专利名称：大豆事件127和与其相关的方法
大豆事件127和与其相关的方法相关申请的交叉引用本申请要求保护2009年1月7日提交的美国专利临时申请号61/143，049的权益， 所述申请的全部内容在此引作参考。经由EFS-WEB提呈的序列表的引用本申请经由EFS-Web电子提交，包括以文本文档格式电子提交的序列表。该文本文档文件含有在2010年1月5日创建的标题为“1378358. txt”的序列表，为47，052个字节大小。该文本文档文件中含有的序列表是本说明书的部分，在此以其整体引作参考。领域本发明一般涉及分子生物学，涉及用于提高植物对抑制乙酰羟酸合成酶的除草剂的耐受性的组合物及方法和用于杂草控制的组合物及方法。背景大豆(Glycine max)在世界上很多地区是重要作物。已将生物技术方法应用于大豆以改进农学性状和产物质量。在大豆生产中重要的一种这类农学性状是对除草剂的耐受性，尤其是对草甘膦除草剂的耐受性。随着草甘膦耐受性大豆使用的扩展，耐受草甘膦的杂草也出现了。因此，为了控制杂草，需要耐受除草甘膦外的除草剂的大豆植物。植物例如大豆中转基因(例如提供除草剂耐受性的转基因)的表型表达，受到基因本身结构及其在植物基因组中的整合位置二者的影响。同时，基因组中不同位置的转基因(在外来DNA中)的存在，将以不同方式影响植物的总体表型。通过基因操作在农艺方面或工业方面成功地将商业上感兴趣的性状引入植物中，可能是取决于不同因素的漫长过程。遗传转化的植物实际上的转化和再生仅是一系列选择步骤的开始，所述一系列选择步骤包括大量遗传表征、育种和田间试验评估，最终通向选择优良事件(event)。因为在作物改良中增加了遗传修饰的使用以改进转基因向商业品种的基因渗入， 所以明确地检测和/或鉴定特定转基因事件的能力越来越重要，以便分开GMO和非GMO产品及鉴定专有物质。仍然需要开发既快速又简单不需大量实验室设备的方法，用于检测特定转基因事件。另外，用于检测特定事件的方法在以下方面将有益遵从规则，所述规则要求对源自重组作物植物的食品进行预先市场批准和标记；或用于环境监测、野外作物性状监测或来自作物收获物的产品的监测；以及用于确保受监管条款或合同条款管辖的各方遵守。简述在一个实施方案中，本发明提供用于在栽培区控制杂草的方法，所述方法包括将有效量的非选择性除草剂施用于具有包含事件127核酸分子的大豆植物的栽培区。在另一实施方案中，本发明提供用于控制作物田(crop field)中耐受草甘膦的杂草的方法，所述方法包括将有效量的抑制AHAS的除草剂施用于具有包含事件127核酸分子的大豆植物的作物田。在又一实施方案中，本发明提供具有SEQ ID NO 1的1312-6069位核酸序列的分离的核酸分子。
在另一实施方案中，本发明亦提供具有异源核酸分子的转基因大豆植物，所述异源核酸分子具有SEQ ID NO 1的核苷酸1302-6079的核酸序列。 本发明亦提供分离的核酸引物对，所述核酸引物对包含能够扩增事件127核酸分子的第一和第二分离的核酸分子。在另一实施方案中，本发明提供用于鉴定生物学样品中的事件127核酸分子的试剂盒，所述试剂盒包括第一和第二核酸引物，其中第一和第二核酸引物能够扩增事件127 核酸分子。本发明亦提供用于鉴定事件127大豆植物的方法，所述方法包括(a)形成混合物，所述混合物包含含有大豆DNA的生物学样品和能够扩增事件127特异性核酸分子的第一和第二核酸引物；(b)在允许第一和第二核酸引物扩增事件127特异性核酸分子的条件下，让混合物反应；和(c)检测扩增的片段核酸分子的存在情况，其中存在大豆事件127特异性核酸分子，表明大豆植物为事件127大豆植物。在再一实施方案中，本发明提供用于鉴定具有事件127核酸分子的大豆植物的方法，所述方法包括(a)形成混合物，所述混合物包含含有大豆DNA的生物学样品和能够与事件127特异性核酸分子杂交的核酸分子探针；(b)在允许核酸分子探针与事件127特异性核酸分子杂交的条件下，让混合物反应；和(c)检测所述探针与DNA的杂交情况，其中存在核酸分子探针与大豆DNA的杂交表明存在事件127核酸分子。本发明进一步提供用于提高包含事件127核酸分子的大豆植物的产量的方法，所述方法包括将有效量的抑制AHAS的除草剂施用于一种或多种包含事件127核酸分子的大豆植物和周围区域，其中所述抑制AHAS的除草剂减少周围区域的杂草生长；和从所述一种或多种大豆植物收获种子。在另一实施方案中，本发明提供用于对耐受抑制AHAS的除草剂的大豆植物进行育种的方法，所述方法包括(a)让包含事件127核酸分子的大豆植物与第二种大豆植物杂交；(b)从步骤(a)的杂种获得种子；(c)从所述种子获得DNA样品；和(d)检测样品中事件127核酸分子的存在情况，其中存在事件127核酸分子表明所述种子能够产生耐受抑制 AHAS的除草剂的大豆植物。本发明亦提供包含事件127核酸分子的大豆植物的种子。在又一实施方案中，本发明提供用于检测生物学样品中事件127核酸分子的存在情况的方法，所述方法包括(a)形成混合物，所述混合物包含含有DNA的生物学样品和能够扩增事件127特异性核酸分子的第一和第二核酸引物；(b)在允许第一和第二核酸引物扩增包含事件127特异性核酸分子的核酸分子的条件下，让混合物反应；和(c)检测扩增的核酸分子的存在情况，其中存在事件127特异性核酸分子表明样品含有事件127核酸分子。在另一实施方案中，本发明提供用于检测生物学样品中的事件127核酸分子的方法，所述方法包括(a)形成混合物，所述混合物包含含有DNA的生物学样品和能够与事件 127特异性核酸分子杂交的核酸探针；(b)在允许探针与事件127特异性核酸分子杂交的条件下，让混合物反应；和(c)检测杂交的核酸分子的存在情况，其中存在事件127特异性核酸分子表明样品含有事件127核酸分子。本发明亦提供用于检测生物学样品中事件127插入核酸分子的存在情况的方法， 所述方法包括(a)形成混合物，所述混合物包含含有DNA的生物学样品和能够扩增事件127插入核酸分子的第一和第二引物；(b)在允许第一和第二核酸引物扩增包含事件127插入核酸分子的核酸分子的条件下，让混合物反应；和(c)检测扩增的核酸分子的存在情况， 其中存在事件127插入核酸分子表明样品含有事件127插入DNA。在再一实施方案中，本发明提供用于检测生物学样品中事件127插入核酸分子的存在情况的方法，所述方法包括(a)形成混合物，所述混合物包含含有DNA的生物学样品和能够与事件127插入核酸分子区退火的第一引物和能够与宿主细胞基因组中的侧翼核酸分子退火的第二引物；(b)在允许第一和第二核酸引物产生包含事件127插入核酸分子片段的扩增核酸分子的条件下，让混合物反应；和(c)检测扩增的核酸分子的存在情况，其中存在事件127插入核酸分子片段表明样品含有事件127插入DNA在另一实施方案中，本发明提供用于栽培大豆植物的方法，所述方法包括(a)提供包含事件127核酸分子的大豆种子；(b)在允许种子发芽以产生生长中的包含事件127 核酸分子的大豆植物的条件下，将大豆种子种植在生长培养基中；和(c)让生长培养基、种子或植物与包含至少一种选自以下的组分的除草剂组合物接触咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、其彼此的组合及其与至少一种其它活性成分的组合。在又一实施方案中，本发明提供用于检测样品中的事件127多肽的方法，所述方法包括从大豆植物获得生物学样品；和对样品进行至少一种免疫学测定，其中所述测定能够检测事件127多肽。本发明亦提供用于检测生物分子的装置，所述装置包括具有表面的固相支持体； 和至少一种与固相支持体表面连接的事件127诊断分子。附图简述图IA提供质粒pAC321的示意图。图IB提供用于转化的含有AHASL5，UTR、csrl-2 编码序列和AHASL3’ UTR的pAC321的PvuII片段的示意图。标明了用于拷贝数、缺乏主链和两代间的稳定性的DNA印迹分析的限制性酶位点(NcoI、XbaI、SpeI)。图2提供大豆事件127植物的一个实例的育种历史的示意图。图3提供pAC321 PvuII转化片段与大豆事件127插入物的比对的示意图。图4A-4C提供实施例3中所述的大豆事件127植物的一个实例中插入物拷贝数的 DNA印迹杂交结果。图4D提供用于杂交实验的探针的相对位置的示意图。图5提供显示在实施例3中所述的大豆事件127植物的一个实例中缺乏载体主链序列的DNA印迹杂交结果。图5A提供用探针VPl的结果，图5B提供用探针VP2的结果。图 5C提供127事件序列上的杂交区的相对位置的示意图。图6提供事件127序列两代间稳定性的DNA印迹杂交分析结果。图6A提供用 5’ UTR探针的结果。图6B提供用AHAS探针的结果。图6C提供用3’ UTR探针的结果。图 6D提供各个探针在事件127序列上的杂交区域的示意图。图7提供大豆事件127植物的一个实例中的插入物和侧翼序列的图示。亦标明用于实施例3中所述的序列测定的6个扩增子。图8提供大豆事件127插入物和侧翼区的全长核酸序列(SEQ ID NO :1)。1-1311 位代表5，侧翼DNA，1312-6069位代表编码经修饰的AHASL蛋白的插入DNA，6070_10，656 位代表3，侧翼DNA。图9提供实施例3中所述的大豆事件127植物的一个实例中AtSec 61 γ亚基转录的RT-PCR分析的凝胶电泳结果。
图10提供501bp开放阅读框(ORF)转录的RT-PCR分析的凝胶电泳结果，所述开放阅读框通过在实施例3中所述的大豆事件127植物的一个实例的3’侧翼连接处插入 csrl-2编码序列的376bp重复来创建。图11提供实施例3中所述的事件127-特异性PCR检测方法实例的凝胶电泳结果。图12提供用于产生事件127的DNA，即来自pAC321构建体的6156bp的PvuII片段(SEQ ID NO :4)。详述本发明提供表现出对抑制AHAS的除草剂有耐受性的大豆植物，所述抑制AHAS的除草剂为例如咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑并嘧啶磺酰苯胺除草剂和/或嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂。本发明大豆植物含有位于大豆基因组的特征位置的插入的核酸分子。亦提供用于与所公开的大豆植物一起使用的方法和组合物。在进一步详述本发明之前，将首先定义以下术语。I.定义本文所用术语“大豆”和“大豆植物”意指大豆(Glycine max)植物，包括可产大豆的所有植物品种。术语“大豆植物”包括植物部分。本文所用术语“植物部分”包括植物细胞、植物器官、植物原生质体、来自可再生植株的植物细胞组织培养、植物愈伤组织、植物块和在植物或植物部分(例如晶胚、花粉、胚珠、种子、种子荚果、叶、花、枝条、果实、茎、根、 根尖、花药、子叶、胚轴等)中完整的植物细胞。谷物意指由商业栽培者为了除栽培或繁殖物种外的目的生产的成熟的种子。再生植株的后代、衍生物、变体和突变体亦包括在本发明范围内，前提是这些部分包含事件127核酸分子。“事件127核酸分子(event 127 nucleic acid molecule) ”是指以下核酸分子， 其包含来自SEQ ID NO 1的1312-6069位的核酸序列；通过传统植物育种获得的其变体， 所述变体提供用于表达AHAS酶的修饰形式，所述AHAS酶的修饰形式具有对应于653位含有天冬酰胺而不是天然丝氨酸(S653N)的AHASL蛋白，其中AHAS酶的修饰形式表现出耐受 AHAS抑制剂，所述AHAS抑制剂正常应抑制野生型AHAS酶的酶活性；或这些中任一种的互补序列。事件127核酸分子可含有在SEQ ID NO 1的1312-6069位侧翼的另外的序列(或对于变体，在5’和3’位置侧翼的另外的序列)。“事件127区”是指包括至少事件127核酸分子片段并指示事件127植物的核酸分子。事件127区可包括以下中一种或多种5’和/或3’连接区、插入DNA或插入DNA的 csrl-2重复与插入DNA的其余部分的连接区。此外，其中可另外包括5’和/或3’侧翼序歹Ij DNA0本文所用术语“事件127特异性核酸分子”是指区别地鉴别或能够区别地鉴别样品中的事件127核酸分子的核酸分子序列。事件127特异性核酸分子可包括因转化事件产生的插入DNA的连接区及独特突变或重复。例如，在PCR反应中使用具有SEQ ID NO :37和 38核酸序列的PCR引物导致扩增子的扩增，这指示事件127核酸分子。“事件127分子”是指源自事件127核酸分子、从其获得或由其编码的核酸分子、多肽分子和其它生物分子。“事件127诊断分子”是指可用于直接或间接检测事件127核酸分子的分子。事件127诊断分子包括可在检测事件127核酸分子或由所述核酸分子表达的多肽的方法中使用的核酸分子，例如引物和探针、抗体及其保留结合位点的片段(例如FV、Fab、Fab’、F(ab’ ) 和缺失H-结构域的抗体)、多肽及其衍生物、核酸类似物、适体等。本文所用“插入DNA”是指经由转化过程引入到植物材料中的异源DNA，包括与用于本文所解释的这类转化中的初始DNA不同的DNA。“事件127插入核酸”和“事件127插入DNA”是指具有SEQ ID NO=I的1312-6069位核酸序列的核酸分子(其不同于用于产生事件127的DNA，即来自图12中提供的pAC321构建体的6156bp的PvuII片段(SEQ ID NO 4))。 “事件127”植物、细胞、种子、植物部分或植物组织是指含有事件127核酸分子的任何植物、细胞、种子、植物部分或植物组织，其优选含有至少一种事件127特异性核酸。事件127植物包括含有具有SEQ ID NO 1序列的核酸分子的事件127-9大豆植物，例如称为 BPS-CV127-9的大豆植物。术语“侧翼DNA ”是指天然存在于生物体例如植物中紧接插入核酸分子的上游或下游并与之邻接的基因组DNA。本文所用“侧翼区”或“侧翼序列”是指至少10、20、50、100、 200、300、400U000U500、2000、2500或5000个碱基对或更多的序列，其位于初始外来插入 DNA分子的紧接上游(5’ )并与之邻接或紧接下游(3’ )并与之邻接。事件127侧翼区的非限制性实例在SEQ ID NO :2和3和其变体及片段中提出，其中SEQ ID NO :2代表SEQ ID NO :1 的 1-1311 位，SEQ ID NO 3 代表 SEQ ID NO 1 的 6070-10，656 位。导致外来插入DNA随机整合的转化程序，导致产生含有对每一转化体特征性和独特性的不同侧翼区的各个转化体。当通过传统杂交将重组DNA引入到植物中时，其侧翼区通常与初始转化体的侧翼区没有变化。各个转化事件亦将含有在异源插入DNA和基因组 DNA片段之间或两个基因组DNA片段之间或两个异源DNA片段之间的独特连接。“连接点”是其中两个特异性DNA片段连接的点，例如其中插入DNA连接侧翼DNA 的点。连接点亦存在于转化生物体中，其中两个DNA片段以自天然生物体中发现的方式改变的方式连接在一起。本文所用“连接DNA”或“连接区”是指包含连接点的DNA。来自大豆事件127的DNA中的连接点的非限制性实例，包括例如SEQ ID NO 5和6中提出的序列， 其中 SEQ ID NO 5 代表 SEQ ID NO 1 的 1311-1312 位，SEQ ID NO 6 代表 SEQ ID NO 1 的 6069-6070 位。应该理解，本文所用术语“转基因的”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，其基因型已通过存在异源核酸来改变，其包括最初如此改变的那些转基因学以及通过有性杂交或无性繁殖从初始再生事件产生的那些。本文所用术语“转基因的”不包括通过以下方法对基因组(染色体的或染色体外的)的改变常规植物育种方法；或天然存在的事件，例如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变。“转化”是指将核酸片段转移到宿主生物体基因组，导致遗传上稳定的遗传。含有转化的核酸片段的宿主生物体称为“转基因的”生物体。植物转化方法的实例包括本领域已知和以下公开的那些方法。“转基因事件”如下产生通过用一种或多种异源DNA构建体转化植物细胞，所述异源DNA构建体包括包含目的转基因的核酸表达盒；因将转基因插入到植物基因组中所致的植物群再生；和选择特征为插入到特定基因组位置的特定的再生植物。事件的表型特征为表达一种或多种转基因。在遗传水平，事件是植物遗传组成的部分。本文所用“样品”包括含有核酸分子或多肽的任何样品，其源自植物、植物材料或在产品中，所述产品为例如但不限于包含或源自植物材料的食物或饲料产品(新鲜的或经过加工的)。在转化情境中的“引入”或“被引入”，意指以使构建体获得进入植物细胞内部这样的方式将异源DNA构建体提呈给植物。本发明植物和方法不依赖将核酸构建体引入到植物的特定方法，只要核酸构建体获得进入植物的至少一个细胞的内部即可。用于将核酸构建体引入植物的方法为本领域已知，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。术语“后代”是指通过在事件127植物和另一品种之间有性杂交(例如异型杂交、 自交或回交)产生的植物。即使是在与回归亲本反复回交后，来自事件127亲本的插入的 DNA和/或侧翼DNA也在相同的染色体位置存在于杂交后代中，并可例如通过针对事件127 特异性区进行筛选来鉴定。本文提及核酸分子所用的“异源的”为来源于外来物种的核酸分子，或若其来自同一物种，则通过故意的人为干预在组成和/或基因组基因座方面自其天然形式进行修饰。“分离的”或“纯化的”核酸分子或其生物学活性部分，大体上或基本上不含通常在其天然存在的环境中发现的伴随所述核酸分子或与其互相作用的组分。因此，分离的或纯化的核酸分子大体上不含其它细胞物质或当通过重组技术产生时的培养基，或当为化学合成时大体上不含化学前体或其它化学药品。“探针”是指与可检测标记或报道分子(例如放射性同位素、配体、化学发光剂、酶等)连接的分离的核酸分子。所述探针与靶标核酸分子的链互补，在本发明情况下，与来自大豆事件127植物生物学材料的分离的DNA链互补，所述生物学材料来自大豆植物或来自包含来自所述事件的DNA的样品。探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，而且还包括可特异性检测靶标DNA序列存在情况的聚酰胺及其它探针材料。本文所用“引物”为以下分离的核酸分子，其能够通过核酸杂交与互补的靶标DNA 链退火，以在引物与靶标DNA链之间形成杂合体，然后可通过聚合酶例如DNA聚合酶将其沿着靶标DNA链延伸。“引物对”是指用于例如通过聚合酶链式反应(PCR)或其它常规核酸扩增方法来扩增靶标核酸分子的引物对。“聚合酶链式反应”或“PCR”为用于扩增特定DNA区段的技术。“系”或“株”为同样家系的个体组，其通常被近交到一定程度并通常为同基因或接近同基因的。本发明上下文中的术语“被杂交”或“杂交”，意指配子融合，例如在植物情况下经由授粉以产生后代(即细胞、种子或植株)。该术语包括有性杂交(一个植株由另一个植株来授粉)和在植物情况下的自交(自花授粉，即当花粉及胚珠来自同一个植株时)二者。术语“基因渗入”是指将来自一个遗传背景的遗传基因座的所期需的等位基因传送到另一个遗传背景。在一种方法中，可通过两个亲本间的有性杂交来使所期需的等位基因基因渗入，其中至少一个亲本在其基因组中具有所期需的等位基因。II.大豆事件127植物
提供了涉及耐受AHAS抑制剂的转基因大豆植物的组合物和方法。所述组合物包含事件127大豆植物。如下修饰野生型或非转化大豆植物获得事件127大豆植物通过将拟南芥(Arabidopsis thaliana)的耐受咪唑啉酮的乙酰羟酸合酶大亚基基因(csrl_2)插入或基因渗入到本文所定义的大豆基因组中。在某些实施方案中，将csrl-2基因插入到大豆基因组提供乙酰羟酸合酶(AHAS)酶修饰形式的表达，所述修饰形式具有含对应于653位的天冬酰胺而不是天然丝氨酸(S653N)的AHASL蛋白。AHAS酶对于支链氨基酸的生物合成很重要，受到某些除草剂(抑制AHAS的除草剂)的抑制。对AHAS基因的修饰克服了该抑制，从而提供对大范围的抑制AHAS的除草剂的耐受性。因此，大豆事件127植物耐受至少一种抑制AHAS的除草剂，或与缺乏事件127核酸分子的大豆植物相比，对增加量的至少一种抑制AHAS的除草剂有耐受性发现赋予AHAS抑制剂耐受性的核酸分子被插入到了大豆基因组的特征位置，由此产生127事件。在一个实施方案中，在列举的染色体位置具有事件127核酸分子的事件 127大豆植物，包含具有至少SEQ ID NO :5和/或6的核酸分子序列的一个或多个基因组/ 转基因连接。事件127的基因组插入位点的特征提供提高的繁殖效能，使得能够使用分子标记以在繁殖群及其后代中跟踪转基因插入物。本文提供了用于鉴别、检测和使用事件127 大豆植物的各种方法和组合物。来自质粒pAC321的PvuII片段的csrl_2表达盒在大豆基因组的单个特征性遗传基因座整合，产生事件127。在一个实施方案中，相对于来自质粒PAC321的原始转化片段， 事件127中插入的csrl-2盒含有三个点突变，其中一个突变在AHAS编码序列，另两个在 AHASL 3’非翻译区(UTR)的下游。所述突变包括编码序列中G到A的突变，其导致表达具有R272到K272的氨基酸取代的AHAS多肽。点突变的DNA印迹分析和序列验证，表明插入物在至少8代内稳定。事件127中插入的DNA亦含有直接在3’整合点前面的csrl-2编码序列部分的376个碱基对(bp)重复(重复由SEQ ID NO=I的5694-6069位来代表)。所述重复的376bp区段产生延伸到3’侧翼序列的501bp的开放阅读框(ORF)。逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)结果表明，该501bp ORF未被转录。在某些实施方案中，事件127核酸分子亦含有拟南芥SEC61 γ亚基基因座(At3g48570)的大部分，其为用于转化的DNA片段的组分。在其它实施方案中，SEC61 γ亚基基因可在大豆事件127植物中表达。例如，如以下实施例所更详细地公开，RT-PCR实验显示拟南芥SEC61 γ亚基基因在事件127叶组织中弱转录。总共约1. 3千碱基(kb)的5，侧翼大豆DNA与约4. 6kb的3，侧翼大豆DNA —起测序。可将侧翼序列信息用于开发本发明事件127-特异性定性PCR检测方法。事件127核酸分子的其它特性，例如经鉴定的点突变和重复，亦可用于本文提供的方法中，用于检测包括后代及其衍生物在内的事件127植物。本发明事件127植物对抑制AHAS的除草剂的施用耐受。事件127植物对抑制AHAS 的除草剂在以下施用水平的水平表现出耐受或提高的耐受，所述施用水平包括等同于施用 50g ai/ha-约 500g ai/ha、70g ai/ha-约 400g ai/ha 以及 70g ai/ha-约 300g ai/ha 除草剂量的量。所述耐受亦可包括耐受抑制AHAS的除草剂施用的商业水平的1X、2X、3X、4X、 5X或更大倍数量的所述除草剂水平。可通过测定除草剂耐受性的任何方法来测定对抑制AHAS的除草剂的耐受。例如，如果与合适的对照植物相比，显示伤害小于对照植物所表现出的伤害达至少5%、10%、15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,90%, 100% ,150%,200%,250%,300%,400%,500%,600%,700%,800%,900%^； 1000% 或更多，那么可证明大豆事件127植物耐受抑制AHAS的除草剂或其它化学药品。以该方式，耐受抑制AHAS的除草剂或其它化学药品的植物，与合适的对照植物相比显示“改进的耐受性”。 通过评价植物生长的任何参数或本领域技术人员充分认为合适的参数，来评估因除草剂或其它化学药品处理而产生的伤害。可通过肉眼检查和/或通过统计学分析个体植株或植株群的合适参数来评估伤害。因此，例如，可通过评价诸如植株高度、植株重量、叶的颜色、开花、繁殖力、产量、种子生产等参数来评估伤害。亦可通过评价到特定发育阶段(例如成熟或开花)消逝的时间，或植物从用特定化学药品和/或除草剂处理直到恢复所消逝的时间， 来评估伤害。可在用除草剂处理或接触事件127植物后的不同时间，评估用抑制AHAS的除草剂或其它化学药品引起的伤害。可大约在对照植物表现出最大伤害的时间来评估伤害，或可一段时期后来评估，所述时期中用除草剂或其它化学药品处理的对照植物相对于给予处理时的大小或阶段可测量地生长和/或发育。另外，可在用除草剂处理测试植物后的不同时间例如12小时或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或3周、4周或更长时间，评估伤害。只要允许检测测试植物和对照植物响应处理的差异，任何时间评估都合适。本发明进一步包括含有事件127核酸分子的大豆CV603系(亦称为 “BPS-CV127-9”)的种子和源自所述种子的植物、植物细胞及种子，所述大豆CV603系以 NCIMB专利保藏号41603保藏。申请人于2008年12月22日在国家工业、食品和海洋细菌保藏中心(National Collections of Industrial, Food, and Marine Bacteria, NCIMB) (23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland, United Kingdom)保藏了至少邪00 粒含有事件127核酸分子大豆植物的种子，保藏物指派的NCIMB登记号为41603。遵照国际承认用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约的条款保持这些保藏物。该保藏仅因对本领域技术人员的方便而进行，并不承认保藏需要在35U. S. C. §112之下进行。从 Embrapa(Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuaria) ^^^1 ^ !^ 2008 ^ 12 月22日保藏在NCIMB的种子。在本申请待审期间，专利和商标事务专员(Commissioner of Patents and Trademarks)和在提出请求后由事务专员确定有资格的人员可获得该保藏物。在批准本申请中的任何权利要求后，申请人将依照37C. F. R. § 1.808让公众可获得保藏物的样品，该保藏物为在国家工业、食品和海洋细菌保藏中心(NCIMB) (23 St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1RY, Scotland, United Kingdom)保藏的至少 2500 粒含有事件 127 核酸分子的大豆植物的种子。该大豆CV603系种子的保藏物将在NCIMB保藏处(其为公共保藏处)保持30年时间或于最近请求后5年或专利可实施期(以时间较长者为准)，如果在该期间种子失活的话会更换。另外，申请人满足37C.F.R. § § 1.801-1. 809的所有要求，包括提供保存时样品生存力指示。申请人无权放弃法律关于生物材料转移或其商业运输强制的任何限制。申请人不放弃对该专利赋予的其权利或遵循植物品种保护法(Plant Variety Protection Act) (7 USC 2321，参照以下)适用于大豆CV603系的权利的任何侵犯。禁止未经授权的种子繁殖。所述种子可受管制。本发明事件127大豆植物亦包括产生事件127大豆植物的初始转化事件的后代、 衍生物、变体和突变体。可用鉴定所述植物的任何方法来鉴定所述植物，所述方法包括但不
13限于育种记录、除草剂耐受法、分子检测方法、本文公开的方法及其组合。本发明事件127大豆植物耐受至少一种除草剂，所述除草剂干扰缺乏S653N突变的内源性AHAS酶(抑制AHAS的除草剂)的活性。干扰AHAS酶活性的除草剂包括咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、三唑并嘧啶除草剂、嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂、磺酰基氨基-羰基三唑啉酮除草剂或其混合物或组合。在一个实施方案中，所述除草剂为咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂或其混合物。咪唑啉酮除草剂包括但不限于PURSUIT (咪草烟)、CADRE (甲基咪草烟)、RAPTOR (甲氧咪草烟)、SCEPTER (灭草喹)、ASSERT (咪草酯(imazethabenz))、ARSENAL (灭草烟)、前述任一种除草剂的衍生物和前述除草剂中的两种或更多种的混合物或组合，例如灭草烟/甲氧咪草烟(ODYSSEY )。咪唑啉酮除草剂亦可选自但不限于2-(4_异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、[2-(4_异丙基)-4-][甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-3_喹啉羧]酸、[5-乙基-2- (4-异丙基-]4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸、2- (4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)_烟酸、[2-(4-异丙基-4-甲基5-氧代-2-]咪唑啉-2-基)-5_甲基烟酸以及[6-(4-异丙基4_]甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-间-甲苯甲酸甲酯和[2-(4_异丙基-4-甲基-5-]氧代-2-咪唑啉-2-基)-对-甲苯甲酸甲酯的混合物。在一个实施方案中，使用5-乙基-2-(4-异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-烟酸和[2-(4_异丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-]基)_5_(甲氧基甲基)_烟酸。在另一实施方案中，使用[2-(4_异丙基-4-]甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)-5-(甲氧基甲基)_烟酸。可用于本发明的磺酰脲除草剂包括但不限于氯磺隆、甲磺隆、甲嘧磺隆、氯嘧磺隆、噻吩磺隆、苯磺隆、苄嘧磺隆、烟嘧磺隆、胺苯磺隆、砜嘧磺隆、氟胺磺隆、醚苯磺隆、 氟嘧磺隆(primisulfuron methyl)、醚磺隆、酰嘧磺隆、啶嘧磺隆(fluzasulfuron)、唑吡嘧磺隆、吡嘧磺隆、吡氯磺隆、四唑嘧磺隆、环丙嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、啶嘧磺隆、氟嘧啶磺隆(flupyrsulfuron methyl)、甲酰胺磺隆、碘磺隆(iodosulfuron)、环氧嘧磺隆、甲磺胺磺隆、氟磺隆、磺酰磺隆、三氟啶磺隆、三氟甲磺隆、前述任一种除草剂的衍生物和前述除草剂中两种或更多种的混合物。本发明三唑并嘧啶除草剂包括但不限于氯酯磺草胺 (cloransulam)、双氯磺草胺、双氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺和五氟磺草胺。本发明嘧啶基氧基苯甲酸酯(或嘧啶羧酸)除草剂包括但不限于双草醚(bispyribac)、嘧草硫醚(pyrithiobac)、嘧草醚(pyriminobac)、嘧啶肟草醚和环酯草醚(pyriftalid)。磺酰基氨基-羰基三唑啉酮除草剂包括但不限于氟酮磺隆(flucarbazone)和丙苯磺隆 (propoxycarbazone)0应该认识到，嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂与嘧啶基硫代苯甲酸酯除草剂有关，可由美国杂草科学协会(Weed Science Society of America)归于嘧啶基硫代苯甲酸酯除草剂目录下。因此，本发明除草剂进一步包括嘧啶基硫代苯甲酸酯除草剂，其包括但不限于上述嘧啶基氧基苯甲酸酯除草剂。III.核酸分子本发明亦提供分离的事件127核酸分子。本文所用术语“核酸分子”并非意欲将核酸分子限于包含DNA，而是可包括任何核苷酸，例如核糖核苷酸和核糖核苷酸及脱氧核糖核苷酸的组合。所述脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物二者。核酸分子亦包括所有序列形式，所述序列形式包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、干环结构等。在一个实施方案中，事件127核酸分子包括具有SEQ ID NO 1的1312-6069位核酸序列的核酸分子。在另一实施方案中，事件127核酸分子包括具有SEQ ID N0:1的 1302-6079核苷酸序列的核酸分子。事件127核酸分子亦包括SEQ ID NO :1片段。核苷酸序列“片段”可具有任何长度，例如至少 7、15、20、25、30、40、60、80、100、150、200、250、300、350、400、450、550、650、 700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3500、4000、 4500或更多个核苷酸(nt)长。这些片段具有多种用途，所述用途包括但不限于诊断探针和引物。当然，按照本发明较长的片段例如601-8000nt长的片段亦有用，对应于大部分(如果不是全部)SEQ ID NO :1核苷酸序列的片段也是如此。例如，至少20nt长的片段意为包含例如来自SEQ ID NO 1核苷酸序列的20个或更多个连续碱基的片段。事件127植物包含具有AHASL编码序列的转基因表达盒，所述序列具有能够提供对咪唑啉酮抑制性除草剂的抗性或耐受性的S653N突变。表达盒另外包括可操作地与 AHASL编码序列连接的5'和3'调控序列。“可操作地连接”意指在两个或更多个元件之间功能上连接。例如，目的核酸分子与调控序列(例如启动子)之间的可操作连接，是使得允许表达目的核酸分子的功能连接。可操作地连接的元件可为邻接或非邻接。当可操作地连接用于指两个蛋白编码区的连接时，其意指编码区处于同一个读框内。因此，大豆事件127植物中的表达盒以转录的5' -3'方向含有在植物中有功能的转录起始区及翻译起始区(例如启动子)、AHASL S653N编码区和转录终止区及翻译终止区。“启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA表达的核苷酸序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3'。启动子序列可包含近侧和更远侧上游元件，后述元件通常称为增强子。因此，“增强子”为可刺激启动子活性的核苷酸序列，可为启动子的固有元件或插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。启动子可以其整体得自天然基因，或由源自自然界发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含人工合成核苷酸区段。本领域技术人员应理解，不同启动子可在不同组织或细胞类型中或在发育的不同阶段或因响应不同的环境条件指导基因的表达。引起核酸片段在大部分细胞类型中于大部分时间表达的启动子， 通常被称为“组成型启动子”。在一个实施方案中，大豆事件127植物中的表达盒含有作为可操作地连接的组分的AHASL S653N编码序列(在拟南芥csrl_2启动子控制下)和csrl_2转录终止区。表达盒作为PvuII片段得自核酸构建体pAC321。在一个实施方案中，表达盒具有SEQ ID NO 4 的序列。提供分离的核酸分子，其可用于各种用于检测和/或鉴定事件127核酸分子的方法中。在一个实施方案中，“分离的”核酸分子不含在所述核酸分子源自的生物体的基因组 DNA中天然位于所述核酸分子侧翼的序列(即位于所述核酸的5'和3'端的序列)(例如蛋白质编码序列)。例如，在不同实施方案中，分离的核酸分子可含有在所述核酸分子源自的细胞的基因组DNA中天然位于所述核酸分子侧翼的核苷酸序列的不到约51Λ、41Λ、31Λ、 2kb、lkb、0. 5kb 或0. Ikb。在某些实施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO :5和/或6中提出的连接DNA序列。 在其它实施方案中，核酸分子包含SEQ ID NO :5和/或6中提出的连接DNA序列或其变体及片段。连接DNA序列的片段和变体适用于区别地鉴定事件127DNA。如本文另外地方所讨论，所述序列可用作用于检测样品中的事件127插入DNA的引物和/或探针。在其它实施方案中，提供可检测事件127植物、事件127插入DNA或事件127特异性核酸分子的核酸分子。这类序列包括包含SEQ ID NO :5和/或6中提出的核酸分子或其变体或其互补序列的任何核酸分子。在某些实施方案中，用于检测事件127核酸分子的核酸分子，包含SEQ ID NO :5和/或6中提出的序列或其互补序列。检测事件127核酸分子、 事件127插入DNA或事件127特异性区的核酸分子的片段和变体，适用于区别地鉴定事件 127植物。如本文其它地方所论述，这类序列可用作引物和/或探针。另外提供分离的DNA 核苷酸引物序列，其包含以下序列或由其组成=SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、41、42、43、 44、45、47、67、68、69、70 中提出的序列或其互补序列；或 SEQ ID NO :35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、47、67、68、69、70的变体和片段或其互补序列。在一个实施方案中，本文使用的特异性引物对包含以下所示的正向和反向引物 (具有所表示的SEQ ID NO 1的相对位置)。预测引物产生327个碱基对大小的带。
权利要求
1.一种用于控制栽培区中的杂草的方法，所述方法包括将有效量的非选择性除草剂施用于具有包含事件127核酸分子的大豆植物的栽培区。
2.权利要求1的方法，其中所述事件127核酸分子包含事件127特异性核酸分子。
3.权利要求1的方法，其中所述事件127核酸分子包含SEQID NO=I的核酸序列。
4.权利要求1的方法，其中所述非选择性除草剂包括㈧抑制AHAS的除草剂；⑶多种抑制AHAS的除草剂的组合；或(C) (A)或⑶与选自以下的除草剂的组合抑制EPSPS的除草剂、抑制GS的除草剂、抑制PPO的除草剂、生长素类除草剂及其组合。
5.权利要求4的方法，其中所述抑制AHAS的除草剂为灭草烟、甲基咪草烟或其任何组合。
6.权利要求1的方法，其中所述杂草耐受草甘膦。
7.一种用于控制作物田中耐受草甘膦的杂草的方法，所述方法包括将有效量的抑制AHAS的除草剂施用于具有包含事件127核酸分子的大豆植物的作物田ο
8.权利要求7的方法，其中所述大豆植物包含具有SEQID NO :1核酸序列的核酸分子。
9.权利要求7的方法，其中所述事件127核酸分子包含事件127特异性核酸分子。
10.权利要求7的方法，其中所述抑制AHAS的除草剂为灭草烟或甲基咪草烟。
11.一种包含SEQ ID NO :1的1312-6069位的核酸序列的分离的核酸分子。
12.权利要求11的分离的核酸分子，其中所述核酸分子在重组核酸构建体中。
13.一种包含权利要求11的分离的核酸分子的大豆植物。
14.一种包含异源核酸分子的转基因大豆植物，所述异源核酸分子包含SEQ ID NO 1 的核苷酸1302-6079的核酸序列。
15.权利要求14的转基因大豆植物，其中所述大豆植物耐受抑制AHAS的除草剂。
16.一种分离的核酸引物对，其包含能够扩增事件127核酸分子的第一和第二分离的核酸分子。
17.权利要求16的分离的核酸引物对，其中所述第一分离的核酸分子选自SEQID NO37、39、41、43和 67。
18.权利要求16的分离的核酸引物对，其中所述第二分离的核酸分子选自SEQID NO38、40、42、44和 68。
19.权利要求16的分离的核酸引物对，其中所述第一分离的核酸分子包含SEQID NO 41，所述第二分离的核酸分子包含SEQ ID N0:42。
20.权利要求19的分离的核酸引物对，其中所述引物对能够扩增具有SEQID N0:1核酸序列的核酸分子。
21.一种用于鉴定生物学样品中的事件127核酸分子的试剂盒，所述试剂盒包括第一和第二核酸引物，其中所述第一和第二核酸引物能够扩增事件127核酸分子。
22.权利要求21的试剂盒，其中所述第一和第二核酸引物能够扩增具有SEQID NO=I 核酸序列或其片段的核酸分子。
23.一种用于鉴定事件127大豆植物的方法，所述方法包括(a)形成混合物，所述混合物包含含有大豆DNA的生物学样品和能够扩增事件127特异性核酸分子的第一和第二核酸引物；(b)在允许所述第一和第二核酸引物扩增事件127特异性核酸分子的条件下，让所述混合物反应；和(c)检测扩增的片段核酸分子的存在情况，其中存在所述大豆事件127特异性核酸分子表明所述大豆植物为事件127大豆植物。
24.一种用于鉴定具有事件127核酸分子的大豆植物的方法，所述方法包括(a)形成混合物，所述混合物包含含有大豆DNA的生物学样品和能够与事件127特异性核酸分子杂交的核酸分子探针；(b)在允许所述核酸分子探针与事件127特异性核酸分子杂交的条件下，让所述混合物反应；和(c)检测所述探针与所述DNA的杂交情况，其中存在所述核酸分子探针与所述大豆DNA 的杂交表明存在事件127核酸分子。
25.一种用于提高包含事件127核酸分子的大豆植物的产量的方法，所述方法包括 将有效量的抑制AHAS的除草剂施用于一种或多种包含事件127核酸分子的大豆植物和周围区域，其中所述抑制AHAS的除草剂减少所述周围区域的杂草生长；和从所述一种或多种大豆植物收获种子。
26.一种用于对耐受抑制AHAS的除草剂的大豆植物进行育种的方法，所述方法包括(a)让包含事件127核酸分子的大豆植物与第二种大豆植物杂交；(b)从步骤(a)的杂种获得种子；(c)从所述种子获得DNA样品；和(d)检测所述样品中事件127核酸分子的存在情况，其中存在所述事件127核酸分子表明所述种子能够产生耐受抑制AHAS的除草剂的大豆植物。
27.一种包含事件127核酸分子的大豆植物的种子。
28.权利要求27的种子，其中所述事件127核酸分子包含SEQID NO=I的核酸序列。
29.权利要求28的种子，其中将包含事件127核酸分子的种子的代表性样品以NCIMB 登记号41603保藏。
30.一种通过栽培权利要求27的种子产生的大豆植物或其部分。
31.一种用于检测生物学样品中事件127核酸分子的存在情况的方法，所述方法包括(a)形成混合物，所述混合物包含含有DNA的生物学样品和能够扩增事件127特异性核酸分子的第一和第二核酸引物；(b)在允许所述第一和第二核酸引物扩增包含事件127特异性核酸分子的核酸分子的条件下，让所述混合物反应；和(c)检测所述扩增的核酸分子的存在情况，其中存在所述事件127特异性核酸分子表明所述样品含有事件127核酸分子。
32.权利要求31的方法，其中所述生物学样品自大豆植物获得。
33.一种用于检测生物学样品中的事件127核酸分子的方法，所述方法包括(a)形成混合物，所述混合物包含含有DNA的生物学样品和能够与事件127特异性核酸分子杂交的核酸探针；(b)在允许所述探针与事件127特异性核酸分子杂交的条件下，让所述混合物反应；和(c)检测杂交的核酸分子的存在情况，其中存在所述事件127特异性核酸分子表明所述样品含有事件127核酸分子。
34.权利要求33的方法，其中所述生物学样品自大豆植物获得。
35.一种用于栽培大豆植物的方法，所述方法包括(A)提供包含事件127核酸分子的大豆种子；(B)在允许所述种子发芽以产生生长中的包含事件127核酸分子的大豆植物的条件下，将所述大豆种子种植于生长培养基中；和(C)让生长培养基、种子或植物与除草剂组合物接触，所述除草剂组合物包含至少一种选自以下的组分咪唑啉酮除草剂、磺酰脲除草剂、其彼此的组合及其与至少一种其它活性成分的组合。
36.权利要求35的方法，其中步骤(C)在步骤(B)之前实施，并包括让所述生长培养基与所述除草剂组合物接触。
37.权利要求35的方法，其中步骤(C)在步骤(B)后实施，并包括在所述植物已从所述生长培养基萌发后接触所述植物或生长培养基。
38.权利要求35的方法，其中所述除草剂组合物包含(1)至少一种咪唑啉酮除草剂或至少一种磺酰胺除草剂或二者与(2)至少一种其它活性成分的组合，所述其它活性成分选自杀真菌剂、杀细菌剂、有机磷除草剂、磺酰胺除草剂、苯并噻二嗪酮除草剂及其组合。
39.权利要求35的方法，其中所述除草剂组合物包含灭草烟、甲基咪草烟或以下中的任何一种(A)灭草烟和甲基咪草烟的组合；(B)灭草烟、甲基咪草烟和苯达松的组合；(C)灭草烟、甲基咪草烟和吡唑醚菌酯的组合；(D)灭草烟、甲基咪草烟和苯嘧磺草胺的组合；(E)灭草烟、甲基咪草烟、苯嘧磺草胺和草甘膦的组合；(F)灭草烟和苯达松的组合；(G)灭草烟和吡唑醚菌酯的组合；(H)灭草烟和苯嘧磺草胺的组合；(I)灭草烟、苯嘧磺草胺和草甘膦的组合；(J)灭草烟和草甘膦的组合；(K)甲基咪草烟和草甘膦的组合；(L)甲基咪草烟、苯嘧磺草胺和草甘膦的组合；和(M)苯嘧磺草胺和草甘膦的组合。
40.权利要求35的方法，其中所述事件127核酸分子具有SEQID NO :1的核苷酸 1302-6069的核酸序列。
41.一种检测样品中事件127多肽的方法，所述方法包括从大豆植物获得生物学样品；和对所述样品实施至少一种免疫学测定，其中所述测定能够检测事件127多肽。
42.权利要求41的方法，其中所述免疫学测定选自=ELISA(酶联免疫吸附测定)、免疫染色测定、免疫组织化学测定、蛋白质芯片测定、放射免疫沉淀测定、快速膜免疫色谱测定、 快速条免疫色谱测定及其组合。
43.一种用于检测生物分子的装置，所述装置包含具有表面的固相支持体；和与所述固相支持体的表面连接的至少一种事件127诊断分子。
44.权利要求43的装置，其中所述固相支持体(A)选自玻璃、凝胶、聚合物、塑料、弹性物质、陶瓷、金属及其组合；或(B)选自板、芯片、膜、棒、条、珠粒、纤维、垫、格栅、织物、容器壁及其组合；或(C)选自㈧及⑶二者。
45.权利要求43的装置，其中所述事件127诊断分子选自核苷碱基寡聚物探针、适体、 抗体及其组合。
46.权利要求45的装置，其中所述核苷碱基寡聚物探针包含核酸类似物。
47.权利要求45的装置，其中所述抗体选自单克隆抗体、单链抗体和保留对事件127多肽的结合特异性的免疫反应性抗体片段。
48.权利要求43的装置，其中所述一种或多种诊断分子通过选自共价结合、配位结合和非共价结合的方法固定到所述表面。
49.权利要求43的装置，其中所述基材包含免疫色谱条。
50.权利要求43的装置，其中所述装置包含多个限定区域的阵列，每一区域包括(a) 所述固相支持体表面的部分和与其连接的(b)至少一种事件127诊断分子。
51.权利要求43的装置，其中所述事件127诊断分子选自事件127核酸分子、事件127 多肽、其特异性抗体、前述物质的可检测标记的形式、任何这些的衍生物及其组合。
52.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括将嗜球果伞素施用于所述栽培区。
53.权利要求52的方法，其中所述嗜球果伞素包括吡唑醚菌酯。
54.权利要求7的方法，其中所述方法进一步包括将嗜球果伞素施用于所述栽培区。
全文摘要
本发明提供涉及耐受抑制AHAS的除草剂的转基因大豆植物的组合物和方法。提供具有赋予对抑制AHAS的除草剂的耐受性的突变的AHAS编码序列的事件127大豆植物。在经鉴定的染色体位置处具有事件127核酸分子的事件127大豆植物，可包含具有至少SEQ ID NO5和/或6核酸序列的基因组/转基因连接。事件127的基因组插入位点的特征提供提高的育种效率，并使得能够利用分子标记来跟踪繁殖种群及其后代中的转基因插入物。提供用于鉴定、检测及使用事件127大豆植物的各种方法和组合物。
文档编号C12Q1/68GK102368903SQ201080011786
公开日2012年3月7日 申请日期2010年1月6日 优先权日2009年1月7日
发明者A·乌尔布里奇, B·M·卢兹, C·A·A·阿里亚斯, D·卡尔森, E·L·R·菲尔霍, F·J·L·阿拉高, L·罗扎诺, S·谭, T·梅尔费特, T·约特苏莫托, U·莱恩曼 申请人:巴斯夫农化产品有限公司, 巴西农业研究公司-恩布拉帕