抗线虫的转基因植物的制作方法

专利名称：抗线虫的转基因植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过使用抗线虫的转基因植物和种子增强农业生产力，以及制备此类 植物和种子的方法。
背景技术：
线虫是以2000多种行栽作物、蔬菜、水果和观赏植物为食的微小线虫动物，在全 世界引起大约1千亿美元的作物损失。多种寄生线虫物种感染作物植物，包括根癌线虫 (root-knot nematode) (RKN)、胞囊形成线虫(cyst-forming nematode)禾口病变形成线虫 (lesion-forming nematode) 0以在进食位点引起根虫瘿形成为特征的根癌线虫，具有相对 广的宿主范围并因此寄生在多种作物物种上。胞囊形成线虫和病变形成线虫具有较为有限 的宿主范围，但是仍在易感作物中引起相当大的损失。寄生线虫目前遍及整个美国，在南部和西部的温暖、潮湿区域以及在沙质土壤中 发生最为密集。1%4年，首次在美国北卡罗莱纳州发现了大豆胞囊线虫(Soybean cyst nematode) (Heterodera glycines)，其是大豆植物最严重的害虫。一些地区受到大豆胞囊 线虫(SCN)侵染太严重，以至于不采取控制措施，大豆产量将不再是经济上可行的。尽管 大豆是受到SCN攻击的主要经济作物，但是SCN总共寄生大约50种宿主，包括大田作物、蔬 菜、观赏植物和杂草。线虫损害的病征包括在炎热时期叶子的矮化和黄化，以及植物枯萎。然而，线虫感 染可以在没有任何明显的地上疾病症状的情况下引起显著的产量损失。产量降低的主要原 因是由于地下的根损伤。受到SCN感染的根会矮化或者发育不良。线虫感染也可以减少根 上固氮根瘤的数量，并可以使根更易于受到其他土传植物线虫的攻击。线虫的生活史具有三个主要的阶段卵、幼体和成体。线虫物种之间生活史不同。 SCN的生活史类似于其他植物寄生线虫的生活史。在最佳的条件下，SCN的生活史通常可以 在M到30天内完成，然而其他物种可能需要1年或者更长以完成生活史。在春天，当温度 和湿度水平变得有利的时候，在土壤中，虫状的幼体从卵中孵化。只有在幼体发育阶段的线 虫能感染大豆根。在渗透入大豆根后，SCN幼体移动穿过根直到它们接触到维管组织，在那时，它们 停止迁移并开始进食。通过口针，线虫注射修饰某些根细胞的分泌物并将它们转变成专门 的进食位点。根细胞在形态上被转化成作为线虫的营养来源的大型多核合胞体(或者在 RKN的情况下为巨大细胞)。因此，主动进食线虫从植物中盗取基本营养物质，造成了产量 损失。随着雌性线虫进食，它们开始膨大并最终变得太大以至于它们的身体突破了根组织 并暴露于根的表面。在一段时间的进食后，没有如成年雌性膨大的雄性SCN，迁移到根的外面进入土壤 中并使增大的成年雌性受精。然后雄性死亡，而雌性仍依附于根系统并继续进食。在膨大的 雌性内的卵开始发育，最初在体外的团块(mass)或卵囊内，并然后随后在线虫体腔内。最 终，整个成年雌性体腔都充满了卵，且线虫死去。死亡雌性的充满卵的身体称为胞囊。胞囊 最终扩散并在土壤中可随意发现。胞囊的壁变得非常坚硬，为包含在其中的大约200至400个卵提供良好的保护。SCN的卵在胞囊中存活直到合适的孵化条件出现。尽管许多卵可以 在第一年内孵化，但是许多卵也会在保护性胞囊中存活几年。线虫在土壤中以其自身的能力每年仅可以移动几英寸。然而，线虫感染可以以多 种方式传播到相当远的距离。任何移动受感染土壤的东西都能传播感染，包括农业机械、车 辆和工具、风、水、动物和农场工人。土壤的种子大小颗粒常常污染收获的种子。因此，当从 受感染的田地的受污染的种子播种在未受感染的田地的时候，线虫感染可以传播。甚至有 证据表明，某些线虫物种可以通过鸟类传播。这些原因中仅有一些可以预防。用于管理线虫感染的常规方法包括在受线虫感染的土地中保持合适的土壤营养 和土壤PH水平；控制其他植物疾病，以及昆虫和杂草害虫；仅在耕种了未感染田地后使用 卫生实践，如线虫感染田地的耕作、种植和栽培；在受感染的田地作业后，用高压水或者蒸 汽彻底清洁设备；不使用在受感染的土地上生长的种子用于种植未感染的田地，除非种子 已经适当地清洁；轮作受感染的田地并用非宿主作物替换宿主作物；使用杀线虫剂；和种 植抗性植物品种。已经提出了用于植物的基因转化的方法以赋予对植物寄生线虫增加的抗性。例 如，美国专利号5，589，622和5，824，876涉及在受到线虫附着后在植物的进食位点内或者 附近特异表达的植物基因的鉴定。许多方法涉及用能抑制基本线虫基因的双链RNA来转化 植物。其他农业生物技术方法提出过表达编码对线虫有毒性的蛋白质的基因。当受到根瘤菌属的共生土壤细菌感染的时候，豆科植物例如大豆和苜蓿产生了特 化的根瘤。一旦在根瘤内建立，根瘤菌固定大气氮，使其可以为植物所用。由于氮作为植物 营养的基本作用，在根瘤中的氮固定对于农业是重要的。许多植物基因，称为“根瘤蛋白”优 先地表达在根瘤中。根瘤蛋白基因编码多种蛋白质，包括豆血红蛋白、尿酸酶、谷氨酰胺合 成酶、蔗糖合成酶和大量未知功能的其他蛋白质。一类蒺藜苜蓿(Medicago trunculata)根瘤蛋白基因编码富含氨基酸半胱氨酸的 小蛋白质，称为“半胱氨酸簇蛋白质”或者“CCP”。CCP的一种亚类以N末端信号肽；小的、 高电荷的极性成熟肽；以及在成熟肽内形成两个二硫键的4个半胱氨酸残基的特征性排列 为特征。这种CCP亚类通过半胱氨酸残基的数目与其他蒺藜苜蓿(M. trunculata) CCP亚类 区别其他CCP在成熟肽中含有6个、8个或者10个半胱氨酸残基，且在成熟肽中可能形成 多于2个二硫键。除了每一亚类的成员都共有的半胱氨酸的特征性排列外，CCP表现出相 对低水平的氨基酸同一性。含有多于4个半胱氨酸残基的蒺藜苜蓿CCP成熟肽的二硫桥模式与植物防卫素 的二硫桥模式类似，所述植物防卫素是低分子量半胱氨酸富集的抗微生物和抗真菌蛋白 质。植物防卫素包含形成4个结构稳定化二硫桥的8个半胱氨酸。植物防卫素的三维结构 以“半胱氨酸稳定的α β ”或者“CS α β ”基序为特征，所述“半胱氨酸稳定的α β ”或者 "CSa β ”基序为来自昆虫、蝎子、蜜蜂和蜘蛛毒液的毒素所共有。短链毒素例如蝎子毒素与 K+通道或者Cl—通道结合。美国专利号6，121，436 ；6, 316，407和6，916，970公开了蒺藜苜蓿防卫素AFPl和 AFP2。将AFPl基因转化入马铃薯中处于组成型FMV启动子的控制下，得到的转基因植物在 温室中和田间试验中都表现出对真菌大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)增加的抗性。 (Gao等(2000) Nat. Biotechnol. 18，1307)。尽管有这些积极的结果，但是到目前为止还没有商业化的包含编码AFPl防卫素的转基因的转基因马铃薯。美国专利号6，911，577和7，396，980公幵了编码来自稻(Oryza sativa)、玉蜀黍 (Zea mays)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、舌甘菜(Beta vulgaris)、常
(Hedera helix) λ^ΜΜ^ΙΡ^^ (Tulipafosteriana)(Tulipa gesneriana) Λ
苦瓜(Momordica charantia)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、檢胶草(Taraxacum kok-saghyz)、Picramnia pentandra、Amaranthus retroflexux、韭葱(Allium porrum)、瓜 尔豆(Cyamopsis tetragonoloba)、欧洲油菜(Brassica napus)、Vernoniamespilifolia、 灰白银胶菊(Parthenium argentatum)、Licania michauxii、蓖麻(Ricinus communis)、巨 按(Eucalyptus grandis)、葡萄(Vitis yinifera)禾口花生(Arachis hypogaea)的防卫素 的植物基因。公开于美国专利号6，911，577和7，396，980的植物防卫素基因据说赋予了对 寄生虫，包括线虫的抗性。到目前为止，在任何国家中还没有解除了对包含能赋予线虫抗性的转基因的基因 修饰植物的管制。因此，仍然存在使用农业生物技术来鉴定用于控制植物寄生线虫的安全 且有效的组合物和方法的需要。发明概述本发明人已经发现，包含编码含有不多于4个半胱氨酸残基的蒺藜苜蓿CCP成熟 肽的多核苷酸的转基因可以使得大豆植物抗SCN感染。因此，本发明提供了转基因植物和 种子，以及克服或者至少减轻线虫感染有价值的农作物的方法。在一个实施方案中，本发明提供了用包含编码至少一种蒺藜苜蓿基因的分离的多 核苷酸的表达载体转化的转基因植物，所述蒺藜苜蓿基因编码含有不多于4个半胱氨酸残 基的CCP成熟肽。本发明的另一个实施方案提供了通过上述转基因植物产生的种子。该种子对于包 含至少一种编码含有不多于4个半胱氨酸残基的CCP成熟肽的至少一种蒺藜苜蓿基因是纯 合等位基因的，并且一种或多种CCP基因的表达赋予了生长自转基因种子的植物增加的线 虫抗性。本发明的另一个实施方案涉及表达载体，其包含与编码含有不多于4个半胱氨酸 残基的至少一种蒺藜苜蓿CCP成熟肽的多核苷酸有效连接的启动子。优选地，启动子是组 成型启动子。更优选地，启动子能特别地指导在植物根中表达。更优选地，启动子能特别地 指导在受线虫感染的植物的合胞体位点中表达。在另一个实施方案中，本发明提供了产生抗线虫的转基因植物的方法，其中所述 方法包括以下步骤a)用包含与编码含有不多于4个半胱氨酸残基的至少一种蒺藜苜蓿 CCP成熟肽的多核苷酸有效连接的启动子的表达载体转化野生型植物细胞；b)从转化的植 物细胞中再生转基因植物；和c)选择与相同物种的对照植物相比具有增加的线虫抗性的 转基因植物。附图简述

图1显示了分配给对应的基因和启动子的SEQ ID NO的表。图 2 显示了 MtCCPl (SEQ ID NO 2)、MtCCP3 (SEQ ID NO 4)、MtCCP4 (SEQ ID NO 6)、MtCCP5(SEQ ID NO :8)、MtCCP8(SEQID NO 10)、MtCCP2(SEQ ID NO 12)、MtCCP7(SEQ ID NO :14)、MtCCP9(SEQ ID NO :16)和 MtCCP6 (SEQ ID NO :18)的氨基酸比对。比对在 Vector NTI软件套件中进行(空位开放罚分=10，空位延伸罚分=0. 05，空位间隔罚分=8)。
图 3 显示了 MtCCP基因MtCCPl(SEQ ID NO 1)、MtCCP3 (SEQID NO :3)、MtCCP4 (SEQ ID NO :5)、MtCCP5(SEQ ID NO :7)、MtCCP8 (SEQ ID NO :9)、MtCCP2 (SEQ ID NO :11)、 MtCCP7 (SEQID NO 13)、MtCCP9 (SEQ ID NO :15)和 MtCCP6 (SE ID NO :17)之间的总体核苷 酸百分比同一性。使用 Needle of EMBOSS-4. 0. 0 (Needleman，S. B.和 Wunsch，C.D. (1970) J. Mol. Biol. 48,443-453)计算成对比对和百分比同一性。图 4显示了 MtCCP基因MtCCPl (SEQ ID NO :2)、MtCCP3 (SEQID NO :4)、MtCCP4(SEQ ID NO :6)、MtCCP5(SEQ ID NO :8)、MtCCP8 (SEQ ID NO : 10)、MtCCP2 (SEQ ID NO :12)、 MtCCP7 (SEQ ID NO : 14)、MtCCP9 (SEQ ID NO :16)禾口MtCCP6 (SEQ IDNO :18)之间的总体氨基 酸百分比同一性。使用 Needle of EMBOSS-4. 0. 0 (Needleman, S. B.和 Wunsch，C.D. (1970) J. Mol. Biol. 48,443-453)计算成对比对和百分比同一性。优选实施方案详述通过参考以下详细的说明和本文中所包含的实施例可以更容易地理解本发明。在 本申请中，参考了多种出版物。因此，所有这些出版物的公开和在那些出版物中引用的那些 参考文献以其整体都引入本申请中作为参考，以便更充分地说明本发明所属的技术领域。 本文中所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，且并不意为限制。如本文中所用，“个 可以意为一个或者多个，取决于在其中使用它的上下文。因此，例如，提到“一个细胞”可以 指可以使用至少一个细胞。如本文中所用，词语“或者”意为具体列表的任意一个成员且也 包括该列表成员的任意组合。如本文中所定义，“转基因植物”是已经用重组DNA技术改变的植物，以含有否则在 植物中不存在的分离的核酸。如本文中所用，术语“植物”包括整个植物、植物细胞和植物 部分。植物部分包括但不限于，茎、根、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、胼胝体组织、配子体、 孢子体、花粉、小孢子等。本发明的转基因植物可以是雄性不育的或者雄性可育的，并且可 以进一步包括除本文中所述的包含分离的多核苷酸的那些转基因的转基因。如本文中所定义，术语“核酸”和“多核苷酸”是可互换的并指线性的或者分枝的、 单链或者双链的RNA或者DNA或者它们的杂合物。该术语也包括RNA/DNA杂合物。“分离 的”核酸分子是基本上与在该核酸的天然来源中存在的其他核酸分子(如，编码其他多肽的 序列)分离的一种核酸分子。例如，认为克隆的核酸是分离的。如果核酸已经通过人为干 预改变、或者已经将核酸放置于其非天然位点的基因座或位置、或者如果通过转化将它引 入细胞中，那么也认为核酸是分离的。此外，分离的核酸分子，例如cDNA分子，可以没有一 些其天然结合的其他细胞物质、或者当通过重组技术产生时，没有培养基、或者当化学合成 时没有化学前体或其他化学物质。尽管它可以任选地包括位于基因的编码区的3’和5’末 端的非翻译序列，但是它可以优选地除去天然地位于其天然发生的复制子中的编码区侧的 序列。术语“基因”广泛地用于指与生物学功能相关的核酸的任意区段。因此，当在基因 组序列中时，基因包括内含子和外显子，或者当在cDNA和/或它们的表达所必需的调节序 列中时，基因仅包括编码序列。例如，基因指表达mRNA或功能RNA、或者编码特定蛋白质的 核酸片段，并且包括调节序列。术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指连续氨基酸残基的聚合物。术语“有效连接”和“有效地连接”可互换并在本文中用于指分离的多核苷酸在单个核酸片段上连接，使得一个分离的多核苷酸的功能受到另一个分离的多核苷酸影响。例 如，如果两个DNA所处的位置使得调节DNA影响了编码DNA的表达，那么就称调节DNA与表 达RNA或者编码多肽的DNA “有效连接”。术语“启动子”在本文中使用时指当与目的核苷酸序列连接时，DNA序列能控制目 的核苷酸序列转录成mRNA。尽管不是必需的，但启动子一般位于目的核苷酸的5’(例如， 上游)(例如，接近结构基因的转录起始位点)，启动子控制所述目的核苷酸向mRNA的转录， 并且提供了 RNA聚合酶和其他用于起始转录的转录因子的特定结合位点。术语“转录调节元件”在本文中用于指能调节有效连接的多核苷酸的转录的多核 苷酸。它包括但不限于，增强子、内含子、5’ UTR和3，UTR0如本文中所用，术语“载体”指能运输已经与其连接的另一核酸的核酸分子。载体 的一种类型是“质粒”，其指在其中可以连接额外的DNA区段的环状双链DNA环。在本说明 书中，“质粒”和“载体”可以互换地使用，因为质粒是载体最常见的使用形式。载体可以是 双元载体或者包括T-DNA，其包含左边界和右边界并且可以在其间包含目的基因。如本文中 所用，术语“表达载体”与术语“转基因”可互换，并意为能指导特定的核苷酸在合适的宿主 细胞中表达的载体。核苷酸的表达可以是过表达。表达载体包括与目的核酸有效连接的调 节核酸元件，其-任选地-与终止信号和/或其他调节元件有效连接。如本文中所用，术语“同源物”指通过从共同的祖先DNA序列遗传而来的与另一 基因有关的基因。术语“同源物”可以应用于由于物种形成事件而分离的基因之间的关系 (如，直向同源物)或者应用于由于基因复制事件而分开的基因之间的关系(例如，旁系同 源物)。如本文中所用，术语“直向同源物”指来自不同物种的基因，但是通过物种形成从 共同的祖先基因进化。在进化过程中，直向同源物保留了相同的功能。直向同源物编码具 有相同或者类似的功能的蛋白质。如本文中所用，术语“旁系同源物”指通过在基因组内复 制而相关的基因。旁系同源物通常具有不同的功能或者新的功能，但是这些功能可能是相 关的。如本文中所用，术语“保守区域”或者“保守结构域”指在异源多核苷酸或者多肽 序列中的区域，在所述区域中不同的序列之间存在的相对高度序列同一性。例如，可以使用 Clustal W比对，从多序列比对来鉴定“保守区域”。如本文中所用，术语“细胞”或者“植物细胞”指单个细胞，并且也包括细胞群体。 群体可以是包含一种细胞类型的纯群体。此外，群体可以包含多于一种的细胞类型。本发 明含义中的植物细胞可以是分离的(例如，悬浮培养中的)或者是包含于植物组织、植物器 官或者任一发育阶段的植物中的。如本文中所用，术语“纯合等位基因”指对于特定性状的植物的变种，如果其对于 该性状是基因上纯和的，那么当纯合等位基因变种自花授粉时，在后代中将观察不到性状 的显著量的独立分离。如本文所用，术语“无效分离子(null segregant)”指由于孟德尔分离，转基因植 物的不含有转基因的后代(或者衍生自后代的株系)。如本文中所用，术语“野生型”指在实验意义上没有被遗传修饰或者处理的植物细 胞、种子、植物组分、植物组织、植物器官或者整个植物。
如本文中所用，术语“对照植物”指为了在转基因或者遗传修饰植物中鉴定增强的 表型或者想要的性状而用于与转基因或者遗传修饰的植物比较的植物细胞、外植体、种子、 植物组分、植物组织、植物器官或者整个植物。“对照植物”在某些情况下可以是包含空载体 或者标记基因的转基因植物株系，但是并不含有在待评价的转基因或者遗传修饰的植物中 存在的重组目的多核苷酸。对照植物可以是与待检测的转基因或遗传修饰植物相同株系或 变种的植物，或者它可以是另一株系或者变种，例如已知具有特定表型、特性或者已知基因 型的植物。合适的对照植物将包括用于产生本文中的转基因植物的亲代株系的遗传上未改 变的或者非转基因的植物。如本文中所用，术语“合胞体位点”指线虫感染后在植物根中形成的进食位点。该 位点用作为线虫的营养来源。合胞体是胞囊线虫的进食位点并且巨细胞是根癌线虫的进食 位点。作物植物和对应的寄生线虫列于美国植物疾病索引andex of PlantDiseases in the United Mates)(美国农业部手册号165，1960)；植物寄生线虫物种在北美的分 布(Distribution of Plant-Parasitic NematodeSpecies in North America)(线虫学 家协会，1985)；和美国植物和植物产品上的真菌(Fungi on Plants and Plant Products in the United Mates)(美国植物病理学协会，1989)。例如，本发明靶向的植物寄生 线虫包括但不限于，胞囊线虫和根癌线虫。本发明靶向的具体植物寄生线虫包括但不限 于，大豆异皮线虫、甜菜异皮线虫(Heterodera schachtii)、燕麦异皮线虫(Heterodera avenae)、7jC 稻异皮线虫(Heterodera oryzae)、木豆异皮线虫(Heterodera cajani)、 车轴草异皮线虫(Heterodera trifolii)、马铃薯白线虫(Globodera pallida)、马铃 薯金线虫(G. rostochiensis)或烟草球异皮线虫(Globodera tabacum)、南方根结线 虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(M. arenaria)、北方根结线虫(M. hapla)、 爪哇根结线虫(M. javanica)、纳西根结线虫(M. naasi)、短小根结线虫(M. exigua)、起 绒草茎线虫(Ditylenchus dipsaci)、窄小茎线虫(Ditylenchus angustus)、相似穿孔 线虫(Radopholus similis)、柑橘穿孔线虫(Radopholus citrophilus)、多带螺旋线虫 (Helicotylenchus multicinctus)、口力口口非失豆f本_& (Pratylenchus coffeae), MMJ^M 体线虫(Pratylenchus brachyurus)、伤残短体线虫(Pratylenchusvulnus)、弯曲短体 线虫(Paratylenchus curvitatus)、玉米短体线虫(Paratylenchus zeae)、肾形小盘旋 线虫(Rotylenchulus reniformis)、银莲花拟毛刺线虫(Paratrichodorus anemones)、 较zj、 毛束Il线虫(Paratrichodorus minor) > Paratrichodorus christiei、麦f立|§线虫 (Anguinatritici)、Bidera avenae、小麦根瘦线虫(Subanguina radicicola)、塞氏纽带线 虫(Hoplolaimus seinhorsti)、哥伦比亚纽带线虫(HoplolaimusColumbus)、帽状纽带线 虫(Hoplolaimus galeatus)、半穿刺小垫刃线虫(Tylenchulus semipenetrans)、花生鞘线 ji, (Hemicyc 1 iophora arenaria)、 〒细If刃(Rhadinaphelenchus cocophilus) >/jC 平对朿 1J线虫(Belonolaimus longicaudatus)、原始毛朿Ij线虫(Trichodorus primitivus)、 异常珍珠线虫(Nacobbus aberrans)、贝氏滑刃线虫(Aphelenchoides besseyi)、卡纳 亚拟鞘线虫(Hemicriconemoides kanayaensis)、克莱顿矮化线虫(Tylenchorhynchus claytoni)、美洲剑线虫(Xiphinema americanum)、癌疫坏死线虫(Cacopaurus pestis)、玉 米异皮线虫(Heterodera zeae)、菲利普异皮线虫(Heterodera filipjevi)等。
在一个实施方案中，本发明提供了用包含编码至少一种蒺藜苜蓿基因的分离的多 核苷酸的表达载体转化的抗线虫的转基因植物，所述蒺藜苜蓿基因编码含有不多于4个半 胱氨酸残基的CCP成熟肽。优选地，在本实施方案中，分离的多核苷酸具有如在SEQ ID NO
1、3、5、7、9、11、13、15或者17中所定义的序列。备选地，多核苷酸编码具有如在SEQIDNO
2、4、6、8、10、12、14、16或者18中所定义的序列的多肽。根据本发明，植物可以选自单子叶植物和双子叶植物。植物可以是选自玉米、小 麦、稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱、香蕉和裸麦草的属。植物可以是选自豌豆、苜蓿、大豆、胡萝
卜、芹菜、西红柿、马铃薯、棉花、烟草、胡椒、油籽油菜、甜菜、卷心菜、花椰菜、绿花椰菜、莴 苣和拟南芥(Arabidopsis thaliana)的属。本发明也提供了植物、来自此种植物的种子和部分，以及来自此种植物的后代植 物，包括杂交系和自交系。本发明也提供了植物育种的方法，例如，以制备杂交的可育转基 因植物。该方法包括将包含本发明的特定表达载体的可育转基因植物自交或者与第二植 物，例如一种缺乏该特定的表达载体的植物杂交，以制备包含特定表达载体的杂交可育转 基因植物的种子。然后，将种子种植以获得杂交可育转基因植物。植物可以是单子叶植物。 杂交可育转基因植物可以具有从母代亲本或者从父代亲本遗传而来的特定表达载体。第二 植物可以是近交系植物。杂交可育转基因(植物)可以是杂交的。任一这些杂交可育转基 因植物的种子也包括于本发明中。本发明的转基因植物可以是使用已知的植物育种方法，用类似的转基因植物或者 用缺乏本发明的核酸的转基因植物或者用非转基因植物杂交来制备种子。此外，本发明的 转基因植物可以包含，和/或是与另一种包含一种或者多种核酸的转基因植物杂交，因此 在植物和/或其后代中产生转基因的“堆积”。然后，将种子种植以获得包含本发明核酸的 杂交可育转基因植物。杂交可育转基因植物可以具有从母代亲本或者从父代亲本遗传而来 的特定表达盒。第二植物可以是近交系植物。杂交可育转基因植物可以是杂种。任一这些 杂交可育转基因植物的种子也包括于本发明中。本发明的种子可以收获自可育转基因植物 并用于种植本发明的转化植物的后代，包括包含DNA构建体的杂交植物株系。“基因堆积”也可以通过植物转化来转移两种或多种基因到细胞核中来完成。在转 化期间，可以将多个基因依次或者同时引入到细胞核中。根据本发明，可以堆积多个编码包 含不多于4个半胱氨酸残基的CCP成熟肽的蒺藜苜蓿基因以提供增强的线虫抗性。这些堆 积的组合可以通过任一方法产生，所述方法包括但不限于通过常规方法杂交育种植物或者 通过基因转化。如果通过基因转化堆积性状，那么蒺藜苜蓿基因可以以任一顺序依次或者 同时组合。例如，如果要引入两种基因，那么两种序列可以包含于分开的转化盒中或者在相 同的转化盒上。序列的表达可以通过相同或者不同的启动子驱动。本发明的另一个实施方案涉及包含与本发明的一种或多种多核苷酸有效连接的 启动子的表达载体，其中多核苷酸的表达赋予转基因植物增加的线虫抗性。在一个实施方 案中，转录调节元件是能调节有效连接的多核苷酸组成型表达的启动子。“组成型启动子” 指能表达可读框的启动子或者在植物的所有或者几乎所有发育阶段在所有或者几乎所有 植物组织中其控制的调节元件。组成型启动子包括但不限于，来自植物病毒的35S CaMV 启动子(Franck 等，Cell 21 :285-294,1980), Nos 启动子(An G.等，The Plant Cell 3 225-233，1990)、泛素启动子(Christensen 等，Plant Mol. Biol. 12 :619-632,1992 和 18 581-8，1991)、MAS 启动子(Velten 等，EMBO J. 3 :2723_30，1984)、玉米 H3 组蛋白启动子 (L印etit 等，Mol Gen. Genet 231 :276_85，1992)、ALS启动子(W096/30530) U9S CaMV启动 子(US 5，352，605)、超级启动子(US 5，955，646)、玄参镶嵌病毒启动子(US 6，051，753)、 稻肌动蛋白启动子(US 5，641，876)和核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶(Rubisco)小亚基启 动子(US 4，962，028)。在另一个实施方案中，转录调节元件是调节型启动子。“调节型启动子”指非组成 型而是以时间和/或空间的方式指导基因表达的启动子，并且包括组织特异性和诱导型启 动子二者。不同的启动子可以在不同的组织或者细胞类型中、或者在发育的不同阶段、或者 在应答不同的环境条件时指导基因或者调节元件的表达。“组织特异性启动子”或者“组织优选的启动子”指并不表达于所有的植物细胞中， 而仅仅表达于特定器官(例如叶子或者种子)、特定的组织(例如胚或者子叶)、或者特定 的细胞类型(例如叶实质细胞或者种子贮藏细胞)中的一种或多种细胞类型中的调节型启 动子。这些也包括短期调节，例如在早期或者晚期胚发生时、在果实成熟期间、在发育的种 子或者果实中、在完全分化的叶子中、或者在序列起始的时候的启动子。合适的启动子包括 来自油菜籽的油菜籽蛋白基因启动子(us 5，608，152)、来自蚕豆(Vicia faba)的USP启动 子(Baeumlein等，Mol Gen Genet. 225(3) :459_67，1991)、来自拟南芥的油质蛋白启动子 (W0 98/45461)、来自菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白启动子(US 5，504，200)、来 自芸苔的Bce4启动子(W0 91/13980)或者豆球蛋白B4启动子(LeB4 ；Baeumlein等，Plant Journal, 2 (2) =233-9,1992)以及在单子叶植物如同玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等中赋予种 子特异性表达的启动子。值得注意的合适的启动子是来自大麦的lpt2或者Iptl基因启动 子(W0 95/15389和W095/23230)或者是在WO 99/16890中描述那些(来自大麦醇溶蛋白 基因、稻谷蛋白基因、稻水稻素基因、稻谷醇溶蛋白基因、小麦麦醇溶蛋白基因、小麦谷蛋白 基因、玉米醇溶蛋白基因、燕麦谷蛋白基因、高粱kasirin基因和黑麦裸麦醇溶蛋白基因的 启动子)。适合于在植物根组织优先表达的启动子包括，例如，源自玉米烟酰胺合酶基因的 启动子(US 20030131377)和稻RCC3启动子(US 11/075,113)。用于在植物绿色组织中优 先表达的合适启动子包括来自基因例如玉米醛缩酶基因FDA(US 20040216189)、醛缩酶和 丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK) (Taniguchi 等，Plant Cell Physiol. 41(1) :42-48,2000)的 启动子。“诱导型启动子”指可以通过外部刺激，例如，化学、光、激素、胁迫或者线虫例如线 虫类在一种或者多种细胞类型中打开的那些调节型启动子。如果希望基因表达以时间特异 的方式发生，那么化学诱导型启动子是特别合适的。这类启动子的例子是水杨酸诱导的启 动子(W0 95/19443)、四环素诱导的启动子(feitz等，Plant J. 2 :397_404，1992)、来自核 酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)的小亚基的光诱导启动子和乙醇诱导的启动子(W0 93/21334)。此外，对生物的或者非生物的胁迫条件起反应的合适启动子是例如线虫诱导 的PRPl基因启动子(Ward等，Plant. Mol. Biol. 22 =361-366,1993)、来自西红柿的热诱导 的hsp80启动子(US5187267)、来自马铃薯的冷诱导的α淀粉酶启动子(W0 96/12814), 玉米的干旱诱导的启动子(Busk等，Plant J. 11 :1285_1四5，1997)、来自马铃薯的冷、干 旱和高盐诱导的启动子(Kirch, Plant Mol. Biol. 33 =897-909,1997)或者来自拟南芥的 RD29A 启动子(Yamaguchi-Shinozalei 等，Mol. Gen. Genet. 236 :331-340,1993)、许多冷诱导的启动子例如来自拟南芥的cor 1 fe启动子(Genbank检索号UO1377)、来自大麦的 bltlOl 和 blt4. 8 (Genbank 检索号 AJ310994 和 U63993)、来自小麦的 wcsl20 (Genbank 检索 号AF031235)、来自谷物的mlipl5 (Genbank检索号拟6563)、来自芸苔的bnll5 (Genbank检 索号U01377)和创伤诱导的pinll启动子(欧洲专利号375091)。本发明中特别的应用是合胞体位点优选的、或者线虫进食位点诱导的启动子，包 括但不限于来自在PCT/EP2008/051328中公开的Mtn3样启动子、在PCT/EP2007/051378 中公开的Mtn21样启动子、在PCT/EP2007/064356中公开的过氧化物酶样启动子、在PCT/ EP2007/063761中公开的海藻糖_6_磷酸磷酸酶样启动子和在PCT/EP2008/051329中公开 的At5gl2170样启动子。所有前述的应用在此处引用作为参考。本发明的再一个实施方案涉及产生抗线虫的转基因植物的方法，其中该方法包括 以下步骤a)用包含编码a的多核苷酸的表达载体转化野生型植物；和c)选择增加了线虫 抗性的转基因植物。用于引入多核苷酸到植物基因组中和用于从植物组织或者植物细胞中再生植物 的多种方法在，例如，Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC 出版社，Boca Raton，佛罗里达)，第 6/7 章，第 71-119 页(1993) ；White FF(1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants ;TransgenicPlants,第 1卷，Engineering and Utilization, Kung 禾口 Wu R 编辑，AcademicPress，第 15—38 页 Jenes B 等(1993) Techniques for Gene Transfer ；Transgenic Plants,第 1 卷，Engineering and Utilization, Kung 禾口 R. Wu 编
Academic Press,H 128-143M ；Potrykus(1991)Annu Rev PlantPhysiol Plant Molec Biol 42 :205-225 ；Halford NG, Shewry PR(2000)Br Med Bull 56(1) :62-73 中是已知的。转化方法可以包括直接的和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导 的DNA摄取、脂质体介导的转化(US 4，536，475)、使用基因枪的生物射弹方法(Fromm ME 等，Bio/technology. 8(9) :833_9，1990 ;Gordon-Kamm 等，Plant Cell 2 :603，1990)、电穿 孔、在含DNA的溶液中温育干胚和显微注射。在这些直接转化方法的情况下，使用的质粒不 需要满足任何具体的要求。可以使用简单质粒，例如PUC系列的那些、pBR322、M13mp系列、 PACYC184等。如果要从转化细胞中再生完整的植物，那么额外的选择标记基因优选地定位 在质粒上。直接转化技术等同地适合于双子叶和单子叶植物。 转化也可以通过借助土壤杆菌属(Agrobacterium)的细菌感染(例如EP 0116718)、借助病毒载体的病毒感染(EP 0067553 ；US 4，407, 956 ；WO 95/34668 ；WO 93/03161)或者借助花粉(EP 0270356 ；WO 85/01856 ；US 4, 684,611)来实施。基于土壤杆 菌属的转化技术(特别对于双子叶植物)是本领域熟知的。土壤杆菌属菌株(例如根瘤土壤 杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或者发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes))包 含质粒(Ti或者Ri质粒)和用土壤杆菌属感染后转移到植物中去的T-DNA元件。T-DNA (转 移DNA)整合到植物细胞的基因组中。T-DNA可以定位在Ti或者Ri质粒上或者单独地包 含在所谓的双元载体中。土壤杆菌属介导的转化的方法描述于，例如，Horsch RB等(1985) Science 225 :12 中。土壤杆菌属介导的转化最适合于双子叶植物，但是也已经适应于 单子叶植物。通过土壤杆菌转化植物描述于，例如，White FF, Vectors for GeneTransfer in Higher Plants, Transgenic Plants,第 1 卷，Engineering andUtilization, S. D. Kung 禾口 R.Wu 编辑，Academic Press, 1993,第 15—38 页 Jenes B 等 Techniques for GeneTransfer, Transgenic Plants,第 1 卷，Engineering and Utilization, S. D. Kung 禾口 R. Wu He Academic Press,1993, % 128-143 M ；Potrykus(1991)Annu Rev Plant Physiol Plant MolecBiol 42 :205-225 中。本文中所述的核苷酸可以直接转化到质体基因组中。质体表达相对于核表达基因 利用大量拷贝数的优势以允许高表达水平，在质体表达中，通过同源重组将基因插入到每 一植物细胞中的环状质体基因组的几千个拷贝中。在一个实施方案中，将核苷酸插入到质 体靶向的载体中并转化到想要的植物宿主的质体基因组中。获得了对于含有核苷酸序列的 质体基因组同质的植物，并且其优先地能够高水平表达所述核苷酸。质体转化技术详细描述于例如美国专利号5，451，513,5, 545，817,5, 545，818和 5，877，462 中、WO 95/16783 和 WO 97/32977 中，以及McBride 等(1994)PNAS 91,7301-7305 中。本发明的转基因植物可以用于控制受到植物线虫感染的作物的方法，其包括培养 来自包含表达载体的种子的所述作物的步骤，所述表达载体包含与编码含有不多于4个半 胱氨酸残基的至少一种蒺藜苜蓿CCP成熟肽的多核苷酸有效连接的启动子，其中表达载体 稳定整合在种子的基因组中。本发明通过以下的实施例进行进一步说明，并非以任一方式解释作为对其范围施 加限制。实施例1 从蒺藜苜蓿克隆MtCCP基因和载体构建将蒺藜苜蓿Jemalong A17的种子在温室中萌发并培养。将基因组DNA从这些植 物的苗中分离，并且使用标准的分子生物学技术，将MtCCP基因从该基因组DNA PCR扩增。 将扩增产物连接到TOPO进入载体(Invitrogen，Carlsbad, CA)中。将克隆的MtCCP基因测序并亚克隆到含有来自欧芹的泛素启动子的植物表达载 体(W0 03/102198 ；图1中的p-PcUbi4-2启动子(SEQ ID NO :19))中。转化的选择标记 是来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的乙酰羟酸合酶(AHAS)选择基因的突变形式 (Sathasivan 等，Plant Phys. 97 1044-50，1991)，赋予了对除草剂 ARSENAL(Imazapyr， BASF公司，Mount Olive, NJ)的抗性。AHAS2的表达受到来自欧芹的泛素启动子 (W003/102198) (SEQ ID NO 19)的驱动。表1描述了含有蒺藜苜蓿CCP的构建体，所述蒺 藜苜蓿CCP在其成熟肽中包含不多于4个半胱氨酸残基。表 权利要求
1.用表达载体转化的转基因植物，所述表达载体包含分离的多核苷酸，所述多核苷酸 编码至少一种蒺藜苜蓿(M. trunculata)基因，所述蒺藜苜蓿基因编码含有不多于4个半胱 氨酸残基的CCP成熟肽。
2.权利要求1的转基因植物，其中所述分离的多核苷酸选自a)具有如在SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15或者17中定义的序列的多核苷酸；和b)编码具有如在SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16或者18中定义的序列的多肽的多 核苷酸。
3.权利要求1的植物，其中所述植物选自玉米、大豆、马铃薯、棉花、油籽油菜和小麦。
4.种子，所述种子对于编码至少一种蒺藜苜蓿基因的至少一种多核苷酸是纯合等位基 因的，所述蒺藜苜蓿基因编码含有不多于4个半胱氨酸残基的CCP成熟肽。
5.权利要求1的种子，其中所述分离的多核苷酸选自a)具有如在SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15或者17中定义的序列的多核苷酸；和b)编码具有如在SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16或者18中定义的序列的多肽的多核苷酸。
6.表达载体，其包含与分离的多核苷酸有效连接的启动子，所述分离的多核苷酸编码 至少一种蒺藜苜蓿基因，所述蒺藜苜蓿基因编码含有不多于4个半胱氨酸残基的CCP成熟 肽。
7.权利要求6的表达载体，其中所述多核苷酸选自a)具有如在SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15或者17中定义的序列的多核苷酸；和b)编码具有如在SEQID N0:2、4、6、8、10、12、14、16或者18中定义的序列的多肽的多核苷酸。
8.产生抗线虫的转基因植物的方法，其中所述方法包括以下步骤a)用表达载体转化植物细胞，所述表达载体包含编码至少一种蒺藜苜蓿基因的分离的 多核苷酸，所述蒺藜苜蓿基因编码含有不多于4个半胱氨酸残基的CCP成熟肽；b)从所述转化的植物细胞中再生转基因植物；和c)选择具有增加的线虫抗性的转基因植物。
9.权利要求8的方法，其中所述多核苷酸选自i)具有如在SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15或者17中定义的序列的多核苷酸；和ii)编码具有如在SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16或者18中定义的序列的多肽的多核苷酸。
全文摘要
本发明提供了包含编码蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)半胱氨酸簇蛋白质的多核苷酸的抗线虫的转基因植物和种子，所述蒺藜苜蓿半胱氨酸簇蛋白质在各自的成熟肽中包含不多于4个半胱氨酸残基。本发明也提供了产生具有对大豆胞囊线虫增加的抗性的转基因植物的方法以及用于此类方法中的表达载体。
文档编号C07K14/415GK102124025SQ200980131816
公开日2011年7月13日 申请日期2009年8月24日 优先权日2008年8月27日
发明者D·P·罗哈, S·希尔 申请人:巴斯夫植物科学有限公司