冷-活跃的β-半乳糖苷酶、其生产方法、以及所述酶的用途的制作方法

专利名称：冷-活跃的β-半乳糖苷酶、其生产方法、以及所述酶的用途的制作方法
冷-活跃的β -半乳糖苷酶、其生产方法、以及所述酶的用
途
技术领域：
本发明涉及特异于乳糖的新的冷-活跃的β-半乳糖苷酶。酶由此在例如用于在低温催化乳糖二糖水解成其成分单糖，葡萄糖和半乳糖的食品工业中有用。本发明还提供通过重组DNA技术产生冷-活跃的β -半乳糖苷酶的方法。
背景技术：
β -半乳糖苷酶(β -D-半乳糖苷半乳糖水解酶，EC 3. 2. 1. 23)是能将二糖乳糖水解成其单糖成分，D-葡萄糖和D-半乳糖的酶。β -半乳糖苷酶见于广泛的生物，如哺乳动物，植物，真菌，酵母和细菌。本质上，半乳糖苷酶水解乳糖和其他含D-半乳糖的碳水化合物。在工业上，半乳糖苷酶主要在食品工业中使用。乳糖和含乳糖的乳产品的 β -半乳糖苷酶水解在整个乳制品工业中，在无乳糖或低-乳糖产品(其可被患有乳糖不耐性的人消费)的制备中使用。通过半乳糖苷酶的乳糖水解也可用于需要去除乳糖的应用中，即防止食品中的乳糖结晶化和去除糖基化的蛋白中的D-半乳糖部分。β-半乳糖苷酶的其他应用包括将乳糖水解成D-半乳糖和D-葡萄糖，随后将单糖修饰成高价值产品，如甜味剂 D-塔格糖(Jergensen et al. 2004)。β -半乳糖苷酶的应用可用于产生用于不耐受乳糖的人的无乳糖和低-乳糖乳产
P
ΡΠ O乳糖水解的主要应用如以下所列。(a)液体乳。液体乳中的乳糖水解改善乳糖不耐受消费者的可消化性。在香味乳中，乳糖水解增加甜度及增强香味。(b)乳粉。乳糖水解的乳粉用于饮食使用，尤其用于具有临时的β -半乳糖苷酶缺乏的婴儿。(C)发酵的乳产品。在一些情况中，用于生产干酪及酸乳的乳中乳糖水解可增加酸发展速度和由此减少处理时间。(d)浓缩的乳产品。浓缩的乳产品(例如甜炼乳，冰淇淋)中的乳糖水解阻止乳糖
结晶化。(e)用于动物饲喂的乳清。乳清中的乳糖水解致使给猪和牛饲喂更多的乳清固体， 且也阻止乳清浓缩物中的结晶化。(f)乳清。将乳糖水解的乳清浓缩，以产生含70-75%固体的糖浆。此糖浆提供有功能的乳清蛋白及甜碳水化合物的来源，并且用作冰淇淋，面包及糖果产品中的食品成分。食品处理中的常规方法是为了于40°C进行乳糖水解约4小时。但是，作为原材料的乳或乳糖溶液是细菌的优选的营养来源。结果，处理期间由腐生生物污染的腐败是食品生产中的严重的问题。由此，实际情况是常规半乳糖苷酶的使用受限。实际应用中的多数β-半乳糖苷酶仅在20 30°C以上温度活跃，这是腐败食品的细菌最旺盛的温度。已使用利用嗜热β -半乳糖苷酶的尝试，但产品由于热处理而香味减少及外观变差，且处理需要高能成本。已描述了来自节杆菌属(Arthrobacter) (Coker，et al. 2003 ； Karasova-Lipovova, et al. 2003 ；Nakagawa et al. 2003 ；Nakagawa et al. 2006),来自的栖鱼肉杆菌(Carnobacterium piscicola) (Coombs and Brenchley, 1999)禾口来自的fi 交替单胞菌属(Pseudoalteromonas) (Cieslinski, et al. 2005 ；Fernandes, et al. 2002 ； Hoyoux, et al. 2001 ；Turkiewicz, et al. 2003)的数种冷-活跃的 β _ 半乳糖苷酶。此外，Nakagawa等人0006)描述了来自酵母普兰久浩酵母(Guehomyces pullulans)的冷-活跃的半乳糖苷酶。但是，迄今描述的冷-活跃的半乳糖苷酶的活性在乳品工业需要的低温下低。来自酵母普兰久浩酵母(Guehomyces pullulans)的β -半乳糖苷酶于0°C具有约17%的活性(Nakagawa et al. 2005)，来自栖鱼肉杆菌(Carnobacterium piscicola) BA 的 β -半乳糖苷酶于 10°C显示约 24%活性(Coombs 和 Brenchley, 1999)，而来自假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)分离物的酶于10°C显示39%活性(Fernandes et al. 2002)，22%活性(Cieslinski et al. 2005)，及 12%活性(Hoyoux et al. 2001)。至今，在低温具有最高活性的半乳糖苷酶分离自南极节杆菌属(Arthrobacter)分离物。 Karasovci-Lipovovci,等人 QOO3)显示，耐冷节杆菌属(Arthrobacter sp.)C2_2 分离物产生半乳糖苷酶，其于10°C显示其最大活性的19%，Coker等人Q003)描述了来自南极节杆菌属(Arthrobacter)分离物的酶，其于0°C具有约50%的活性，而Nakagawa等人 (2003，2006)描述了来自A.psychrolactophilus F2的β-半乳糖苷酶，其于10°C具有最佳温度。但是，来自南极节杆菌属(Arthrobacter)的冷-活跃的β _半乳糖苷酶在天然的细胞中以低量产生，且在大肠埃希氏菌(E.coli)中重组产生酶的尝试不成功，由于约90% 的酶位于不溶性包含体(Coker et al. 2003)。来自A. psychrolactophilus F2的冷-活跃的β-半乳糖苷酶可异源性地产生，但相比其他节杆菌属(Arthrobacter) β -半乳糖苷酶具有更低活性(Nakagawa et al. 2006)。因此，为了开发乳糖的低-温度水解方法，需要新冷-活跃的β -半乳糖苷酶和产生所述酶的方法。发明概述本发明通过使用重组DNA技术首次使以对于生产食品和药物工业上适当的量提供具有高特异性活性的冷-活跃的β-半乳糖苷酶成为可能。因此，本发明提供纯化的冷-活跃的β -半乳糖苷酶，其特异于乳糖，在低于8°C及特别在4°C的温度具有稳定的酶促活性，其对应于乳产品的冷冻保存温度。结果，本发明的酶可水解乳产品中的乳糖，并在所述阻止腐生生物增殖的低温乳处理。乳糖的水解可在这些冷冻条件下，无需对相关乳产品的特定处理而进行。特别是，本发明提供冷活跃的β -半乳糖苷酶，其具有SEQ ID NO 1所示的序列， 或与SEQ ID Ν0:1所示的氨基酸序列具有至少80%同源性，所述氨基酸序列选择为酶在低于8°C的温度具有稳定的酶促活性。优选所述氨基酸序列与SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列具有至少90 %，及更优选95 %同源性。冷-活跃的半乳糖苷酶，还提供了 DNA序列，其(a)编码具有SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列的蛋白，或者(b)在严格或非常严格条件下与(a)的序列杂交，或者(c)是(a)或(b)的序列的简并体。优选DNA 序列源于 Alkalilactibacillus 属，例如物种 Alkalilactibacillus ikkense，及具有SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。在进一步实施方式中，本发明提供重组载体，其包括编码具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列具有至少80%同源性的氨基酸序列的蛋白的DNA序列，所述氨基酸序列选择为酶在低于8°C的温度具有稳定的酶促活性。优选氨基酸序列与SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列具有至少90%，及更优选95%同源性。本发明的另一目的是分离的AlkalilactibacilIus属细菌株，其能产生本发明的冷-活跃的半乳糖苷酶。优选的株是在2009年3月3日，根据布达佩斯条约以保藏号 LMG Ρ-24866保藏在比利时微生物协调保藏中心(Belgian Coordinated Collections of Microorganisms)的 Alkalilactibacillus ikkense 及源于其的变体禾口突变体。为了纯化本发明的冷-活跃的半乳糖苷酶，将在格陵兰区中生活的细菌分离， 并表征，以便研究该酶如何，及尤其是，β -半乳糖苷酶如何适应寒冷。这些研究导致β -半乳糖苷酶的纯化，意为使用本领域已知的蛋白纯化步骤得到从其他蛋白基本上游离的此蛋白。由此，本发明的另一目的是分离的Alkalilactikicillus属细菌株，其能产生本发明的冷-活跃的β-半乳糖苷酶。优选的株是alkalilactibacillus ikkense。本发明的另一目的是重组质粒或载体适合于宿主转化，能引导本发明的DNA序列以宿主以可恢复的形式表达本发明的冷-活跃的β-半乳糖苷酶的方式表达。根据本发明，另一目的是如此转化的宿主。各种宿主-表达系统可接受以表达冷-活跃的β -半乳糖苷酶编码序列，例如细菌，酵母，昆虫细胞，植物细胞，哺乳动物细胞， 等。尤其是，在酵母及细菌中，可使用含组成型或诱导型启动子的许多载体。本发明还旨在提供从细菌纯化本发明的冷-活跃的β -半乳糖苷酶的方法，以及提供在转化的宿主中产生本发明的冷-活跃的β-半乳糖苷酶的方法。因此，本发明涉及产生具有冷-活跃的半乳糖苷酶活性的多肽的方法，包括 分离编码多肽的DNA片段，将所述DNA片段插入适当的宿主生物，在导致具有冷-活跃的 β -半乳糖苷酶活性的多肽表达的条件下培养宿主生物，以及从培养培养基或宿主生物回收所述多肽。适当的宿主生物优选选自埃希氏菌属(Escherichia)，芽孢杆菌属(Bacillus)， 双岐杆菌属(Bifidobacterium),乳球菌属(Lactococcus), ILff lifM (Iactobacillus), 链霉菌属(Str印tomyces)，明串球菌属(Ieuconostoc)，链霉菌属(Str印tomyces)，酵母菌属(Saccharomyces)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，念珠菌属(Candida)，串酵母属 (Torula)，球拟酵母属(Torulopsis)和曲霉属(Aspergillus)。再一方面，本发明涉及重组DNA分子，其包括编码具有冷-活跃的β -半乳糖苷酶活性的多肽的DNA片段，且涉及包括所述重组DNA分子的微生物细胞。在另一方面，本发明涉及以上具有冷-活跃的β -半乳糖苷酶活性的多肽或表达所述多肽的微生物细胞在生产食品或药物产品中的用途。在另一有用的方面，提供了减少食品的乳糖含量的方法，包括向食品添加一定量的如本文所述的多肽或微生物细胞，其足以去除存在于所述食品中的至少部分乳糖。在另一方面，本发明涉及通过适度增加温度的多肽的半乳糖苷酶活性的灭活。在另一感兴趣的方面，提供了本发明的具有冷-活跃的β -半乳糖苷酶活性的多肽或微生物细胞用于乳糖水解的方法，其中多肽和/或微生物细胞将应用于含在低温条件下水解的乳糖的反应器。本发明的这些和其他目的将从以下公开内容中显而易见。本发明的其他特征将列于随附的权利要求。

图1显示了来自Alkalilactibacillus ikkense株517和其在种系聚类中的rRNA 组1内分类学上定义为芽孢杆菌属(Bacillus)的最接近的相对物的16S rRNA基因序列的系统树。显示了引导(η = 100)值。条，0.015置换/核苷酸位置。图2显示天然的Uka-β -半乳糖苷酶的温度依赖性。Y轴是以最大活性的百分率的相对活性。X轴是温育温度。图3显示天然的Ilcka- β -半乳糖苷酶的温度稳定性。Y轴是温育X轴上指定的时间后残留的活性。 ， ，▲，■， ，〇分别表示0，10，20，30，40和50°C的温育温度。图4显示天然的^ka- β -半乳糖苷酶的ρΗ依赖性。Y轴是以最大活性的百分率的相对活性。X轴是半乳糖苷酶测定中的ΡΗ。图5显示来自用ImM IPTG诱导的天然的A. ikkense细胞的(泳道2和3)和来自未诱导的天然的A. ikkense的(泳道4和5)提取物的SDS-PAGE。泳道2和3的箭标表示 120kDa β-半乳糖苷酶条带。泳道1是分子量标记物。120kDa处的标记物是来自大肠埃希氏菌(E.coli)的β-半乳糖苷酶。图6显示来自表达Ikka-β-半乳糖苷酶的重组大肠埃希氏菌(E.coli)细胞的3种提取物稀释液的SDS-PAGE (泳道4，5和6)。为了比较，将含来自乳克鲁维酵母 (Kluyveromyces lactis)的β -半乳糖苷酶的酶提取物稀释液(泳道7，8和9)和含天然的大肠埃希氏菌(E. coli) 半乳糖苷酶的分子量标记物(120kDa的标记物)重组 Ikka-β-半乳糖苷酶共-电泳。箭标显示120kDa β -半乳糖苷酶条带的位置。图7显示大肠埃希氏菌(E. coli)中产生的重组Ikka-β -半乳糖苷酶的温度依赖性。Y轴是以最大活性的百分率的相对活性。X轴是温育温度. ，表示重组半乳糖苷酶；〇，表示乳克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis) β -半乳糖苷酶。图8显示大肠埃希氏菌(E. coli)中产生的重组Ilcka-β -半乳糖苷酶的特异性活性。Y轴是以nmol释放的ONP/小时/mg酶的特异性活性。X轴是以。C的温度。 是重组 Ilika-β-半乳糖苷酶，〇是乳克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis) β -半乳糖苷酶。图9显示重组Uka-β -半乳糖苷酶的热稳定性。在指定温度温育相等的量的酶， 并以不同的时间间隔取样品。Y轴是波长415nm处的吸光度。X轴是以分钟的时间。图10也显示重组Ilika-β -半乳糖苷酶的热稳定性，而X轴是以小时的时间。
图11显示重组Ilcka- β -半乳糖苷酶的ρΗ依赖性。Y轴是在波长415nm处测量的吸光度。X轴是β-半乳糖苷酶测定中的PH。图12显示由大肠埃希氏菌(E. coli)中产生的重组^ka-β-半乳糖苷酶的乳糖水解。反应混合物以3种浓度含乳糖，1. 25mg/ml,2. 5mg/ml和5mg/ml。温育15，150和1440 分钟后采集样品。将反应于5°C (A)或20°C (B)温育，并通过薄层层析(TLC)分析。将TCL 板用苔黑酚试剂喷射，及乳糖水解通过TLC板上乳糖斑点的消失和伴随的葡萄糖和半乳糖斑点的出现来估计。图13显示表达A. ikkense β -半乳糖苷酶的大肠埃希氏菌(E. coli)细胞的粗提取物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，泳道1。粗提取物中的半乳糖苷酶还在离子交换层析上纯化，泳道2，或在亲和层析上纯化，泳道3。箭标表示大肠埃希氏菌(E.Coli)120kDa β-半乳糖苷酶条带的位置。左侧的数表示I^ageRuler Plus Prestained Protein Ladder(Fermentas)中蛋白条带的位置。图14显示纯化的，重组A. ikkense β -半乳糖苷酶及含重组酶的粗提取物的温度依赖性(A)和ρΗ依赖性(B)。Y轴是以最大活性的百分率的相对活性。X轴是温育温度(A) 或ρΗ(Β)。通过黑矩形显示用ONPG作为底物的纯化的，重组酶的相对活性。以一式三份进行测定，及标准误差在0. 05以下。图15显示纯化的，重组A. ikkense β -半乳糖苷酶的热稳定性。在指定温度温育相等的量的酶，并以不同的时间间隔采集样品。Y轴是以最大活性的百分率的残留的活性。 酶样品在0°c 60°C的温度温育，及在指定的时间点(X轴)，采集样品，及于20°C测定活跃的半乳糖苷酶。测定以一式三份进行，及标准误差在0.05以下。图16显示将A. ikkense β-半乳糖苷酶(黑矩形)用商业上可用的来自乳克鲁维酵母(K. Iactis)的Lactozyme 33000L(开环)作为基准。将相等的量的酶Omg/ml) 以ONPG作为底物，以0°C 20°C的温度温育。以不同的时间间隔采集样品，并在A420nm处测量水解的0ΝΡ。水解效率计算为以A420nm/min/yg活性酶的增加。测定以一式三份进行，及标准误差在0. 05以下。图17显示由A. ikkense β -半乳糖苷酶的乳糖水解的薄层层析(TLC)。泳道4 6 样品经 5°C温育 21/2h(4 :1. 25mg/ml 乳糖，5 :2. 5mg/ml 乳糖，6 :5mg/ml 乳糖)。泳道 7 9 样品经 20°C温育 21/2h(7 :1. 25mg/ml 乳糖，8 :2. 5mg/ml 乳糖，9 :5mg/ml 乳糖)。泳道 1 3 对照，0. 0125 μ g的各碳水化合物13乳糖(泳道1)，半乳糖(泳道2、和葡萄糖(泳道3)。发明详述“β-半乳糖苷酶”(β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，EC 3.2. 1.23)定义为能将乳糖水解成单糖D-葡萄糖和D-半乳糖的酶。“冷-活跃的”定义为于15°C及以下，优选于10°C及以下和最优选于5°C及以下温
度具有活性。“宿主细胞”选自一组微生物，包括真菌，酵母和原核生物。微生物更优选为原核生物，且最优选为细菌。温育β-半乳糖苷酶与乳糖的条件被定义为在0°C和20°C之间，优选在5°C和 15°C之间的温度进行温育。
术语〃严格条件"指在含6乂33((20乂33(代表3331111柠檬酸钠，3331111 NaCl)， 0.5% SDS和50%甲酰胺的溶液中于42°C进行杂交，及然后在0. 1XSSC,0. 5% SDS的溶液中于 68°C洗涤杂交的产物的条件，或如 Nakayama, et al.，Bio-Jikken-Illustrated, vol. 2, “ Idenshi-Kaiseki-No-Kiso (A Basis for Gene Analysis)" ,pp. 148-151,Shujunsha, 1995中所述的条件。
实施例实施例1产生冷-活跃的β -半乳糖苷酶的细菌的分离1.1细菌采样由潜水员在Ikka Fjord，西南格陵兰(61° 11，N, 48° 01，W)从约6 IOm的深度收集Uaite物质。柱长度在36 70cm之间和直径在5和30cm之间。在运输到领域实验室期间柱保持冷。1.2筛选β -半乳糖苷酶产生的细菌钻出来自ikaite柱顶部的15 18cm切片的约3cm3的ikaite物质，并悬浮在如 Stoll 和 Blanchard(1990)所述用 0. 2M Na2C03/NaHC03 缓冲液缓冲到 pHIO 的 250ml R2 肉汤(Schmidt et al. 2006)中。于5°C温育2个月后，将培养物接种到R2培养基，pHIO，无葡萄糖，但补充了乳糖(l^w/V)，5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal) (40 μ g/ml)，IOmM异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和琼脂(1.5%, w/v)。将板于 5°C温育1 2周。总17个蓝集落表明检测到β-半乳糖苷酶的产生。由于17个分离物的16S rRNA基因分析显示仅分离物之一，株517相同的序列，将其选择用于进一步表征。实施例2分离物517的分类学分析和新属和物种，Alkalilactibacillus ikkense的描述2.116SrRNA基因序列的种系发生分析使用土壤用FastDNA SPIN试剂盒，如制造商(ΒΙ0 101，Irvine, CA)所述从分离物517的细胞提取用于种系发生分析的DNA。使用引物27F和1492R进行16S rRNA 基因扩增(泳道1991)，及以MWGBiotech AG^bersberg，德国)使用相同的2种引物加额外的引物519R，532F，907F和907R进行DNA测序(泳道1991)。将来自分离物517 的16S rRNA基因的接近全长DNA序列以登录号No. EU281853提交到GenBank/EMBL/ DDBJ。在 NCBI 月艮务器(http //www, ncbi. nlm. nih. Rov/blast/)上使用 BLASTn 从公共数据库检索相关的序列。将最接近相关的16S rRNA基因序列使用Clustal W多重比对程序 MegAlign 5. 03 (DNASTAR, Inc. , Madison, WI)比对。Clustal W 分析显示，最接近的相关体是 Natronobacillus azotifigens (登录号 No. EU850815) (Sorokin et al. 2008) ,Paraliobacillus ryukyuensis (登录号No. AB087828) (Ishikawa et al. 2002)， Halolactibacillus halophilus( g ^ No.AB196783)(Ishikawa et al. 2005), Halolactibacillus miurensis (登录号 No. AB196784) (Ishikawa et al. 2005)，热带双芽孢杆菌(Amphibacillus tropicus)(登录号 No. AF418602) (Zhilina et al. 2001,2002)和 Gracilibacillus halotolerans (登录号 No. AF036922) ( Waill0 et al. 1999)。分离物 517 以分另Ij 95,9%,94. 4%和 93. 9%序列相似性与 N. azotifigens,P. ryukyuensis 及热带双芽孢杆菌(A. tropicus)最接近地相关。分离物517与H. halophilus, H. miurensis及G. halotolerans之间的序列相似性是93. 4%。由此，分离物517和最接近相关体之间的 16S rRNA基因序列相似性的距离在97%相似性以下，其常用作物种分离的初步指南。通过邻接法分析(引导=100)使用 TREEC0N 1. 3b 软件(Van de Peer 和 De Wachter，R. 1994) 创建系统树(图1)。2.2DNA-DNA杂交和基因组DNA的碱基组成分析在DSMZ (Braunschweig,德国)进行DNA-DNA杂交和DNA碱基组成(G+C含量)。 将DNA使用弗氏压碎器(Thermo Spectronic)分离，及通过层析在羟基磷灰石上纯化， 如Cashion等人(1977)所述。DNA-DNA杂交如De Ley等人(1970)所述，考虑Huss等人 (1983)描述的修饰，使用配备 Peltier-thermostatted 6X6multicell changer 的模型 Cary IOOBio UV/VIS-分光光度计及具有原位温度探针的温度控制器(Varian)进行。基于16S rRNA序列相似性P. ryukyuensis的分离物517和最接近相关物之间的DNA-DNA杂交是28. 8%，及分离物517和H. miurensis之间是24. 7%0为了确定GC含量，将DNA用Pl核酸酶水解，并将核苷酸用牛碱性磷酸酶去磷酸化(Mesbah et al. 1989)。得到的脱氧核糖核苷酸通过HPLC分析。分离物517的DNA G+C含量是38. 4mol %，其相当类似于最接近相关的物种。N. azotifigen的G+C含量是 36. 1 38. 5mol% (Sorokin et al. 2008)，H. halophilus 及 H. miurensis 的 G+C 含量报道为 38. 5 40. 7mol % (Ishikawa et al. 2005)，P. ryukyuensis 的 G+C 含量是；35· 6mol % (Ishikawa et al. 2002)，及 G. h alotoleran 的 G+C 含量报道为 3& ο1 % ( Wain0 et al. 1999)。基于GC含量的种系发生结果和数据表明分离物517代表新属中的新物种，由于 DNA-DNA杂交以分离2个物种的阈值是70% (Wayne等人，1987)。由此，我们建议分离物 517 MTfrM Alkalilactibacillus 属 gen. nov. 禾中 Alkalilactibacillus ikkense sp. novο实施例3 来自Alkalilactobacillus ikkense的天然的Ikka-β-半乳糖苷酶的表征3.1 β-半乳糖苷酶测定β -半乳糖苷酶活性通过ο-硝基苯基-β -D-吡喃半乳糖苷(ONPG)的水解和用分光光度计测量在415nm处的释放的ο-硝基苯基(ONP)化合物的吸光度来测定。在测定中， 在415nm处于20°C及pH7. 0 (0. lMNaH2P04/Na2HP04)测量通过重组β -半乳糖苷酶活性的从 ImmONPG的ONP释放。反应通过添加300 μ 1 0. 6Μ Na2CO3来停止。测定于0，5，10，20，30， 40，50和60°C进行30分钟。测定开始之前将磷酸钠缓冲液预加热至相应温度。通过于温度0，10，20，30，40和50°C放置等份的酶，并在t = 0 t = M小时取样品进行酶的热稳定性分析。取样品后立即将它们冷却，并于20°C测定，如上所述。使用用HCl或NaOH从pH4调整到pHIO的混合的pH缓冲液Q50mM Tris, 250mM MES, 250mM乙酸)研究pH活性特征。将样品于20°C温育1小时，并如上所述测定。3.2天然的Ikka-β -半乳糖苷酶的产生将AlkalilactibacilIus ikkense细胞在补充了乳糖和IPTG的液体R2培养基中于15°C在旋转摇床上培养3天。将细胞通过用Sigma 3-18M离心机以4，700rpm离心来收获，并将沉淀悬浮于2ml的0. lMNaH2P04/Na2HP04, pH7。将细胞通过珠敲打在i^astft·印FP120仪(BiolOl/Savant)中以速度5. 5裂解3次25s。然后从玻璃珠去除上清，并于4°C 以10，000 g离心15min。然后将无细胞上清用于测定。3.3天然的Uka-β -半乳糖苷酶的最佳温度的表征天然的Uka-β -半乳糖苷酶于20°C显示最大活性，于0°C得到40%的最大活性， 及于10°C观察到多于最大活性的60% (图2)。在30°C以上，酶仅中度活跃，并于60°C实际上观察不到活性。研究Uka- β -半乳糖苷酶的温度稳定性。图3显示于0°C温育M小时后观察到几乎100%的残留的活性，于20°C温育M小时后残留多于80%活性。在20°C以上的温度， 天然的Uka-β -半乳糖苷酶快速丧失活性(图幻。在高温的灭活显示是不可逆的。研究了天然的Ilika- β -半乳糖苷酶的ρΗ依赖性。图4显示在ρΗ7观察到天然的 Ikka- β -半乳糖苷酶的最大活性，及该酶在ρΗ6及在ρΗ8显示最大活性的约70%。在ρΗ9， 观察到约25%的最大活性。酶在ρΗ5和以下或在pHIO和以上显示无活性(图4)。3.4天然的Ikka-β -半乳糖苷酶的SDS-PAGE在SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)中分析来自用ImM IPTG诱导的及未诱导的A. ilckense细胞的提取物(图5)。通过如上3. 2所述使用珠-敲打裂解细胞来制备细胞内提取物。将提取物(0.5 5μ 1)与12. 5μ 1 4 * LDS样品缓冲液，5 μ 1 10* DTT和0. lMNaH2P04/Na2HP04混合至最终体积50 μ 1。将样品加热至70°C 10分钟，并将30 μ 1 装载到 4 12%505凝胶上。将凝胶在^^11 SureLockTMMini-Cell(Invitrogen，CA，美国) 中以150V于室温运行1小时。电泳后，将凝胶使用考马斯亮蓝R-250 (40% EtOH和10%乙酸中的0. 考马斯亮蓝R-250(krVa，Heidelberg，德国))染色。图5显示在含来自用 IPTG诱导的A. ilckense细胞的提取物的泳道中观察到强120kDa条带，及在含来自非-诱导的细胞的提取物的泳道中缺失此条带。由此，120kDa条带推定为天然的Uka-β -半乳糖苷酶。实施例4 来自Alkalilactobacillus ikkense的Ikka-β -半乳糖苷酶基因的分离和表征4.IIkka-β-半乳糖苷酶基因的分离从50ml的培养物分离来自A. ikkense的DNA。通过离心收获细胞，并将染色体 DNA使用常规苯酚-氯仿提取方法(Maniatis等人，1982)分离。将DNA使用Sau3AI (New England Biolabs, MA，美国)部分消化，并如生产商所述将具有31Λ和101Λ之间的长度的片段使用QIAquick凝胶提取试剂盒Oliagen，Hilden，德国)从琼脂糖凝胶纯化。用于克隆来自A. ikkense的染色体DNA的载体是修饰的pUC18质粒(Stratagene， CA，美国)。通过NdeI和HindIII内切核酸酶(New England Biolabs)限制质粒pUC18。 使用DNA聚合酶的Klenow片段(New England Biolabs)弥补粘端，并将钝端使用T4DNA 连接酶(New England Biolabs)连接。将修饰的pUC18质粒，标识为pUC18dlacZ，在GATC Biotech AG (Konstanz，德国)上DNA测序，并且用 CLC Workbench 4软件(CLC Bio, Aarhus, 丹麦)的DNA序列分析确证，质粒pUC18dlacZ中缺失了 pUC18的α-亚基序列。由此，质粒pUC18dlacZ在导入到带有β-半乳糖苷酶Δ Ζ15突变的大肠埃希氏菌(E. coli)细胞时不能介导α-互补。将Sau 3ΑΙΙ限制的和凝胶-纯化的来自A. ikkense的染色体DNA连接到用限制性内切酶BamHI和南极磷酸酶(New England Biolabs)处理的质粒pUC18dlacZ。将连接混合物转化进化学感受的大肠埃希氏菌(E. coli)TOP10细胞。将转化的细胞平铺于含20μ g/ml X-gal,0. ImM IPTG，及100 μ g/ml氨苄西林的LB琼脂(10g/l细菌胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/l NaCl)，并于37°C过夜温育。16小时过夜温育后，将板转移到20°C，并再温育另外的20小时。筛选出总580个集落，并且检测到1个蓝色集落。选择于20°C温育期间变蓝色的集落，并转移到IOml LB肉汤，并于37°C过夜生长。通过离心收获来自过夜培养物的重组大肠埃希氏菌(E. coli)细胞，及将质粒DNA使用QIApr印Spin Minipr印试剂盒Oliagen) 纯化。通过用限制性内切酶EcoRI和I3StI (New England Biolabs)消化来分析质粒DNA 的插入子。将质粒中的插入子，标识为pUCIkka-bgal，在GATC Biotech AG (Konstanz，德国)中使用与引物M13反向并行的引物和自定义制造的特异于pUCHkka-bgal中的插入子 (SEQ ID NO 3 :5，CCGTCATCCATATCACC3，；SEQ ID NO 4 :5，CCTTTGCCCAAGAGCCAACC3，；SEQ ID NO 5 :5，GCTATTATCAGACTTGGCACC3，；SEQ ID NO 6 :5，GTAATTCAATGTTCCAACGTG3，；SEQ ID NO 7 :5，CGCTTATGGTGTGAAG3’ )和恰好在pUC18dlacZ中多克隆位点下游的序列(SEQ ID NO 8 :5，GGGCTGGCTTAACTATGCGG3，)的引物来测序。DNA 插入子带有的 Ikka-β-半乳糖苷酶基因序列显示为SEQ ID NO :2。4.2Ikka-^-半乳糖苷酶基因序列的表征使用CLC Workbench 4 软件(CLC BIO, Aarhus，丹麦)的 DNA 序列，SEQ ID N0: 2的分析显示开放阅读框具有1，041个氨基酸，SEQID NO 1的编码容量。使用NCBI检索工具Blastp来检索数据库中相关的序列。最接近相关的序列是来自巨大芽胞杆菌 (Bacillus megaterium)的β -半乳糖苷酶(登录号ABW3675) 56. 7 %同一性，类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.) JDR-2 (登录号 ZP_(^849115) 55. 3 % 同一性，及土芽孢杆菌属 (Geobacillus sp.) Y412MC10 (登录号ZP_03036811) 同一性，全部属于糖基水解酶家族2。由此，得出Ilika-β-半乳糖苷酶属于此家族。计算的Uka-β-半乳糖苷酶的亚基分子量和Pl分别是119kDa和pi 5. 0，(ExPASy ProtParam工具)。计算的亚基分子量通过SDS-PAGE确证，图5和6。Ikka- β -半乳糖苷酶与结构解析的酶的比对显示，大肠埃希氏菌(E. coli)中保守的活性位点区(ILCEYAHAMGN)(阳性.534-544) (Gebler et al. 1992) 在Ilika-β -半乳糖苷酶中良好保守(ILCEFSHAMGN)(阳性.Μ7-557)，且活性位点亲核体 Glu-537可能发现为Glu-550。实施例5大肠埃希氏菌(Escherichia coli)中重组Ikka-β -半乳糖苷酶的产生天然的Alkalilactibacillus ikkense显示产生仅中等量的Ikka-β -半乳糖苷酶。因此，为了产生更大量的半乳糖苷酶，进行将^ka-β-半乳糖苷酶基因亚克隆进表达质粒。5.1用于在大肠埃希氏菌(Escherichia coli)中重组Ikka-β -半乳糖苷酶表达的载体的构建将Uka-β -半乳糖苷酶基因进一步使用DNA来自A. ikkense的染色体作为模板和PCR引物bGal5，5，CTGAATTCGCATATGGCAAAAAAATTAAAAAAATTC3，(有下划线的EcoRI 限制性位点)(SEQ ID NO 9) , Ji hGaUWCX AAGCTT ATCTGTTTA A ACTATTCA ACATGH (有双下划线的HindIII位点)(SEQ ID NO 10)亚克隆。使用的聚合酶是校正聚合酶Phusioil 高-保真度DNA聚合酶(New England BioLabs)。PCR反应通过在0. 8%琼脂糖凝胶Geakem GTG)上凝胶电泳来分析，并将3.91Λ片段连接到pJET1.2/钝克隆载体(i^ermentas， Helsingborg，Sweden)，并转化进大肠埃希氏菌(E. coli) T0P10细胞。在含氨苄西林的LB 琼脂板上分离含PJET1. 2/钝的大肠埃希氏菌(E. coli)转化体，并如上所述制备质粒DNA。 将质粒DNA用酶EcoRI和HindIII限制，并如所述在0.8% (w/v)琼脂糖凝胶上分析。从凝胶使用QIAquick凝胶提取试剂盒如生产商所述纯化3. 9kb DNA片段。将纯化的DNA片段连接到用酶EcoRI和HindIII类似限制的质粒pUC18dlacZ，并且如上所述纯化凝胶。将连接混合物转化进大肠埃希氏菌(E. coli) TOPlO细胞，并在含100 μ g/ml氨苄西林，ImM IPTG， 及40 μ g/ml X-gal的LA板上作为蓝色集落选择带有含Ilika-β -半乳糖苷酶基因的质粒 i3UC18dlacZ的重组细胞。选择转化体，并且分析质粒和插入子。从IOml培养物制备质粒 DNA，并将DNA发送给GATCbiotech (Konstanz，德国)使用以上4. 1中描述的引物测序。测序两条链的整个Ikka-β -半乳糖苷酶基因，以便确保PCR期间无突变导入。选择含具有让1 1-0-半乳糖苷酶基因的质粒？肌18(11￡1(^(标识为质粒？肌11^￡1^^￡11_6即)的重组克隆之一用于进一步表达研究。5.2大肠埃希氏菌(Escherichia coli)中重组Ikka-β -半乳糖苷酶的表达将带有质粒pUCIkka-bgal 和 pUCIkka_bgal_exp 的大肠埃希氏菌(E. coli) T0P10 细胞在含100 μ g/ml氨苄西林的30ml LB肉汤中于37°C培养过夜。过夜温育后，给细胞补充0. ImM IPTG，并且于20°C温育再20小时。通过以4，700rpm于10°C离心30min来收获细胞，及悬浮于 Iml 0. IM NaH2P04/Na2HP04，pH7。将细胞通过在 i^ast ft·印仪(Fast Prep FP120, BiolOl/Savant Instruments Inc.，Holbrook, NY)中以速度 5· 5 珠敲打 3 次 25 秒钟来裂解。敲打/摇动之间将样品在冰上冷却。将裂解物于4°C以10，00(^离心15!^11，及将含Ilcka-β -半乳糖苷酶的上清转移到清洁的管。将此粗提取物用于随后分析。5.3大肠埃希氏菌(Escherichia coli)中产生的重组Ikka-β -半乳糖苷酶的性质5.3. 1.重组Ikka-β -半乳糖苷酶的SDS-PAGE和产率的确定如上3. 4所述在SDS-PAGE(SDS凝胶4 12%，PAGEgel, CA，美国)上分析来自带有质粒pUCIlcka-bgal的重组大肠埃希氏菌(E. coli)细胞的细胞内提取物。分析用ImM IPTG诱导的培养物和未诱导的对照培养物。来自用及不用IPTG生长的培养物的提取物中的蛋白条带与来自用IPTG诱导的培养物中的约120kDa的条带的彼此相同(图6中的箭标)。由此，由于半乳糖苷酶的计算的分子质量是119kDa，且由于仅在用IPTG诱导的培养物中观察到120kDa的强条带，由此推定，120kDa条带代表Ilika- β -半乳糖苷酶。如上所述制备来自带有质粒pUCIlcka-bgal的大肠埃希氏菌(E. coli)培养物的提取物，并在SDS-PAGE上电泳之前稀释。将具有已知的分子质量及指定的浓度的来自大肠 ±矣希氏菌(E. coli) (Sigma-Aldrich, M0，美国)和乳克鲁维酵母(K. lactis) (Novozymes, Bagsvaerd，丹麦)的β _半乳糖苷酶在相同的凝胶上共电泳用于比较(图6中的箭标)。 通过比较已知的β -半乳糖苷酶与Ilcka-β -半乳糖苷酶的迁移和考马斯亮蓝染色，得到估计的量的Ilcka-β -半乳糖苷酶。估计用于随后分析的提取物具有ang/ml的Ilcka-β -半乳糖苷酶浓度。
5.3. 2重组Ikka-β -半乳糖苷酶的温度依赖性如上对于使用ONPG作为底物的天然的酶所述测定重组Ilika-β -半乳糖苷酶的最佳温度。对于重组让！^-日-半乳糖苷酶，及作为对照，对于来自大肠埃希氏菌(E. coli)和乳克鲁维酵母(K. Iactis)的β-半乳糖苷酶，于0，5，10，20，30，40，50和60°C测定温度特征30，60和120分钟。对于重组Uka- β -半乳糖苷酶活性的最佳温度测定为20 30°C (图 7)。但是，Ikka-β-半乳糖苷酶也在低温显示高活性，于0°C多于40%活性，于5°C约80% 活性及于10°C多于90%活性。相比乳克鲁维酵母(K. Iactis) β-半乳糖苷酶，Ilcka-β-半乳糖苷酶的特异性活性在0°C和30°C之间的温度几乎两倍高(图8)。两种酶于40°C及以上显示接近于0的活性(图8)。于0，10，20，30，40，50和60°C测定Ikka-β-半乳糖苷酶的热稳定性。从t = 0小时 t = 123小时，以从第1小时期间的5分钟到实验末的几小时的增加的间隔获取样品 (图9)。图9和10显示，Ikka-β-半乳糖苷酶于QV及5 °C显示高稳定性，于10°C，酶稳定约100小时，而在20°C以上温度，Ikka-β -半乳糖苷酶更不稳定。于40°C处理40分钟导致完全灭活。Ilika-酶的灭活是不可逆的。[5. 3.3重组Ikka-β-半乳糖苷酶的ρΗ依赖性使用用HCl或NaOH调整到ρΗ4 pHIO的混合的ρΗ缓冲液Q50mM Tris, 250mM MES, 250mM乙酸)研究ρΗ活性特征。将样品于20°C温育2小时。Ilika- β -半乳糖苷酶的最佳PH值显示为大致ρΗ7. 0。在ρΗ6. 0，酶显示60%的最大活性，及在ρΗ8. 0，Ikka-酶显示90%活性。在ρΗ9.0，观察到15%活性，然而在ρΗ5.0或以下或在pHIO和以上检测不到活性。[5. 3.3重组Ikka-β-半乳糖苷酶的ρΗ依赖性在于ΡΗ7.0和20°C使用9种不同的发色底物进行20分钟的测定中测定 Ilcka-β-半乳糖苷酶的底物特异性0-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷，P-硝基苯基-α -D-吡喃半乳糖苷，ο-硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷，ρ-硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷，P"硝基苯基-β -D-吡喃阿拉伯糖苷，ρ-硝基苯基-β -D-纤维二糖糖苷，ρ-硝基苯基-β -D-吡喃果糖苷，ρ-硝基苯基-β -D-吡喃乳糖苷和ρ-硝基苯基-β -D-吡喃甘露糖苷。各底物以IOmM的浓度使用。测定显示，Ilcka-β-半乳糖苷酶仅能水解ο-硝基苯基-β -D-吡喃半乳糖苷(ONPG)和ρ-硝基苯基-β -D-吡喃果糖苷(相对ONPG水解，4% 的相对活性)。以下检测其余底物的利用。在水中乳糖溶液中测定乳糖水解。测定3种不同的乳糖浓度1. 25mg/ml,2. 5mg/ ml和5mg/ml。总反应体积是0. ^il，且各反应含0. 2mg/ml的重组Ilika-β -半乳糖苷酶。酶反应于5 °C及20 V温育，及在15分钟，21/2小时和M小时后收集样品。温育后，通过于95 °C 加热20分钟来停止反应。通过薄层层析(TLC)在TLC氧化硅凝胶60 (Merck，Darmstadt，德国)上在含1-丁醇，2-丙醇和水的溶剂(3 12 4)中进行产物的可视化。在TLC上运行含0. 005mg乳糖的体积。对照是0. 5 μ 1乳糖(2. 5% )，0. 5 μ 1半乳糖O. 5% )和0. 5 μ 1 葡萄糖O. 5% )。干燥后，将糖通过用苔黑酚试剂喷射，然后是于100°C温育5 IOmin来可视化。于5°C及于20°C观察乳糖水解。于5°C，在15分钟后，1.25mg/ml反应中约75 85%乳糖水解，以及在21/2小时之内100%水解，(图12A)。在于20°C温育的1. 25mg/ml反应中观察到类似水解效率(图12B)。在2. 5mg/ml乳糖反应中的水解有效性显示在两种温度下21/2小时之内约90 95%水解。M小时后，在两种温度从全部3种乳糖浓度观察到100%水解(图12)。5.3. 4重组Ikka-β -半乳糖苷酶的纯化从粗提取物通过离子交换层析纯化β-半乳糖苷酶。2ml的部分经历在生物学LP 系统上的Iml高Q盒(Bio-Rad)上层析。将柱用IOml的50mM磷酸盐缓冲液(pH7)洗涤，通过在50mM磷酸盐缓冲液(pH7) 中的NaCl的0 IM的梯度，以0. 5ml/min的流速洗脱。收集Iml的级分。粗提取物也在与 P-氨基苄基-1-硫代-β -D-吡喃半乳糖苷偶联的2ml琼脂糖柱(PABTG-琼脂糖，Sigma) 上经历亲和层析。将柱用IOml的50mM磷酸盐缓冲液(pH7)洗涤，之后其通过50mM磷酸盐缓冲液(PH7)中的IOOmM NaCl以0. 5ml/min的流速洗脱。收集Iml的级分。使用BCA蛋白测定试剂盒(Pierce)分析级分中蛋白的存在，及在如上所述的 ο-硝基苯基(ONP)-β-D-吡喃半乳糖苷测定中测量半乳糖苷酶。通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳G 20%，PAGEgel, CA，美国)分析含β -半乳糖苷酶活性的级分。纯化的 β-半乳糖苷酶用于随后的稳定性及活性实验。图13显示来自大肠埃希氏菌(E. coli)的粗提取物含具有约115 120kDa的单体分子量的重组β -半乳糖苷酶。离子交换层析产生纯β -半乳糖苷酶(图13，泳道2)， 然而亲和层析(图13，泳道幻仅产生部分纯化的重组酶。由此，为了随后分析，使用来自离子交换的纯半乳糖苷酶，除非别有指定。5.3. 5天然的和重组A. ikkense β -半乳糖苷酶的表征当使用已知的来自大肠埃希氏菌(E.coli)和乳克鲁维酵母(K. Iactis)的β-半乳糖苷酶作为参照在SDS-PAGE上分析时，A. ikkense β -半乳糖苷酶的分子量测定为约 115 120kDa。此结果与如由DNA测序确定的计算的分子量(119kDa) —致。来自大肠埃希氏菌(E. coli)的粗提取物估计含10mg/ml的A. ikkense β -半乳糖苷酶。以ONPG作为底物，基于由离子交换层析纯化的β -半乳糖苷酶计算的特异性活性于 20°C是 8.4ymol/min/mg 蛋白(表 1)。表1
权利要求
1.纯化的冷-活跃的β-半乳糖苷酶，其具有SEQID NO :1所示的氨基酸序列，或与 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列具有至少80%同源性，所述氨基酸序列选择为酶在低于 8V的温度具有稳定的酶促活性。
2.权利要求1的β-半乳糖苷酶，其中氨基酸序列与SEQID NO :1所示的氨基酸序列具有至少90 %，优选95 %同源性。
3.权利要求1或2的β-半乳糖苷酶，其中其由Alkalilactikicillus属的株产生。
4.权利要求1，2或3的β-半乳糖苷酶，其中其由Alkalilactibacillusi Iikense产生。
5.分离的DNA序列，其包括编码权利要求1 4中任一项的β-半乳糖苷酶的基因。
6.分离的DNA序列，其(a)编码具有SEQID NO :2所示的氨基酸序列的蛋白，或者(b)在严格条件下与(a)的序列杂交，或者(c)是(a)或(b)的序列的简并体。
7.权利要求6的DNA序列，其中序列如SEQID NO 2所示。
8.重组载体，其包括权利要求5 7中任一项的DNA序列。
9.权利要求8的载体，其中所述载体是表达载体。
10.宿主细胞，其经权利要求8或9的载体转化。
11.权利要求10的细胞，其中细胞选自埃希氏菌属(Escherichia)，芽孢杆菌属(Bacillus),双岐杆菌属(Bifidobacterium),乳球菌属(Lactococcus), ff lif M (Iactobacillus)，链霉菌属(Streptomyces)，明串球菌属(Ieuconostoc)，链霉菌属 (Streptomyces),酵母菌属(Saccharomyces),克鲁维酵母属(Kluyveromyces),念珠菌属 (Candida)，串酵母属(Torula)，球拟酵母属(Torulopsis)和曲霉属(Aspergillus)。
12.权利要求11的细胞，其中细胞选自短双歧杆菌(Bifidobacteriumbreve)，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，婴儿双岐杆菌(Bifidobacterium infantis)，两岐双岐杆菌(Bifidobacterium bifidum)，动物双岐杆菌(Bifidobacterium animal is)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
13.权利要求10 12中任一项的细胞用于生产选自下列的产品的用途无乳糖的乳， 低-乳糖乳，酸乳，干酪，发酵的乳产品，饮食补充剂和益生菌食品。
14.权利要求13的用途，其用于生产具有或更低乳糖浓度的乳产品。
15.权利要求14的用途，其中乳糖浓度是0.或更低。
16.权利要求15的用途，其中乳糖浓度是0.01%或更低。
17.权利要求1 4中任一项的半乳糖苷酶用于生产选自下列的产品的用途无乳糖的乳，低-乳糖乳，酸乳，干酪，发酵的乳产品，饮食补充剂和益生菌食品。
18.权利要求17的用途，其用于生产具有或更低乳糖浓度的乳产品。
19.权利要求18的用途，其中乳糖浓度是0.或更低。
20.权利要求19的用途，其中乳糖浓度是0.01%或更低。
21.生产权利要求1 4中任一项的酶的方法，包括 在适宜培养基中、在允许表达所述酶的条件下培养权利要求10 12中任一项的细胞，及 从培养物中回收得到的酶。
22.权利要求21的方法，其中将得到的酶固定。
23.乳糖的水解方法，包括使权利要求1 4中任一项的酶或权利要求10 12中任一项的细胞与乳糖溶液接触。
24.嗜冷细菌Alkalilactibacillus ikkense BCCM 保藏号 LMGP-24866 及源于其的变体和突变体，其能产生权利要求1或2定义的冷-活跃的β半乳糖苷酶。
全文摘要
本发明提供了特异于乳糖的新冷-活跃的β-半乳糖苷酶。酶由此在例如用于在低温催化将乳糖二糖水解成其成分单糖，葡萄糖和半乳糖的食品工业中有用。本发明还提供通过重组DNA技术产生冷-活跃的β-半乳糖苷酶的方法。
文档编号C12N9/38GK102361974SQ201080012589
公开日2012年2月22日 申请日期2010年2月9日 优先权日2009年2月10日
发明者M·施米特, P·斯托加德 申请人:哥本哈根大学