治疗癌症和纤维化疾病的化合物组合物和方法

专利名称：治疗癌症和纤维化疾病的化合物组合物和方法
技术领域：
本发明涉及靶向END0180多肽并由此内化的分子、包含该分子的偶联物、包含该分子和偶联物的组合物，以及使用它们将治疗剂递送至在细胞表面上表达END0180多肽的细胞用以治疗细胞增生性疾病或病症以及纤维化并且用以控制(调控)肿瘤进展的方法。
背景技术：
ENDO180 警体END0180也称为⑶280、uPARAP (尿激酶纤溶酶原激活物受体相关蛋白)和2型甘露糖受体C(MRC2)，它是指导所结合的配体在内涵体内降解的循环型胞吞受体。它是与尿激酶型纤溶酶激活物(uPA)和尿激酶型纤溶酶激活物受体(uPAR)形成的三体复合物的一部分，因而参与纤溶酶原至纤溶酶的生成过程。已知纤溶酶在胞外基质(ECM)转换和将休眠型TGF-β至其活性形式的蛋白水解性转化中起作用。三体复合物除了在产生纤溶酶中起作用之外，还显示出参与基质金属蛋白酶 (MMP)酶原的激活，作用于纤维蛋白以结合若干胶原蛋白，并参与胞外基质的常规转换。该复合物还参与细胞粘附和信号转导(Bherendt等，2000. JBC 275 1993-2002)。END0180是通过促进细胞迁移并摄入胶原蛋白用于细胞内降解而在细胞活动性和胞外基质重构中起作用的循环型胞吞受体(Niels. 2004Biol Chem. 385 (2) 103-36 ； Kjoller 等，2004 Exp Cell Res. 293(1) 106-16 ；Wienke 等，2007Cancer Res. 67(21) 10230-40)。END0180与巨噬细胞甘露糖受体家族共享同源性，该家族包括甘露糖受体、磷月旨酶 A2 和 DEC-205/MR6 (Isacke 等，1990Mol. Cell. Biol. 10 :2606_2618 ；Sheikh 等，2000， J. Cell. Sci. 113 :1021_1032 ；Behrendt 等，2000，J. Biol. Chem. 275 1993-2002)。此家族构成是基于总体结构保守性大的胞外结构域包含N末端信号序列，随后是富含半胱氨酸的结构域，II型纤连蛋白结构域(FNII)和8或10个C型凝集素样结构域(CTLDs)以及小的跨膜和胞内结构域(共约66个氨基酸)。作为一个家族，这些受体具有两个明显特征 第一，尽管它们属于大的C型凝集素超家族，但是它们仍在单个多肽骨架中独特地包含多个 CTLDs (Taylor Μ. Ε.，1997Glycobiology 7 :v-vii ；McKay 等，1998，Eur. J. Immunol. 28 4071-4083 ；Howard和Isacke，2002，见上文)。第二，它们共享在细胞的质膜和胞间区室之间循环的能力(Isacke 等，1990，见上文；Zvaritch 等，1996，J. Biol. Chem. 271 :250_257)。 在甘露糖受体家族中，END0180的不寻常之处在于它从质膜靶向循环的内涵体而不是随后的内涵体/溶酶体区室(Howard和Isacke，2002，见上文)。ENDO180 位于细胞表面上，被膜小窝(Isacke 等，1990 Mol. Cell. Biol. 10 2606-2618 ； Sheikh 等，2000，J. Cell. Sci. 113 1021-1032)和内涵体中。它主要表达
于成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞中。原位杂交显示它表达于高度血管化的器官中。END0180还发现于小鼠胚胎的骨形成区(Wu等，1996，J. Biol. Chem. 271 =21323-21330)和发育期间处于软骨内和膜内骨化位置的成骨细胞和骨细胞中(Engelholm等，2001，Trends Cardiovasc. Med. 11 7-13)。以下的专利公布也涉及 END0180 受体US 6，117，977、US7, 399，468,WO 97/40154 和TO 00/58473。转让给本发明受让人的并在此通过引用整体并入本文的PCT专利公布 No. WO 2004/100759以及美国专利公布No. 2007/0072244和2009/0202566涉及鉴定能调控人END0180受体活性的化合物的方法。 抗体疗法对治疗癌症及其它疾病的新疗法的寻求使人们开发了能抑制受体功能的人抗体和人源化抗体。国际专利公布WO 2006/023491提供了 RNA干扰方法，其包括使细胞接触融合蛋白-双链RNA复合物，该复合物包含含感兴趣的双链RNA的双链RNA区段及为抗体Fab 片段-鱼精蛋白融合蛋白的融合蛋白。发明概述本发明部分基于对特异性结合细胞表面上的END0180多肽的分离的分子的鉴定。 在一些实施方案中，该分子结合END0180多肽的胞外结构域并通过所述多肽内化到细胞中，从而给表达END0180多肽的细胞提供用于递送治疗和诊断药物(cargo)的媒介物。因此在一些实施方案中，本发明提供包含特异性结合END0180多肽的分子和治疗剂以用于将该治疗剂递送到细胞的偶联物。在一些实施方案中，所述END0180多肽与SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列具有基本同一性，由与SEQ ID NO :1所示的核酸序列具有基本同一性的多核苷酸编码。一方面，本发明提供由命名为E3-8D8的杂交瘤细胞系(BCCM登记号LMBP 7203CB) 产生的抗END0180抗体或该抗体的片段，其结合细胞表面上的END0180受体。在一些实施方案中，抗体与受体的结合使抗体内化到细胞中。本发明还提供了 E3-8D8杂交瘤细胞系。在一些实施方案中，抗体或其片段是人源化的或嵌合的抗体或其片段。本发明提供包含至少一个抗END0180抗体或其片段(所述抗体由E3-8D8杂交瘤产生)、或其人源化分子、嵌合抗体或其片段以及载体的组合物。在一些实施方案中，该分离的抗体选自由以下组成的组全IgG、Fab片段、Fab' 片段、F(ab' )2片段、其重链和/或轻链的可变部分、Fab微抗体和scFv。在一些实施方案中，所述抗体是包含具有SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列的重链CDR3结构域的重组多肽， 或其仍保留特异性结合END0180能力的变体。在一些实施方案中，所述抗体还包含具有SEQ ID NO 8所示的氨基酸序列的轻链CDR3结构域，或其仍保留特异性结合END0180能力的变体。在一些实施方案中，所述抗体是包含SEQ ID N0:6所示的氨基酸序列的scFv重组多肽，或其仍保留特异性结合END0180能力的变体。在具体实施方案中，显示与END0180受体的结合亲和力并包含SEQ ID NO :7和8所示的⑶R3结构域的抗体当与受体接触时，由受体内化到表达END0180的细胞中。本发明还提供组合物，其包含至少一种如上所述的抗END0180抗体或其片段，和包括放射性同位素、治疗剂、细胞毒剂或可检测标记的部分(moiety)。在一些实施方案中， 该部分共价地(通过接头或化学键)或非共价地(通过离子、范德华力、静电或氢键)与抗体相连(或连接或偶联)。在一些实施方案提供抗END0180抗体或其抗原结合片段，其选自以下

a)由杂交瘤细胞系E3-8D8 (BCCM登记号LMBP 7203CB)产生的单克隆抗体；b)与(a)中的抗体结合相同表位的抗体或其片段；c) (a)或(b)的人源化抗体；d)包含与SEQ ID NO 6基本相似的多肽的抗体片段；和e)包含氨基酸序列与SEQ ID NO 7和8所示的氨基酸序列基本相似的⑶R3的重组多肽。本发明还提供组合物，其包含选自下列的抗END0180抗体或其抗原结合片段a)由杂交瘤细胞系E3-8D8 (BCCM登记号LMBP 7203CB)产生的单克隆抗体；b)与(a)中的抗体结合相同表位的抗体或其片段；c) (a)或(b)的人源化抗体；d)抗体片段，其包含与SEQ ID NO 6基本相似的多肽；和e)重组多肽，其包含氨基酸序列与SEQ ID NO :7和8所示的氨基酸序列基本相似的 CDR。在一些实施方案中，所述组合物还包含包括放射性同位素、治疗剂、细胞毒剂或可检测标记的部分。本发明还提供治疗患有增生性病症的受治疗者的方法，包括给该受治疗者施用包含选自下列的抗END0180抗体或其抗原结合片段的组合物a)由杂交瘤细胞系E3-8D8 (BCCM登记号LMBP 7203CB)产生的单克隆抗体；b)与(a)中的抗体结合相同表位的抗体或其片段；c) (a)或(b)的人源化抗体；d)包含与SEQ ID NO 6基本相似的多肽的抗体片段；和e)其包含氨基酸序列与SEQ ID NO 7和8所示的氨基酸序列基本相似的⑶R的
重组多肽。在一些实施方案中，所述增生性病症选自实体瘤、造血系统肿瘤、转移瘤、纤维化和巨噬细胞相关病症。在一些实施方案中，所述肿瘤是卵巢肿瘤、乳腺肿瘤、成骨细胞/骨细胞癌、前列腺癌、头颈癌、白血病、肾细胞癌或移行细胞癌。在一些实施方案中，所述纤维化是肝纤维化、骨髓纤维化、所有病因的肾纤维化 (CKD包括晚期肾病，ESRD)、肺纤维化(包括肺间质纤维化ILF)；与所有可能类型的意外和医源性(手术)皮肤创伤有关的异常疤痕(瘢痕疙瘩(keloid))、硬皮病、心纤维化 (cardiofibrosis)、青光眼滤过手术失败、肠粘连。在一些实施方案中，所述巨噬细胞相关病症是炎症或动脉粥样硬化。一方面，本发明提供了偶联物，其包含a)特异性结合细胞表面上的END0180多肽的胞外结构域的抗体或其抗原结合部分；b)包括放射性同位素、治疗剂、细胞毒剂或可检测标记的部分；和c)任选的连接(a)与(b)的连接部分。
在一些实施方案中，所述部分是选自寡核苷酸剂和非寡核苷酸剂的治疗剂。在一些实施方案中，所述治疗剂是寡核苷酸治疗剂，包括抑制性寡核苷酸。因此，在各种实施方案中，所述治疗剂选自反义化合物、化学修饰的siRNA化合物、未修饰的siRNA化合物、化学修饰的shRNA化合物、未修饰的shRNA化合物、化学修饰的miRNA化合物和未修饰的miRNA 化合物。在各种优选实施方案中，所述治疗剂是化学修饰的siRNA。在一些实施方案中， 所述化学修饰的siRNA化合物抑制与癌症、纤维化或巨噬细胞相关疾病有关的靶基因的表达。在一些实施方案中，所述靶基因选自表A所示的任一个靶基因，见后文。在某些实施方案中，所述治疗剂经核苷酸或非核苷酸连接部分与抗体相连。另一方面，本发明提供了包含本发明偶联物的药物组合物。另一方面，本发明提供了治疗患有增生性疾病的受治疗者的方法，包括给该受治疗者施用治疗有效量的特异性结合END0180多肽并通过由END0180多肽内化的抗体，其中所述抗体共价或非共价地与治疗剂结合。在一些实施方案中，所述增生性疾病选自恶性和良性的增生性疾病。在一些实施方案中，该增生性疾病是癌症。在其它实施方案中，该增生性疾病是纤维化。使用本发明的疾病和病症的非限制性实例包括1.其中END0180在肿瘤和肿瘤间质细胞(激活的肌成纤维细胞、 巨噬细胞_单核细胞系的血管生成和浸润细胞)中表达的软组织肉瘤；2.其中END0180在肿瘤间质细胞(激活的肌成纤维细胞、巨噬细胞_单核细胞系的血管生成和浸润细胞)中表达的癌；3.表达END0180并已经受上皮-间充质移行因此有高转移可能的癌；4.例如自巨噬细胞-单核细胞系表达END0180的白血病；5.纤维化疾病，例如具有激活的肌成纤维细胞的肾、肺和肝的纤维化疾病；6.与巨噬细胞有关的疾病和病症，包括动脉粥样硬化和慢性炎症。附图简述

图1A-1J提供了根据本发明的多种化合物的多核苷酸和氨基酸序列。图IA 人 ENDO180 mRNA (SEQ ID NO 1)；图 IB 人 END0180 多肽(SEQ ID NO 2)；图 IC 具有 FLAG 序列的人END0180胞外结构域的SEQ ID NO 3多核苷酸序列(氨基酸1-522)，FLAG结构域用下划线标记(pcDNA3-5 ‘ hendol80-FLAG 构建体，SEQ ID NO 3)；图 ID :SEQ ID NO 3 的多肽序歹丨J (SEQ ID NO 4)；图IE :scFv克隆G7V的多核苷酸序列(SEQ ID NO 5)；图IF :scFv 克隆 G7V 的多肽序列(SEQ ID NO 6)；图 IG :G7V 的重链 CDR3 (SEQ ID NO 7)；图 1H:G7V 的轻链CDR3(SEQ ID NO 8)；图IJ 人END0180胞外结构域的多肽1-522。图2A-2H CypHer5E荧光团抗END0180mAb至ENDO180表达细胞的内化。图3 生物素抗END0180 mAb至具有单侧输尿管阻塞的肾的小鼠的内化。图4 与CypHer5E荧光团偶联的抗END0180 mAb至表达END0180的骨髓-单核细胞样人白血病MonoMac细胞系的内化。发明详述^JL为方便起见，对说明书、实施例和权利要求中所用的某些术语在本文进行描述。应注意的是，本文所用的单数形式均包括复数形式，除本文另作清楚地说明外。
虽然本发明的方面或实施方案是参照马库什组或可选的其它分组进行描述的，但是本领域技术人员应理解，本发明由此还可参照组成员的任何单个成员或亚组来进行描述。“抑制剂”是一种能(部分或完全)降低基因表达或该基因产物活性至足以实现所需的生物学或生理学效应的程度的化合物。本文使用的术语“抑制剂”包括一种或多种寡核苷酸抑制剂，所述寡核苷酸抑制剂包括siRNA、shRNA、合成shRNA、miRNA、反义RNA和DNA 和核酶。“抑制性寡核苷酸”包括反义化合物、化学修饰的siRNA化合物、未修饰的siRNA化合物、化学修饰的shRNA化合物、未修饰的shRNA化合物、化学修饰的miRNA化合物和未修饰的miRNA化合物。“siRNA抑制剂”是一种能降低基因表达或该基因产物活性至足以实现所需的生物学或生理学效应的程度的化合物。本文使用的术语“siRNA抑制剂”指一种或多种siRNA、 shRNA、合成shRNA、miRNA。抑制也称为下调，或对RNAi而言是指沉默。本文使用的术语“抑制”指降低基因表达或该基因产物活性至足以实现所需的生物学或生理学效应的程度。抑制可以是完全的或部分的。本文使用的术语“END0180基因” 定义为END0180基因的任何同源物，其与SEQ ID NO=I的氨基酸编码区或在高度严格的杂交条件下与END0180基因结合的核苷酸序列具有优选90%同源性，更优选95%同源性，并甚至更优选98%同源性，这是本领域所熟知的(例如参见Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons, Baltimore,Maryland(1988),在 1995 年禾口 1998年再版)。本文使用的术语“END0180”或“END0180多肽”或“END0180受体”的定义为END0180 多肽的任何同源物(与SEQ ID NO :2具有优选至少90%同源性，更优选至少95%同源性， 并甚至更优选至少98%同源性或100%同一性)、全长或其片段或结构域、突变体或剪接变体的核苷酸序列所编码的多肽、或与其它多肽的嵌合物，条件是任一上述与END0180受体具有相同或基本上相同的生物学功能。END0180多肽或END0180多肽同源物可以不同形式存在，包括但不限于可溶性蛋白质、膜结合(在纯化膜制备物中或在细胞表面上)、小珠结合、或递呈END0180蛋白质或片段及其衍生多肽的任何其它形式。本文使用的术语“抑制” 是指降低基因表达或该基因产物活性至足以实现所需的生物学或生理学效应的程度。抑制可以是部分的或完全的。术语“mRNA多核苷酸序列”、"mRNA序列”和“mRNA”可互换使用。本文使用的术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用，并指包含脱氧核糖核酸(DNA) 和核糖核酸(RNA)的核苷酸序列。应理解这些术语包括从核苷酸类似物制备的RNA或DNA 类似物作为等价物。贯穿本申请，将mRNA序列作为代表相应基因列出。“寡核苷酸”或“寡聚体”是指约2至约50个核苷酸的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸序列。每个DNA或RNA核苷酸都可独立为天然的或合成的，和/或修饰的或未修饰的。修饰包括对糖部分、碱基部分和/或寡核苷酸中核苷酸之间的键的改变。本发明的化合物包括包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸及其组合的分子。基本互补是指与另一序列约84%以上互补。例如，在19个碱基对组成的双链区中，一个错配导致互补性变为94. 7%，两个错配导致互补性变为约89. 5%，和三个错配导致互补性变为约84. 2%，使双链区基本互补。因此，基本上具有同一性(substantially identical)指与另一序列具有约84%以上的同一性。本发明偶联物包含a)特异性结合细胞表面上的END0180多肽的抗体或其片段，b) 基于核苷酸的治疗剂，其选自反义化合物、化学修饰的siRNA化合物、未修饰的siRNA化合物、化学修饰的shRNA化合物、未修饰的shRNA化合物、化学修饰的miRNA化合物和未修饰的miRNA化合物；和c)连接(a)与(b)的连接部分；其中所述基于核苷酸的治疗剂抑制所述细胞中靶基因的表达。根据本发明“接头”为将抗体与治疗分子连接的核苷酸或非核苷酸部分。在一些实施方案中，该接头是可切割部分。优选的可切割基团包括二硫键、酰胺键、硫代酰胺键、酯键、硫酯键、邻二醇键或半缩醛。其它可切割键包括酶可切割键，如肽键(由肽酶切割)、磷酸键(由磷酸酶切割)、核酸键(由内切核酸酶切割)和糖键(由糖苷酶切割)。在一些实施方案中，所述接头是非核苷酸接头，包括肽接头。肽序列的选择对偶联物成功与否很关键。在一些实施方案中，所述接头对血清蛋白酶稳定，但却会被靶细胞内的溶酶体酶切割。在非限制性实例中，所述接头是肽(选自US 5574142所述的接头)、鱼精蛋白、鱼精蛋白片段、(Arg)9、生物素-亲和素、生物素-链霉亲和素和触角肽。例如，肽接头用于将所述抗体与核苷酸治疗剂连接。其它非核苷酸接头包括约5至100个原子的烷基或芳基链。在一些实施方案中，所述接头是核苷酸接头。在某些实施方案中，核酸接头具有 2-100个、优选2-50个或2-30个核苷酸的长度范围。寡核苷酸化学修饰“核苷酸”应包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，其可以是天然的或合成的，和/或修饰的或未修饰的。修饰包括对糖部分、碱基部分和/或寡核糖核苷酸中核糖核苷酸间键合的改变。本文所用术语“核糖核苷酸”包括天然的和合成的、未修饰的和修饰的核糖核苷酸。修饰包括对糖部分、碱基部分和/或寡核苷酸中核糖核苷酸间键合的改变。用于制备治疗剂的核苷酸包括天然存在的或合成的修饰碱基。天然存在的碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核苷酸的修饰碱基包括肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基、2-丙基和其它烷基腺嘌呤、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、 6_氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶，8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-巯基腺嘌呤、8-巯基烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤及其它8-取代的腺嘌呤、8-卤代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-巯基鸟嘌呤、8-硫代烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤及其它取代的鸟嘌呤、其它氮杂和脱氮腺嘌呤，其它氮杂和脱氮鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。 在一些实施方案中，寡聚体中的一或多个核苷酸被肌苷取代。根据本发明的一些实施方案，提供抑制性寡核苷酸化合物，其包含未修饰的和修饰的核苷酸和/或非保守的部分。在某些实施方案中，所述治疗剂是寡核苷酸。在各种优选实施方案中，所述治疗剂是双链寡核苷酸并优选是siRNA。已有选择并合成对应于已知基因的siRNA的广泛报道；(参见例如Ui-Tei等， 2006.J Biomed Biotechnol. ；2006 65052 ；Chalk 等，2004. BBRC. 319 (1) 264-74 ；Sioud & Leirdal，2004. Met. Mol Biol. ；252 457-69 ；Levenkova ^,2004, Bioinform. 20(3) 430-2 ；Ui-Tei 等，2004. NAR 32(3) :936_48)。
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关于修饰的siRNA的用途及制备的实例参见例如Braasch等，2003. Biochem.， 42(26) 7967-75 ；Chiu 等，2003，RNA,9(9) 1034-48 ；PCT 公布 WO 2004/015107(atugen AG)和 WO 02/44321 (Tuschl 等)。美国专利 No. 5，898，031 和 6，107，094 教导了化学修饰的寡聚体。美国专利No. 7，452，987涉及具有可替换的未修饰的和2’糖修饰的核糖核苷酸的寡聚化合物。美国专利公布No. 2005/0042647描述了带有化学修饰的核苷间键合的dsRNA 化合物。Amarzguoui 等(2003，NAR, 31 (2) :589_595)表明了 siRNA 活性取决于 2' -0-甲基修饰的定位。Holen等(2003，NAR，31 (9) =2401-2407)报道了有少量2' -0-甲基修饰的核苷的siRNA显示出比野生型高的活性，但随着2' -0-甲基修饰的核苷数增多其活性下降。Chiu和Rana(2003，RNA，9 =1034-1048)教导了相对于未修饰的siRNA在正义或反义链中并入2' -0-甲基修饰的核苷(完全修饰的链)严重降低了 siRNA活性。据报道，在反义链的5'-末端放置2' -0-甲基基团会严重限制其活性，而在反义链的3'-末端和在正义链的两个末端的放置则是耐受的(Czauderna等，2003，NAR, 31 (11)，2705-2716)。转让给本发明受让人并在此通过引用整体并入本文的PCT专利申请No. PCT/ IL2008/000248和PCT/IL2008/001197公开了用于制备化学修饰的siRNA化合物的基序。 PCT专利公布No. WO 2008/020435公开了针对本文所述靶基因的抑制剂，包括一些siRNA化合物。所述化合物包含选自糖修饰、碱基修饰和核苷酸间键合修饰的至少一种修饰的核苷酸，并可能包括DNA，及修饰的核苷酸如LNA (锁核酸)、ENA (亚乙基桥联核酸)、PNA (肽核酸)、阿糖胞苷、膦酰基羧酸酯或膦基羧酸酯核苷酸(PACE核苷酸)/镜像核苷酸或具有六碳糖的核苷酸。所有核苷酸/寡核苷酸的类似物或修饰都可用于本发明，只要所述类似物或修饰基本不利地影响所述核苷酸/寡核苷酸的功能。可接受的修饰包括糖部分的修饰、碱基部分的修饰、核苷酸间键合的修饰及其组合。糖修饰包括在糖残基的2’部分上的修饰，包括氨基、氟代、烷氧基如甲氧基、烷基、 氨基、氟代、氯代、溴代、CN、CF、咪唑、羧酸酯、硫代酯(thioate)、C1至Cltl低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基、OCF3> 0CN、0-、S-或N-烷基；0-、S-或N-烯基；SOCH3 ；SO2CH3 ； ONO2 ；N02、N3 ；杂环烷基(heterozycloalkyl)；杂环烷芳基(heterozycloalkaryl)；氨基烷基氨基；聚烷基氨基或取代的甲硅烷基，如其中在欧洲专利EP 0586520B1或EP 0 618 925 Bl中所述。在一个实施方案中，所述siRNA化合物包含至少一个包含在糖部分上的2’修饰 (“2’糖修饰”)的核糖核苷酸。在某些实施方案中，所述化合物包含任选在替换位置上的 2’ 0-烷基或2’ -氟代或2’ 0-烯丙基或任何其它2’修饰。其它稳定的修饰也是可能的 (例如末端修饰)。在一些实施方案中，优选的2’ 0-烷基是2’ 0-甲基(甲氧基)糖修饰。在一些实施方案中，所述寡核苷酸的骨架是修饰的并包含磷酸-D-核糖实体，但还可能包含硫代磷酸酯-D-核糖实体、三酯、硫代酯、2’ -5’桥联骨架(也可称为5’ -2’ )、 PACE及其类似物。本文所用术语“非配对的核苷酸类似物”指包含非碱基配对部分的核苷酸类似物， 所述非碱基配对部分包括但不限于6脱氨基腺苷(水粉蕈素)、4-Me-吲哚、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-Me 核糖 U、N3_Me 核糖 T、N3_Me dC、N3-Me-dT、m-Me-dG、m_Me-dA、 N3-乙基-dC、N3-Me dC。在一些实施方案中，所述非碱基配对的核苷酸类似物是核糖核苷酸。在其它实施方案中，核苷酸类似物是脱氧核糖核苷酸。另外，可以制备多核苷酸的类似物，其中一或多个核苷酸的结构根本地改变并更适合作为治疗剂或试验试剂。核苷酸类似物的实例是肽核酸(PNA)，其中DNA或RNA中的所述脱氧核糖(或核糖)的磷酸酯骨架用与肽中所发现的类似的聚酰胺骨架替代。PNA类似物已显示出对酶降解的抗性，并在体内和体外具有的延长的稳定性。对寡核苷酸可作的其它修饰包括聚合物骨架、环状骨架、非环状骨架、硫代磷酸酯-D-核糖骨架、三酯骨架、硫代酯骨架、2’ -5’桥联骨架、人工核酸、吗啉代核酸、乙二醇核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)、阿糖胞苷和镜像核苷酸(例如，β-L-脱氧核糖核苷而不是β -D-脱氧核糖核苷)。包含LNA核苷酸的siRNA化合物的实例公开于Elmen等 (NAR 2005，33(1) :439_447)。本发明化合物可用一或多种反向的核苷酸，例如反向的胸苷或反向的腺嘌呤合成 (参见例如，Takei 等，2002，JBC 277(26) :23800_06)。其它修饰包括在寡核苷酸5’和/或3’部分的末端修饰，又称加帽部分(capping moieties) 0这些末端修饰选自核苷酸、修饰的核苷酸、脂质、肽、糖和反向的脱碱基 (abasic)部分。本发明中有时称为“脱碱基核苷酸”或“脱碱基核苷酸类似物”的物质更适当地称为假核苷酸或非保守部分。核苷酸是核酸单体单元，由核糖或脱氧核糖、磷酸酯、和碱基 (在DNA中为腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶；在RNA中为腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶或胞嘧啶)组成。修饰的核苷酸包含对一个或多个糖、磷酸酯和/或碱基的修饰。脱碱基的假核苷酸缺少碱基，因此严格意义说不是核苷酸。在一些实施方案中，所述siRNA治疗剂包含加帽部分。本文所用术语“加帽部分” 包括脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、对脱碱基核糖或脱碱基脱氧核糖部分的修饰 (包括2’ 0烷基修饰)；反向的脱碱基核糖和脱碱基脱氧核糖部分及对其的修饰；C6-亚氨基-Pi ；包括L-DNA和L-RNA的镜像核苷酸；5’ O-Me核苷酸；和包括4 ‘ ,5'-亚甲基核苷酸的核苷酸类似物；1_(β -D-赤呋喃酰基(erythrofuranosyl))核苷酸；4'-硫代核苷酸、碳环核苷酸；5 ‘-氨基-烷基磷酸酯；1，3- 二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；12-氨基十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1，5-脱水已糖醇核苷酸；α-核苷酸；苏-戊呋喃糖基核苷酸；非环状3'，4'-开环(seco)核苷酸；3，4_二羟丁基核苷酸；3，5-二羟戊基核苷酸、'-5'-反向脱碱基部分；1，4_ 丁二醇磷酸酯；5'-氨基；和桥联或非桥联的甲基膦酸酯及5'-巯基部分。某些优选加帽部分是脱碱基核糖或脱碱基脱氧核糖部分；反向脱碱基核糖或脱碱基脱氧核糖部分；C6-氨基-Pi ；包括L-DNA和L-RNA的镜像核苷酸。在一些实施方案中，所述治疗siRNA包括核苷酸之外的部分。本文所用术语“非保守部分”指脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、脱氧核糖核苷酸、修饰的脱氧核糖核苷酸、镜像核苷酸、非碱基配对的核苷酸类似物及通过2’-5’核苷酸间磷酸酯键与邻近核苷酸相连的核苷酸，包括LNA和亚甲基桥联的核酸的桥联核酸。脱碱基脱氧核糖部分包括例如脱碱基脱氧核糖-3’ -磷酸酯、1，2- 二脱氧-D-呋喃核糖-3-磷酸酯、1，4-脱水-2-脱氧-D-核糖醇-3-磷酸酯。反向脱碱基脱氧核糖部分包括反向脱氧核糖脱碱基、3’，5’反向脱氧脱碱基5’ -磷酸酯。“镜像”核苷酸是具有与天然存在或常用的核苷酸相反手性的核苷酸，即天然存在的D-核苷酸的镜面影像(L-核苷酸)，在镜像核糖核苷酸的情况下也称为L-RNA和“镜像适配体(spiegelmer) ”。核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，并还可包含至少一个糖、碱基和/或骨架的修饰。参见美国专利No. 6，586，238。美国专利No. 6，602，858还公开了包括至少一个L-核苷酸取代的核酸催化剂。镜像核苷酸包括例如L-DNA (L-脱氧核糖腺苷_3’ -磷酸酯(镜面dA)、L-脱氧核糖胞苷_3’ -磷酸酯(镜面dC)、L-脱氧核糖鸟苷-3’-磷酸酯(镜面dG)、L-脱氧核糖胸苷-3’-磷酸酯(镜像dT))和L-RNA (L-核糖腺苷-3’ _磷酸酯(镜面rA)、L-核糖胞苷-3’ -磷酸酯(镜面rC)、L-核糖鸟苷_3’ -磷酸酯(镜面rG)、L-核糖尿嘧啶-3’ -磷酸酯(镜面dU))。修饰的脱氧核糖核苷酸包括例如可用作5’末端位置中的核苷酸(1号位置)的 5’ OMe DNA(5-甲基-脱氧核糖鸟苷-3'-磷酸酯)、PACE(脱氧核糖腺嘌呤3‘膦酰乙酸酯、脱氧核糖胞苷3'膦酰乙酸酯、脱氧核糖鸟苷3'膦酰乙酸酯、脱氧核糖胸苷3'膦酰乙酸酯。桥联核酸包括LNA(2' -0,4' _C_亚甲基桥联核酸腺苷3 ‘单磷酸酯、2' _0， 4' -C-亚甲基桥联核酸5-甲基-胞苷3'单磷酸酯、2' -0,4' -C-亚甲基桥联核酸鸟苷 3'单磷酸酯、5-甲基-尿苷(或胸苷)3'单磷酸酯)；和ENA(2‘ -0,4' -C-亚乙基桥联核酸腺苷3'单磷酸酯，2' -0,4' -C-亚乙基桥联核酸5-甲基-胞苷3'单磷酸酯，2' -0， 4' -C-亚乙基桥联核酸鸟苷3'单磷酸酯，5-甲基-尿苷(或胸苷)3'单磷酸酯)。在本发明一些实施方案中，优选的非保守部分是脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、脱氧核糖核苷酸、镜面核苷酸(mirror nucleotide)和与邻近核苷酸通过2’_5’核苷酸间磷酸酯键相连的核苷酸。根据一方面，本发明提供了抑制性寡核苷酸化合物，其包含未修饰的和修饰的核苷酸。所述化合物包含由糖修饰、碱基修饰和核苷酸间键合修饰组成的组的至少一个修饰的核苷酸，并可以包括DNA，及修饰的核苷酸如LNA (锁核酸)，包括ENA (亚甲基-桥联核酸)、PNA(肽核酸)、阿糖胞苷、PACE(膦酰乙酸及其衍生物)，镜面核苷酸或具有六碳糖的核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供了用于抑制靶基因体内表达的方法和组合物。通常，所述方法包括施用递送物_治疗剂的偶联物。在具体实施方案中，靶向mRNA的小干扰 RNA(即siRNA)以足以通过RNA干扰机制下调靶基因表达(降低mRNA，降低蛋白质水平) 的量从靶基因转录。具体地，该主题方法可用于抑制靶基因的表达以用于治疗疾病。根据本发明，靶基因的siRNA分子或抑制剂用作药物来治疗多种病变。本文所述的核酸合成在本领域技术人员已知范围内。该合成例如在Beaucage SL 和 Iyer RP, 1992Tetrahedron ；48 2223-231 UBeaucage S.和 Iyer RP, 1993 Tetrahedron ； 49 :6123-6194 和 Caruthers MH 等，1987 Methods Enzymo 1. ；154 :287_313 中描述，硫代酯合成例如在 Eckstein F.，1985Annu. Rev. Biochem. ；54 367-402 中描述，RNA 分子合成在 Sproat B. ,in Humana Press 2005Edited by Herdewijn P. ； Kap. 2 :17_31 巾自白勺下游工序例如在 Pingoud Α.等，IRL Press 1989 年，Oliver R. W. Α.编辑；Kap. 7 183-208 和 Sproat B.，Humana Press2005 年，Herdewi jn P.编辑；Kap. 2 17-31 中描述(见上文)。基于靶基因mRNA的已知序列，用上述的本领域已知方法合成任一靶基因的siRNA,并通过本文所述的多种修饰使其对血清和/或细胞核酸酶稳定。靶基因根据本发明的偶联物可用于抑制与选自增生性疾病、转移性疾病及纤维化的疾病或病症相关基因的表达。靶基因包括抗凋亡基因、与基本的细胞分裂机制相关的基因、与细胞周期调控/ 细胞增生相关的基因、与限速代谢相关的基因(核苷酸/核酸合成、蛋白质合成、能量代谢)、与蛋白质运输(例如分泌)相关的基因；促炎性基因、细胞因子、趋化因子、NFkB、生长因子 / 受体(TGF β 1 和 2、CTGF、IGFl、PDGFl、PDGF2、VEGF、EGFR、HER2 等)。
权利要求
1.一种抗END0180抗体或其抗原结合片段，其选自如下a.由杂交瘤细胞系E3-8D8(BCCM登记号LMBP7203CB)产生的单克隆抗体；b.与(a)抗体结合相同表位的抗体或其片段；c.(a)或(b)的人源化抗体；d.包含SEQID NO :6所示的氨基酸序列的重组多肽或其变体；和e.包含具有SEQID NO 7和8所示的氨基酸序列的⑶R3的重组多肽，或其变体； 其中，经与END0180表达的细胞接触，所述抗体或其抗原结合片段被内化至所述细胞 中。
2.一种组合物，其包含权利要求1所述的抗END0180抗体或其抗原结合片段，及可药用载体。
3.权利要求2所述的组合物，其还包含选自可检测标记、细胞毒剂和治疗剂的部分。
4.权利要求2或3所述的组合物，其中所述载体包含脂质颗粒、多糖颗粒或其组合。
5.权利要求4所述的组合物，其中所述颗粒包含脂质化多糖颗粒。
6.权利要求5所述的组合物，其中所述载体包含脂质化糖胺聚糖。
7.权利要求2-6任一项所述的组合物，其中所述抗END0180抗体或其抗原结合片段固定在所述颗粒上。
8.权利要求3-7任一项所述的组合物，其中所述部分是治疗剂。
9.权利要求8所述的组合物，其中所述治疗剂是抑制性寡核苷酸。
10.权利要求9所述的组合物，其中所述抑制性寡核苷酸选自反义化合物、化学修饰的 siRNA化合物、未经修饰的siRNA化合物、化学修饰的shRNA化合物、未经修饰的shRNA化合物、化学修饰的miRNA化合物和未经修饰的miRNA化合物。
11.权利要求10所述的组合物，其中所述抑制性寡核苷酸是化学修饰的siRNA化合物。
12.权利要求11的组合物，其中所述化学修饰的siRNA化合物抑制与癌症、纤维化或巨噬细胞相关疾病有关的靶基因的表达。
13.权利要求12所述的组合物，其中所述化学修饰的siRNA化合物抑制表A所示的人靶基因的表达。
14.权利要求2所述的组合物，其中所述部分与所述抗体或抗原结合片段连接。
15.权利要求4所述的组合物，其中所述部分封装在脂质颗粒内。
16.一种将部分递送到受治疗者的END0180表达细胞的方法，其包括给所述受治疗者施用权利要求2-15任一项所述的组合物，以使治疗剂递送到所述细胞。
17.权利要求8-15任一项所述的组合物的用途，用于治疗患有癌症、纤维化或巨噬细胞相关疾病的受治疗者。
18.—种抑制表达END0180的癌细胞的生长的方法，其包括使所述细胞与权利要求 2-15任一项所述的组合物接触，从而抑制所述癌细胞的生长。
19.权利要求16或17所述的方法，其中所述组合物被全身或局部施用。
20.权利要求19所述的方法，其中所述组合物被静脉内施用。
21.所述杂交瘤细胞系E3-8D8，以登记号LMBP7203CB保藏于BCCM。
22.—种分离的抗END0180抗体或其抗原结合片段，其由权利要求21所述的杂交瘤细胞系分泌。
23.一种抗体或其抗原结合片段，其与权利要求22所述的抗体结合相同的表位。
24.权利要求22或23所述的抗体或其抗原结合片段，其为人源化的。
25.权利要求22或23所述的抗体或其抗原结合片段，其为嵌合的。
26.一种偶联物，其包含a)权利要求22-25任一项所述的抗体或抗原结合片段；b)选自可检测标记、细胞毒剂和治疗剂的部分；和c)任选的连接a)与b)的接头。
27.权利要求26所述的偶联物，其包含接头。
28.权利要求27所述的偶联物，其中所述接头将所述抗体或抗原结合片段的3’末端与所述部分相连。
29.权利要求27所述的偶联物，其中所述接头选自多肽接头、肽接头、脂质接头或核酸接头。
30.权利要求29所述的偶联物，其中所述接头选自鱼精蛋白、鱼精蛋白片段、(Arg)9、 生物素-亲和素和触角肽。
31.权利要求29所述的偶联物，其中所述接头是核酸接头。
32.权利要求26所述的偶联物，其中所述部分是治疗剂。
33.权利要求27所述的偶联物，其中所述治疗剂是抑制性寡核苷酸。
34.权利要求33所述的偶联物，其中所述抑制性寡核苷酸选自反义化合物、化学修饰的siRNA化合物、未经修饰的siRNA化合物、化学修饰的shRNA化合物、未经修饰的shRNA 化合物、化学修饰的miRNA化合物和未经修饰的miRNA化合物。
35.权利要求34所述的偶联物，其中所述抑制性寡核苷酸是化学修饰的siRNA化合物。
36.权利要求35所述的偶联物，其中所述化学修饰的siRNA化合物抑制与癌症、纤维化或巨噬细胞相关疾病有关的靶基因的表达。
37.权利要求36所述的偶联物，其中所述化学修饰的siRNA化合物抑制表A所示的人靶基因的表达。
38.一种组合物，其包含权利要求26-37任一项所述的偶联物和载体。
39.权利要求38所述的组合物，其中所述载体包含脂质颗粒、多糖颗粒或其组合。
40.权利要求39所述的组合物，其中所述颗粒是脂质化多糖颗粒。
41.权利要求40所述的组合物，其中所述载体包含脂质化糖胺聚糖。
42.一种将部分递送到受治疗者的END0180表达细胞的方法，其包含给所述受治疗者施用权利要求26所述的偶联物或权利要求38-41任一项所述的组合物，以使所述部分递送到所述细胞。
43.一种治疗患有癌症、纤维化或巨噬细胞相关疾病的受治疗者的方法，其包括给所述受治疗者施用有效治疗所述受治疗者的量的权利要求38-41任一项所述的组合物。
44.一种抗END0180抗体或抗原结合片段，其包含具有SEQ ID NO :7所示的氨基酸序列的重链⑶R3片段。
45.权利要求44所述的抗END0180抗体或抗原结合片段，其还包含具有SEQID NO 8 所示的氨基酸序列的轻链CDR3片段。
46.权利要求44或45所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段选自由以下组成的组全IgG、Fab片段、Fab'片段、F(ab' ) 2片段、其重链和/或轻链的可变部分、Fab微抗体和scFv。
47.权利要求46所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含SEQID N0:5所示的多肽序列。
48.一种分离的多核苷酸，其具有编码权利要求47所述的多肽的SEQ ID NO :6。
49.权利要求46所述的抗体或其抗原结合片段，其为人源化的。
50.权利要求46所述的抗体或其抗原结合片段，其为嵌合的。
51.一种偶联物，其包含a)权利要求44-50任一项所述的抗体或抗原结合片段；b)选自可检测标记、细胞毒剂和治疗剂的部分；和c)任选的连接a)与b)的接头。
52.权利要求51所述的偶联物，其包含接头。
53.权利要求52所述的偶联物，其中所述接头将所述抗体或抗原结合片段的3’末端与所述部分相连。
54.权利要求53所述的偶联物，其中所述接头选自多肽接头、肽接头、脂质接头或核酸接头。
55.权利要求54所述的偶联物，其中所述接头选自鱼精蛋白、鱼精蛋白片段、(Arg)9、 生物素-亲和素和触角肽。
56.权利要求54所述的偶联物，其中所述接头是核酸接头。
57.权利要求51所述的偶联物，其中所述部分是治疗剂。
58.权利要求57所述的偶联物，其中所述治疗剂是抑制性寡核苷酸。
59.权利要求58所述的偶联物，其中所述抑制性寡核苷酸选自反义化合物、化学修饰的siRNA化合物、未经修饰的siRNA化合物、化学修饰的shRNA化合物、未经修饰的shRNA 化合物、化学修饰的miRNA化合物和未经修饰的miRNA化合物。
60.权利要求59所述的偶联物，其中所述抑制性寡核苷酸是化学修饰的siRNA化合物。
61.权利要求60所述的偶联物，其中所述化学修饰的siRNA化合物抑制与癌症、纤维化或巨噬细胞相关疾病有关的靶基因的表达。
62.权利要求61所述的偶联物，其中所述化学修饰的siRNA化合物抑制表A所示的人靶基因的表达。
63.一种组合物，其包含权利要求51-62任一项所述的偶联物和载体。
64.权利要求63所述的组合物，其中所述载体包含脂质颗粒、多糖颗粒或其组合。
65.权利要求64所述的组合物，其中所述脂质颗粒是脂质化多糖颗粒。
66.权利要求65所述的组合物，其中所述载体包含脂质化糖胺聚糖。
67.一种将部分递送至受治疗者的END0180表达细胞的方法，其包括给所述受治疗者施用权利要求51所述的偶联物或权利要求63-66任一项所述的组合物，以使所述部分递送到所述细胞。
68.一种治疗患有癌症、纤维化或巨噬细胞相关疾病的受治疗者的方法，其包括给所述受治疗者施用有效治疗所述受治疗者的量的权利要求63-66任一项所述的组合物。
69.一种将治疗部分递送至受治疗者的END0180表达细胞的方法，其包括给所述受治疗者施用包含如下的组合物a)抗END0180抗体或其抗原结合片段；b)治疗部分；c)载体；和d)任选的连接a)与b)的接头； 以使所述部分递送到所述细胞。
70.权利要求69所述的方法，其中所述受治疗者患有选自癌症、纤维化和巨噬细胞相关疾病的增生性疾病。
71.权利要求70所述的方法，其中所选的增生性疾病是癌症。
72.权利要求70所述的方法，其中所选的增生性疾病是纤维化。
73.权利要求67-72任一项所述的方法，其中所述载体包含脂质颗粒、多糖颗粒或其组
74.权利要求73所述的方法，其中所述脂质颗粒是脂质化多糖颗粒。
75.权利要求74所述的方法，其中所述载体包含脂质化糖胺聚糖。
76.权利要求69所述的方法，其中所述治疗剂是抑制性寡核苷酸。
77.权利要求76所述的方法，其中所述抑制性寡核苷酸选自反义化合物、化学修饰的 siRNA化合物、未经修饰的siRNA化合物、化学修饰的shRNA化合物、未经修饰的shRNA化合物、化学修饰的miRNA化合物和未经修饰的miRNA化合物。
78.权利要求77所述的方法，其中所述抑制性寡核苷酸是化学修饰的siRNA化合物。
79.权利要求78所述的方法，其中所述化学修饰的siRNA化合物抑制与癌症、纤维化或巨噬细胞相关疾病有关的靶基因的表达。
80.权利要求79所述的方法，其中所述化学修饰的siRNA化合物抑制表A所示的人靶基因的表达。
全文摘要
本发明提供了特异性结合ENDO180多肽并且由此内化的抗体或其抗原结合片段、包含该分子的偶联物、包含该抗体和偶联物的组合物，以及使用它们将治疗剂递送至在细胞表面上表达ENDO180多肽的细胞用以治疗细胞增生性疾病或病症以及纤维化并且用以控制(调控)肿瘤进展的方法。
文档编号C12N5/12GK102378766SQ201080012287
公开日2012年3月14日 申请日期2010年3月23日 优先权日2009年3月23日
发明者埃琳娜·费因斯坦 申请人:夸克医药公司