用于增强植物中的线虫抗性的组合物和方法

用于增强植物中的线虫抗性的组合物和方法
【专利摘要】本发明涉及用于在植物或其部分中增强对线虫植物有害生物的抗性或耐受性的方法和组合物。提供了当在植物中表达时赋予对线虫植物有害生物的抗性或耐受性的核苷酸序列、以及包含由这些核苷酸序列编码的多肽的组合物、以及包含这些核苷酸序列的转基因植物及其部分。
【专利说明】用于增强植物中的线虫抗性的组合物和方法
[0001] 关于序列表的电子提交的声明
[0002] 提供ASCII文本格式的序列表作为纸质副本的替代，该序列表是根据37C. F. R. § 1. 821 提交的，名称为 9207-58W0_ST25. txt，大小为 3, 013, 855 字节，于 2012 年 11 月14日生成并经EFS-Web提交。这个序列表在此通过引用以其披露内容结合到本说明书 中。
[0003] 优先权声明
[0004] 本申请要求2011年11月21日提交的美国临时申请号61/562, 060和2012年8 月17日提交的美国临时申请号61/684, 234的权益，每份申请的全部内容通过引用结合在 此。 发明领域
[0005] 本发明涉及用于控制植物中的线虫有害生物的组合物和方法。
[0006] 发明背景
[0007] 线虫是构成动物界中最大且最成功的门之一的细长的对称的蛔虫。很多线虫物种 是独立生存并且以细菌为食的，而其他线虫已进化为植物和动物（包括人）的有害生物或 寄生虫。
[0008] 植物的线虫有害生物是造成每年几十亿美元经济损失的原因。线虫植物有害生物 以超过2, 000种蔬菜、水果、以及观赏植物的茎、芽、叶、以及特别是根为食，在世界范围内 造成估计$1000-1250亿的作物损失。线虫存在于整个美国（US)，但是在南部以及西部的 温暖潮湿地区以及在沙壤土中是一个主要的问题。大多数在经济上有害的植物线虫有害生 物属属于垫刃目（order Tylenchida)的异皮线虫（Heterderidae)科，并且包括胞囊线虫 [异皮线虫属（genera Heterodera)和球胞囊属（genera Globodera)，例如，大豆胞囊线虫 (大豆异皮线虫（Heterodera glycines)，SCN)和马铃薯胞囊线虫（白线虫（G. pallida)和 金线虫（G.rostochiensis)]和根结线虫（root-knot nematode)(根结线虫属）。
[0009] 根结线虫侵染数千种不同的植物物种，包括蔬菜、水果以及行间作物。已知胞 囊线虫侵染烟草、谷物、甜菜、马铃薯、稻、玉米、大豆、以及很多其他作物。甜菜胞囊线虫 (Heterodera schachtii)(BCN)主要攻击甜菜，并且禾谷胞囊线虫（Heterodera avenae) 是谷物的有害生物。玉米胞囊线虫（Heterodera zeae)以玉米为食，并且马铃薯金线虫 (Globodera rostochiensis)和白线虫以马铃薯为食。大豆胞囊线虫（SCN)存在于美国每 个产大豆的州，并且每年引起的总大豆产量损失估计将近$10亿。一旦SCN存在于大田里， 便不能使用已知方法可行地根除之。尽管大豆是受SCN攻击的主要经济作物，然而SCN还 攻击总计约50种宿主，包括大田作物、蔬菜、观赏植物、以及杂草。
[0010] 棉花根结线虫（RKN)是一种破坏性线虫，它在棉花植物的根上形成虫瘿。病原 体是南方根结线虫（Meloidogyne incognita(Kofoid and White)Chitwood)，一种可侵 染多种植物物种的线虫。在受侵染的植物中营养物和水摄取有所减少，并且植物可易受 病原体的影响，特别是枯萎病。因此，被RKN侵染的植物的产量有所减少。仅在美国， 在2004年，估计有10. 93 %的棉花产量损失是归因于RKN(布拉辛格姆（Blasingame) 和帕特尔（Patel)，美国产棉区大会会议记录（Proceedings of the Beltwide Cotton Conferences) 1:259-262 (2005)。RKN广泛分布于整个美国产棉区。减轻RKN损害的方法包 括将棉花作物与不易受影响的作物进行轮作并且施用昂贵的杀线虫剂。然而，对于棉花种 植者来说减少由于RKN所致的产量损失和作物损害的最有效方式是种植RKN抗性的棉花栽 培品种。
[0011] 线虫损害的迹象包括叶的发育不良和黄化，以及在炎热时节植物的萎蔫。然而，线 虫（包括SCN)可能导致严重的产量损失，同时没有明显的地上症状。例如，SCN对植物的 侵染可能导致矮化的或发育不良的根、根上的固氮根瘤的数目减少，和/或使根更易受其 他土传植物有害生物或病原体的攻击。
[0012] 与很多病毒和细菌病原体相比，关于线虫-植物相互作用的分子基础知之甚少， 这限制了适用于控制线虫的可用方法。适用于控制线虫植物有害生物的化学剂包括现存最 老的杀线虫剂类别有机磷酸酯和氨基甲酸酯，它们靶向乙酰胆碱酯酶。咪唑衍生物如苯并 咪唑通过结合微管蛋白发挥它们的杀线虫作用。左旋咪唑用作烟碱乙酰胆碱受体的激动 齐IJ，并且阿维菌素用作谷氨酸门控的氯离子通道的不可逆性激动剂。不幸的是，存在某些弱 化的线虫侵染，这些线虫侵染难以（如果有可能的话）用现有的控制措施来根除。此外，现 有可用的线虫控制剂在功效、成本以及环境安全方面具有缺点。例如，在美国用于在很多高 投入、高价值的作物中控制线虫的有效播前土壤熏蒸剂甲基溴由于环境和人的健康问题而 被逐步淘汰。然而，因为甲基溴已提供用于线虫控制的投资的可靠回报，所以如果不鉴别替 代物，则可能对很多高价值作物的种植者产生负面影响。此外，环境问题，主要为地下水污 染、臭氧消耗、以及食物中的杀有害生物剂残留，已促使美国环境保护署从市场上去除涕灭 威、DGBCP、以及其他毒性杀线虫剂。已使用物理控制措施（如日晒和热水处理）、生物控制 措施（例如，作物轮作）、以及综合手段来减轻由植物线虫有害生物引起的损害，但单一方 法或措施的组合不是一致有效的。
[0013] 线虫抗性种质和转基因植物也被认为是化学控制措施的替代或补充。例如，表 达蛋白酶抑制剂的转基因植物显示针对胞囊线虫和根结线虫的一定抗性（厄温（Urwin) 等人，1997.植物杂志（Plant J. ) 12:455-461)。这类替代控制措施的使用需要更多线 虫-植物相互作用的知识，以实现满意的结果。若干研究已生成基因表达数据，表明很多 宿主植物基因响应于线虫侵入而向上或向下调节（萨卡希奇（Szakasits)等人，2009. 植物杂志57:771-784 ;帕特霍夫（Puthoff)等人，2003.植物杂志33:911-921 ;贝特克 (Bethke)等人，2009.美国科学院院刊（Proc. Natl. AcacL Sci. ) 106:8067-8072 ;史蒂潘 诺娃（St印anova)等人，2007.植物细胞杂志（Plant Cell) 19:2169-2185;以及基利恩 (Kilian)等人，2007.植物杂志50:347-363)。然而，这些研究未能帮助技术人员预测，（如 果有的话）这类基因能否成功地用于控制线虫，尤其是用于在转基因植物中部署的嵌合基 因构建体。
[0014] 因此，本发明通过提供包含重组核酸分子和它们所编码的多肽的组合物和方法用 于控制植物中的线虫有害生物侵染来克服本领域中的缺点。
[0015] 发明概述
[0016] 以上所列出的需要是通过本发明来满足的，在多个实施例中，本发明提供了控制 经济上重要的线虫有害生物的新组合物和方法。具体地说，发现表达本发明的至少一种重 组核酸分子（其调节本发明的蛋白质的表达）的转基因植物和/或植物部分减小了线虫 有害生物存活、生长以及繁殖的能力或者限制了对这些转基因植物的线虫相关的损害或损 失。本发明还涉及在转基因植物中过度表达或者具有减少表达的本发明的蛋白质的转基因 线虫抗性植物并且涉及单独使用该转基因植物或与其他线虫控制措施组合使用而在减小 的环境影响下赋予最大的线虫控制效率的方法。具有过度表达或受抑制（例如，与对照相 t匕，减少的数量和/或降低的活性等）的本发明的蛋白质的转基因植物和植物部分具有对 线虫有害生物侵染更大的耐受性或抗性。例如，可以通过转基因大豆植物控制经济上重要 的线虫有害生物大豆胞囊线虫（大豆异皮线虫），这些转基因大豆植物过度表达本发明的 一种蛋白质或者包含减少本发明的蛋白质的表达的本发明的一种核酸分子。
[0017] 在本发明的一个方面，提供了一种控制线虫植物有害生物的方法，该方法包 括使该线虫有害生物与一种转基因植物或其部分接触，将调节一种或多种具有SEQ ID N0:29-42、SEQIDN0:135-209、SEQIDN0:243-260、SEQIDN0:665-1046、或其任意组合的 氨基酸序列的多肽的表达的重组核酸分子并入到其基因组中，从而控制该线虫植物有害生 物。在本发明的另一方面，该重组核酸分子能够产生一种包含反义链和有义链的双链RNA， 其中该反义链与编码一种或多种多肽的核苷酸序列的一部分互补，该部分包含与SEQ ID NO: 1-28、SEQ ID NO: 43-134、SEQ ID NO: 210-242、SEQ ID NO: 261-664、或其任意组合的核 苷酸序列中的任一个具有实质上一致性的约18个至约25个连续核苷酸，基本上由其组成， 由其组成。
[0018] 在本发明的又一方面，提供了一种重组核酸分子，该核酸分子包含可操作地连接 至在植物或植物细胞中起作用的启动子上的一种核苷酸序列，其中该核苷酸序列是：(a) SEQ ID N0:1-28、SEQ ID N0:43-134、SEQ ID N0:210-242、SEQ ID N0:261-664 中任一 项的一种核苷酸序列；(b)编码一种包含 SEQ ID N0:29-42、SEQ ID NO: 135-209、SEQ ID NO: 243_260、SEQ ID NO:665-1046中任一项的氨基酸序列的多肽的一种核苷酸序列；（c)与 以上（a)和（b)的核苷酸序列具有至少70%序列一致性的一种核苷酸序列；(d)在严格杂 交条件下退火至（a)、（b)或（c)的核苷酸序列的一种核苷酸序列；(e)由于遗传密码的简 并性而不同于以上（a)、（b)、（c)或（d)的核苷酸序列的一种核苷酸序列；或者（f) (a)至 (e)的核苷酸序列的任意组合。
[0019] 在本发明的另一方面，提供了一种多肽，该多肽包含SEQ ID N0:29-42、SEQ ID N0:135-209、SEQ ID N0:243-260、SEQ ID N0:665-1046、或其任意组合中任一项的氨基酸序 列，基本上由其组成，或由其组成。
[0020] 在本发明的又一方面，提供了一种产生转基因植物细胞的方法，该方法包括将一 种重组核酸分子引入到植物细胞中，该重组核酸分子包含可操作地连接至在植物或植物 细胞中起作用的启动子上的一种核苷酸序列，其中该核苷酸序列是：（a)SEQ ID N0:1-28、 SEQ ID N0:43-134、SEQ ID N0:210-242、SEQ ID N0:261-644 中任一项的一种核苷酸序 列；（b)编码一种包含 SEQ ID NO:29-42、SEQ ID NO: 135-209、SEQ ID NO:243-260、SEQ ID N0:665-1046的氨基酸序列中任一项的氨基酸序列的多肽的一种核苷酸序列；（c)与以上 (a)和（b)的核苷酸序列具有至少70%序列一致性的一种核苷酸序列；(d)在严格杂交条 件下退火至（a)、（b)或（c)的核苷酸序列的一种核苷酸序列；(e)由于遗传密码的简并性 而不同于以上（a)、（b)、（c)或（d)的核苷酸序列的一种核苷酸序列；或者（f) (a)至（e)的 核苷酸序列的任意组合，从而产生可以再生一种对线虫植物有害生物具有增强的抗性的植 物的一种转基因植物细胞。
[0021] 本发明的又一方面提供了一种产生对由线虫植物有害生物的侵染具有增强的抗 性的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：(a)使本发明的转基因植物与其自身或另一 种植物杂交以产生包含本发明的核酸分子或本发明的载体的种子；(b)从所述种子生长后 代植物以产生一种对于由线虫植物有害生物的侵染具有增强的抗性的植物。
[0022] 在本发明的另外的方面，提供了包含一种核酸分子的转基因植物细胞、转基因植 物以及其部分，该核酸分子包含本发明的核苷酸序列中的一种或多种；并且提供了使用它 们来控制、抑制、和/或降低线虫植物有害生物的侵染性的方法。进一步提供了本发明的多 肽以及使用这些多肽来控制、抑制、和/或降低线虫植物有害生物的侵染性、侵染性和/或 胞囊发育的方法，该方法包括使线虫植物有害生物与有效量的一种或多种多肽接触。在一 些实施例中，使该线虫植物有害生物与有效量的一种多肽接触包括使该线虫植物有害生物 与一种包含本发明的核酸分子的转基因植物接触。
[0023] 本发明另外提供一种作物，该作物包括在农田中栽种在一起的多个本发明的转基 因植物。在一些方面，本发明提供了一种提高与线虫植物有害生物接触的植物作物的产量 的方法，该方法包括栽培包含本发明的核酸分子的多个植物作为植物作物，其中所述植物 作物的该多个植物对线虫侵染具有增强的抗性，从而提高所述植物作物的产量。
[0024] 本发明进一步提供一种提高与线虫植物有害生物接触的作物中的产量的方法，该 方法包括使该线虫植物有害生物与有效量的本发明的多肽或本发明的杀线虫组合物接触， 其中该作物的产量有所提高。
[0025] 在下文本发明的描述中更详细地阐述本发明的这些方面和其他方面。
[0026] 附图简要说明
[0027] 图1是适用于用本发明的重组核酸分子转化植物和/或植物细胞的一个二元载 体。
[0028] 图2是适用作植物和/或植物细胞转化实验中的阴性对照的一个空载体。
[0029] 图3是适用于用本发明的重组核酸分子转化植物和/或植物细胞的一个二元载 体。
[0030] 图4是适用作植物和/或植物细胞转化实验中的阴性对照的一个空载体。
[0031] 图5是包含可以用于表达本发明的分离的多核苷酸序列的At6669启动子和⑶S 内含子的修饰的PGI二元质粒（PQYN6669)的示意图。RB-T-DNA右边界；LB-T-DNA左边界； MCS-多克隆位点；RE-任何限制酶；NOS pro =胭脂碱合酶启动子；NPT-II =新霉素磷酸转 移酶基因 ；NOS ter =胭脂碱合酶终止子；聚-A信号（聚腺苷酸化信号）；⑶S内含子-GUS 报道基因（编码序列和内含子）。在一些实施例中，将本发明的分离的多核苷酸序列克隆到 该载体中，同时置换GUS内含子报道基因。
[0032] 图6是包含用于表达本发明的分离的多核苷酸序列的At6669启动子的修饰的pGI 二元质粒（pQFN或pQFNc)的示意图。RB-T-DNA右边界；LB-T-DNA左边界；MCS-多克隆位 点；RE-任何限制酶；NOS pro =胭脂碱合酶启动子；NPT-II =新霉素磷酸转移酶基因；N0S ter =胭脂碱合酶终止子；聚-A信号（聚腺苷酸化信号）；GUS内含子-GUS报道基因（编 码序列和内含子）。在一些实施例中，将本发明的分离的多核苷酸序列克隆到该载体的MCS 中。
[0033] 图7是pQXNc质粒的示意图，该质粒是用于表达本发明的一些实施例的分离的多 核苷酸序列的修饰的PGI二元质粒。RB-T-DNA右边界；LB-T-DNA左边界；NOS pro =胭脂 碱合酶启动子；NPT-II=新霉素磷酸转移酶基因 ；NOS ter=胭脂碱合酶终止子；RE=任何 限制酶；聚-A信号（聚腺苷酸化信号）；35S-35S启动子。在一些实施例中，将该分离的多 核苷酸序列克隆到该载体的MCS(多克隆位点）中。
[0034] 在序列表中的序列的简要说明
[0035] SEQ ID N0:1-14是包含非翻译区和编码区的本发明的核苷酸序列。
[0036] SEQ ID N0:15-28是编码SEQ ID NO :29-42的氨基酸序列的本发明的编码序列。
[0037] SEQ ID N0:29-42是当在转基因植物中过度表达或受抑制时赋予对线虫的耐受性 或抗性的本发明的蛋白质的氨基酸序列。
[0038] SEQ ID N0:43-134是编码SEQ ID N0:29-42、135-209的氨基酸序列的核苷酸序 列。
[0039] SEQ ID N0:135-209 是 SEQ ID N0:29-42 的同源物的氨基酸序列。
[0040] SEQ ID N0:210-223是包含非翻译区和编码区的本发明的核苷酸序列。
[0041] SEQ ID NO :224-242是编码SEQ ID NO :243-260的氨基酸序列的本发明的编码序 列。
[0042] SEQ ID N0:243-260是当在转基因植物中过度表达或者数量或活性减小时赋予对 线虫的耐受性或抗性的本发明的蛋白质的氨基酸序列。
[0043] SEQ ID N0:261-664是编码SEQ ID N0:210-242的同源物的本发明的核苷酸序列。
[0044] SEQ ID N0:665-1046是当在转基因植物中过度表达或者数量或活性减小时赋予 对线虫的耐受性或抗性的本发明的蛋白质的氨基酸序列。
[0045] 发明详细说明
[0046] 本说明不意在是一个本发明以其而实施的所有不同方式，或可以加入本发明中的 所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例所说明的特征可以结合入其他实施例中，并且 关于一个具体实施例所说明的特征可以从那个实施例删除。因此，本发明考虑了，在本发明 的一些实施例中，可以排除或省略在此陈述的任何特征或特征的组合。另外，鉴于本披露 内容，对在此建议的不同实施例的众多变体以及附加对于本领域内的普通技术人员是明显 的，这不脱离本发明。因此，以下说明旨在阐明本发明的一些具体实施例，并不旨在完全列 举出其所有排列、组合以及变型。
[0047] 除非另外定义，否则所有在此使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普 通技术人员通常所理解的相同的意思。在本发明的在此说明中使用的术语是仅出于描述具 体实施例的目的，且并不旨在限制本发明。
[0048] 在本说明书中提到的所有公开文件和专利申请对于本发明所涉及的领域的技术 人员的技术水平是指示性的。此外，公开、专利申请、专利、以及其他在此提到的参考文献通 过引用以其全部内容结合在此。
[0049] 如在本发明的实施例的说明和所附权利要求中所使用的，单数形式"一个（a) "、 "一种（an)"和"该（the)"旨在也包括复数形式，除非上下文清楚地另外指明。
[0050] 如在此使用的，"和/或"是指并且涵盖相关列出项目中的一个或多个的任何和所 有可能的组合。
[0051] 如在此使用的术语"约"当是指一个可测量的值如化合物的量、剂量、时间、温度等 时意在涵盖20%、10%、5%、1%、0. 5%、或甚至0. 1 %的指定量的变化。
[0052] 术语"包含（comprise) "、"包含了（comprises) " 和 / 或"包含的（comprising) " 当用于本说明书中时指示所说明的特征、整数、步骤、操作、要素、和/或组分的存在，但并 不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、要素、组分、和/或其组的存在或添加。
[0053] 如在此使用的，连接词"基本上由...组成"（以及语法变体）意指，权利要求书 的范围有待被解读为涵盖权利要求书中所列举的指定材料或步骤以及不实质上改变所要 求的发明的一个或多个基本和新颖特征的那些。因此，在本发明的权利要求中使用时，术语 "基本上由...组成"不旨在被解读为等同于"包含"。
[0054] 本发明部分是针对以下发现：通过在植物中过度表达或减少表达至少一种在此所 述的多肽来调节表达可以产生对线虫有害生物具有增强的抗性的植物。在本发明的上下文 中术语"进行调节（modulating)"或"调节（modulates)"意指通过过度表达一种蛋白质或 减少该蛋白质表达而改变本发明的该蛋白质的表达。
[0055] 因此，在一个实施例中，本发明涵盖了一种控制线虫植物有害生物的方法，该方法 包括使该线虫有害生物与一种转基因植物或其部分接触，将调节一种或多种具有SEQ ID NO:29-42、SEQ ID NO: 135-209、SEQ ID NO:243-260、SEQ ID NO:665-1046、或其任意组合 的氨基酸序列中任一项的多肽的表达的一种重组核酸分子并入到其基因组中，从而控制该 线虫植物有害生物。在另一个实施例中，该重组核酸分子包含可操作地连接至在植物或植 物细胞中起作用的启动子上的一个核苷酸序列，其中该核苷酸序列包含以下、基本上由以 下组成、或由以下组成：（a) SEQ ID N0:1-28、SEQ ID N0:43-134、SEQ ID N0:210-242、SEQ ID NO: 261-644中任一项的一种核苷酸序列；（b)编码一种包含SEQ ID NO: 29-42、SEQ ID N0:135-209、SEQ ID N0:243-260、SEQ ID N0:665-1046 中任一项的氨基酸序列的多肽的 一种核苷酸序列；（c)与（a)或（b)的核苷酸序列具有至少70%序列一致性的一种核苷酸 序列；(d)在严格杂交条件下退火至（a)、（b)或（c)的核苷酸序列的一种核苷酸序列、或 其一个互补序列；（e)由于遗传密码的简并性而不同于以上（a)、（b)、（c)或（d)的核苷酸 序列的一种核苷酸序列；以及（f) (a)至（e)的核苷酸序列的任意组合。在更具体的实施 例中，该核苷酸序列可包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：（a)SEQ ID N0:15、17、 20、22、23、24、26、226、227、228、230、232、233 中任一项的一种核苷酸序列；（b)编码一种包 含 SEQ ID N0:29-38、40-42、52、243、244、245、246、248-252、254、256-259 中任一项的氨基 酸序列的多肽的一种核苷酸序列；(c)与（a)或（b)的核苷酸序列具有至少70%序列一致 性的一种核苷酸序列；（d)在严格杂交条件下退火至（a)、（b)或（c)的核苷酸序列的一种 核苷酸序列、或其一个互补序列；（e)由于遗传密码的简并性而不同于以上（a)、（b)、（c)或 (d)的核苷酸序列的一种核苷酸序列；以及（f) (a)至（e)的核苷酸序列的任意组合。在 另外的实施例中，该核苷酸序列可包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：(a)SEQ ID N0:56-63、66-127、389-401、408-633、637-642 中任一项的一种核苷酸序列；（b)编码一种 包含 SEQ ID N0:56-63、66-127、389-401、408-633、637-642 中任一项的氨基酸序列的多肽 的一种核苷酸序列；（c)与（a)或（b)的核苷酸序列具有至少70%序列一致性的一种核苷 酸序列；（d)在严格杂交条件下退火至（a)、(b)或（c)的核苷酸序列的一种核苷酸序列、或 其一个互补序列；（e)由于遗传密码的简并性而不同于以上（a)、（b)、（c)或（d)的核苷酸 序列的一种核苷酸序列；以及（f) (a)至（e)的核苷酸序列的任意组合。
[0056] 在又一个实施例中，该重组核酸分子能够产生一种包含反义链和有义链的双链 RNA，其中该反义链与编码一种或多种多肽的核苷酸序列的一部分互补，该部分包含与SEQ ID N0:1-28、SEQ ID N0:43-134、SEQ ID N0:210-242、SEQ ID N0:261-644、或其任意组合 的核苷酸序列中的任一个具有实质上一致性的约18个至约25个连续核苷酸（例如，约18、 19、20、21、22、23、24、或25个连续核苷酸），基本上由其组成，由其组成。在又一个实施例 中，该重组核酸分子通过引起本发明的一种或多种多肽在转基因植物中的过度表达来调节 该一种或多种多肽（例如，SEQ ID N0:29-42、SEQ ID N0:135-209、SEQ ID N0:243-260、SEQ ID NO:665-1046)的表达。在另一个实施例中，该重组核酸分子通过引起本发明的一种或多 种多肽在转基因植物中的表达减少或减少其表达来调节该一种或多种多肽（例如，SEQ ID NO: 29-42、SEQ ID NO: 135-209、SEQ ID NO: 243-260、SEQ ID NO:665-1046)的表达。
[0057] 在另一个实施例中，本发明的转基因植物或植物部分是转基因大豆植物、转基因 甜菜植物、转基因玉米植物、转基因棉花植物、转基因卡罗拉（canola)植物、转基因小麦植 物、转基因甘蔗植物、或转基因稻植物、或其部分。
[0058] 在又一个实施例中，线虫有害生物是选自下组，该组由以下各项组成：胞囊线 虫（异皮线虫属物种（Heterodera spp·))、根结线虫（根结线虫属物种（Meloidogyne spp·))、群矛线虫（纽带线虫属物种（Hoplolaimus spp·))、矮化线虫（矮化线虫属物种 (Tylenchorhynchus spp·))、螺旋线虫（螺旋线虫属物种（Helicotylenchus spp·))、腐 线虫（短体线虫属物种（Pratylenchus spp·))、刺线虫（刺线虫属物种（Belonoluimus spp·))、肾形线虫（肾形肾状线虫（Rotylenchulus reniformis))、穿孔线虫（香蕉穿孔线 虫（Radopholus similis))、环线虫（环线虫属物种（Criconema spp·))、以及其任意组合。 在另一个实施例中，该线虫是一种大豆胞囊线虫或一种甜菜胞囊线虫。
[0059] 在此所述的多肽的过度表达或减少表达可以产生对线虫植物有害生物具有增强 的抗性的植物。因此，在一个方面，本发明提供了一种包含一个或多个（例如，1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15个等）核苷酸序列的重组核酸分子，每个核苷酸序列当在植 物中表达时赋予对线虫植物有害生物的增强的抗性，其中该一个或多个核苷酸序列包含 以下、基本上由以下组成、或由以下组成：（a)SEQ ID N0:1-28、SEQ ID N0:43-134、SEQ ID N0:210-242、SEQ ID N0:261-644中任一项的一种核苷酸序列；（b)编码一种包含SEQ ID N0:29-42、SEQ ID N0:135-209、SEQ ID N0:243-260、SEQ ID N0:665-1046 中任一项的氨 基酸序列、基本上由其组成、或由其组成的多肽的一种核苷酸序列；（c)与以上（a)和（b) 的核苷酸序列具有至少70%序列一致性的一种核苷酸序列；（d)在严格杂交条件下退火至 (a)、（b)或（c)的核苷酸序列的一种核苷酸序列；（e)由于遗传密码的简并性而不同于以 上（a)、（b)、（c)或（d)的核苷酸序列的一种核苷酸序列；或者（f) (a)至（e)的核苷酸序 列的任意组合。在更具体的实施例中，这些核苷酸序列可包含以下、基本上由以下组成、或 由以下组成：（a)SEQ ID N0:15、17、20、22、23、24、26、226、227, 228、230、232、233 中任一项 的一种核苷酸序列；（b)编码一种包含 SEQ ID N0:29、31、34、36-38、40、244-246、250、251 中任一项的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成的多肽的一种核苷酸序列；（c)与以 上（a)和（b)的核苷酸序列具有至少70%序列一致性的一种核苷酸序列；（d)在严格杂交 条件下退火至（a)、（b)或（c)的核苷酸序列的一种核苷酸序列；（e)由于遗传密码的简并 性而不同于以上（a)、（b)、（c)或（d)的核苷酸序列的一种核苷酸序列；或者（f) (a)至（e) 的核苷酸序列的任意组合。在另外的实施例中，这些核苷酸序列可包含以下、基本上由以下 组成、或由以下组成：（a)SEQ ID N0:56-63、66-127、389-401、408-633、637-642 中任一项的 一种核苷酸序列；（b)编码一种包含 SEQ ID N0:56-63、66-127、389-401、408-633、637-642 中任一项的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成的多肽的一种核苷酸序列；（c)与以 上（a)和（b)的核苷酸序列具有至少70%序列一致性的一种核苷酸序列；（d)在严格杂交 条件下退火至（a)、（b)或（c)的核苷酸序列的一种核苷酸序列；（e)由于遗传密码的简并 性而不同于以上（a)、（b)、（c)或（d)的核苷酸序列的一种核苷酸序列；或（f) (a)至（e)的 核苷酸序列的任意组合。
[0060] 在一些实施例中，除了以上所述的核苷酸序列之外，本发明的核酸分子还可以包 含当在植物中表达时在植物中赋予对线虫植物有害生物的增强的抗性的一个或多个核苷 酸序列，该一个或多个核苷酸序列包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：SEQ ID NO: 1-28、SEQ ID NO: 43-134、SEQ ID NO: 210-242、SEQ ID NO: 261-644、或其任意组合中任 一项的核苷酸序列。在一些具体实施例中，本发明的核酸分子可以包含当在植物中表达时 在植物中赋予对线虫植物有害生物的增强的抗性的一个或多个核苷酸序列，该一个或多个 核苷酸序列包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：SEQ ID N0:15、17、20、22、23、24、 26、226、227、228、230、232、233、或其任意组合中任一项的核苷酸序列。
[0061] 因此，在一些实施例中，本发明提供了一种包含一个或多个核苷酸序列的重组核 酸分子，其中该一个或多个核苷酸序列包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：(a) SEQ ID N0:1-28、SEQ ID N0:43-134、SEQ ID N0:210-242、SEQ ID N0:261-644 中任一 项的一种核苷酸序列；(b)编码一种包含 SEQ ID N0:29-42、SEQ ID NO: 135-209、SEQ ID N0:243-260、SEQ ID N0:665-1046中任一项的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成的 多肽的一种核苷酸序列；（c)与以上（a)、（b)的核苷酸序列具有显著序列一致性的一种核 苷酸序列；(d)在严格杂交条件下退火至以上（a)至（c)的核苷酸序列的一种核苷酸序列； (e)由于遗传密码的简并性而不同于以上（a)至（d)的核苷酸序列的一种核苷酸序列；或 者（f) (a)至（e)的核苷酸序列的任意组合。
[0062] 在本发明的一些实施例中，提供了与本发明的核苷酸序列具有显著序列一致性的 多个核苷酸序列。"显著的序列一致性"或"显著的序列相似性"意指与另一个核苷酸序列有 至少约 70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、和/或100%-致性或相似性。因此，在另 外的实施例中，"显著的序列一致性"或"显著的序列相似性"意指与另一个核苷酸序列有 约70%至约100%、约75%至约100%、约80%至约100%、约81 %至约100%、约82%至 约100%、约83%至约100%、约84%至约100%、约85%至约100%、约86%至约100%、 约87%至约100%、约88%至约100%、约89%至约100%、约90%至约100%、约91 %至 约100%、约92%至约100%、约93%至约100%、约94%至约100%、约95%至约100%、约 96%至约100%、约97%至约100%、约98%至约100%、和/或约99%至约100%-致性或 相似性的范围。因此，在一些实施例中，本发明的核苷酸序列是与SEQ ID N0:1-28、SEQ ID N0:43-134、SEQ ID N0:210-242、SEQ ID N0:261-644中任一项的核苷酸序列具有显著序列 一致性的一种核苷酸序列。在一些具体实施例中，本发明的核苷酸序列是与SEQ ID NO: 15、 17、20、22、23、24、26、226、227、228、230、232和/或233中任一项的核苷酸序列具有显著序 列一致性的一种核苷酸序列。
[0063] 在本发明的一些实施例中，可以表达本发明的这些核苷酸序列和/或核酸分子以 产生多种多肽，每种多肽当在植物中产生时造成对线虫植物有害生物的抗性增强。因此，在 本发明的其他方面，提供了一种多肽，该多肽包含SEQ ID N0:29-42、SEQ ID N0:135-209、 SEQ ID N0:243-260、SEQ ID N0:665-1046中任一项的氨基酸序列、基本上由其组成、或由 其组成，其中所述多肽在植物中的产生造成该植物对线虫植物有害生物的抗性增强。
[0064] 本发明的又一方面是一种包含一种或多种本发明的多肽的杀线虫组合物。在一些 实施例中，该组合物包含一种多肽，该多肽包含SEQ ID N0:29-42、SEQ ID N0:135-209、SEQ ID N0:243-260、SEQ ID N0:665-1046、或其任意组合中任一项的氨基酸序列、基本上由其组 成、或由其组成。
[0065] 在一些实施例中，本发明的多肽包含一个氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组 成，该氨基酸序列与 SEQ ID N0:29-42、SEQ ID N0:135-209、SEQ ID N0:243-260、SEQ ID N0:665-1046中任一项的氨基酸序列至少70%-致，例如，至少70%、75%、80%、81%、 82 %,83 %,84 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%、99%、和/或100%-致。
[0066] 可以在用包含本发明的核苷酸序列的核酸分子转化的细胞中产生本发明的多肽 并且从这些细胞中收集这些多肽。因此，可以分离这些多肽并将其作为部分或完全纯化的 全长多肽或者作为其活性变体或片段提供在本发明的一种组合物中，或者可以作为来自产 生所述一种或多种多肽的一个或多个有机体细胞中的细胞提取物或细胞裂解物提供这些 多肽。在任何情况下都不要求完全纯化。该多肽、其变体或片段可以是至少约5%、10%、 15 %,20 %,25 %,30 %,35 %,40 %,45 %,50 %,55 %,60 %,65 %,70 %,75 %,80 %,85 %, 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%纯的（界/^)，或更纯。
[0067] 在一些实施例中，本发明的多肽或核苷酸序列可以是一种保守修饰的变体。如在 此使用的，"保守修饰的变体"是指含有单独取代、缺失或添加的多肽或核苷酸序列，这些取 代、缺失或添加在该序列中改变、添加或缺失一个单个氨基酸或核苷酸或小百分比的氨基 酸或核苷酸，其中该改变导致一个氨基酸被一个化学上相似的氨基酸取代。提供功能上相 似的氨基酸的保守取代表在本领域中是熟知的。
[0068] 如在此使用的，一种多肽的保守修饰的变体是有生物活性的并且因此具有如在此 所述的参考多肽的所希望的活性（例如，赋予对线虫植物有害生物的增强的抗性、减少线 虫植物有害生物的生长、减少线虫胞囊发育）。该变体可以产生于例如遗传多态性或产生 于人工操纵。该参考多肽的一种生物活性变体可以与该参考多肽的氨基酸序列具有至少 约 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、或更大的序列一致性或相似性（例如，约40%至约99%或更 大的序列一致性或相似性以及其中的任何范围），如通过在此的其他地方描述的序列比对 程序和参数所测定的。一种活性变体不同于该参考多肽序列的氨基酸残基可以是尽可能少 的1-15个氨基酸残基，尽可能少的1-10个、如6-10个，尽可能少的5个，尽可能少的4个、 3个、2个、或甚至1个氨基酸残基。
[0069] 天然存在的变体可以存在于一个群体内。此类变体可以通过使用熟知的分子生物 学技术来鉴定，如使用如以下描述的聚合酶链式反应（PCR)以及杂交。合成来源的核苷酸 序列，例如通过定点诱变或PCR-介导的诱变生成的、仍编码本发明的多肽的序列也作为变 体包括在内。可以将一个或多个核苷酸或氨基酸取代、添加、或缺失引入在此所披露的核苷 酸或氨基酸序列中，以使得将这些取代、添加、或缺失引入所编码的蛋白中。这些添加（插 入）或缺失（截短）可以在天然蛋白的N-末端或C-末端进行，或者在该天然蛋白的一个 或多个位点处进行。类似地，一个或多个核苷酸或氨基酸的取代可以在该天然蛋白的一个 或多个位点处进行。
[0070] 例如，保守的氨基酸取代可以在一个或多个预测的、优选是非必需氨基酸残基处 进行。"非必需的"氨基酸残基是一种可以与蛋白质的野生型序列不同但不改变生物活性的 残基，而一种"必需的"氨基酸是生物活性所要求的。"保守的氨基酸取代"是其中用一种具 有相似侧链的氨基酸残基替换该氨基酸残基的取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本 领域内是已知的。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸（例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸）、 具有酸性侧链的氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸）、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸（例 如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、具有非极性侧链的氨 基酸（例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸）、具有 β -分支侧链的氨基酸（例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）、以及具有芳香族侧链的氨基酸 (例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）。此类取代不会针对保守的氨基酸残基、或针对 位于保守基序中的氨基酸残基进行，在这些地方此类残基对于蛋白质活性是必需的。
[0071] 例如，可以通过使编码酶的核苷酸序列突变来制备参考多肽的氨基酸序列变体。 可以在植物中将所得到的突变体进行重组表达，并且利用在此所述的标准测定技术通过测 定针对线虫和植物的活性来筛选保留生物活性的那些。用于诱变与核苷酸序列改变的方法 在本领域中是已知的。参见，例如，孔克尔（Kunkel) (1985)美国科学院院刊82:488-492; 孔克尔等人，（1987)酶学方法（Methods in Enzymol. ) 154:367-382 ;以及分子生物学技 术（Techniques in Molecular Biology)(瓦尔克（Walker)和嘉世宝（Gaastra)编辑， 麦克米兰出版公司（MacMillan Publishing Co. ) 1983)以及其中所引用的参考文献；以 及美国专利号4, 873, 192。清楚的是，在编码该变体的DNA内所进行的突变一定不能破坏 阅读框并且优选地不会生成互补区，这些互补区会产生二级mRNA结构。参见，欧洲专利 申请
【发明者】D·夏利丁, H·卡奇, 黄翔 申请人:先正达参股股份有限公司, 伊沃基因有限公司