实时核酸分析整合装置及利用该装置的靶核酸检测方法

专利名称：实时核酸分析整合装置及利用该装置的靶核酸检测方法
技术领域：
本发明涉及实时核酸分析整合装置及利用该装置的靶核酸检测方法，更详细的涉及，由多个种类的多个生物试样同时进行与试样相应的基因的定性分析或定量分析的实时核酸分析整合装置及利用该装置的靶核酸检测方法。
背景技术：
体外诊断测试(invitro diagnostic testing =IVD testing)是以判定疾病感染与否等为目的，将血液、尿液(urine)及唾液(saliva)等来自人体的试样作为检测体而对特定指标物质进行检测或定量分析的测试。分子诊断测试(Molecular diagnostic testing)或核酸诊断测试(NAT ；nucleic acid testing)是体外诊断测试市场中发展速度最快的领域，但由于操作的复杂性，测试以大型医院和临床测试专门机构为中心进行。分子诊断测试如今主要为感染疾病即病毒、细菌等的定性、定量测试，还进行独立地确认感染疾病的诊断测试的结果或用于确认变异株的确诊测试(confirmatory test) 等。用于肿瘤的早期确认、治疗方法的疗效增加的诊断测试(diagnostic test)也在快速增加，并在检测与根据个体的基因遗传性病因(genetic predisposition)的疾病相关的异常基因或用于治疗方法的决定、药物选择及药效评价的个体化医学(personalized medicine)的领域中被广泛应用。现如今，使用中的分子诊断测试的自动化系统逐渐发展为将核酸提取、扩增及确认的全过程自动化的方式。作为其中一个例子的Gen-Probe的TIGRIS DTS (TIGRIS Direct Tube Sampling)系统为美国食品药品管理局承认的最早的自动化系统，靶捕获、扩增、确认及测试结果输出过程成为自动化，且能够测试作为代表性的性病中的一种的淋病的病原菌-淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)和性感染疾病病原菌-沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的感染与否。作为其它例子,如罗氏分子系统(Roche Molecular Systems) 的 COBAS 系统(AmpIipr印，Taqman analyzer)、Abbott 的 m2000 系统(m2000sp,m2000rt)、 Cepheid 的 GeneXpert 系统 IQuum Inc 的 Liat (Lab-in-a-Tube) analyzer 等皆开发成基于聚合酶链反应(PCR)的自动化系统而推出市场。但是，上述现有的自动化系统用一种试样，且试样的准备(pr印)_实时定量分析-记录(report)以一个步骤实现，因此无法用多个种类的试样来同时进行试样的准备-实时定量、定性分析-记录的检测。尤其，对B型肝炎而言患者数较多，与此相反，对结核而言患者数不多。这种情况下存在直到获得一定数量的检测体为止等待几天之后方可进行测试的不便。在诊断测试多个种类的检测体时，由于需要对每个种类进行不同测试，从而需要反复进行实验，因此存在一天内无法进行大量测试的繁杂的缺点。为了 B型肝炎病毒的检测，将用于B型感染检测的检测体试样聚集起来分离纯化核酸并进行扩增时所需时间很长。如同上述的情形，直至获得多个相同种类的检测体试样需要很长时间，且为了只分析几个B型肝炎检测试样而使用现有的96孔核酸扩增反应器会产生极大的浪费。此时，最终会浪费装置的运行或需要多等几天直到获得检测试样。由于这种原因，所以存在以下问题，即，中小规模的医院中，以比较少的数量的临床检测体来进行多种临床测试时在经济上时间上受到限制，而委托外部的测试机构时反而需要付出更多的时间、费用及努力。

发明内容
于是，本发明的发明人研究了一次同时提取并分析多个种类的靶，而且还可以进行报告(report)的自动化系统，结果开发了检测体试样数比较少的中小规模的医院为了高效地进行多种诊断测试而将多个种类的检测体试样攒起来，在当天从多个种类的检测体中提取核酸，并在一个核酸扩增器中同时进行检测的实时核酸分析整合装置及利用该装置的靶核酸检测方法，从而完成的本发明。本发明的目的是提供一种实时核酸分析整合装置，使其由多个种类的多个生物试样同时进行与试样相应的基因的定性分析或定量分析。另外，本发明的另一目的是提供一种利用上述实时核酸分析整合装置的靶核酸检测方法。本发明提供一种同时进行与多个种类的生物试样相应的核酸的定性分析或定量分析的实时核酸分析整合装置。另外，本发明还提供一种由含有核酸的生物试样利用上述本发明的实时核酸分析整合装置的靶核酸的检测方法。以下对本发明进行详细说明。本发明提供一种实时核酸分析整合装置，其特征在于，是同时进行与多个种类的生物试样相对应的靶核酸的定性分析或定量分析的实时核酸分析整合装置，包括多个自动纯化分注装置100，其从含有靶核酸的多种生物试样中分离纯化各个试样中含有的靶核酸；实时核酸扩增器200，其包括多孔温度循环块体(望司嗜)210，并且实时测定从所述多个自动纯化分注装置100获得的不同的靶核酸的量；控制部，以与按照各个所述自动纯化分注装置100分别分离纯化的不同的靶核酸的种类对应的方式，以列为单位划分所述实时核酸扩增器200的温度循环块体210的多孔区域，按靶核酸种类来设定区域，并且，按所述设定区域的各个孔分别存储根据所述自动纯化分注装置100的生物试样的信息，且将所述温度循环块体在相同条件下同时进行扩增，从而以对各个靶核酸进行定性分析或定量分析的扩增结果对应于所述自动纯化分注装置100中分离纯化的各个生物试样的方式进行整合管理；以及显示部300，实时输出所述控制部的定性分析或定量分析的结果。本发明中，提供一种实时核酸分析整合装置，其特征在于，所述实时核酸扩增器的温度循环块体210的多孔区域以列为单位划分，按靶核酸种类来设定区域，并且，所述设定的区域按各个孔分别存储根据所述自动纯化分注装置100的生物试样的信息，其中，追加存储阳性标准试样、阴性标准试样或定量标准试样的信息。本发明中，提供一种实时核酸分析整合装置，其特征在于，所述实时核酸扩增器200在所述多孔温度循环块体210上安装有诊断试剂盒，该诊断试剂盒含有含有从多个自动纯化分注装置100获得的不同的核酸。本发明中，提供一种实时核酸分析整合装置，其特征在于，所述多孔温度循环块体 210是由12列X8行的孔构成的96孔温度循环块体。本发明中，提供一种实时核酸分析整合装置，其特征在于，所述多孔温度循环块体 210以列为单位选择性地设定测定项目。本发明中，提供一种实时核酸分析整合装置，其特征在于，所述控制部在各个所述自动纯化分注装置100中将多个种类的生物试样与内对照(IPC) —同进行分离时，通过所述实时核酸扩增器200中的扩增产物来判断所述自动纯化分注装置100中核酸分离成功与否，从而能够决定是否再次执行核酸分离。本发明中，提供一种实时核酸分析整合装置，其特征在于，所述控制部将各个生物试样的靶核酸的Ct值与临界Ct值进行比较，从而定性地检测靶核酸的存在与否，所述各个生物试样的靶核酸是实时核酸扩增器200在相同条件下同时扩增而得到。本发明中，提供一种实时核酸分析整合装置，其特征在于，所述控制部将在所述实时核酸扩增器200中以相同条件同时扩增已知浓度的定量标准试样和各个生物试样而得的各个Ct值与定量标准试样的Ct值定量曲线进行比较，从而换算出靶核酸的数量，进而定量地确定试样内的靶核酸。本发明中，提供一种实时核酸分析整合装置，其特征在于，所述自动纯化分注装置 100包括药筒，其含有包含核酸的多种生物试样和用于从这些试样中提取核酸的缓冲液； 冷藏块体；高温块体；废液桶；以及移液管块体，其可在具备移液管药筒的基板上移动并能够安装或卸下移液管，且具备用于施加或解除所述移液管的磁场的磁场施加单元；并且，控制部中存储根据所述自动纯化分注装置100的各个标准试样及生物试样的信息和靶核酸的信息。本发明中，提供一种实时核酸分析整合装置，其特征在于，所述实时核酸扩增器 200包括转换为设定的温度的多孔温度循环块体210 ；用于向安装在所述温度循环块体上的反应管照射光的光源；用于接受从反应管发出的光的荧光检测传感器；按所述设定的列分别设定测定项目并存储。本发明中，提供一种实时核酸分析整合装置，其特征在于，所述实时核酸分析整合装置还包括存储分析结果的存储数据库装置400。本发明提供一种利用实时核酸分析整合装置的靶核酸检测方法，其特征在于，包括1)在多个自动纯化分注装置100中，从标准试样和含有核酸的多种生物试样中分离纯化各个试样中含有的核酸，然后将分离纯化的溶液添加到核酸扩增反应混合物反应管而混合的步骤；2)通过使安装所述核酸扩增反应混合物反应管的多孔温度循环块体210与从所述自动纯化分注装置100中分离纯化的各个靶核酸相对应的方式，按靶核酸种类以列为单位划分多孔温度循环块体210的多孔而设定块体，按所述设定的块体内的各个孔分别存储从所述自动纯化分注装置100中分离的标准试样和生物试样的信息的步骤；3)以与所述步骤2)中存储的实时核酸扩增器的多孔温度循环块体210的各个孔的生物试样信息一致的方式，将步骤1)中准备的反应管安装到各个孔中的步骤；
4)将安装在所述实时核酸扩增器的温度循环块体210上的各个靶核酸在相同条件下同时进行扩增，从而将与多个生物试样对应的各个靶核酸进行定性分析或定量分析， 得到扩增结果的步骤。本发明中，上述步骤2、和步骤幻可以同时进行或步骤幻比步骤2、先进行。本发明中，提供一种利用实时核酸分析整合装置的靶核酸检测方法，其特征在于， 在所述自动纯化分注装置100中向生物试样添加内对照(internal positive control, IPC)而分离核酸，从所述扩增结果判断在自动纯化分注装置100中的靶核酸分离的成功与否和扩增效率，确定靶核酸检测的有效性。本发明中，提供一种利用实时核酸分析整合装置的靶核酸检测方法，其特征在于， 在所述步骤1)中，反应管以干燥的状态含有核酸扩增所需的成分，向其中加入分离纯化的核酸溶液并混合，从而制造核酸扩增反应混合物反应管。本发明中，提供一种利用实时核酸分析整合装置的靶核酸检测方法，其特征在于， 靶核酸为RNA时，所述内对照为烟草花叶病毒粒子。本发明中，提供一种利用实时核酸分析整合装置的靶核酸检测方法，其特征在于， 靶核酸为DNA时，所述内对照为质粒DNA或PCR扩增产物(PCR product)。根据本发明的实时核酸分析整合装置具有如下优点，S卩，能够至少利用两个以上的自动纯化分注装置，从多个种类的生物试样中自动进行核酸的分离和纯化，并可以在实时核酸扩增器中将多种试样在相同条件下一次同时进行分析，且通过管理自动纯化分注装置和实时核酸扩增器的控制部来缩短测试时间并节省费用。利用本发明的实时核酸分析整合装置的靶核酸检测方法，具有如下优点，S卩，在自动纯化分注装置中与生物试样一同添加本发明的内对照而进行分离纯化，从而能够确认对各个生物试样的核酸分离与否和在实时核酸扩增器中的核酸扩增工序的问题。另外，以与各个自动纯化分注装置中分离纯化的不同的靶核酸的种类对应的方式，可将以列为单位的多孔温度循环块体的多孔区域按靶核酸种类分别设定，从而具有多种检测体所要求的多种靶的测试以一系列的一个阶段的工序
(钍守对碎項)并列地得到处理、在需要疾病的迅速诊断的医院等中能够
高效地使用的优点。


图1是本发明的实时核酸分析整合装置的概略图。图2是本发明的实时核酸扩增器200中具备的多孔温度循环块体210的图。图3是对于本发明的显示部300的图。图4是表示本发明的实时核酸分析整合装置的整体流程图(flow diagram)的图。图5是在本发明的自动纯化分注装置中表示药筒的试样填装孔(旦句省)部分的图。图6是表示本发明的根据烟草花叶病毒粒子(IPC)的烟草花叶病毒(TMV)标准模板的实时聚合酶链反应的曲线的图。图7是表示本发明的根据烟草花叶病毒粒子(IPC)的烟草花叶病毒(TMV)标准模板的实时聚合酶链反应的曲线的标准曲线(斜率U83，R2:1)的图。图8是表示将本发明的HBV定量PCR试剂盒用于实时核酸扩增器中对HBV标准模板DNA进行实时聚合酶链反应而所得到的曲线的图。图9是表示将本发明的HBV定量PCR试剂盒用于实时核酸扩增器中对HBV标准模板DNA进行实时聚合酶链反应而所得到的曲线的标准曲线(斜率-0. 2882,R2 :0. 9997)的图。图10是表示将本发明的HCV定量RT-PCR试剂盒用于实时核酸扩增器中进行HCV标准模板RNA的实时聚合酶链反应而所得到的曲线的图。图11是表示将本发明的HCV定量RT-PCR试剂盒用于实时核酸扩增器中进行HCV标准模板RNA的实时聚合酶链反应而所得到的曲线的标准曲线(斜率-0. 2970，R2 0.9998)的图。符号说明100:自动纯化分注装置 200:实时核酸扩增器300 显示部400 存储数据库装置
具体实施例方式以下，参照附图对本发明的实时核酸分析整合装置进行详细说明。下面进行说明的附图是为了给本领域技术人员充分转达本发明的思想而作为例子来提供，可能以夸张的方式图示。此时，就所使用的技术用语和科学用语而言，如果没有其它定义，则具有本发明所属技术领域的技术人员通常所理解的意思，且在下述说明和附图中省略可能对本发明的主旨产生混淆的公知作用及构成。[实施例1]实施例1涉及本发明的实时核酸分析整合装置，图1显示了本发明的实时核酸分析整合装置的概略图，以下对本发明进行更详细地说明。上述实时核酸分析整合装置具备多个自动纯化分注装置100，该自动纯化分注装置100用于从含有核酸的多个种类的生物试样中分离纯化不同的核酸。上述生物试样为在自然环境中分离、且含有核酸的生物学物质。本发明的生物试样可以是分离或纯化的核酸溶液、微生物、组织、生物流体或细胞。生物流体包扩血液、血浆、痰、尿液、脑脊髓液、胃洗涤液、白细胞透入(leukophoresis)、从人体获得的各种检测体试样等，但不仅限于此。本发明的试样可由来自含有核酸的任意的植物、动物、人体、细菌或病毒的样品构成。在本发明中，核酸一般是指0嫩、1 離、？嫩、0嫩与1 離的杂化物(hybrid)及含有这些的物质，但并非仅限于此，如蛋白质之类的物质的分离、检测中可采用本发明的装置。参照图1，本发明的自动纯化分注装置100的特征在于，其可以是一个或多个，而为了从多个种类的试样中分离核酸，优选安装多个，如2 6个。本发明的自动纯化分注装置100的特征在于，为了从大量的生物试样溶液中分离核酸，利用磁性粒子，使磁性粒子与核酸可逆性地结合，从而分离核酸。上述自动纯化分注装置100为将核酸自动纯化并分注的装置，其包括药筒，其含有含有核酸的多种生物试样和用于从这些试样中提取核酸的缓冲液；冷藏块体；高温块体；废液桶；移液管药筒；以及移液管块体，其可在具备这样的块体和药筒的基板上移动并能够安装和卸下移液管，且具备用于施加或解除上述移液管的磁场的磁场施加单元。上述移液管块体可安装和卸下8 16个移液管。利用于从大量生物试样溶液中分离核酸的磁性粒子在缓冲液溶液中与核酸结合， 在移液管内吸入了与磁性粒子结合的核酸的状态下，向移液管施加磁场时，结合了核酸的磁性粒子在移液管内部凝集而附着，除此以外的其它溶液排出至移液管外。本发明的磁性粒子优选使用表面积大的微小的磁性粒子。本发明中，作为用于向移液管施加磁场的磁场施加单元可以使用永久磁铁或电磁铁，可以向移液管可逆性地施加磁场。移液管的操作可通过连接在移液管的活塞来排出溶液，且可通过移液管移动单元来移动。本发明的自动纯化分注装置100可使用现有公知的自动纯化分注装置，例如，韩国授权专利 148239 号、US5702590、US5647994、EP 0691541, US 5336760 号、US5897783 号、US6187270号以及韩国专利申请10-2008_003四04号中记载的装置。另外，可优选使用 Bioneer 公司的 ExiPi^p 16-全自动 DNA/RNA/蛋白质纯化系统(fully Automated DNA/ RNA/Proteins Purification System)作为本发明的自动纯化分注装置100。在上述自动纯化分注装置100中分离/纯化的核酸分注到由预先安装的单位反应管构成的诊断试剂盒中，用户从自动纯化分注装置100内取出分注的由8-孔条 (^iH^ )管构成的诊断试剂盒，用透明膜密封后，安装在实时核酸定量扩增器的设定的列上之后，进行动作，从而使结果自动导出。用于从上述含有核酸的生物试样中分离、纯化核酸的多个自动纯化分注装置100 上可追加条形码(bar code)识别装置(未图示)。由条形码识别装置识别的生物试样信息被数据库化而存储到作为实时核酸分析整合装置内的系统管理(manager)软件的控制部。 这种信息也可以自动应用到实时核酸扩增器200上。上述条形码显示基于生物试样的性别、年龄、种类等试样之间可识别且为必须的内容而可进行分类的内容。本发明包括将从上述多个自动纯化分注装置100获得的不同的靶核酸实时进行扩增的实时核酸扩增器200。本发明的实时核酸扩增器200安装有与从上述自动纯化分注装置100分离并纯化的核酸相应的诊断试剂盒，且包括转换为设定温度的多孔温度循环块体210 ；用于向安装在上述温度循环块体上的反应管内照射光的光源；以及用于接受从反应管内的检测标记中发出的光的荧光检测传感器。根据上述荧光检测传感器的结果可对靶核酸实时地进行定量及定性分析。本发明的实时核酸扩增器200为可进行实时聚合酶链反应的装置，可使用公知的实时核酸聚合酶链反应用装置，可优选使用韩国专利第794703号中记载的装置、 PCT/KR2008/064558号中记载的装置或Bioneer的Exicycler 96实时定量温度块体 (Real-Time Quantitative Thermal Block)制品。上述实时核酸扩增器200包括多孔温度循环块体210，上述多孔温度循环块体形成由12列X8行的孔构成的96孔，且上述多孔温度循环块体以列为单位设定了多孔温度循环块体的区域，且能够以上述多孔温度循环块体的列为单位，实时地将根据不同的靶核酸的种类的各个靶核酸的扩增量及靶信息显示于显示部300。本发明中，以列为单位设定了靶核酸的检测项目，但并非仅限于此，也可变更为按行或孔来进行设定。在本发明中，上述实时核酸分析整合装置可还具有存储分析结果的存储数据库装置 400。本发明的实时核酸扩增器200存储从上述自动纯化分注装置100中分离纯化的靶核酸的种类及对生物试样的信息。另外，上述实时核酸扩增器200根据从各个自动纯化分注装置100中分离的各个靶核酸的种类，以列为单位设定多孔温度循环块体210的多孔区域。优选在上述多孔温度循环块体中设定一个以上的列。就具有相同的检测靶的设定区域内的各个孔而言，孔中加入从生物试样中分离的核酸和标准试样，且对它们的信息分别存储在各个孔中。本发明中，“孔211a”是指能够安装诊断试剂盒的反应管的多孔温度循环块体210 的各个孔。根据诊断试剂盒的种类以核酸扩增器的温度循环块体上的列为单位设定各个检测靶。本发明包括实时核酸分析整合装置管理(manager)软件，该管理软件用于控制自动纯化分注装置100，控制实时核酸扩增器200，将来自自动纯化分注装置的信息传递给实时核酸扩增器，并将上述实时核酸扩增器的信息进行存储并管理。本发明中使用的诊断试剂盒包括可进行检测的标记，且由以相同的量装有用于扩增特定靶核酸的引物和缓冲液的反应管500构成。本发明中，“反应管500”是指能够容纳试样的容器，有1至96个，优选为8个、12 个、16个或96个，它是由塑料或类似材料形成的凹陷("9"!")或管(tube)，可以优选为有规则的图案，例如格子形状的96孔反应板(12列X8行)、384孔反应板或8-孔条状的管。上述诊断试剂盒的反应管500中含有用于扩增靶核酸的引物、可检测的标记及缓冲液，并添加上述分离的核酸，且总量优选为10 50μ 1，但并非仅限于此。多个诊断试剂盒的不同的引物和/或探针根据相同的退火(T1)温度而扩增，且上述诊断试剂盒的每个单位反应管中包括为使不同的靶核酸扩增而制备的引物和探针。本发明中，诊断试剂盒通过将混合了用于扩增核酸的特定部分的特异性 (specific)引物、带有荧光的探针、DNA聚合酶、dNTP的组合物进行干燥而制备。可加入稳定剂来进行干燥。干燥方法可采用冷冻干燥、加热干燥、真空减压干燥等。因此，由于本发明中为干燥状态，因此无需调节容量而将分离纯化的核酸溶液以一定量进行添加，直接制备核酸扩增反应混合物。本发明中，用于检测各个诊断试剂盒中使用的靶核酸的引物，采用为了各个靶核酸的诊断测试而以TmOiielting point, °C )相似的方式进行设计的碱基序列。上述TmOiielting point, V )以靶核酸的部分碱基序列为基础来设计，且为了基于退火 (annealing)温度而将多种靶核酸同时选择性地进行扩增，重要的是设定为相同的反应温度条件。根据本发明，可从一个人的检测体试样或多个人的检测体试样同时检测出多个靶核酸。例如，将AIDS、B型肝炎、C型肝炎、性病诊断在相同的扩增条件下一次性地在一个实时核酸扩增器中进行。图2为具有上述多个诊断试剂盒的反应管500分别对应地安装的多个孔的多孔温度循环块体210的图。本发明中反应管500优选由8条、16条或96孔板形态来构成。参照图2，上述设定区域的列的孔211a上安装有注入了从同种生物试样分离纯化的核酸的反应管，各个块体中安装在同一列上的反应管内含有为了扩增相同靶核酸而制备的引物和/或探针。参照图2，上述多孔温度循环块体210由多个孔211构成。各个孔211a上可安装诊断试剂盒的反应管500。本发明中，多孔温度循环块体上可安装不同的多个诊断试剂盒反应管，以列为单位将多孔温度循环块体的多孔区域按靶核酸种类进行设定。多孔温度循环块体上安装靶核酸不同的多个诊断试剂盒，由此，以与不同的靶核酸的种类相对应的方式， 以列为单位将多孔温度循环块体上的多孔区域按靶核酸种类进行指定，但以相同扩增条件来进行，此为特征。本发明的实时核酸扩增器的多孔温度循环块体210可以为96孔(12列X8行) 的形态，上述多孔温度循环块体的多孔区域优选以相邻的一到两个列为单位设定检测靶， 但并非仅限于此。本发明的实时核酸扩增器200在后述的控制部的控制下，反复地变化为作为第一温度的退火(T1)温度和作为第二温度的扩增(T2)温度。因此，安装在孔211a上的诊断试剂盒反应管在作为第一温度的退火(T1)温度和作为第二温度的扩增(T2)温度之间变化而扩增核酸，为了变性，还可能需要第三温度。上述多孔温度循环块体210中，作为第一温度的退火(T1)温度、作为第二温度的扩增(T2)温度及第三温度可根据靶核酸而多样地进行设定。实时核酸扩增器200基于对于设定在多孔温度循环块体上的区域的靶核酸种类及生物试样的信息，同时测定各个靶核酸的扩增程度及扩增量，上述靶核酸的测定可根据
反应管中所含有的可检测的检测标记的信号(Al ZL^T)的数值来进行测定。由上述标记产生的信号的水平与扩增的靶核酸的量成比例。检测标记的信号可以为包括例如发光信号、彩色颜料信号或放射性信号的任意种类的信号。作为优选方式，可检测的信号为发光信号。发光信号可以是荧光信号或化学发光信号。这是由于靶核酸的扩增开始时开始发光，且随着靶核酸的扩增量而发光的时期及发光强度变得不同，从而可监测靶核酸扩增量。 本发明中，为了信号检测可使用结合有荧光染料的探针或嵌入染料之类的荧光染料。优选地，为了核酸扩增而可以主要使用双标探针(dual-labeled probe)。上述实时核酸扩增器200具备控制部。上述控制部存储对于从上述自动纯化分注装置100中分离的靶核酸的种类以及从上述自动纯化分注装置100中分离纯化的各个生物试样的信息，并且，以从各个自动纯化分注装置100中分离纯化的不同的靶核酸的种类相对应的方式，将多孔温度循环块体的多孔区域以列为单位按不同靶核酸种类进行设定，且使上述温度循环块体上的所有靶核酸在相同的条件下同时扩增，并基于与上述设定的列所对应的靶核酸的种类及对于各个孔的生物试样的信息，测定同时扩增的各个靶核酸，从而进行判断。上述控制部中保存的所有信息设置为可由用户进行输入，并可存储输入的信息而进行保存。上述实时核酸扩增器200根据安装在上述多孔温度循环块体210上的诊断试剂盒种类，将各个靶核酸的扩增量及靶信息实时显示在显示部300上，所述诊断试剂盒用于检测按列或孔不同的靶核酸。
图3为本发明的显示部300的图。参照图3，显示部300具有第一显示部302，其显示实时核酸扩增器200的上述设定的列的信息；第二显示部301，其对单位反应管中扩增的靶核酸的量进行测定而图示化；以及孔选择部303，其可使用户选择观看个别的孔211a ；根据用户的选择使孔选择部303将一个或一个以上的单位反应管的诊断结果以多种颜色一次性地进行显示，从而能够以将其差异显著区分的方式进行显示。根据本发明的实时核酸分析整合装置将自动纯化分注装置及实时核酸扩增器进行整合管理。更具体地，包括将生物试样数据从自动纯化分注装置向实时核酸扩增器进行传输、且将从实时核酸扩增器获得的不同的靶核酸的种类所对应的各个靶核酸的信息及扩增结果进行定性分析或定量分析的控制部。如图6所示，本发明的实时核酸分析整合装置根据控制部的软件，大体上分为1.信息输入，2.在自动纯化分注装置100中的核酸的分离纯化，3.在实时核酸扩增器200中的运行(RUN)，4.分析结果(Update Result/Analysis)这四种。本发明的控制部的软件统管整体的运作。软件的功能是，大体上执行DB功能及保持、自动纯化分注装置的控制保持、实时核酸扩增器的运行及分析控制保持等功能。本发明的实时核酸分析整合装置由两台计算机、三台自动纯化分注装置和一台实时核酸扩增器构成。首先，控制部的软件以用户向实时核酸分析整合装置的管理软件输入的数据为基础。两台计算机中一台为设置有本地DB、实时核酸分析整合系统的管理软件及自动纯化分注装置程序的实时核酸分析整合装置管理软件用计算机。剩下的一台计算机用于实时核酸扩增器程序。各个计算机通过TCP/IP通信收发数据。实时核酸分析整合装置管理(manager)软件用计算机与三台自动纯化分注装置通过TCP/IP进行收发通信。实时核酸扩增用计算机与核酸扩增器通过USB通信进行收发。上述的实时核酸分析整合装置由计算机间的客户端服务器环境、实时核酸分析整合装置管理软件与自动纯化分注装置间的客户端服务器环境构成。更具体而言，各医院的网站中存在主DB。在主DB中对实时核酸分析整合装置管理软件执行试样输入作业。该作业为在本实时核酸分析整合装置中使用的本地DB装载(^il )作业清单(worklist)的工序。装载的作业清单经用户通过条形码或通过自动分配方式向各个自动纯化分注装置进行分配。所有分配完成后运作自动纯化分注装置。运作全部结束之后，结束的同时执行根据动作结束的更新。实时核酸分析整合装置管理软件用计算机对更新进行检查，从而在本地DB上结束更新。本发明的整合管理软件可分别同时控制多台核酸纯化分注装置，并提供这些的动作状态。上述实时核酸分析整合装置管理(Manager)软件用计算机向用户通知实时核酸扩增器已准备好。用户得到通知指示，向96孔多孔温度循环块体安装反应管。反应管安装完毕后，进行实时核酸扩增器的运行。运行完毕后，告知用户是否启动分析(analysis)程序。分析完毕后，用户执行完成及结束操作。整合管理软件用计算机检查所有运行及分析是否完成。检查完毕后更新本地DB。首先，为了使本发明的实时核酸分析整合装置运行，需要输入信息(数据)。数据信息的输入是指用户按检测体试样以作为实时核酸分析整合装置与实时核酸分析整合装置管理软件用计算机的整合管理程序内的数据库相符的方式进行输入的意思。根据数据信
息的输入来确定按相应的诊断试剂盒使用的协议(H·旦旦署)。即，输入试样的名称，选择诊断试剂盒(Diagnosis kit)、核酸种类、样品来源类型(sample source type)及分离协议。选择要输入的试样的个数，按下“输入(input)”按钮。在自动纯化分注装置中根据输入的信息(数据)向各个自动纯化分注装置的药筒孔进行“分配(Assign)”。本发明中， “分配”可支持“自动分配(Auto assign)”和条形码“分配”。本发明中按照点击要纯化的试样的顺序自动进行“分配”。各自动纯化分注装置的“分配”完成之后，变成自动纯化分注装置可动作的状态。用户使自动纯化分注装置中各个装置运行。自动纯化分注装置的软件中存储动作相关的所有信息。自动纯化分注装置软件能够向用户提供运行时的时间、进行状态等进行信息。自动纯化分注装置的运行时间需要40 50分钟。自动纯化分注装置运行完毕后，实时核酸分析整合装置管理软件进行自动检测。根据自动检测来指示作为下一步工序的实时核酸扩增器的运行。本发明的实施例中，由于实时核酸扩增器的相应计算机被分开设置，用户执行实时核酸扩增器程序。执行时，作业清单从自动纯化分注装置到实时核酸扩增器向用户自动提供。整合管理软件中，点击核酸扩增器软件而选择进行实验的诊断试剂盒。本发明中，对照根据选择的诊断试剂盒而自动分配。用户根据从核酸纯化分注装置中执行的作业清单来执行。与点击试样的顺序相符地“分配”到多个孔内。安装与相应设定信息相符的诊断试剂盒。执行核酸扩增器的动作。实时核酸扩增器的运行约需要2 3小时。核酸扩增器运行s/w的动作结束后，将该结果文件传输到管理s/w。动作结束后，实时核酸分析整合装置的“管理(Manager) ”软件中自动识别运行状态，更新结果，将作业清单向下一工序移交。 “管理”程序通过执行结果的更新，将所有结果进行更新。点击按多个孔中的孔分别更新的试样。失败的不进行更新，而是重新返回分离工序或扩增工序的相应工序。将可重新观看目前动作的所有分属的“分析(Analysis)”在窗口中显示，从而用户可分析扩增的状态。本发明的实时核酸分析整合装置的控制部将“作业清单(work list)”本地数据库、实时核酸分析整合装置管理(manager)软件、自动纯化分注装置软件、实时核酸扩增器运行软件、实时核酸扩增器分析软件这五种程序自动进行连接而提供一系列的自动化工序。运行时，为了防止人为失误，在“分配”时提供相关画面，使所有数据都可以追溯。使所有装置运行时，皆产生日志文件。根据本发明的实时核酸分析整合装置可还具有存储上述各个诊断试剂盒的单位反应管的分析结果的存储数据库装置400。[实施例2]实施例2涉及利用本发明的实时核酸分析整合装置的靶核酸检测方法，以下对其进行更加详细的说明。本发明提供一种利用实时核酸分析整合装置的靶核酸检测方法，其特征在于包括1)在多个自动纯化分注装置100中，从标准试样和含有核酸的多种生物试样中分离纯化各个试样中含有的核酸，然后将分离纯化的溶液添加到核酸扩增反应混合物反应管而进行混合的步骤；2)通过使安装所述核酸扩增反应混合物反应管的多孔温度循环块体210与从所述自动纯化分注装置100中分离纯化的各个靶核酸相对应的方式，按靶核酸种类以列为单位划分多孔温度循环块体210的多孔而设定块体，按所述设定的块体内的各个孔分别存储从所述自动纯化分注装置100中分离的标准试样和生物试样的信息的步骤；3)以与所述步骤2)中存储的实时核酸扩增器200的多孔温度循环块体210的各个孔的生物试样信息一致的方式，将步骤1)中准备的反应管安装到各个孔的步骤；4)将安装在所述实时核酸扩增器200的温度循环块体上的各个靶核酸在相同条件下同时进行扩增，从而将与多个生物试样对应的各个靶核酸进行定性分析或定量分析， 得到扩增结果的步骤。在本发明中，上述步骤幻和步骤幻可以同时进行或步骤幻比步骤幻先进行。本发明中，上述步骤1)的自动纯化分注装置100中纯化并分离的核酸可使用各个不同的核酸，或多个种类的生物试样用于核酸的分离中。本发明中，其特征在于，在上述自动纯化分注装置100中向生物试样添加内对照 (internal positive control, IPC)而分离核酸，从所述扩增结果判断在自动纯化分注装置100中的靶核酸分离的成功与否和扩增效率，确定靶核酸检测的有效性。本发明中，其特征在于，在所述步骤1)中，反应管以干燥的状态含有核酸扩增所需的成分，向其中加入分离纯化的核酸溶液并混合，从而制造核酸扩增反应混合物反应管。本发明的诊断试剂盒由于由干燥的组合物组成，因此可以添加分离纯化的核酸溶液来直接制造混合物。对溶液状态的诊断试剂盒而言，在添加分离后的核酸溶液时，存在反应用量变多的问题，且分离后的核酸的浓度降低。本发明中，其特征在于，靶核酸为RNA时，所述内对照为烟草花叶病毒粒子。本发明中，其特征在于，靶核酸为DNA时，所述内对照为质粒DNA或PCR扩增产物 (PCR product)。PCR扩增产物是指由PCR扩增而制备的DNA。上述步骤1)中，特征在于，内对照还包含按已知的浓度分别添加的定量标准试样，从而进行分离。上述步骤1)中，特征在于，作为标准试样追加使用阴性对照(NTC)和阳性对照 (PC)，从而进行分离。上述用于内对照的扩增的引物、探针的特征在于，采用下述表1中提示的序列。本发明中，将上述内对照(或内部对照组，internal positive control, IPC)从核酸分离纯化步骤开始就使用，在从试样分离核酸之后，在实时核酸扩增器中进行扩增。这是为了如下的难点而提出的，即，在核酸扩增时核酸没有正常扩增的情况下，难以确认是在纯化工序中存在问题，还是在扩增工序中存在问题。本发明中，从分离工序开始向试样添加已知浓度的内对照(internal positive control, IPC) 一同进行分离并纯化，从而不仅能够在自动核酸纯化分注装置中确认分离是否正常进行，还能够在分离后的扩增工序中核酸扩增没有正常地显示的情况下，能够很容易地确认是在分离步骤存在问题还是在核酸扩增步骤中存在问题。本发明中作为内对照(IPC)使用了烟草花叶病毒。烟草花叶病毒(TMV) 为RNA病毒，其在将如新型流感Hmi病毒之类的RNA病毒的检测作为靶时，可很好地作为内对照(IPC)来使用。使用烟草花叶病毒(TMV)的优点如下。现有技术中，从检测体试样分离核酸时没有一同使用内对照(IPC)，只有在核酸扩增反应时将特定种类的RNA添加到分离后的核酸试样中进行反应。本发明中，将病毒粒子自身从检测体试样的分离步骤开始一起进行分离、 纯化，直到实时核酸扩增反应为止一同进行，因此有利于效率鉴定。作为植物病毒的烟草花叶病毒(TMV)可进行大量纯化，操作上无需担心危险。人体病毒和植物病毒其反应的“受体(receptor)”各自不同，因此具有植物病毒不会感染人体，且与作为靶的人体病毒之间的遗传关系较远，在制造引物和探针时或核酸扩增反应时很少或几乎没有碱基序列与所需的人体核酸靶一致的现象。在本发明中，特征在于，诊断试剂盒在单位反应管内以相同量具备与内对照(IPC)和扩增的靶核酸相对应的引物、用于检测靶核酸的检测标记及缓冲液。作为单位反应管可使用8-孔条。另外，特征在于，上述单位反应管内核酸扩增的反应物为干燥的形态。本发明中，在上述实时核酸扩增器200中向生物试样添加内对照(internalpositive control, IPC)来分离核酸并进行确认的扩增结果，可以确认从上述自动纯化分注装置100获得的核酸的分离与否以及将上述实时核酸扩增器200在相同的条件下同时扩增而得到的扩增工序。根据本发明的实时核酸分析整合装置可通过实时核酸扩增器200将从多个自动纯化分注装置分离的核酸一次性地同时进行扩增。另外，还包括从同时进行扩增的各个核酸中收集需要检测的靶核酸的信息的步
马聚ο例如从血液、尿液、痰、细胞等中分离核酸的工序有可能不同，但从中分离出的核酸可以在一个扩增器中同时进行扩增。本发明中，由多台核酸自动纯化分注装置分离核酸。在三台自动纯化分注装置中分别从血液、尿液、痰试样中分离核酸。分离的核酸可适用于利用例如AIDS、B型肝炎、C型肝炎、疟疾、结核、性病的诊断试剂盒将其同时检测。为了在实时核酸扩增器中同时检测这些疾病原因，本发明中可以将多孔温度循环块体按列分别划分而指定特定区域。例如，将多孔温度循环块体的列指定成第一列为AIDS、第二列为B型肝炎、第三列为C型肝炎、第四列为性病，然后对其设定相同的扩增条件，然后将含有分离出的核酸的各个诊断试剂盒对应地安装在多孔温度循环块体上的各个设定区域，从而进行扩增反应。为了将扩增反应条件设定成相同条件，所以将各诊断试剂盒反应条件的Tm值皆设定为相同或相近。通过将使用的引物或探针的Tm值设定为相同值，使得聚合酶链反应(PCR)反应条件变得相同，从而使得能够同时在96孔核酸扩增器中进行扩增，增加了方便性、缩短了检测时间、尤其在需要检测多个种类的靶时，减少了按每个种类依次进行而发生的时间误差，从一次检测一个种类的靶病原菌变成同时以相同条件在实时核酸扩增器中同时检测多个靶DNA或RNA，从而能够容易地进行确认。由于从来自1个人的多个种类的试样或来自多人的试样中分离核酸，从中一次性地同时分离多种靶核酸，从而具有能够将多种病原菌同时在很短的时间内进行确认的优点。本发明中，能以多孔温度循环块体的列为单位指定特定的病原体的测试项目。根据本发明使用多个自动纯化分注装置100从生物试样中分离、纯化核酸的工序如下。在本发明的实施例中，作为自动核酸分注装置选用Bioneer公司的ExiPi^p 全自动核酸提取仪(Fully automated nucleic acid extraction instrument),并且作为核酸纯化试剂盒将Bioneer公司选用Exift^p 提取试剂盒(extraction kit)并进行改进后使用。本发明中，自动纯化分注装置的核酸纯化试剂盒包括含有用于从含有核酸的多种生物试样中提取核酸的缓冲液的药筒组合及用于纯化的塑料消耗品组合。药筒组合由药筒①和药筒②构成，药筒①含有细胞内蛋白质分解用蛋白质分解酶、用于细胞分解的分解溶液、用于结合溶出的核酸的二氧化硅磁性粒子以及用于溶出的核酸与二氧化硅磁性粒子的结合的结合溶液；药筒②含有用于洗涤附着在二氧化硅磁性粒子的表面上的核酸之外的其它物质的一种以上的洗涤溶液以及用于从二氧化硅磁性粒子的表面上高效分离核酸的溶出溶液。塑料消耗品组合由一次性滤嘴、反应用管、洗脱(elution)管构成，所述一次性滤嘴在核酸纯化工序中用于各种缓冲液的搬运、移送，所述反应用管在利用蛋白质分解酶的细胞分解工序中使用，所述洗脱(elution)管用于储藏最终纯化的核酸。核酸纯化试剂盒的药筒为多孔药筒，优选使用96孔型药筒。用于新型流感 A(HlNl)RNA的分离的核酸纯化试剂盒可选用Bioneer公司的ExiPi^p 病毒DNA/RNA试剂盒。病毒RNA提取工序包括样品预处理工序；作为标准试样添加阳性对照(Positive Control)、阴性对照(Negative Control)、内对照(IPC)及检测体试样的工序；利用自动纯化分注装置的核酸提取工序。提取的核酸自动与实时RT-PCR用诊断试剂盒混合，因此在核酸提取后无需向诊断试剂盒手动添加病毒RNA。作为具体的一个例子，利用实时核酸分析整合装置的核酸自动纯化分注装置和核酸纯化试剂盒纯化新型流感A病毒的病毒核糖核酸的工序如下。利用棉棒从患者的口腔及鼻腔中采集检测体。在用于核酸纯化之前，将装有病毒运送培养基(VTm media, Virus Transport Media)的检测体保管用管利用涡旋搅拌机强力搅拌一小时，使得病毒从棉棒中有效地落入到病毒运送培养基中。为了使粘在棉棒上的病毒移出到溶液(PBS、生理盐水、运送介质等)中，利用涡旋搅拌机充分混合1分钟以上。 向1. 5ml试管中移入混合的试样溶液1ml，以13，OOOrpm离心分离5秒 10秒。取上清液 200 μ 1用于病毒RNA的提取。按下自动纯化分注装置的电源进行初始化。本发明的实时核酸分析整合装置的管理软件(Manager Software)大体上分为两个部分，其一是控制自动核酸纯化分注装置的部分，另一是控制实时核酸扩增器的部分构成。为了提取病毒RNA，点击软件主界面左边的自动纯化分注装置的图标来选择测试中使用的诊断试剂盒。点击诊断试剂盒的输入栏来选择新型流感测试用诊断试剂盒时，自动选择应提取的核酸的种类。在“样品来源类型”输入窗内输入根据患者检测体类型的检测体种类。输入检测体种类后自动出现询问药筒状态的弹出窗。参考缓冲液药筒①来确认有没有使用的孔，存在使用的孔时，将该孔点击而显示，使得无法再次使用该孔。自动地在药筒①剩下的孔中标出阴性对照(Negative control)、阳性对照(Positive control)的位置。基本设定是各1个NTC、PC，也可以变更为各2个来设置。若存在复检清单时，在这步骤中可看到复检清单，选择清单中要复检的检测体号时按序完成“分配”。点击“样品名称”栏而利用条形码读取器或键盘输入检测体信息。为了将至今为止输入的信息应用到实时核酸分析整合装置，点击“应用”按钮。在工作台上向核酸纯化试剂盒的药筒①的第1列和第2列分别加入20 μ 1内对照 (IPC)。实时核酸分析整合装置中与输入内容相符地向药筒①的阴性对照(NTC)、阳性对照 (PC)的位置上，即A-I的位置上加入标准物质(positive control, PC) 200 μ 1，药筒①的 B-I位置上加入用DEPC处理的三次灭菌水(negative control，NTC) 200 μ 1。此外，剩下的 C-I中的H-I、Α-2中的Η-2位置上分别各加入患者的检测体200 μ 1。这时，一定要将核酸试样与实时核酸分析整合装置中输入的位置相符地加入到药筒内。对应各个装有标准物质、用DEPC处理的三次灭菌水、患者的检测体的药筒的孔的位置，将一次性滤嘴和单位反应管安装到各自动纯化分注装置内的架子(司)上。另外，将装有纯化的核酸的洗脱(elution)管和新型流感诊断测试用诊断试剂盒安装到冷藏块体。将准备好的药筒组合和塑料消耗品组合安装到自动纯化分注装置之后， 点击实时核酸分析整合装置管理软件的“运行”按钮，使自动纯化分注装置运行，从患者的检测体中纯化新型流感病毒的RNA。核酸纯化结束后，将用于保管核酸的洗脱(elution) 管和诊断测试用诊断试剂盒从冷藏块体分离，核酸保管用管利用提供的管盖盖上之后在-80°C保管。诊断试剂盒用光学粘合剂(adhesive optical)膜来密封条管上端之后，移到实时核酸扩增器进行实时RT-PCR。提取完毕后，核酸分注纯化装置内的洗脱管和诊断试剂盒反应管内分别装有提取的核酸溶液各50uL。本发明的实施例中，作为实时核酸扩增器选用了 exicycler 96实时定量温度块体(Real-Time Quantitative Thermal Block)，作为诊断试剂盒选用了 Bioneer 公司的 AccuPowerDiagnostics Kit。实时核酸扩增器中的得到的扩增结果由如下工序构成。首先，在实时核酸整合分析装置中点击实时核酸扩增器图标。管理软件中在左侧上端按试剂盒存储有提取结束的检测体清单。选择相应的清单而点击“获取样品清单”按钮。此时，生成用于指定将选择的诊断试剂盒放入多孔温度循环块体的哪个位置的弹出窗。选择按反应管条分类的的样品清单的检验栏(check box)，将检测体分配到多个孔内。选择各个孔可以指定位置，选择想要将画面的多孔图像进行报告的位置。对应诊断试剂盒条的个数，选择列和行的数值，决定将条安装到温度循环块体的哪个位置。例如，核酸分注后的诊断试剂盒为8-条时，将96孔的相应位置点击按钮，使得位于核酸扩增器的多孔温度循环块体的中间部分。选择完毕后，会看见能够输入数据名称的窗口，输入所需的名称之后，点击按钮会生成核酸扩增的作业清单。将诊断试剂盒与“分配”的位置相符地安装到实时核酸扩增器的多孔温度循环块体上之后，进行实时核酸扩增器的软件运行(rim software)。实时核酸扩增器中运行完毕之后，结果数据传输到管理软件。在实时核酸分析整合装置中，在控制部的管理软件的菜单部中点击可进行确认的“tap”，选择“更新结果”，调出聚合酶链反应(PCR)结果。选择生成在新打开的窗口的左侧上部的“作业清单”而调出结果。结果值按“分配”的顺序以Excel 文件形式进行确认。查看按各检测体分类的结果曲线时，可与链接的分析软件联动而分析曲线。结果确认的检测体在管理软件上更新结果，并非如此时，将从扩增步骤开始的重新测试或从分离(prep)步骤开始的重新测试进行yjsxor，生成复检清单。更具体地，在BSC(生物安全柜)内准备的自动纯化分注装置的板上放置个反应 (Reaction)管架子、一次性滤嘴(Disposable tip)架子，洗脱(Elution)管架子、缓冲液药筒(Buffer Cartridge)①号。对应检测体试样的个数，将反应管、一次性滤嘴(Disposable filter tip)、洗脱(Elution)管以及诊断试剂盒分别插在各个架子上。利用提供的“穿孔器 (hole-punch) ”对应检测体试样的个数和作为标准试样使用的阳性对照(PC)和阴性对照 (NTC)的个数，在缓冲液药筒(Buffer Cartridge)①、缓冲液药筒(Buffer Cartridge)② 的密封膜上开孔。参照图5所示的图，对应放入检测体试样、阳性对照(PC)和阴性对照 (NTC)的位置将20 μ 1植物性内对照(IPC)放入孔内。阴性对照(NTC)孔内放入用DEPC处理的蒸馏水200 μ 1。阳性对照(PC)孔内添加200 μ 1阳性对照(PC)。药筒孔内添加上述准备好的患者检测体试样200μ 1。盖上透明丙烯酸(。!■三皇)盖子之后，放入自动纯化分
注装置。启动自动纯化分注装置，调出新型流感测试用软件。确认要使用的装置之后，显示放入作为标准试样使用的阳性对照(PC)和阴性对照(NTC)的孔。在除了放入阳性对照(PC)和阴性对照(NTC)孔之外的检测体孔内，使用条形码读取器或手动地输入对于患者的检测体试样的患者信息(姓名、性别、担当等)。按下运行按钮开始提取病毒RNA。上述病毒RNA的提取工序结束之后，打开“门(Door) ”，将“基板(Base plate) ”向前拉动时，可看到安装有洗脱管和诊断试剂盒的洗脱管架子。洗脱(Elution)管和诊断试剂盒内分别装有提取的病毒RNA各50μ 1。因此，无需追加放入RNA或经DEPC处理的蒸馏水的工序。新型流感测试所需的诊断试剂盒从洗脱(Elution)管架子中取出后可直接利用实时核酸扩增器进行实时RT-PCR，且装在洗脱(Elution)管内的病毒RNA在复检时使用。提取出的病毒RNA尽可能直到使用时保存在-80°C下。洗脱(Elution)管架子为了保管提取出的核酸而保持4°C状态。本发明中使用的诊断试剂盒中含有的核酸扩增分析试剂包括装有靶核酸扩增中所需的所有成分的分析试剂。上述分析试剂为了利用实时核酸扩增器实时定性或定量检测检测体试样内的靶DNA或RNA而以“随时可用(ready-to-use)，，方式构成。上述本发明中使用的诊断试剂盒内的分析试剂包括核酸扩增所需的反应用缓冲液、MgCl2、4种dNTP、聚合酶、引物和检测标记，以及选择性地含有稳定剂，且为干燥的状态。检测标记为荧光染料或标记有荧光染料的探针，以此为特征。另外，根据本发明，分析试剂组合物优选为通过冷冻干燥、真空干燥、加热干燥或减压干燥而干燥的形态的组合物。本发明中使用的诊断试剂盒例如可使用Bioneer公司的AccuPower PCR试剂盒。Bioneer公司的New InfA(HlNl)& Inf A Premix中包括用于扩增新型流感A(HlNl)和流感A病毒的基因组的特定部分的引物、双标荧光探针(dual-labeled fluorogenic probe)、DNA聚合酶、dNIPs及稳定剂。扩增产物可通过检测热循环(thermal cycling)期间结合在特定探针上的荧光而得知。聚合酶链反应(PCR)产物的随循环的扩增可通过测定从探针掉落的报告染料(reporter dye)而实时测定。另外，诊断试剂盒中，为了试样的定性分析而
New Inf A HlNl & Inf A Positive controls。将核酸扩增分析试剂用在扩增步骤中时，向装有分析试剂的条(Strip)中放入分离的核酸。此时，向管内添加New Inf A HlNl & hf A阳性对照RNA和内对照(IPC)RNA试剂。经DEPC处理的蒸馏水和内对照(IPC)RNA以计算出的量混合制备混合液，向条的各个孔分别以45 μ 1进行分注。所有试剂及RNA的分注完毕的条在盖上盖子或密封膜密封后，使混合液的内容物完全混合。此时优选利用 Bioneer 公司的 Exispin (Cat. No :A_7040，Bioneer Co.，KOREA)混合后，进行旋转工序。此后，将条安装在实时核酸扩增器(Exicycler 96 Real-TimeQuantitative Thermal Block，Bioneer公司)的多孔温度循环块体上，运行实时核酸扩增
ο打开上述实时核酸扩增器(Exicycler 96)的后方下端的主电源按钮。当96孔多孔温度循环块体伸到机器前时，将聚合酶链反应(PC 条或板对应多孔温度循环块体的孔方向而放入。再次按下“门”按钮，96孔多孔温度循环块体(thermal block)进入里面。 运行Exicycler 96的操作程序(Run ExiDiagnosis icon)。为了运行聚合酶链反应(PCR) 反应中所需的操作方法而点击上端的“文件-设计实验(File-Design Experiment) ”。然后，出现“选择诊断试剂盒窗口 (Select Diagnostics Kit window) ”时选择 "New Inf A and InfA Real-Time PCR Kit”。上述“选择诊断试剂盒窗口”的选择结束后， 选择并打开输入有96孔多孔温度循环块体内的条位置信息的Excel文件。所有选择结束后，可以对能看到适合试剂盒的聚合酶链反应(PCR)反应条件和选择的位置信息的协议和板信息显示窗进行确认。点击“Rim tap”或“”按钮时，弹出可输入要存储的文件名称的新窗口。输入实验日期及样品相关信息后，按下“0K”按钮时，聚合酶链反应(PCR)开始。可用输入的文件名在分析软件中确认结果。对于上述核酸扩增的扩增结果利用Exicycler 96分析程序(analysis program)来进行分析。选择想要分析的“PCR data file(. ex3)”。在扩增结果的“Flu. Graph”画面中通过“基线减法(Baseline subtraction)(手动方式)”可进行匹配型分析， 使用“自动缩放按钮(auto scale button) ”还可确认分析软件中提供的基本的分析结果。 对阴性对照(NTC)孔而言，由于没有添加New Inf A & hf A RNA，因此应无法测到FAM和德克萨斯红(Texasred)荧光值。内对照(IPC) RNA孔的情况下，应在所有孔中测定出TAMRA 荧光值。执行聚合酶链反应(PCR)时，在孔中指定一定的孔，例如，指定Al、Bl为阴性对照 (NTC)，C1、D1为阳性对照(PC)。阳性对照和阴性对照作为标准试样来使用。上述两种对照不符合标准时，会在分析软件中生成错误(error)信息。本发明中，诊断分析时，软件具有 “自动(Auto)”分析功能。将结果分析自动分析而显示。[实施例3]实施例3涉及在利用本发明的实时核酸分析整合装置的靶核酸的检测方法中，用于核酸的分离纯化的内对照及多个检测体的同时检测，以下对本发明更详细地进行说明。(1)植物性内对照引物、探针设计及应用植物性内对照Qnternal Positive Control, IPC)为在烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)的基因组 RNA (GeneBank. ACCESSION No. NC001367)的碱基序列 4903 到 5709 (Movement protein gene,MP)、5712 到 6191 (Coat protein gene, CP)之间中，任意选择长度为18 ^bp、Tm值为55°C 62°C的碱基序列作为正向及反向引物。另外，在上述碱基序列之间中，任意选择长度为19 30bp之间，Tm值为67 72°C 之间的碱基序列作为探针[表1]，Tm值用ft~imer3 Plus软件进行了检测。[表1]
编号名称正向引物反向引物TaqMan探针(正向)1MPlAGATTTCAGTTCAAGGTCGTTCGAAACCCGCTGACATCTTACGCGATGAAAACGTCTGGCAAGT2MP2TCAGTTCAAGGTCGTTCCGAGAAAGCGGACAGAAACCACGCGATGAAAAACGTCTGGCAAGT3MP3ACAATTGCAGAGGAGGTGTGGGAACGACCTTGAACTCTGGTGGACAAAAGGATGGAAAGAGC
权利要求
1.一种实时核酸分析整合装置，其特征在于，是同时进行与多个种类的生物试样相对应的靶核酸的定性分析或定量分析的实时核酸分析整合装置，包括多个自动纯化分注装置(100)，其从含有靶核酸的多种生物试样中分离纯化各个试样中含有的靶核酸；实时核酸扩增器000)，其包括多孔温度循环块体(210)，并且实时测定从所述多个自动纯化分注装置(100)获得的不同的靶核酸的量；控制部，以与按照各个所述自动纯化分注装置(100)分别分离纯化的不同的靶核酸的种类对应的方式，以列为单位划分所述实时核酸扩增器O00)的温度循环块体O10)的多孔区域，按靶核酸种类来设定区域，并且，按所述设定区域的各个孔，分别存储根据所述自动纯化分注装置(100)的生物试样的信息，且将所述温度循环块体在相同条件下同时进行扩增，从而以对各个靶核酸进行定性分析或定量分析的扩增结果对应于所述自动纯化分注装置(100)中分离纯化的各个生物试样的方式进行整合管理；以及显示部(300)，实时输出所述控制部的定性分析或定量分析的结果。
2.根据权利要求1所述的实时核酸分析整合装置，其特征在于，所述实时核酸扩增器的温度循环块体O10)的多孔区域以列为单位划分，按靶核酸种类来设定区域，并且，所述设定的区域按各个孔分别存储根据所述自动纯化分注装置(100)的生物试样的信息，其中，追加存储阳性标准试样、阴性标准试样或定量标准试样的信息。
3.根据权利要求1所述的实时核酸分析整合装置，其特征在于，所述实时核酸扩增器(200)在所述多孔温度循环块体(210)上安装有诊断试剂盒，该诊断试剂盒含有从多个自动纯化分注装置(100)获得的不同的核酸。
4.根据权利要求3所述的实时核酸分析整合装置，其特征在于，所述多孔温度循环块体O10)是由12列X8行的孔构成的96孔温度循环块体。
5.根据权利要求4所述的实时核酸分析整合装置，其特征在于，所述多孔温度循环块体O10)以列为单位选择性地设定测定项目。
6.根据权利要求1所述的实时核酸分析整合装置，其特征在于，所述控制部在各个所述自动纯化分注装置(100)中将多个种类的生物试样与内对照一同进行分离时，通过所述实时核酸扩增器(200)中的扩增产物来判断所述自动纯化分注装置(100)中核酸分离成功与否，从而能够决定是否再次执行核酸分离。
7.根据权利要求1所述的实时核酸分析整合装置，其特征在于，所述控制部将各个生物试样的靶核酸的Ct值与临界Ct值进行比较，从而定性地检测靶核酸的存在与否，所述各个生物试样的靶核酸是实时核酸扩增器(200)在相同条件下同时扩增而得到。
8.根据权利要求1所述的实时核酸分析整合装置，其特征在于，所述控制部将在所述实时核酸扩增器O00)中以相同条件同时扩增已知浓度的定量标准试样和各个生物试样而得的各个Ct值与定量标准试样的Ct值定量曲线进行比较，从而换算出靶核酸的数量，进而定量地确定试样内的靶核酸。
9.根据权利要求1所述的实时核酸分析整合装置，其特征在于，所述自动纯化分注装置(100)包括药筒，其含有包含核酸的多种生物试样和用于从这些试样中提取核酸的缓冲液；冷藏块体；高温块体；废液桶；以及移液管块体，其可在具备移液管药筒的基板上移动并能够安装或卸下移液管，且具备用于施加或解除所述移液管的磁场的磁场施加单元；并且，控制部中存储根据所述自动纯化分注装置(100)的各个标准试样及生物试样的信息和靶核酸的信息。
10.根据权利要求3所述的实时核酸分析整合装置，其特征在于，所述实时核酸扩增器 (200)包括转换为设定温度的多孔温度循环块体；用于向安装在所述温度循环块体上的反应管照射光的光源；用于接受从反应管发出的光的荧光检测传感器；按所述设定的列分别设定测定项目并存储。
11.根据权利要求1所述的实时核酸分析整合装置，其特征在于，所述实时核酸分析整合装置还包括存储分析结果的存储数据库装置000)。
12.一种利用实时核酸分析整合装置的靶核酸检测方法，其特征在于，包括1)在多个自动纯化分注装置(100)中，从标准试样和含有核酸的多种生物试样中分离纯化各个试样中含有的核酸，然后将分离纯化的溶液添加到核酸扩增反应混合物反应管而混合的步骤；2)通过使安装所述核酸扩增反应混合物反应管的多孔温度循环块体(210)与从所述自动纯化分注装置(100)中分离纯化的各个靶核酸相对应的方式，按靶核酸种类以列为单位划分多孔温度循环块体O10)的多孔而设定块体，按所述设定的块体内的各个孔分别存储从所述自动纯化分注装置(100)中分离的标准试样和生物试样的信息的步骤；3)以与所述步骤2)中存储的实时核酸扩增器的多孔温度循环块体O10)的各个孔的生物试样信息一致的方式，将步骤1)中准备的反应管安装到各个孔的步骤；4)将安装在所述实时核酸扩增器的温度循环块体(210)上的各个靶核酸在相同条件下同时进行扩增，从而将与多个生物试样对应的各个靶核酸进行定性分析或定量分析，得到扩增结果的步骤。
13.根据权利要求12所述的利用实时核酸分析整合装置的靶核酸检测方法，其特征在于，所述步骤1)中，在自动纯化分注装置(100)中向生物试样添加内对照而分离核酸，从所述扩增结果判断在自动纯化分注装置(100)中的靶核酸分离的成功与否和扩增效率，确定靶核酸检测的有效性。
14.根据权利要求12所述的利用实时核酸分析整合装置的靶核酸检测方法，其特征在于，在所述步骤1)中，反应管以干燥的状态含有核酸扩增所需的成分，向其中加入分离纯化的核酸溶液并混合，从而制造核酸扩增反应混合物反应管。
15.根据权利要求13所述的利用实时核酸分析整合装置的靶核酸检测方法，其特征在于，靶核酸为RNA时，所述内对照为烟草花叶病毒粒子。
16.根据权利要求13所述的利用实时核酸分析整合装置的靶核酸检测方法，其特征在于，靶核酸为DNA时，所述内对照为质粒DNA或PCR扩增产物。
全文摘要
本发明涉及实时核酸分析整合装置及利用该装置的方法，更详细地，由多个种类的多个生物试样同时进行与试样相应的基因的定性分析或定量分析的实时核酸分析整合装置及利用该装置的靶核酸检测方法，根据上述本发明的实时核酸分析整合装置及利用该装置的靶核酸检测方法，具有一次性地迅速且准确地处理多种检测体所要求的多种靶的测试、在需要诊断疾病的医院等能够高效地使用的优点。
文档编号C12Q1/68GK102388148SQ201080011492
公开日2012年3月21日 申请日期2010年3月11日 优先权日2009年3月11日
发明者丘完林, 张大镇, 徐振喆, 朴海埻, 朴翰浯, 金成烈, 金裕晶, 金锺勋 申请人:株式会社百奥尼