，突变型L147W187Y，突变型L148Y188F，突变型L149Y188L，突变型L150Y188W，突变型L151G190A，突变型L152G190D，突变型L153F193W，突变型L154H194D，突变型L155F200A，突变型L156F200L，突变型L157F200S，突变型L158F200V，突变型L159L201Q，突变型L160L201S，突变型L161Q202A，突变型L162Q202D，突变型L163Q202F，突变型L164Q202S，突变型L165Q202T，突变型L166Q202V，突变型L167D203E，突变型L168A204G，突变型L169A204L，突变型L170A204S，突变型L171A204T，突变型L172A204V，突变型L173F205L，突变型L174F205Q，突变型L175F205V，突变型L176F205W，突变型L177T206F，突变型L178T206K，突变型L179T206L，突变型L180F207I，突变型L181F207W，突变型L182F207Y，突变型L183M208A，突变型L184M208L，突变型L185S209F，突变型L186S209K，突变型L187S209L，突变型L188S209N，突变型L189S209V，突变型L190T210A，突变型L191T210L，突变型L192T210Q，突变型L193T210V，突变型L194F211A，突变型L195F211I，突变型L196F211L，突变型L197F211M，突变型L198F211V，突变型L199F211W，突变型L200F211Y，突变型L201G212A，突变型L202V213D，突变型L203V213F，突变型L204V213K，突变型L205V213S，突变型L206P214D，突变型L207P214F，突变型L208P214K，突变型L209P214S，突变型L210R215A，突变型L211R215I，突变型L212R215K，突变型L213R215Q，突变型L214R215S，突变型L215R215T，突变型L216R215Y，突变型L217P216D，突变型L218P216K，突变型L219K217D，突变型L220P218F，突变型L221P218L，突变型L222P218Q，突变型L223P218S，突变型L224I219D，突变型L225I219F，突变型L226I219K，突变型L227T220A，突变型L228T220D，突变型L229T220F，突变型L230T220K，突变型L231T220L，突变型L232T220S，突变型L233P221A，突变型L234P221D，突变型L235P221F，突变型L236P221K，突变型L237P221L，突变型L238P221S，突变型L239D222A，突变型L240D222F，突变型L241D222L，突变型L242D222R，突变型L243Q223F，突变型L244Q223K，突变型L245Q223L，突变型L246Q223S，突变型L247F224A，突变型L248F224D，突变型L249F224G，突变型L250F224K，突变型L251F224L，突变型L252K225D，突变型L253K225G，突变型L254K225S，突变型L255G226A，突变型L256G226F，突变型L257G226L，突变型L258G226N，突变型L259G226S，突变型L260K227D，突变型L261K227F，突变型L262K227S，突变型L263I228A，突变型L264I228F，突变型L265I228K，突变型L266I228S，突变型L267P229A，突变型L268P229D，突变型L269P229K，突变型L270P229L，突变型L271P229S，突变型L272I230A，突变型L273I230F，突变型L274I230K，突变型L275I230S，突变型L276K231F，突变型L277K231L，突变型L278K231S，突变型L279E232D，突变型L280E232F，突变型L281E232G，突变型L282E232L，突变型L283E232S，突变型L284A233D，突变型L285A233F，突变型L286A233H，突变型L287A233K，突变型L288A233L，突变型L289A233N，突变型L290A233S，突变型L291D234L，突变型L292D234S，突变型L293K235D，突变型L294K235F，突变型L295K235L，突变型L296K235S，突变型L297K259Y，突变型L298R276A，突变型L299R276Q，突变型L300A298S，突变型L301D300N，突变型L302V301M，突变型L303Y328F，突变型L304Y328H，突变型L305Y328M，突变型L306Y328W，突变型L307W332H，突变型L308E336A，突变型L309N338A，突变型L310N338F，突变型L311Y339K，突变型L312Y339L，突变型L313Y339T，突变型L314L340A，突变型L315L340I，突变型L316L340V，突变型L317V439P，突变型L318I440F，突变型L319I440V，突变型L320E441F，突变型L321E441M，突变型L322E441N，突变型L323N442A，突变型L324N442L，突变型L325R443S，突变型L326T444W，突变型L327R445G，突变型L328R445K，突变型L329E446A，突变型L330E446F，突变型L331E446Q，突变型L332E446S，突变型L333E446T，突变型L334Y447L，突变型L335Y447S。
28.根据权利要求20所述的突变型蛋白质，其具有如下氨基酸序列，并具有肽合成活性，所述氨基酸序列是在含有上述突变型L1～L335之中的任意1种或2种以上的突变的氨基酸序列的突变部位之外的部位，还含有选自取代、缺失、插入、添加或倒位的1个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。
29.根据权利要求27或28所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L124或突变型L125。
30.根据权利要求27～29任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L303。
31.根据权利要求27～30任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L12。
32.根据权利要求27～31任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L127。
33.根据权利要求27～32任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L195或L199。
34.根据权利要求27～33任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L130。
35.根据权利要求27～34任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L115。
36.根据权利要求27～35任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L316。
37.根据权利要求27～36任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L99。
38.根据权利要求27～37任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L15或L16。
39.根据权利要求27～38任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L131。
40.根据权利要求27～39任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L284。
41.根据权利要求27～40任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L191。
42.根据权利要求27～41任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L65。
43.根据权利要求27～42任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L265。
44.根据权利要求27～43任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L317。
45.根据权利要求27～44任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L255。
46.根据权利要求27～45任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L52。
47.根据权利要求27～46任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L155。
48.根据权利要求27～47任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L298。
49.根据权利要求27～48任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L201。
50.根据权利要求27～49任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L145。
51.根据权利要求27～50任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L170。
52.根据权利要求27～51任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L87。
53.根据权利要求27～52任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L60。
54.根据权利要求27～53任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型L110。
55.具有如下氨基酸序列的突变型蛋白质，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO208所示的氨基酸序列中含有下述突变型M1～M642之中的任意1种或2种以上的突变；突变型M1T69N/1157L，突变型M2T69Q/1157L，突变型M3T69S/1157L，突变型M4P70A/1157L，突变型M5P70G/1157L，突变型M6P70I/1157L，突变型M7P70L/1157L，突变型M8P70N/1157L，突变型M9P70S/1157L，突变型M10P70T/1157L，突变型M11P70T/T210L，突变型M12P70T/Y328F，突变型M13P70V/1157L，突变型M14A72E/G77S，突变型M15A72E/E80D，突变型M16A72E/Y81A，突变型M17A72E/S84D，突变型M18A72E/F113W，突变型M19A72E/I157L，突变型M20A72E/G161A，突变型M21A72E/F162L，突变型M22A72E/A184G，突变型M23A72E/W187F，突变型M24A72E/F200A，突变型M25A72E/A204S，突变型M26A72E/T210L，突变型M27A72E/F211L，突变型M28A72E/F211W，突变型M29A72E/G226A，突变型M30A72E/I228K，突变型M31A72E/A233D，突变型M32A72E/Y328F，突变型M33A72S/I157L，突变型M34A72V/Y328F，突变型M35V73A/I157L，突变型M36V73I/I157L，突变型M37S74A/I157L，突变型M38S74N/I157L，突变型M39S74T/I157L，突变型M40S74V/I157L，突变型M41G77A/I157L，突变型M42G77F/I157L，突变型M43G77M/I157L，突变型M44G77P/I157L，突变型M45G77S/E80D，突变型M46G77S/Y81A，突变型M47G77S/S84D，突变型M48G77S/F113W，突变型M49G77S/I157L，突变型M50G77S/Y159N，突变型M51G77S/Y159S，突变型M52G77S/G161A，突变型M53G77S/F162L，突变型M54G77S/A184G，突变型M55G77S/W187F，突变型M56G77S/F200A，突变型M57G77S/A204S，突变型M58G77S/T210L，突变型M59G77S/F211L，突变型M60G77S/F211W，突变型M61G77S/I228K，突变型M62G77S/A233D，突变型M63G77S/R76A，突变型M64G77S/Y328F，突变型M65E80D/Y81A，突变型M66E80D/F113W，突变型M67E80D/I157L，突变型M68E80D/Y159N，突变型M69E80D/G161A，突变型M70E80D/A184G，突变型M71E80D/F211W，突变型M72E80D/Y328F，突变型M73E80S/I157L，突变型M74Y81A/F113W，突变型M75Y81A/I157L，突变型M76Y81A/Y159N，突变型M77Y81A/Y159S，突变型M78Y81A/G161A，突变型M79Y81A/A184G，突变型M80Y81A/W187F，突变型M81Y81A/F200A，突变型M82Y81A/T210L，突变型M83Y81A/F211W，突变型M84Y81A/F211Y，突变型M85Y81A/G226A，突变型M86Y81A/I228K，突变型M87Y81A/A233D，突变型M88Y81A/Y328F，突变型M89Y81H/I157L，突变型M90Y81N/I157L，突变型M91K83P/I157L，突变型M92S84A/I157L，突变型M93S84D/F113W，突变型M94S84D/I157L，突变型M95S84D/Y159N，突变型M96S84D/G161A，突变型M97S84D/A184G，突变型M98S84D/Y328F，突变型M99S84E/I157L，突变型M100S84F/I157L，突变型M101S84K/I157L，突变型M102L85F/I157L，突变型M103L85I/I157L，突变型M104L85P/I157L，突变型M105L85V/I157L，突变型M106N87A/I157L，突变型M107N87D/I157L，突变型M108N87E/I157L，突变型M109N87G/I157L，突变型M110N87Q/I157L，突变型M111N87S/I157L，突变型M112F88A/I157L，突变型M113F88D/I157L，突变型M114F88E/I157L，突变型M115F88E/Y328F，突变型M116F88L/I157L，突变型M117F88T/I157L，突变型M118F88V/I157L，突变型M119F88Y/I157L，突变型M120K106H/I157L，突变型M121K106L/I157L，突变型M122K106M/I157L，突变型M123K106Q/I157L，突变型M124K106R/I157L，突变型M125K106S/I157L，突变型M126K106V/I157L，突变型M127W107A/I157L，突变型M128W107A/Y328F，突变型M129W107Y/I157L，突变型M130W107Y/T206Y，突变型M131W107Y/K217D，突变型M132W107Y/P218L，突变型M133W107Y/T220L，突变型M134W107Y/P221D，突变型M135W107Y/Y328F，突变型M136F113A/I157L，突变型M137F113H/I157L，突变型M138F113N/I157L，突变型M139F113V/I157L，突变型M140F113W/I157L，突变型M141F113W/Y159N，突变型M142F113W/Y159S，突变型M143F113W/G161A，突变型M144F113W/F162L，突变型M145F113W/A184G，突变型M146F113W/W187F，突变型M147F113W/F200A，突变型M148F113W/T206Y，突变型M149F113W/T210L，突变型M150F113W/F211L，突变型M151F113W/F211W，突变型M152F113W/F211Y，突变型M153F113W/V213D，突变型M154F113W/K217D，突变型M155F113W/T220L，突变型M156F113W/P221D，突变型M157F113W/G226A，突变型M158F113W/I228K，突变型M159F113W/A233D，突变型M160F113W/R276A，突变型M161F113Y/I157L，突变型M162F113Y/F211W，突变型M163E114D/I157L，突变型M164D115A/I157L，突变型M165D115E/I157L，突变型M166D115M/I157L，突变型M167D115N/I157L，突变型M168D115Q/I157L，突变型M169D115S/I157L，突变型M170D115V/I157L，突变型M171I157L/Y159I，突变型M172I157L/Y159L，突变型M173I157L/Y159N，突变型M174I157L/Y159S，突变型M175I157L/Y159V，突变型M176I157L/P160A，突变型M177I157L/P160S，突变型M178I157L/G161A，突变型M179I157L/F162L，突变型M180I157L/F162M，突变型M181I157L/F162N，突变型M182I157L/162Y，突变型M183I157L/T165L，突变型M184I157L/T165V，突变型M185I157L/Q181A，突变型M186I157L/Q181F，突变型M187I157L/Q181N，突变型M188I157L/A184G，突变型M189I157L/A184L，突变型M1901157L/A184M，突变型M191I157L/A184S，突变型M192I157L/A184T，突变型M193I157L/W187F，突变型M194I157L/W187Y，突变型M195I157L/F193H，突变型M196I157L/F193I，突变型M197I157L/F193W，突变型M198I157L/F200A，突变型M199I157L/F200H，突变型M200I157L/F200L，突变型M201I157L/F200Y，突变型M202I157L/A204G，突变型M203I157L/A204I，突变型M204I157L/A204L，突变型M205I157L/A204S，突变型M206I157L/A204T，突变型M207I157L/A204V，突变型M208I157L/F205A，突变型M209I157L/F207I，突变型M210I157L/F207M，突变型M211I157L/F207V，突变型M212I157L/F207W，突变型M213I157L/F207Y，突变型M214I157L/M208A，突变型M215I157L/M208K，突变型M216I157L/M208L，突变型M217I157L/M208T，突变型M218I157L/M208V，突变型M219I157L/S209F，突变型M220I157L/S209N，突变型M221I157L/T210A，突变型M222I157L/T210L，突变型M223I157L/F211I，突变型M224I157L/F211L，突变型M225I157L/F211V，突变型M226I157L/F211W，突变型M227I157L/G212A，突变型M228I157L/G212D，突变型M229I157L/G212S，突变型M230I157L/R215K，突变型M231I157L/R15L，突变型M232I157L/R215T，突变型M233I157L/R215Y，突变型M234I157L/T220L，突变型M235I157L/G226A，突变型M236I157L/G226F，突变型M237I157L/I228K，突变型M238I157L/A233D，突变型M239I157L/R76A，突变型M240I157L/Y328A，突变型M241I157L/Y328F，突变型M242I157L/Y328H，突变型M243I157L/Y328I，突变型M244I157L/Y328L，突变型M245I157L/Y328P，突变型M246I157L/Y328V，突变型M247I157L/Y328W，突变型M248I1 57L/L340F，突变型M249I157L/L340I，突变型M250I157L/L340V，突变型M251I157L/V439A，突变型M252I157L/V439P，突变型M253I157L/R445A，突变型M254I157L/R445F，突变型M255I157L/R445G，突变型M256I157L/R445K，突变型M257I157L/R445V，突变型M258Y159N/G161A，突变型M259Y159N/A184G，突变型M260Y159N/A204S，突变型M261Y159N/T210L，突变型M262Y159N/F211W，突变型M263Y159N/F211Y，突变型M264Y159N/G226A，突变型M265Y159N/I228K，突变型M266Y159N/A233D，突变型M267Y159N/Y328F，突变型M268Y159S/G161A，突变型M269Y159S/F211W，突变型M270G161A/F162L，突变型M271G161A/A184G，突变型M272G1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L/T210L/Y328F，突变型M492I157L/T210L/L340V，突变型M493I157L/T210L/V439P，突变型M494I157L/F211W/Y328F，突变型M495I157L/G226A/Y328F，突变型M496I157L/A233D/Y328F，突变型M497I157L/Y328F/L340V，突变型M498I157L/Y328F/V439P，突变型M499Y159N/F211W/Y328F，突变型M500G161A/A184G/W187F，突变型M501G161A/T210L/Y328F，突变型M502G161A/F211W/Y328F，突变型M503A182G/P183A/Y328F，突变型M504A182S/P183A/Y328F，突变型M505A184G/W187F/F200A，突变型M506A184G/W187F/A204S，突变型M507A184G/W187F/F211W，突变型M508A184G/W187F/I228K，突变型M509A184G/W187F/A233D，突变型M510F200A/F211W/Y328F，突变型M511A204S/F211W/Y328F，突变型M512A204T/F211W/Y328F，突变型M513F211W/Y328F/L340V，突变型M514P70T/A72E/I157L/Y328F，突变型M515P70T/A72E/T210L/Y328F，突变型M516P70T/G77M/I157L/Y328F，突变型M517P70T/Y81A/I157L/T210L，突变型M518P70T/Y81A/I157L/Y328F，突变型M519P70T/S84D/I157L/Y328F，突变型M520P70T/F88E/I157L/Y328F，突变型M521P70T/F88E/T210L/Y328F，突变型M522P70T/F113W/I157L/T210L，突变型M523P70T/F113W/G161A/Y328F，突变型M524P70T/F113Y/I157L/Y328F，突变型M525P70T/D115Q/I157L/T210L，突变型M526P70T/D115Q/I157L/Y328F，突变型M527P70T/I157L/G161A/T210L，突变型M528P70T/I157L/A184G/W187F，突变型M529P70T/I157L/A184G/T210L，突变型M530P70T/I157L/W187F/T210L，突变型M531P70T/I157L/W187F/Y328F，突变型M532P70T/I157L/A204T/T210L，突变型M533P70T/I157L/A204T/Y328F，突变型M534P70T/I157L/A204T/T210L，突变型M535P70T/I157L/T210L/F211W，突变型M536P70T/I157L/T210L/G226A，突变型M537P70T/I157L/T210L/A233D，突变型M538P70T/I157L/T210L/Y328F，突变型M539P70T/I157L/T210L/L340V，突变型M540P70T/I157L/T210L/V439P，突变型M541P70T/I157L/Y328F/V439P，突变型M542P70T/G161A/T210L/Y328F，突变型M543P70T/G161A/A233D/Y328F，突变型M544A72E/S74T/I157L/Y328F，突变型M545A72E/G77S/F113W/I157L，突变型M546A72E/Y81H/I157L/Y328F，突变型M547A72E/K83P/I157L/Y328F，突变型M548A72E/F88E/F113W/I157L，突变型M549A72E/F88E/I157L/Y328F，突变型M550A72E/F88E/G161A/Y328F，突变型M551A72E/F113W/I157L/Y328F，突变型M552A72E/F113W/G161A/Y328F，突变型M553A72E/F113Y/I157L/Y328F，突变型M554A72E/F113Y/G161A/Y328F，突变型M555A72E/F113Y/G226A/Y328F，突变型M556A72E/I157L/G161A/Y328F，突变型M557A72E/I157L/F162L/Y328F，突变型M558A72E/I157L/A184G/Y328F，突变型M559A72E/I157L/F200A/Y328F，突变型M560A72E/I157L/A204T/Y328F，突变型M561A72E/I157L/F211W/Y328F，突变型M562A72E/I157L/F211Y/Y328F，突变型M563A72E/I157L/A233D/Y328F，突变型M564A72E/I157L/Y328F/L340V，突变型M565A72E/G161A/A204T/Y328F，突变型M566A72E/G161A/T210L/Y328F，突变型M567A72E/G161A/F211W/Y328F，突变型M568A72E/G161A/F211Y/Y328F，突变型M569A72E/G161A/A233D/Y328F，突变型M570A72E/G161A/Y328F/L340V，突变型M571A72E/A184G/W187F/Y328F，突变型M572A72E/T210L/Y328F/L340V，突变型M573A72V/I157L/W187F/Y328F，突变型M574G77P/I157L/T210L/Y328F，突变型M575Y81A/S84D/I157L/Y328F，突变型M576Y81A/F88E/I157L/Y328F，突变型M577Y81A/F113W/I157L/Y328F，突变型M578Y81A/I157L/G161A/Y328F，突变型M579Y81A/I157L/W187F/Y328F，突变型M580Y81A/I157L/A204S/Y328F，突变型M581Y81A/I157L/T210L/Y328F，突变型M582Y81A/I157L/A233D/Y328F，突变型M583Y81A/I157L/Y328F/V439P，突变型M584Y81A/A184G/W187F/Y328F，突变型M585F88E/I157L/T210L/Y328F，突变型M586F88E/I157L/A233D/Y328F，突变型M587F113W/I157L/A204T/T210L，突变型M588F113W/I157L/T210L/Y328F，突变型M589I157L/G161A/A184G/W187F，突变型M590I157L/G161A/T210L/Y328F，突变型M591I157L/A184G/W187F/T210L，突变型M592I157L/A204S/T210L/Y328F，突变型M593I157L/A204T/T210L/Y328F，突变型M594I157L/T210L/A233D/Y328F，突变型M595G161A/A184G/W187F/Y328F，突变型M596P70T/A72E/S84D/I157L/Y328F，突变型M597P70T/A72E/A204S/I157L/Y328F，突变型M598P70T/A72E/T210L/I157L/Y328F，突变型M599P70T/A72E/G226A/I157L/Y328F，突变型M600P70T/A72E/A233D/I157L/Y328F，突变型M601P70T/Y81A/I157L/T210L/Y328F，突变型M602P70T/Y81A/I157L/A233D/Y328F，突变型M603P70T/Y81A/I157L/T210L/Y328F，突变型M604P70T/Y81A/A233D/I157L/Y328F，突变型M605P70T/S84D/I157L/T210L/Y328F，突变型M606P70T/F113W/I157L/T210L/Y328F，突变型M607P70T/I157L/A184G/W187F/A233D，突变型M608P70T/I157L/W187F/T210L/Y328F，突变型M609P70T/I157L/A204S/T210L/Y328F，突变型M610P70T/G161A/A184G/W187F/Y328F，突变型M611P70V/A72E/F113Y/I157L/Y328F，突变型M612P70V/A72E/I157L/F211W/Y328F，突变型M613A72E/S74T/F113Y/I157L/Y328F，突变型M614A72E/S74T/I157L/F211W/Y328F，突变型M615A72E/Y81H/I157L/F211W/Y328F，突变型M616A72E/K83P/F113Y/I157L/Y328F，突变型M617A72E/W17F/F113Y/I157L/Y328F，突变型M618A72E/F113Y/D115Q/I157L/Y328F，突变型M619A72E/F113Y/I157L/Y328F/L340V，突变型M620A72E/F113Y/I157L/Y328F/V439P，突变型M621A72E/F113Y/G161A/I157L/Y328F，突变型M622A72E/F113Y/A204S/I157L/Y328F，突变型M623A72E/F113Y/A204T/I157L/Y328F，突变型M624A72E/F113Y/T210L/I157L/Y328F，突变型M625A72E/F113Y/A233D/I157L/Y328F，突变型M626A72E/I157L/G161A/F162L/Y328F，突变型M627A72E/I157L/W187F/F211W/Y328F，突变型M628A72E/I157L/A204S/F211W/Y328F，突变型M629A72E/I157L/A204T/F211W/Y328F，突变型M630A72E/I157L/F211W/Y328F/L340V，突变型M631A72E/I157L/F211W/Y328F/V439P，突变型M632P70E/I157L/G226A/F211W/Y328F，突变型M633A72E/I157L/A233D/F211W/Y328F，突变型M634Y81A/S84D/I157L/T210L/Y328F，突变型M635Y81A/I157L/A184G/W187F/Y328F，突变型M636Y81A/I157L/A184G/W187F/T210L，突变型M637Y81A/I157L/A233D/T210L/Y328F，突变型M638F88E/I157L/A184G/W187F/T210L，突变型M639F113Y/I157L/Y159N/F211W/Y328F，突变型M640I157L/A184G/W187F/T210L/Y328F，突变型M641P70T/I157L/A184G/W187F/T210L/Y328F，突变型M642Y81A/I157L/A184G/W187F/T210L/Y328F。
56.根据权利要求55所述的突变型蛋白质，其具有如下氨基酸序列，并具有肽合成活性，所述氨基酸序列是在含有选自上述突变型M1～M642之中的任意1种或2种以上的突变的氨基酸序列的突变部位之外的部位，还含有选自取代、缺失、插入、添加和倒位的1个或多个氨基酸突变的氨基酸序列。
57.根据权利要求55或56任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型M241。
58.根据权利要求55～57任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型M340。
59.根据权利要求55～58任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型M412。
60.根据权利要求55～59任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型M491。
61.根据权利要求55～60任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型M496。
62.根据权利要求55～61任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型M581。
63.根据权利要求55～62任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型M582。
64.根据权利要求55～63任一项所述的突变型蛋白质，其特征在于，至少含有突变型M594。
65.编码含有权利要求18～64任一项所述的突变型蛋白质的氨基酸序列的核苷酸。
66.含有权利要求65所述的多核苷酸的重组多核苷酸。
67.含有权利要求66所述的重组多核苷酸的经过转化的微生物。
68.突变型蛋白质的制造方法，其特征在于，在培养基中培养权利要求67所述的经过转化的微生物，使上述突变型蛋白质在培养基中和/或微生物中积累。
69.肽制造方法，其特征在于，在权利要求18～64任一项所述的突变型蛋白质存在下，进行肽生成反应。
70.肽制造方法，其特征在于，在培养基中培养权利要求67所述的经过转化的微生物，使上述突变型蛋白质在培养基中和/或经过转化的微生物中积累，进行肽生成反应。
71.α-L-天门冬氨酰基-L-苯丙氨酸-β-酯的制造方法，其特征在于，在权利要求18～64任一项所述的突变型蛋白质存在下，进行L-天门冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸之间的反应。
72.α-L-天门冬氨酰基-L-苯丙氨酸-β-酯的制造方法，其特征在于，在培养基中培养权利要求67所述的经过转化的微生物，使上述突变型蛋白质在培养基和/或经过转化的微生物中积累，进行L-天门冬氨酸-α，β-二酯和L-苯丙氨酸之间的反应。
全文摘要
本发明目的在于提供优良的肽合成蛋白质和效率高的肽制造方法等。即，在下述(I)和(II)所示蛋白质中至少一方存在下，使胺成分和羧基成分反应生成肽。(I)具有包含SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的下述突变型1～68、突变型239～290和324～377中任意1种或2种以上的突变的氨基酸序列的突变型蛋白质；(II)具有包含SEQ ID NO208所示的氨基酸序列的下述突变型L1～L335、M1～M642中任意1种或2种以上的突变的氨基酸序列的突变型蛋白质。
文档编号C12P13/00GK101087878SQ20058004388
公开日2007年12月12日 申请日期2005年12月20日 优先权日2004年12月20日
发明者阿部巧, 竹下理绘, 原诚一, 铃木园子, 横关健三, 杉山雅一, 铃木俊一, 渡部乙比古, 榛叶信久, 中村壮史, 田上宇乃, 小玉优哉, 尾上弘美, 汤地玲子, 铃木荣一郎, 柏木立己, 徐宁淳, 开裕子 申请人:味之素株式会社