抗真菌和/或抗细菌肽,其制备方法和含有其的组合物的制作方法

专利名称：抗真菌和/或抗细菌肽,其制备方法和含有其的组合物的制作方法
技术领域：
，阐述了许多源于自然的物质，尤其具有抗微生物性质，特别是抗细菌和真菌性质的肽。这类肽可以用于治疗人和植物中的真菌疾病(De Lucca等，1999，Antimicrob.Agents Chemother.43，1-11)。在人类健康中，机会性真菌感染的频率近年来急剧上升。侵袭性真菌病是由在自然界中发现的真菌所致的非常严重的感染，而且在无免疫应答的人群中成为致病原。许多原因可以引起免疫抑制皮质激素治疗，化疗，移植，HIV感染。机会性真菌感染目前在人群中死亡率较高。它们可以由酵母主要是假丝酵母类型，或丝状真菌，主要是曲霉菌类型导致。在免疫抑制患者中，经常观察到由于其毒性所致的抗真菌治疗的失败，例如用两性霉素B治疗，或有抵抗力真菌的攻击，例如白色假丝酵母对氮衍生物的抗性。因此至关重要的是开发衍生自新分子的新抗真菌医药产品。
在大量动物和植物物种中抗微生物肽的产生代表抗感染的免疫防御中的基本机制。特别是昆虫示出非常有效的抗细菌和真菌抗性。这种应答主要归因于快速合成一些家族的广谱抗微生物肽(Bulet等，(1999)Dev.Comp.Immunol.23，329-344)。这种合成是由脓毒性损伤或注射低剂量细菌诱导的(Hoffmal等，(1999)，科学284，1313-1318)。迄今为止，昆虫的抗微生物肽已经从在发育期间经历全变态的昆虫例如双翅目，鳞翅类和鞘翅类昆虫中鉴定出。在这些昆虫中诱导的抗微生物肽中，可以分成以下四组
- 4kDa的阳离子肽，形成两个两亲性α-螺旋。此组特别包括杀菌肽(cecropins)。
- 富含脯氨酸的阳离子肽，大小为2kDa-4kDa之间，其可以是糖基化的，如drosocine，pyrrhocoricine和lebocines，或者非糖基化的，如apidaecines和metalnikowines。
- 一些独立的多肽，分子量为8-27kDa，大部分为阳离子型，并通常富含甘氨酸残基，如attacines，II sarcotoxins，diptericines和coleoptericine。
- 含有分子内二硫键的肽。此组含有昆虫defensines(4kDa，3个二硫键)，drosomycin(4kDa，4个二硫键)和thanatine(2kDa，1个二硫键)。
综上所述，本发明特别涉及具有如下三维结构的肽，其含有一个α-螺旋和一个由三个二硫键连接的反平行β链，也称为CSαβ结构。这些肽具有抗真菌活性，可用于测试人体和动物及植物中的感染。本发明特别涉及日光霉素，其是一种分离自鳞翅目烟芽夜蛾血淋巴的肽。日光霉素的序列和性质见于出版的国际专利申请PCT WO9953053所述。
在以下所示肽序列中，氨基酸是以单字母代码表示的，但它们也可以根据以下命名法通过其三个字母代码表示A Ala 丙氨酸C Cys 半胱氨酸D Asp 天冬氨酸E Glu 谷氨酸F Phe 苯丙氨酸G Gly 甘氨酸H His 组氨酸I Ile 异亮氨酸
K Lys 赖氨酸L Leu 亮氨酸M Met 甲硫氨酸N Asn 天冬酰胺P Pro 脯氨酸Q Gln 谷氨酰胺R Arg 精氨酸S Ser 丝氨酸T Thr 苏氨酸V Val 缬氨酸W Trp 色氨酸Y Tyr Tyrosine日光霉素是一种两亲性肽，具有CSαβ类型三维结构。序列表中SEQ ID NO1所示日光霉素的氨基酸序列如下1 10 20D K L I G S C V W G A V N Y T S D C N G E C K R R G Y K G3040G H C G S F A N V N C W C E T(SEQ ID NO1)本发明人现在从鳞翅目Archeoprepona demophoon的经免疫的幼虫的血淋巴中，分离了一种日光霉素同源物。这个肽称为Ard1，通过测序和质量测定对其加以定性。Ard1的氨基酸序列示于序列表SEQID NO2。1 10 20D K L I G S C V W G A V N Y T SNC N A E C K R R G Y K G30 40G H C G S F A N V N C W C E T(SEQ ID NO2)
Ard1的序列与日光霉素序列的不同之处有两处日光霉素第17位天冬氨酸(Asp)由天冬酰胺(Asn)置换，第20位的甘氨酸(Gly)由丙氨酸(Ala)置换。相应的密码子在日光霉素的表达载体pSEA2中修饰，Ard1肽由酵母S.cerevisiae产生和分泌。
pSEA2是一种携带MFα1启动子和BGL2前序列和MFα1原序列的酵母表达载体，使所述肽在培养基中分泌(Lamberty等，1999，生物化学杂志274，9320-9326)。
在经HPLC纯化后，将Ard1的抗真菌活性(抗白色假丝酵母和抗烟曲霉活性)与日光霉素相对比。Ard1的抗白色假丝酵母活性是日光霉素的4-8倍。Ard1的抗烟曲霉菌活性是日光霉素的2倍。
本发明人分析了日光霉素和Ard1肽的电荷和疏水性。

图1所示疏水性示意图是根据Kyte和Doolittle所述方法产生的(1982，分子生物学杂志157，105-132)。
日光霉素及其同源物Ard1具有由一个更亲水的区域分隔的两个相当疏水的区域。N和C末端区域是相当亲水的。另外，亲水性中心区具有阳性净电荷。图1示出日光霉素序列中氨基酸的电荷。
日光霉素中天冬氨酸在天然同源物Ard1中由天冬酰胺(第17位)置换，增加了所述肽的阳离子(相对于日光霉素为+1)。通过PCR产生的定向诱变或通过克隆合成的片段，在日光霉素及其同源物Ard1中产生增加正电荷和疏水性的其它突变。
在本发明范围内进行的研究因此包括特别是在疏水性带电的区域中产生突变，以增加所述肽的电荷和/或疏水性，而不改变或改良其两亲性，而且以此方式产生与日光霉素相比具有改良的抗真菌和/或抗生素性质的肽。
这个目的通过取代一或多个氨基酸而衍生自SEQ ID NO1所示的日光霉素的肽而达到SEQ ID NO1DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET本发明的肽符合公式(I)，其中X代表一个氨基酸X1X2X3X4X5X6C7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17C18X19X20X21C22X23X24X25X26X27X28X29X30X31C32X33X34X35X36X37X38X39C40X41C42X43X44(I)其中- X1，X17，X21，X43是酸性氨基酸，- X16，X44是小型极性氨基酸，- X19是大型极性氨基酸，- X36是小型或弱疏水性氨基酸，- X38是一种略微疏水的或小型氨基酸，所述取代是- 至少X1，X17，X21，X43之一是碱性或极性、特别是大型极性氨基酸，和/或- 至少氨基酸X16，X44之一是一种碱性氨基酸或大型极性氨基酸，和/或- X19是一种碱性氨基酸，和/或- 至少氨基酸X36，X38之一是一种强疏水性氨基酸，并且其中其它氨基酸(X)具有以下含义- X13，X37，X39代表大型极性氨基酸，- X6，X15，X36代表小型极性氨基酸，- X2，X23，X24，X25，X28，X31代表碱性氨基酸，- X3，X4，X8，X12代表疏水性氨基酸，- X9，X14，X27，X35，X41代表芳香族疏水性氨基酸，- X5，X10，X11，X20，X25，X29，X30，X33代表小型氨基酸，- C7，C18，C22，C32，C40，C42代表半胱氨酸。
因此，在(I)式所示本发明肽中，当
- 所有或部分X1，X17，X21，X43不是碱性或极性尤其是大型极性氨基酸时，其是酸性氨基酸，- 所有或部分X16，X44不是碱性或大型极性氨基酸时，其是小型极性氨基酸，- X19不是一种碱性氨基酸时，其是一种大型极性氨基酸，- X36不是一种强疏水性氨基酸时，其是一种小型或略微疏水性氨基酸，- X38不是一种强疏水性氨基酸时，其是一种略微疏水的或小型氨基酸。
本发明的肽具有日光霉素的CSαβ结构，因为所述取代不涉及半胱氨酸C7，C18，C22，C32，C40，C42。
本发明的肽的一个首先优选小组是其中至少X1，X17，X43之一是一种碱性或极性尤其是大型极性氨基酸，X21是一种能与至少X23，X24和X25之一建立离子键的酸性氨基酸，所述X23，X24和X25是碱性氨基酸。这些键能参与稳定本发明肽的CSαβ结构。
本发明肽的优选第二组是其中至少X36和X38之一是非芳香族强疏水性氨基酸。
本发明肽的优选第三组是是其中X17是天冬酰胺或精氨酸，X43是谷氨酸，及其中- X36是亮氨酸或异亮氨酸，和/或- X19是精氨酸，和/或- X16是精氨酸。
本发明肽的优选第四组是其中X17是天冬氨酸，X43是谷氨酸及其中- X36是亮氨酸或异亮氨酸，和/或- X19是精氨酸，和/或- X16是精氨酸。
本发明肽的优选第五组是其中X43是谷氨酰胺，X17是天冬酰胺，及其中- X36是亮氨酸或异亮氨酸，和/或- X19是精氨酸。
本发明肽的优选第六组是其中X43是谷氨酰胺，X17是天冬氨酸。
本发明肽的优选第七组是其中X43是谷氨酰胺，X17是天冬氨酸，及其中- X1是天冬酰胺，和/或- X36是亮氨酸或异亮氨酸。
给出以下定义- 碱性氨基酸精氨酸，赖氨酸或组氨酸。
- 疏水性氨基酸·非芳香族甲硫氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，亮氨酸和异亮氨酸被理解为强疏水性氨基酸，甲硫氨酸和缬氨酸被理解为略微疏水性氨基酸，·芳香族苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸，这些是强疏水性氨基酸，- 酸性氨基酸天冬氨酸或谷氨酸，- 大型极性氨基酸，谷氨酰胺或天冬酰胺，- 小型极性氨基酸丝氨酸或苏氨酸，- 极性氨基酸小型和大型极性氨基酸，- 小型氨基酸甘氨酸或丙氨酸。
本发明肽可以使用本领域技术人员熟知的方法，通过化学合成或遗传工程制备。
特别产生了3种类型突变- 酸性氨基酸由极性氨基酸置换，如Aspl突变为Asn，Asp17突变为Asn，Glu43突变为Gln，及- 极性、优选大型极性氨基酸由碱性氨基酸置换，如Asn13突变为Arg，Ser16突变为Arg，Asn17突变为Arg(Ard1)，Asn19突变为Arg，Thr44突变为Arg。- 也产生了引起疏水性提高的突变，如Gly10突变为Leu，Ala36突变为Leu或Ile及Val38突变为Ile。本发明的衍生自日光霉素的优选的肽具有以下氨基酸序列HelioDKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETArd1 DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM37NKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM38DKLIGTCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM43DKLIGSCVWGAVNYTTDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM42DKLIGSCVWGAVNYTRDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM44DKLIGSCVWGAVNYTSDCRGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM22DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFINVNCWCETpEM23DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANINCWCETpEM25DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCETpEM24DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFLNINCWCETpEM7 DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCERpEM21DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCOTpEM39NKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCOTpEM61NKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCOTpEM62NKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFINVNCWCOT本发明的衍生自Ard1的优选的肽具有以下氨基酸序列Ard1 DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM40NKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM50DKLIGSCVWGAVNYTRNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCET
pEM56DKLIGSCVWLAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCEIpEM52DKLIGSCVWGAVNYTSRCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM51DKLIGSCVWGAVNYTSNCRAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM32DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFINVNCWCETpEM33DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANINCWCETpEM34DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNINCWCETpEM35DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCETpEM31DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCOTpEM30DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCERpEM46DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCOTpEM47DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFINVNCWCOTpEM48DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCERpEM49DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFINVNCWCERpEM54DKLIGSCVWLAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCETpEM57DKLIGSCVWLAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCQTpEM55DKLIGSCVWLAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCQT本发明还涉及上述肽的功能等价物。这些等价物例如可以是上述肽的片段或修饰物，得自翻译后加工如糖基化，或化学修饰如酰胺化，乙酰化，酰化，与脂质或糖偶联，与核苷酸偶联等。
所述功能等价物还包括本发明的肽，其中一或多个氨基酸是对映异构体，非对映异构体，D构象的天然氨基酸，稀有的氨基酸特别是羟基脯氨酸，甲基赖氨酸，二甲基赖氨酸，和合成的氨基酸特别是鸟氨酸，正亮氨酸，环己丙氨酸和Ω氨基酸。本发明还涵盖了逆转录肽和逆倒位肽(retro-inversopeptide)。
(I)式所示肽在其N或C末端还可以包含一或多个氨基酸，其不干扰(I)式的结构。本发明显然还涵盖了具有三维结构的肽，其含有一个α-螺旋和一个通过三个二硫键连接的反平行β链，如日光霉素。
下表1示出了在日光霉素的第1，6，13，16，19，36，38，43和44位氨基酸进行的突变，及在白色假丝酵母(C.a.)和烟曲霉(A.f.)上测得的肽的抗真菌活性。
表1

+相对于日光霉素的相对活性下表2示出了在Ard1肽的第1，10，16，17，19，36，38，43和44位氨基酸进行的突变，及在白色假丝酵母(C.a.)和烟曲霉(A.f.)上测得的肽的抗真菌活性。表2

+相对于Ard1的相对活性在S.cerevisiae酵母中生产不同的突变体，经HPLC纯化，并将其抗真菌活性(白色假丝酵母和烟曲霉)与日光霉素或Ard1肽相对比。
上表1和表2示出除了Asn 13突变为Arg(pEM45)之外，所有具有增加的阳性电荷的突变体对两种测试真菌的至少一种的活性提高。其它突变体均位于亲水性区域。大部分突变体对白色假丝酵母活性提高(Ser16突变为Arg，Asn17突变为Arg(Ard1)，Asn19突变为Arg，Thr44突变为Arg)。一种单突变体(Glu43突变为Gln)对烟曲霉的活性明显提高。
关于增加疏水性的突变，Ala36突变为Leu(pEM35)提供了对白色假丝酵母和烟曲霉的活性的最大提高。Gly10突变为Leu及Val38突变为Ile对日光霉素和Ard1的抗真菌活性没有明显作用。
疏水性最大程度提高的突变体与电荷增加的突变体相关。因此观测到累加效应。
本发明的主题还涉及上述肽在人体和动物及在植物中预防或治疗真菌和/或细菌感染的用途。本发明的主题因此是一种组合物，尤其是一种抗真菌和/或抗细菌药物组合物，含有前述至少一种肽作为活性成分，有利的是所述肽在所述组合物中与适当的载体结合。
所述载体根据所述组合物用于药物或农业目的的类型而加以选择。
本发明特别涉及这些肽和含有其的组合物在人体和动物体中的药物应用，但还涉及农业应用。本发明的肽可以用于产生对疾病，尤其是真菌和细菌疾病有抗性的植物。这种农业应用的第一个实施方案是将有效量的所述肽或含有其的组合物施加给植物。这种农业应用的第二个实施方案包括用能表达本发明肽的核酸序列转化植物细胞或植物，以赋予植物对疾病的抗性。
在参照附图阅读以下关于Ard1肽及日光霉素和Ard1的类似物的制备，及其抗真菌活性的实施例之后，将而易见本发明的其它优点和特征，其中- 图1示出使用Kyte和Doolittle方法(1982，分子生物学杂志157，105-132)获得的日光霉素肽的疏水性图；- 图2示出日光霉素和Ard1肽在用传播的(disseminated)白色假丝酵母感染的模型中的活性(相对于感染后天数的存活率)；- 图3示出日光霉素和Ard1肽在用传播的白色假丝酵母感染的模型中的活性(相对于感染后天数的发病率)；- 图4示出肽pEM24，pEM30，pEM31和pEM35在用传播的白色假丝酵母感染的模型中的活性(相对于感染后天数的存活率)；- 图5示出肽pEM24，pEM30，pEM31和pEM35在用传播的白色假丝酵母感染的模型中的活性(相对于感染后天数的发病率)；- 图6示出肽pEM31，pEM35，pEM46和pEM51在用传播的白色假丝酵母感染的模型中的活性(相对于感染后天数的存活率)；- 图7示出肽pEM31，pEM35，pEM46和pEM51在用传播的白色假丝酵母感染的模型中的活性(相对于感染后天数的发病率)；- 图8示出肽pEM35在用传播的白色假丝酵母感染的模型中的活性(相对于感染后天数的存活率)；- 图9示出肽pEM35和pEM51在传播的Scedosporium inflatum感染的模型中的活性(相对于感染后天数的存活率)；- 图10示出肽pEM35和pEM51在传播的Scedosporiuminflatum感染的模型中的活性(相对于感染后天数的发病率)；- 图11示出用pEM51肽处理的健康小鼠随着时间的推移的体重变化；- 图12示出用pEM35和pEM51肽处理的健康小鼠随着时间的推移的体重变化；- 图13示出肽pEM35和pEM51抗白色假丝酵母IHEM 8060的真菌动力学。
实施例1从取自经免疫的鳞翅目A.demophoon幼虫的血淋巴中分离Ard11)在A.demophoon的血淋巴中诱导抗真菌物质的生物合成将鳞翅目A.demophoon的4期成熟幼虫用含有革兰氏阳性细菌(M.luteus和s.aureus)，革兰氏阴性细菌(P.aeruginosa)，丝状真菌(烟曲霉)的孢子和酵母(白色假丝酵母)的20μl PBS溶液两次注射免疫接种。所述细菌是从在Luria-Bertani培养基中在37℃培养12小时的培养物中制备的。所述酵母是在Sabouraud培养基中在30℃培养12小时的培养物中制备的。烟曲霉的孢子取自在-90℃冷冻的原液。将以此方式感染的动物在其宿主植物上，在通风环境中保持24小时。在除去血淋巴之前，将幼虫在冰上冷却。
2)制备血浆通过切除腹部楔形域收集血淋巴(约160μl/幼虫，共81个样品)，并置于在冰上冷却的1.5ml聚丙烯微离心管中，管中含有抑酶肽作为蛋白酶抑制剂(终浓度为20μg/ml)及苯硫脲作为黑化抑制剂(终浓度为40μM)。将收集自经免疫幼虫的血淋巴(13ml)在8000rpm在4℃离心1分钟，以除去血细胞。将离心上清在12000rpm离心。将没有血细胞的血淋巴贮存于-80℃直至使用。
3)血浆酸化在快速融化后，将A.demophoon的血浆用含有抑酶肽(20μg/ml终浓度)和苯硫脲(终浓度40μM)的1％(体积/体积)三氟乙酸酸化为pH3。在酸性条件下提取所述肽是在冰水浴中轻轻摇动30分钟进行的。获得的提取物然后在4℃以10000g离心30分钟。
4)肽纯化a)通过固相提取预纯化将等于5ml血淋巴的提取物沉积于2g反相载体中，如可商购的弹药筒形式(Sep-PakTMC18)，水缔合物，用酸化水(0.05％TFA)平衡。将亲水性分子通过用酸化水简单冲洗而除去。所述肽的洗脱液是用在0.05％TFA中制备的60％乙腈溶液制备的。将用60％乙腈洗脱的级分真空干燥以除去乙腈和TFA，然后将其在无菌酸化水(0.05％TFA)中重配，之后进行第一个纯化步骤。
b)在反相层析柱上进行高效液相层析(HPLC)纯化- 步骤1将含有所述肽的级分在Aquapore RP-300 C8制备层析柱(BrownleeTM，220×10mm，300A)上通过反相层析分析，在0.05％TFA中进行乙腈梯度洗脱，从2％至10％洗脱5分钟，然后从10至25％洗脱30分钟，然后从25％至35％洗脱40分钟，然后从35％至60％洗脱50分钟，共持续125分钟，恒定速度为2.5ml/分钟。根据在225nm吸光度变化，手工收集所述级分。将收集的级分真空干燥，用超纯水重配并使用下述试验分析抗真菌活性。
-步骤2将相当于所述肽的在27％乙腈中洗脱的抗真菌级分，在Aquapore RP-300 C8反相分析柱(BrownleeTM，220×4.6mm，300)上分析，使用在0.05％TFA中的的双相线性梯度的乙腈从2％至23％洗脱5分钟，从23％至31％洗脱50分钟，恒定速度为0.8ml/min。根据在225nm吸光度变化，手工收集所述级分。将收集的级分真空干燥，用超纯水重配，并在下述条件下分析其抗真菌活性。
- 步骤3将含有所述肽的抗真菌级分在反相Narrowbore Delta-PakTMHPI C18层析柱(Waters Associates，150×2mm)上纯化为均质，使用在0.05％TFA中的双相线性梯度乙腈，从2％至22％5分钟，从22％至30％50分钟，恒定速度为0.25ml/分钟，控制温度为30℃。根据在225nm的吸光度变化手工收集所述级分。将收集的级分真空干燥，用过滤的超纯水重配，并分析其抗真菌活性。实施例2Ard1肽的结构特点1)通过MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser DesorptionIonization-Time of Flight)质谱仪检测纯度在MALDI-TOF Bruker Biflex质谱仪(Bremen，德国)上以正线性模式检测纯度(见以下第3节)。
2)确定半胱氨酸数目还原和S-吡啶醇化通过还原和S-吡啶醇化对天然肽测定半胱氨酸残基数目。将400pmole的天然肽在含有2mM EDTA和6M盐酸胍的40μl 0.5MTris/HCl pH 7.5缓冲液中，在存在2μl二硫苏糖醇(2.2M)的情况下还原。将反应培养基置于氮气中。在黑暗中温育60分钟后，将2μl新鲜蒸馏的4-乙烯吡啶加入反应物中，在45℃在氮气黑暗温育10分钟。然后将吡啶醇化的肽从反应培养基的组分中分离，通过在反相Aquapore RP-300C8分析柱(BrownleeTM，220×4.6mm，300A)上进行反相层析而分离，在存在0.05％TFA的情况下使用线性梯度的乙腈，从2％-52％进行70分钟。
3)通过MALDI-TOF质谱仪(Matrix Assisted Laser Desorptionionisation-Time of Flight)确定天然肽，S-吡啶醇化的肽和蛋白酶解的片段的质量在MALDI-TOF Bruker Biflex质谱仪(Bremen，德国)上以阳性线性模式进行质量测定。用已知m/z，分别为2199.5Da，3046.4Da和4890.5Da的肽标准混合物校准所述质谱。将分析的不同产物沉积于一薄层α-氰-4-羟肉桂酸晶体中，所述晶体是通过快速蒸发在丙酮中饱和的溶液而获得的。在微真空干燥后，将样品用0.1％的三氟乙酸滴洗，之后置于质谱仪中。
4)通过Edman降解测序对天然肽，S-吡啶醇化的肽及在进行不同蛋白酶解之后获得的各种片段，通过Edman降解进行自动测序，并在AB1473A测序仪(PEApplied Biosystems Division of Perkin Elmer)上检测乙内酰苯硫脲衍生物。
5)蛋白酶解确证C末端区域中的肽序列将200pmole还原的S-吡啶醇化的肽在存在5pmole内切蛋白酶-Lys-C(Acromobacter蛋白酶I，特异性裂解C末端侧的赖氨酸残基(Takara，Otsu))情况下，在厂商推荐的条件下(10mM Tris-HCl，pH 9，存在0.01％Tween 20)温育。在用1％TFA终止反应后，将所述肽片段通过反相HPLC在Narrowbore DeltaPakTMHPIC18型(Waters Associates，150×2mm)层析柱上以线性乙腈梯度分离，以在0.05％TFA中2％-60％梯度进行80分钟，速度为0.2ml/分钟，恒温37℃。将所得片段通过MALDI-TOF质谱仪分析，并将相当于C末端片段的肽通过Edman降解测序。
AGT GTA GTT GAC GGC GC 3′TCA CAT CAA CTG CCG CG 5′)Thr Tyr Asn Val Ala将PCR扩增的片段用限制酶SphI和SacII消化，并克隆入用相同酶消化的pSEA2质粒中，并用碱性磷酸酶处理。将所得质粒pEM2通过限制性分析和测序加以对照。
2)通过pEM2质粒转化酵母菌株S.cerevisiae将酵母菌株TGY48.1(MATα，ura3-Δ5n his，praI，prbl，prcl，cpsl，Reichhart等，1992，Invert.reprod.Dev.21，15-24)用pEM2质粒转化。在补加0.5％酪蛋白氨基酸的0.5％选择性YNBG培养基上选择转化体。
EM255′GATCCACTCGAGTGCTAGCG 3′XhoI NheIEM265′TCGACGCTAGCACTCGAGTG 3′NheI XhoI将通过预杂交寡核苷酸EM119和EM120而产生的一个合成片段BamHI-SalI，克隆入pEG01载体中。将此连接反应物用XhoI消化，以除去未插入合成的EM119/EM120片段的质粒。将所得pEM22质粒通过限制性分析和测序加以对照。使用寡核苷酸对EM127和EM128，通过相同的克隆方法构建pEM24。EM119 5′GA TCC TTC ATT AAC GTT AAC TGT TGG TGT GAA ACC TGA TAG G 3′Ser Phe Ile Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu ThrEM120 5′TC GAC CTA TCA GGT TTC ACA CCA ACA GTT AAC GTT AAT GAA G 3′EM127 5′GA TCC TTC TTG AAC ATT AAC TGT TGG TGT GAA ACC TGA TAG G 3′Ser Phe Leu Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu ThrEM128 5′TC GAC CTA TCA GGT TTC ACA CCA ACA GTT AAT GTT CAA GAA G 3′2)构建载体pEM30，pEM31，pEM34，pEM35，pEM46和pEM48将通过预杂交寡核苷酸EM25和EM26而产生的一个合成的片段(加热至100℃并缓慢降至25℃)克隆入用BamHI和SalI消化的pEM2载体中(置换编码Ard1的Ser34密码子直至终止密码子的3’末端序列)。这种合成的片段BamHI-Sal1含有限制位点XhoI和Nhe1。将所得pEM16载体通过限制性分析和测序加以对照。
将通过预杂交寡核苷酸EM135和EM136而产生的一个合成片段BamHI-SalI克隆入pEM16载体中。将此连接反应物用XhoI消化以除去未插入合成片段EM135/EM136中的质粒。将所得质粒通过限制性分析和测序加以对照。使用相同克隆方法构建pEM31(EM117/EM118)，pEM34(EM127/EM128)，pEM35(EM129/EM130)，pEM46(EM158/EM159)，pEM48(EM162/EMI63)。EM117 5′GA TCC TTC GCT AAC GTT AAC TGT TGG TGT CAA ACC TGA TAG G 3′Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Gln ThrEM118 5′TC GAC CTA TCA GGT TTG ACA CCA ACA GTT AAC GTT AGC GAA G 3′EM129 5′GA TCC TTC TTG AAC GTT AAC TGT TGG TGT GAA ACC TGA TAG G 3′Ser Phe Leu Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu ThrEM130 5′TC GAC CTA TCA GGT TTC ACA CCA ACA GTT AAC GTT CAA GAA G 3′EM135 5′GA TCC TTC GCT AAC GTT AAC TGT TGG TGT GAA AGA TGA TAG G 3′Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu ArgEM136 5′TC GAC CTA TCA TCT TTC ACA CCA ACA GTT AAC GTT AGC GAA G 3′EM158 5′GA TCC TTC TTG AAC GTT AAC TGT TGG TGT CAA ACC TGA TAG G 3′Ser Phe Leu Asn Val Asn Cys Trp Cys Gln ThrEM159 5′TC GAC CTA TCA GGT TTG ACA CCA ACA GTT AAC GTT CAA GAA G 3′EM162 5′GA TCC TTC TTG AAC GTT AAC TGT TGG TGT GAA AGA TGA TAG G 3′Ser Phe Leu Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu ArgEM163 5′TC GAC CTA TCA TCT TTC ACA CCA ACA GTT AAC GTT CAA GAA G 3′3)构建表达载体pEM37从日光霉素pSEA2的表达载体中，使用PCR进行直接诱变，以将Asp1密码子修改为Asn。使用寡核苷酸EM137和EM53通过PCR扩增一个片段，所述片段携带MFα1原序列的末端和编码日光霉素的序列。在寡核苷酸EM137中插入将Asp1密码子变为Asn的突变。
EM53 5′CCTGGCAATTCCTTACCTTCCA 3′HindIIIEM137 5′TTTTTTA AGC TTGGAT AAA AGA AAC AAG TTG ATT GGC AG 3′Ser Leu Asp Lys Arg Asn Lys Leu Ile Gly将经PCR扩增的片段用限制酶HindIII和SalI消化，并与1.2kb的SphI-HindIII片段同时克隆在用SphI和SalI消化和用碱性磷酸酶处理的pTG4812载体(Michaud等，1996，FEBS Lett.，395，6-10)中，所述1.2kb的SphI-HindIII片段携带MFα1启动子，BGL2前序列和MFα1的原序列，直至HindIII位点。将所得pEM37质粒通过限制性分析和测序加以对照。实施例5对日光霉素类似物进行的筛选实验1)培养将通过日光霉素的表达载体及其类似物转化的酵母克隆在选择性培养基(50ml YNBG+0.5％酪蛋白氨基酸)中在29℃搅拌培养72小时。在4℃以4000g离心30分钟后，将上清用乙酸酸化至pH3。
然后将上清沉积于用酸化水(0.05％TFA)平衡的反相360mg载体Sep-PakTM(Waters Associates)上。通过用酸化水简单冲洗除去亲水性分子。将所述肽用在0.05％TFA中制备的60％乙腈溶液洗脱。将在60％乙腈洗脱的级分真空干燥，以除去乙腈和TFA，然后在1ml 0.05％TFA水中重配，之后进行纯化。
2)在反相层析柱上通过高效液相层析(HPLC)纯化根据每种类似物所得的生产水平，将5-20ml预纯化的上清的等价物在Aquapore RP-300 C8半制备柱(BrownleeTM，220×7mm，300A)上通过反相层析分析，在0.05％TFA中以2％-22％乙腈梯度洗脱5分钟，然后22％-40％洗脱30分钟，在22％等度洗脱2分钟，恒定速度为1.4ml/分钟。根据在225nm的吸光度变化，手工收集在27％-38％乙腈洗脱的级分。
3)类似物质量对照将1μl主要级分在用0.05％TFA酸化的水中洗脱2次，并通过MALDI-TOF质谱仪分析。将测定的质量相当于理论质量的级分真空干燥，并通过加入如下所述计算的1体积的超纯水重配。
4)针对活性测试量化所述类似物通过注入5，10，20和25mg日光霉素产生半制备Aquapore RP-300C8层析柱的校准曲线。使用Millenium软件(Waters)对面积和斜率进行综合，计算。随后，使用这个软件通过自动积分相应于所述类似物的层析谱峰计算所述类似物的数量(μg)。联系如此获得的数量，计算蒸发后样品的体积，以将所述肽浓度调节为1μg/μl。
5)抗白色假丝酵母和抗烟曲霉活性测试在96孔微平板中制备的液态培养基中，使用生长抑制试验评定不同类似物的抗白色假丝酵母和抗烟曲霉活性。测试纯化的肽不同稀释度的活性，并与在相同条件下量化的日光霉素和Ard1相对比。
- 抗白色假丝酵母试验在含有15％甘油的Sabouraud培养基中，对得自在-80℃冷冻的原液的酵母直接进行活性测试。将原液中酵母的密度调节为在600nm光密度为0.4OD。在室温缓慢融化后，将酵母悬浮液通过稀释将光密度降低至Sabouraud培养基中在600nm为1mOD，将90μl这种稀释液沉积于10μl测试样品的微量滴定平板的孔中。系统地产生对照样品，其中将10μl样品置换为10μl无菌水。培养基的无菌性通过在存在90μl培养基中温育10μl无菌水而控制。将所述样品在30℃轻轻搅拌温育40小时，并通过测定在600nm的光密度量化抗真菌活性。
- 抗烟曲霉试验烟曲霉的孢子得自在-80℃冷冻的原液，所述原液是在25％甘油溶液中含有107个孢子/ml。在室温缓慢融化后，将孢子置于PDB培养基悬浮液中(12g马铃薯葡糖肉汤培养基/1升脱矿质水)。将10μl每种样品沉积于含有所述孢子(终浓度为1000个孢子/孔)的微量滴定平板孔中，所述孔中存在90μl PDB培养基，补加了四环素(100μg/ml)和头孢噻肟(1μg/ml)。系统地产生对照培养物，其中将10μl样品置换为10μl无菌水。培养基的无菌性通过在90μl培养基中温育10μl无菌水加以控制。将样品在37℃在潮湿环境中温育24-48小时，并通过0-9萌发分值量化抗真菌活性；在双眼显微镜下测定菌丝的大小和形态。最小抑制浓度(MIC)为4。
6)量化对照将用于活性测试的所述肽溶液系统进行量化对照，通过将10μl溶液在HPLC下注入预先用2，5，7.5和10μg日光霉素校准的Narrowbore Delta-PackTMHPI C18层析柱中。当需要解读结果时，重新调整有效沉积于所述孔中的肽的数量。实施例6体内功效1)方法—白色假丝酵母感染的模型测试日光霉素及其类似物在用白色假丝酵母感染的模型中的体内抗真菌活性，所述白色假丝酵母是小鼠致死因子。将致病因子白色假丝酵母(IHEM 8060菌株)通过静脉内途径(i.v.)，以2.5×106CFU/小鼠的剂量接种，在感染后6，24，48，和72小时，通过i.v.途径注射4次给予所述肽。活性的评定标准是在7天评价存活率和发病率。发病率是考虑总的健康状态(毛皮，灵活性，水合等)，针对每只小鼠用0-5范围的分值确定的，解释如下0＝死亡，1＝濒死，2＝严重患病，3＝患病，4＝轻微患病，5＝健康。各个分值的总和是针对每组计算的，一组10只小鼠分值为50表示所有小鼠均是健康的。
2)在念珠菌病感染的模型中对比Ard1和日光霉素的活性根据标准方法，将10只重12g的Swiss OF1雄性小鼠，通过i.v.途径以2.5×106CFU/小鼠剂量感染。在感染后6，24，48和72小时通过i.v.途径注射4次日光霉素和Ard1。针对每种肽，测试两种剂量10mg/kg和30mg/kg。安慰剂组用肽溶剂0.9％NaCl注射。
图2和3分别示出了针对感染后天数的存活率和发病率(10只小鼠)。
在这种非常严重感染的模型中，在感染后4天死亡率为100％，安慰剂组中60％小鼠在感染后头一天死亡。
观测到以10和30mg/kg施用日光霉素对存活率没有明显作用，即使所述曲线始终在安慰剂组的相关曲线之上。在分别用10和30mg/kg日光霉素治疗的小组中，在感染后48小时和60小时出现中值死亡率，在第7天发病率分值为0/50和5/50。
在这些条件下，以30mg/kg剂量施用的Ard1肽使首发死亡延迟24小时。10只小鼠中有5只在第7天仍存活，发病率分值为16/50。使用对数级统计学测试对比存活曲线(Meier-Kaplan)，发现在安慰剂组和用30mg/kg的Ard1处理组之间有明显差别(p＜0.001)。
以10mg/kg剂量施用的Ard1不能改善小鼠的存活率和一般状态，50％的小鼠在感染后2天死亡。
3)在念珠菌病感染的模型中对比Ard1和类似物pEM24，pEM30，pEM31和pEM35的活性图4和5分别示出了针对感染后天数的存活率和发病率分值(10只小鼠)。
在这个实验中，用2.5×106CFU/小鼠接种小鼠，在接受安慰剂治疗组中，在第5天小鼠的死亡率为50％。首发死亡发生在感染后第2.5天，中值发病率发生在感染后第5天。在第7天，5只小鼠存活，发病率分值为15/50。
以10mg/kg剂量施用Ard1，使首发死亡延迟1.5天。在接种后7天，仍有8只小鼠存活。然而存活曲线与安慰剂组没有统计学差别(p＝0.2516)。
以10mg/kg剂量测试的四种肽pEM24(H5)，pEM30(A1)，pEM31(A2)和pEM35(A6)，均比Adr1更具活性关于首发死亡的时间和在第7天存活的小鼠数目，pEM24(H5)治疗组分别为3天和7只小鼠，pEM30(A1)治疗组分别为4天和7只小鼠，pEM31(A2)治疗组分别为5.5天和8只小鼠，pEM35(A6)治疗组分别为7天和9只小鼠。这些肽中的每一种均能在前3天保持小鼠良好的一般状态，在第3天发病率分值在42/50-48/50之间，相比之下接受安慰剂组为22/50。在接受第4次注射后24小时，小鼠的状况衰退。只有用pEM31处理组保持5天的发病率分值高于40/50。
所述存活曲线与安慰剂组存活曲线的统计学对比示出用pEM35治疗组有明显差别，p＝0.041。
所述存活曲线与安慰剂组存活曲线的统计学对比示出用pEM31治疗组在第8天有明显差别，p＝0.0195。
所述肽的相对活性如下pEM31＞pEM35＞pEM30＞pEM24＞Ard1。
4)在念珠菌病感染的模型中以5mg/ml施用的Ard1及类似物pEM31，pEM35，pEM37，pEM46和pEM51的活性对比图6和7分别示出了针对感染后天数的存活率和发病率分值(10只小鼠)。
在这个实验中，用3×106CFU的白色假丝酵母接种体重为15g的Swiss OF1小鼠，在用安慰剂治疗组中在感染后4天产生50％发病率。首发死亡发生在感染后2.5天，100％小鼠在第5.5天死亡。
以5mg/kg剂量注射3次Ard1及pEM31和pEM46的治疗，相对于安慰剂治疗未明显提高小鼠存活率。然而，用pEM45治疗延迟小鼠健康状况的衰退，在感染后3天发病率分值为31/50，相比之下安慰剂组为9/50。
在这种剂量，用pEM51和pEM35治疗使首发死亡延迟1.5天；针对用pEM51和pEM35治疗组，中值发病率分别发生在感染后5天和6天。统计学分析在第7天的存活曲线相对于安慰剂组示出明显差别，针对pEM51治疗组，p＝0.015，针对pEM35治疗组，p＝0.0004。用pEM35治疗的小鼠的一般健康状态好于给予其它治疗的小鼠，发病率分值保持在28/50直至感染后5天，给予pEM51治疗的小鼠为11/50，接受安慰剂的小鼠为1/50。
总而言之，在这种念珠菌病感染的模型中，pEM35的抗真菌活性高于pEM51，它本身高于pEM46活性。在使用的5mg/kg剂量，Ard1和pEM31分子没有效力。
5)在念珠菌病感染的模型中pEM35类似物的活性图8示出了针对感染后天数的存活率(10只小鼠)。在这个实验中，用2.5×106CFU/小鼠接种小鼠，在安慰剂组中在第5天有50％小鼠死亡，在第8天100％小鼠死亡。首发死亡发生在感染后3天。发病率分值迅速低于30/50(在第2.5天为25/50)。
以每次注射10或30mg/kg的剂量给予pEM35肽，每日3次，共4天(在感染当天在第1，5，和10小时注射；在第1，2和3天在第8，14和20小时注射)；也就是说每日剂量共计30或90mg/kg。
就这种给药模式而言，这两种剂量的pEM35均能使首发死亡延迟4.5天。在感染后第8天，在用30和90mg/kg/天的剂量治疗的小鼠中分别观测到80％和90％的存活率。小鼠直至第7天仍保持良好状态，发病率分值保持在40/50以上。在第8天，所述分值降至30/50。在用pEM35治疗组，用低剂量30mg/kg/天和高剂量90mg/kg/天治疗组之间没有明显差别。
pEM35治疗组的存活率曲线与安慰剂组曲线没有统计学差别(针对两种剂量，均是p＜0.001)。
6)方法-Scedosporium inflatum感染的模型将体重为22g的Swiss OF1小鼠通过静脉内(i.v.)途径，用致死剂量的Scedosporium inflatum(FSSP 7908菌株，在37℃在麦芽琼脂培养基琼脂糖上培养7天)感染。感染剂量为7×106个孢子/小鼠，通过外侧尾静脉以100μl体积注射。
使用具有腹膜内插管的ALZET 1003D渗透泵(流速0.97μl/h；体积93μl；灌注时间4天)和1007D泵(流速0.47μl/h；体积100μl；灌注时间8.5天)，连续给予肽pEM35和pEM51。
用以下方式治疗每组8只感染的小鼠a)安慰剂0.9％NaCl，通过具有腹膜内插管(i.p.)的1007D泵给予；b)不治疗；c)通过1007D经i.p.给予pEM51，剂量为30mg/kg，共8天，相当于0.3μg/ml的理论平衡血浆浓度；d)通过1003D经i.p.给予pEM51，剂量为60mg/kg，共4天，相当于0.6μg/ml的理论平衡血浆浓度；e)通过1003D经i.p.给予pEM35，剂量为35mg/kg，共4天，相当于0.35μg/ml的理论平衡血浆浓度为。
7)在scedosporiosis感染的模型中，在持续灌注条件下，类似物pEM35和pEM51的活性图9和10分别示出针对感染后天数的存活率和发病率分值(8只小鼠)。
在这种scedosporiosis侵袭模型中，接种剂量为7×106个Scedosporium inflatum孢子，在感染后7天死亡率为50％。针对对照组(感染的，未治疗的)和安慰剂组(感染的，用Alzet泵给药)，首发死亡分别发生在感染后5天和6天。在对照组中在第11天观测到100％死亡率，在安慰剂组在第20天观测到75％死亡率。小鼠的健康状态在感染后第3天及之后迅速恶化，这两组的发病率分值是在感染后第3天为28/40和34/40，在感染后第7天为6/40和7/40。在感染后第4天发生脑炎迹象。
用pEM51以30mg/kg剂量治疗8天可以使首发死亡延迟9天。在第20天，8只小鼠中有5只仍存活。在感染后第4天及之后发病率分值降低(28/40)，相当于出现脑炎迹象，在感染后第5天直至第14天，稳定在24/40。之后，小鼠的健康状态逐渐恶化，在感染后第20天发病率分值为11/40。此发病率曲线与对照组和安慰剂组相比有统计学差别(logrank∶p＝0.0027)。
在用pEM51以60mg/kg剂量治疗4天之下，首发死亡延迟4天。在感染后第12天，观测到50％死亡率，即相对于对照组和安慰剂组延迟5天。在第20天，8只小鼠中有3只仍存活。从感染后第5天起，发病率分值降低(30/40)，相当于出现脑炎迹象，并逐渐降低，至感染后第14天分值降为6/40。死亡率曲线与对照组和安慰剂组有统计学差别(logrank∶p＝0.0176)。
在用pEM35以35mg/kg剂量治疗4天之下，可以使首发死亡延迟5天。在感染后第15天，观测到50％死亡率，即相对于对照组和安慰剂组延迟8天。在第20天，8只小鼠中有1只仍存活。在感染后第5天，发病率分值降低(28/40)，相当于出现脑炎迹象，并逐渐降低，至感染后第15天分值降为8/40。死亡率曲线与对照组和安慰剂组有统计学差别(logrank∶p＝0.0177)。
在这个模型中，将pEM51以30mg/kg剂量给药8天示出在存活率方面具有非常好的治疗效力。以高剂量(60mg/kg)给药两次，过一段时间用低剂量给药两次，明显降低pEM51效力。然而，在治疗的前4天期间，用30mg/kg剂量治疗组的发病率分值面低于用60mg/kg剂量治疗组。以60mg/kg剂量给药8天因此应进一步改善pEM51的治疗功效。
将pEM35以35mg/kg剂量给药4天示出与将pEM51以60mg/kg剂量给药4天的功效相同。在这个Scedosporiosis模型中，pEM35的治疗活性至少等于pEM51的活性。
8)pEM35和pEM51在小鼠中的急性毒性研究图11和12示出随着时间推移，治疗的健康小鼠体重变化。
在小鼠中进行治疗效力测试期间，将pEM35和pEM51溶解于0.9％NaCl中静脉内给药，注射剂量为30mg/kg，间隔30分钟重复注射，一日3次共3天，未观测到急性毒性反应。
将健康小鼠用30mg/kg pEM51以一日3次剂量治疗3天，其体重变化与用0.9％NaCl注射的小鼠相似。
在体重为17-18g的Swiss OF1雄性小鼠中，通过静脉内途径以200，300和400mg/kg的单一剂量给予pEM35和pEM51，测试其急性毒性反应。将所述肽溶解于0.9％NaCl溶液中；注射体积为150μl，通过外侧尾静脉在45秒内注入。
所有小鼠均示出与平卧相关的血管舒张。根据剂量，小鼠的身体状态在注射后20-40分钟恢复正常。
4天的体重变化曲线示出在注射后当天生长略微延迟，给予200和400mg/kg剂量pEM35和200和300mg/kg剂量pEM51的小鼠为约1g；给予400mg/kg剂量pEM51的小鼠为约2g。然后所有小鼠的体重曲线恢复正常。实施例7Ard1及类似物pEM31，pEM35，pEM46，pEM48和pEM51的抗真菌活性谱1)检测抗丝状真菌活性实验抗真菌活性是在液体培养基中通过生长抑制实验检测的。
将丝状真菌(烟曲霉，A.flavus和A.terreus，由Dr.H.Koenig，Hpital Civil，Strasbourg提供；及S.prolificans和F.solani，由Drs.J.Meis和J.Mouton提供，荷兰Nijmegen大学医学院微生物学系)种植于麦芽琼脂斜面培养琼脂糖上(Biomerieux)，并在37℃温育7天。
然后用含有0.05％Tween 20的10ml YPG培养基收集孢子，并用纱布过滤。将孢子在1700rpm离心10分钟，将残余物收集在YPG中(每升中有1g酵母膏，1g蛋白胨，3g葡萄糖)。
用Coverslide计数上清并调节为104个孢子/ml。
将100μl肽稀释液(浓度为50％，具有0.097μg/ml肽)沉积于微量滴定平板中。然后加入100μl具有104个孢子/ml的丝状真菌，即1000个孢子。
将测试平板在37℃温育48小时。
通过观查孔覆盖率确定最小抑制浓度(MIC)。MIC分值设定为50％孔覆盖率。
2)检测抗酵母活性实验将假丝酵母(C.albicans，C.glabrata，C.dubliensis，C.tropicalis，C.kefyr，C.krusei和C.parapsilosis-由Dr.H.Koenig，Hpital Civil，Strasbourg提供)，fluconazole抗性C.albicans(n°245962，n°2332，n°246335和n°3552，由Drs.J.Meis and J.Mouton提供，荷兰Nijmegen大学医学院，微生物系)，及Cryptoccocus neoformans(由Dr.H.Koenig提供，Hpital Civil，Strasbourg)，种植于Sabouraud-Cloramphenicol琼脂斜面琼脂糖上(Biomerieux)，并在30℃(Candida sp.)温育24小时，在37℃(Cryptoccocus neoformans)温育72小时。
将一些酵母集落置于液态Sabouraud培养基(Biomerieux)中成为悬浮液，以获得终浓度为600nm光密度为0.1，相当于2.5×106酵母/ml。
将酵母悬浮液调节为在Sabouraud培养基中5×103酵母/ml。
将100μl肽稀释液(浓度为50％，具有0.097μg/ml肽)沉积于微量滴定平板中。在加入具有5×103个酵母/ml即500个酵母的100ml酵母悬浮液后，将测试平板在30℃(Candida)缓慢摇动温育24小时，或在37℃(Cryptoccocus)温育72小时。
使用分光光度计—微量滴定平板阅读器，通过测定在600nm的吸光度，确定最小抑制浓度(MIC)。所述MIC分值设定在生长抑制率为50％。
3)检测抗植物病原体Alternaria brassicola和Neurosporacrassa的活性实验将100μl肽稀释液(浓度为，具有0.097mg/ml肽)沉积于微量滴定平板中。
在加入具有104个孢子/ml的A.brassicola和N.crassa(由Dr.Bullet提供，IBMC，Strasbourg)的100μl冷冻孢子后，将测试平板在30℃温育48小时。
通过观测孔覆盖率确定最小抑制浓度(MIC)。所述MIC设定为50％孔覆盖率。
下表3示出Ard1及其类似物(μg/ml)抗酵母和丝状真菌的MIC分值。下表4和5分别示出类似物pEM35和pEM51(μg/ml)抗白色假丝酵母的fluconazole抗性菌株和抗丝状真菌的MIC分值。
表3

表4

表5

实施例8肽pEM35和pEM51抗白色假丝酵母IHEM 8060的真菌动力学图13示出肽pEM35和pEM51抗白色假丝酵母IHEM 8060的真菌动力学。
根据Klepser等所述进行实验(Antimicrob Agents Chemother，1998年5月，42(5)1207-12“实验条件对抗真菌time-kill曲线结果的影响标准化方法”)。使用的白色假丝酵母菌株与那些先前用于测试抗酵母活性实验的那些菌株相同(酵母由Dr.Koenig提供，Hpital Civil，Strasbourg)。
将所述酵母菌株种植于Sabouraud-氯霉素琼脂糖培养基中，并在30℃温育24小时至48小时。将一些酵母集落置于4ml液态Sabouraud培养基(Biomerieux)中成为悬浮液，然后在30℃搅拌过夜温育。
将所述酵母悬浮液在新鲜Sabouraud中调节为1×106-5×106个酵母/ml。将1ml酵母悬浮液加入9ml Sabouraud-氯霉素(Biomerieux)培养基中，制备1∶10的稀释液，所述培养基中含有或没有(对照组)限量的pEM35或pEM51肽。因此在最初的接种物中酵母浓度为1×105-5×105酵母/ml。
在1μg/ml to 64μg/ml浓度范围测试肽pEM35和pEM51。将每种溶液均在35℃温育。在预定时间(0，1，2，3，4，6，8，10和24小时)，取每种溶液的100μl样品，并在无菌水中连续稀释10倍。然后将30μl等份涂布于Sabouraud琼脂糖平皿上(Biomerieux)，以计数集落。当估计集落数目1000酵母/ml时，直接从测试溶液取30μl样品，并涂布于Sabouraud琼脂糖平皿上(Biomerieux)，不用预先稀释。将所述平皿在35℃温育24-48小时。
根据Klepser等所述方法(Antimicrob Agents Chemother 1997June，41(6)1392-1395，“测试fluconazole和两性霉素B抗白色假丝酵母的抗真菌药效特征”)，同样进行两性霉素B对照实验(浓度相当于1-16倍MIC)。
通过制备白色假丝酵母在具有pEM35或pEM51肽的无菌水中的悬浮液，然后调节为0.5 Mc Farland浊度标准(浓度1×106-5×106酵母/ml)，确定酵母/ml数目的最小检测极限。在无菌水中稀释以获得浓度分别为100，50和30酵母/ml的3种悬浮液。取30μl每种悬浮液并涂布于Sabouraud琼脂糖平皿上(Biomerieux)，以计数克隆。将所述平皿在35℃温育24-48小时。
将计数值(log10酵母/ml)输入针对pEM35和pEM51肽的每种测试浓度而预设的时标中。
序列表<110>恩托梅德股份公司<120>抗真菌和/或抗细菌肽，其制备方法和含有其的组合物<130>FRBRE0024<140>PCT/FR01/02164<141>2001-07-13<150>FR00/11949<151>2000-09-19<150>FR00/09248<151>2000-07-13<160>96<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述日光霉素<400>1Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>2<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述Ard1，日光霉素的肽同源物<400>2Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>3<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM37<400>3Asn Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>4<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM38<400>4Asp Lys Leu Ile Gly Thr Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>5<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM43<400>5Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Thr1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>6<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM42<400>6Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Arg1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>7<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM44<400>7Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Arg Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>8<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM22<400>8Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ile Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>9<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM23<400>9Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>10<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM25<400>10Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Leu Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>11<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM24<400>11Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Leu Asn Ile Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>12<211>44<212>pRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM7<400>12Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Arg35 40<210>13<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM21<400>13Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Gln Thr35 40<210>14<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM39<400>14Asn Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Gln Thr35 40<210>15<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM61<400>15Asn Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Leu Asn Val Asn Cys Trp Cys Gln Thr35 40<210>16<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM62<400>16Asn Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ile Asn Val Asn Cys Trp Cys Gln Thr35 40<210>17<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM40<400>17Asn Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Glv Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>18<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM50<400>18Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Arg1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>19<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM56<400>19Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Leu Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>20<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM52<400>20Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Arg Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>21<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM51<400>21Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Arg Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>22<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM32<400>22Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ile Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>23<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM33<400>23Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Ile Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>24<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM34<400>24Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Leu Asn Ile Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>25<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM35<400>25Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Leu Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>26<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM31<400>26Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Gln Thr35 40<210>27<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM30<400>27Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Arg35 40<210>28<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM46<400>28Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Leu Asn Val Asn Cys Trp Cys Gln Thr35 40<210>29<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM47<400>29Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ile Asn Val Asn Cys Trp Cys Gln Thr35 40<210>30<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM48<400>30Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Leu Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Arg35 40<210>31<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM49<400>31Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ile Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Arg35 40<210>32<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM54<400>32Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Leu Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Leu Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>33<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM57<400>33Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Leu Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Gln Thr35 40<210>34<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM55<400>34Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Leu Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Leu Asn Val Asn Cys Trp Cys Gln Thr35 40<210>35<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM37<400>35Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>36<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM38<400>36Asp Lys Leu Ile Gly Thr Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>37<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM45<400>37Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Arg Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>38<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM42<400>38Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Arg1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>39<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM44<400>39Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Arg Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>40<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM22<400>40Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ile Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>41<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM23<400>41Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Ile Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>42<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM25<400>42Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Leu Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>43<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM24<400>43Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Leu Asn Ile Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>44<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM7<400>44Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Arg35 40<210>45<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM21<400>45Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Gln Thr35 40<210>46<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM39<400>46Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Gln Thr35 40<210>47<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM61<400>47Asn Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Leu Asn Cys Trp Cys Gln Thr35 40<210>48<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM62<400>48Asn Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asp Cys Asn Gly Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Ile Asn Cys Trp Cys Gln Thr35 40<210>49<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM50<400>49Asn Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>50<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM56<400>50Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Arg1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>51<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM56<400>51Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Leu Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>52<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM52<400>52Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Arg Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>53<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM51<400>53Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Arg Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>54<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM32<400>54Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ile Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>55<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM33<400>55Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Ile Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>56<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM34<400>56Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Leu Asn Ile Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>57<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM35<400>57Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Leu Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>58<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM31<400>58Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Gln Thr35 40<210>59<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM30<400>59Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Arg35 40<210>60<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM46<400>60Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Leu Asn Val Asn Cys Trp Cys Gln Thr35 40<210>61<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM47<400>61Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ile Asn Val Asn Cys Trp Cys Gln Thr35 40<210>62<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM48<400>62Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Leu Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Arg35 40<210>63<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM49<400>63Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Gly Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ile Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Arg35 40<210>64<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM54<400>64Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Leu Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Leu Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr35 40<210>65<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM54<400>65Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Leu Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Gln Thr35 40<210>66<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述衍生自日光霉素的肽<220><223>肽pEM55<400>66Asp Lys Leu Ile Gly Ser Cys Val Trp Leu Ala Val Asn Tyr Thr Ser1 5 10 15Asn Cys Asn Ala Glu Cys Lys Arg Arg Gly Tyr Lys Gly Gly His Cys20 25 30Gly Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Gln Thr35 40<210>67<211>26<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸EM72<400>67gtaaatgcat gtatactaaa ctcaca26<210>68<211>55<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸EM89<400>68ttttttccgc ggcgcttgca ctcggcgttg cagttactag tgtagttgac ggcgc55<210>69<211>47<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸EM89互补链<400>69cgccgcgaac gtgagccgca acgtcaatga tcacatcaac tgccgcg 47<210>70<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述类似于Ard1的突变肽<400>70Arg Arg Lys Cys Glu Ala Asn Cys Asn Ser Thr Tyr Asn Val Ala1 5 10 15<210>71<211>20<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸EM25<400>71gatccactcg agtgctagcg 20<210>72<211>20<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸EM26<400>72tcgacgctag cactcgagtg 20<210>73<211>42<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸EM119<400>73gatccttcat taacgttaac tgttggtgtg aaacctgata gg42<210>74<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述突变肽(寡核苷酸EM119和EM120)<400>74Ser Phe Ile Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Thr1 5 10<210>75<211>42<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸EM120<400>75tcgacctatc aggtttcaca ccaacagtta acgttaatga ag42<210>76<211>42<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸EM127<400>76gatccttctt gaacattaac tgttggtgtg aaacctgata 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42<210>85<211>42<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸EM135<400>85gatccttcgc taacgttaac tgttggtgtg aaagatgata gg42<210>86<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述突变肽(寡核苷酸EM135和EM136)<400>86Ser Phe Ala Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Arg1 5 10<210>87<211>42<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸EM136<400>87tcgacctatc atctttcaca ccaacagtta acgttagcga ag42<210>88<211>42<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸EM158<400>88gatccttctt gaacgttaac tgttggtgtc aaacctgata gg 42<210>89<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述突变肽(寡核苷酸EM158和EM159)<400>89Ser Phe Leu Asn Val Asn Cys Trp Cys Gln Thr1 5 10<210>90<211>42<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸EM159<400>90tcgacctatc aggtttgaca ccaacagtta acgttcaaga ag42<210>91<211>42<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸EM162<400>91gatccttctt gaacgttaac tgttggtgtg aaagatgata gg 42<210>92<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述突变肽(寡核苷酸EM162和EM163)<400>92Ser Phe Leu Asn Val Asn Cys Trp Cys Glu Arg1 5 10<210>93<211>42<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸EM163<400>93tcgacctatc atctttcaca ccaacagtta acgttcaaga ag42<210>94<211>22<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸EM53<400>94cctggcaatt ccttaccttc ca 22<210>95<211>39<212>ADN<213>人工序列<220><223>人工序列的描述寡核苷酸EM137<400>95ttttttaagc ttggataaaa gaaacaagtt gattggcag39<210>96<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述突变肽(寡核苷酸EM53和EM137)<400>96Ser Leu Asp Lys Arg Asn Lys Leu Ile Gly1 5 10
权利要求
1.通过取代一或多个氨基酸衍生自日光霉素的肽，其特征在于所述肽符合公式(I)X1X2X3X4X5X6C7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17C18X19X20X21C22X23X24X25X26X27X28X29X30X31C32X33X34X35X36X37X38X39C40X41C42X43X44(I)其中- X1，X17，X21，X43是酸性氨基酸，- X16，X44是小型极性氨基酸，- X19是大型极性氨基酸，- X36是一种小型或略微疏水性氨基酸，- X38是一种略微疏水的或小型氨基酸，所述取代是- 至少氨基酸X1，X17，X21，X43之一是碱性或极性的，尤其是大型极性氨基酸，和/或- 至少氨基酸X16，X44之一是碱性氨基酸或大型极性氨基酸，和/或- X19是一种碱性氨基酸，和/或- 至少氨基酸X36，X38之一是强疏水氨基酸，同时其中其它氨基酸(X)具有以下含义- X13，X37，X39代表大型碱性氨基酸- X5，X15，X34代表小型碱性氨基酸，- X2，X23，X24，X25，X28，X31代表碱性氨基酸，- X3，X4，X8，X12代表疏水性氨基酸，- X9，X16，X27，X35，X41代表芳香族疏水性氨基酸，- X5，X10，X11，X20，X26，X29，X30，X33代表小型氨基酸，- C7，C18，C22，C32，C40，C42代表半胱氨酸。
2.权利要求1的肽，特征在于至少X1，X17，X43之一是碱性或极性的、特别是大型极性的氨基酸，及X21是一种酸性氨基酸。
3.权利要求1的肽，特征在于至少X36和X38之一是一种非芳香族强疏水性氨基酸。
4.权利要求1的肽，特征在于X17是天冬氨酸或天冬酰胺，X43是谷氨酸，且其中- X36是亮氨酸或异亮氨酸，和/或- X19是精氨酸，和/或- X16是精氨酸。
5.权利要求1的肽，特征在于X17是天冬氨酸，X43是谷氨酸，且其中- X36是亮氨酸或异亮氨酸，和/或- X19是精氨酸，和/或- X16是精氨酸。
6.权利要求1的肽，特征在于X43是谷氨酰胺，X17是天冬酰胺，且其中- X36是亮氨酸或异亮氨酸，和/或- X19是精氨酸。
7.权利要求1的肽，特征在于X43是谷氨酰胺，及X17是天冬氨酸。
8.权利要求1的肽，特征在于X43是谷氨酰胺，X17是天冬氨酸，及其中- X1是天冬酰胺，和/或- X36是亮氨酸或异亮氨酸。
9.前述任一权利要求的肽，特征在于所述碱性氨基酸选自精氨酸，赖氨酸或组氨酸。
10.前述任一权利要求的肽，特征在于所述疏水性氨基酸是- 非芳香族氨基酸，选自甲硫氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，其中亮氨酸和异亮氨酸理解为强疏水性氨基酸，甲硫氨酸和缬氨酸理解为略微疏水性氨基酸，或者- 芳香族氨基酸，选自苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸，这些是强疏水性氨基酸。
11.前述任一权利要求的肽，特征在于所述酸性氨基酸选自天冬氨酸或谷氨酸。
12.前述任一权利要求的肽，特征在于所述大型极性氨基酸选自谷氨酰胺或天冬酰胺。
13.前述任一权利要求的肽，特征在于所述小型极性氨基酸选自丝氨酸或苏氨酸。
14.前述任一权利要求的肽，特征在于所述小型氨基酸选自甘氨酸或丙氨酸。
15.前述任一权利要求的肽，符合以下序列之一HelioDKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETArd1 DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM37NKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM38DKLIGTCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM43DKLIGSCVWGAVNYTTDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM42DKLIGSCVWGAVNYTRDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM44DKLIGSCVWGAVNYTSDCRGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM22DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFINVNCWCETpEM23DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANINCWCETpEM25DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCETpEM24DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFLNINCWCETpEM7 DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCERpEM21DKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCOTpEM39NKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCOTpEM61NKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCOTpEM62NKLIGSCVWGAVNYTSDCNGECKRRGYKGGHCGSFINVNCWCOT。
16.权利要求1-14任一项的肽，符合以下序列之一Ard1 DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM40NKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM50DKLIGSCVWGAVNYTRNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM56DKLIGSCVWLAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM52DKLIGSCVWGAVNYTSRCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM51DKLIGSCVWGAVNYTSNCRAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCETpEM32DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFINVNCWCETpEM33DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANINCWCETpEM34DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNINCWCETpEM35DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCETpEM31DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCOTpEM30DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCERpEM46DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCOTpEM47DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFINVNCWCOTpEM48DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCERpEM49DKLIGSCVWGAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFINVNCWCERpEM54DKLIGSCVWLAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCETpEM57DKLIGSCVWLAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFANVNCWCOTpEM55DKLIGSCVWLAVNYTSNCNAECKRRGYKGGHCGSFLNVNCWCOT。
17.抗真菌和/或抗细菌组合物，特征在于其含有至少一种权利要求1-16任一项的肽作为活性成分，有利的是所述肽在所述组合物中与一种适当的载体结合。
18.权利要求17的组合物，用于人体或动物。
19.权利要求17的组合物，用于植物。
全文摘要
本发明涉及通过取代一或多个氨基酸衍生自日光霉素的肽，其特征在于所述肽符合公式(I)X
文档编号A61K38/00GK1441809SQ01812730
公开日2003年9月10日 申请日期2001年7月5日 优先权日2000年7月13日
发明者让－吕克·迪马克, 米谢勒·勒格兰, 洛尔·梅南 申请人:恩托梅德股份公司