专利名称：用于直接表达肽的改进的细菌宿主细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及直接表达肽产物到表达该肽产物的遗传工程化宿主细胞的培养基中。 更特别地，本发明涉及克隆载体、表达载体、宿主细胞和/或用于高产量生产从宿主分泌出并进入培养基中的肽产物的发酵方法。在一些实施方案中，本发明涉及直接表达具有C-末端甘氨酸的肽产物，它在此后被转化为具有代替所述甘氨酸的氨基的酰胺化肽。
背景技术：
存在各种用于重组生产肽产物的技术，肽产物就是任何其分子结构包括多个通过肽键连接的氨基酸的化合物。当外源肽产物较小时的问题就是它们经常容易被表达该肽的宿主细胞的细胞质或周质中的内源蛋白酶降解。其它问题包括不改变其三级结构(它可能不令人期望的减少了发挥其基本功能的能力)而得到足够的产量并以相当纯的形式回收该肽。要解决大小较小的问题，现有技术中已经频繁地将所感兴趣的肽产物与另一(通常更大的)肽作为融合蛋白来表达，并在细胞质中积累这种融合蛋白。另一肽可能提供几种功能，例如保护所感兴趣的肽不暴露给宿主细胞的细胞质中存在的蛋白酶。一种这样的表达系统在 Ray et al. , Bio/Technology, Vol. 11, pages 64-70，(1993)中描述过。但是，用这种技术分离肽产物需要切割融合蛋白质并从宿主细胞质中正常存在的所有肽中纯化出来。这可能使许多其它可能降低方法的总效率的步骤成为必要。例如现有技术的融合蛋白在细胞质中积累时，必须经常收获并裂解细胞，在澄清步骤中去除细胞碎片。根据本发明，所有这些都被避免，其中所感兴趣的肽产物被直接表达到培养基中并从培养基中回收。在现有技术中，经常有必要使用亲合层析步骤来纯化融合蛋白，这还是必须经历切割来将所感兴趣的肽与其融合配偶体分开。例如，在上述Biol Technology论文中，用溴化氰将鲑鱼降钙素前体从其融合配偶体上切割下来。这个切割步骤还是需要额外的步骤来保护鲑鱼降钙素前体1位和7位的半胱氨酸巯基基团。利用磺化作用为半胱氨酸提供保护基团。这随后又改变了鲑鱼降钙素前体的三级结构，需要在随后复性前体(当然还要除去保护基团)。本发明的肽产物只表达为带有信号序列，不与大的融合配偶体一起表达。本发明产生了“直接表达”。它最初表达为带有加入到N-末端侧的信号区域。然而，该信号区域是在肽产物分泌到细胞周质期间被翻译后切除的。其后，肽产物从周质扩散或者分泌到细胞外的培养基中，在此它可能以适当的三级结构被回收。它不与任何融合配偶体连接，后者的除去可能首先需要细胞裂解变性或修饰，尽管在本发明的一些实施方案中，使用了磺化来保护肽产物纯化期间的半胱氨酸巯基基团。现有技术中在细胞内累积肽产物的另一问题是，累积产物可能对细胞有毒，可能因此限制了可被合成的融合蛋白的量。该方法的另一个问题是，大多数产物通常是由较大的融合配偶体构成的。例如，90%的产物可能是较大的融合配偶体，这就导致只有10%的产物属于所感兴趣的肽。该方法还有另一问题是，融合蛋白可能在细胞内形成不溶的包含体， 在裂解之后包含体的溶解可能不产生有生物活性的肽。现有技术中试图将肽与附加在N-末端上的信号肽一起表达以引导期望的肽产物分泌到周质中(参见EP 177, 343, Genentech Inc.) 0几个信号肽已经被鉴别(参 JAL Watson, Μ. Nucleic Acids Research, Vol 12，No. 13， pp :5145-5164)。例如，Hsiung et al. (Biotechnology, Vol 4，November 1986，pp :991-995)使用大肠杆菌的夕卜膜蛋白 A(OmpA)的信号肽来引导某些肽进入周质中。最经常的是，分泌到周质中的肽常常倾向于保持在那里而最少地分泌到培养基中。可能需要并不期望的进一步的步骤来破坏或通透外膜以释放足量的周质组分。一些现有技术试图将肽从周质分泌到细胞外的培养基中，包括破坏外膜屏障的完整性，其通过让宿主细胞同时表达含有信号肽的期望的肽产物与能使外膜成为可通透的或渗漏的溶胞肽蛋白(美国专利No. 4，595，658)。然而，人们需要小心溶胞肽蛋白的量，以便不会破坏细胞的完整性并杀死细胞。通过这种技术也可能使得所感兴趣的肽的纯化变得更加困难。除了上述破坏外膜稳定性的技术外，还有不这么严格的使革兰氏阴性细菌外膜通透的方法。这些方法不会引起不必要的能导致细胞生存力降低的外膜的破坏。这些方法包括但不限于使用阳离子试剂(Martti Vaara, Microbiological Reviews, Vol. 56, pages 395-411(1992))禾口甘氨酸(Kaderbhai et al. , Biotech. Appl. Biochem, Vol. 25, pages53-61(1997))0阳离子试剂通过与外膜的脂多糖主链相互作用并引起脂多糖主链的损伤来使外膜通透。损伤和破坏的量可以是非致死的或致死的，这取决于所使用的浓度。甘氨酸可取代肽聚糖的肽组分中的丙氨酸残基。肽聚糖是革兰氏阴性细菌外细胞壁的结构组分之一。在高浓度的甘氨酸中培养大肠杆菌会提高甘氨酸-丙氨酸的取代频率，这将导致细胞壁的缺陷，从而增加通透性。使期望的肽产物分泌的另一现有技术方法包括将产物融合到正常地被分泌到培养基(溶血素)中的载体蛋白上或者融合到在外膜上表达的完整蛋白质上(如OmpF蛋白质)。例如，当结合了 ompF蛋白片段时，人β -内啡肽可以通过大肠杆菌细胞作为融合蛋白被分泌(EMB0J.，Vol 4，No. 13A，pp =3589-3592,1987) 0然而所期望的肽产物的分离很困难，因为必须将它们与载体肽分开，并且包括一些(虽然不是全部)与在细胞质中的融合肽的表达有关的缺点。还有另一现有技术方法，就是在遗传上改变宿主细胞以产生具有相对不能保留周质的肽和蛋白质的可通透性外膜的新菌株。然而这些新菌株很难维持，可能需要严格的条件，这反过来又影响了所期望的肽产物的产量。Raymond Wong et al.(美国专利No. 5，223，407)设计了另一分泌肽产物的方法， 其通过制造包括编码异源蛋白的DNA的重组DNA构建体，该DNA在读码框内与编码ompA信号肽的DNA以及包括tac启动子的控制区域连接。据报道，该系统的产量明显少于用本发明所能得到的产量。虽然现有技术可能允许蛋白质从周质输出到培养基中，但是这可能导致不健康的细胞，其不容易培养到所期望的高密度，从而又影响了产物的产量。
更近来，Mehta et al.(美国专利No. 6，210，925)披露了用于将肽产物直接表达到培养遗传工程化宿主细胞的培养基中的表达系统。高产量的获得在于用了新载体、特殊的宿主选择、和/或包括小心控制细胞生长速度的发酵工艺、以及在生长期使用诱导物。提供了特殊的载体，其包括具有多个启动子的并与编码信号肽的编码区域可操作地连接的控制区域，该信号肽编码区域位于编码所感兴趣的肽的编码区的上游。也使用多个转录盒来增加产量。本发明设法使用新的遗传工程化宿主细胞来用有效的表达载体生产更高产量的肽。本发明也设法使用新的通用克隆载体来生产有效的表达载体。
发明内容
因此，本发明的目标就是让肽产物在培养产生肽的宿主细胞的培养基中以高产率累积。这是有利的，因为培养基相对不受许多细胞肽的污染。本发明的另一目标是提供遗传工程化宿主细胞，其在表达发明的新的表达载体并使肽产物在培养产生肽的宿主细胞的培养基中以高产率累积方面特别有用。本发明的另一目标是提供改进的发酵工艺，用来增加通过遗传工程化宿主细胞表达的肽产物的产率。本发明进一步的目标是提供改进的方法，其利用具有C-末端甘氨酸的前体肽来生产酰胺化的肽，该前体在直接表达到根据本发明的培养基后被酰胺化。因此，本发明提供了缺乏分别编码重组蛋白A和蛋白酶III的染色体基因recA和 Ptr的遗传工程化大肠杆菌细菌。本发明也提供了克隆载体，包括(a)包括至少两个启动子的控制区；(b)编码信号序列的核酸；(c)两个基因克隆酶限制位点，其允许符合所述信号序列读码框编码地克隆肽的基因，并与所述控制区可操作地连接；(d)至少两个盒克隆酶限制位点，位于所述基因克隆酶限制位点的3'；以及(e)至少两个盒克隆酶限制位点，位于所述控制区的5'，其中所有所述的限制酶位点互不相同，并在所述载体中是独特的。本发明进一步提供了制备含有多个转录盒的表达载体的方法，每个盒包括(1) 带有编码肽产物的核酸的编码区，其符合读码框地连接到编码信号肽的核酸3'；以及(2) 可操作地与编码区连接的控制区，所述控制区包括多个启动子，所述方法包括(a)使用两种基因克隆酶限制位点将所述带有编码肽产物的核酸的编码区符合读码框地克隆到本发明克隆载体中编码信号肽的核酸的3'，从而形成克隆载体中的表达盒；(b)使用在所述基因克隆酶限制位点3'的盒克隆酶限制位点处进行切割的第一限制酶和在所述基因克隆酶限制位点5'的盒式克隆酶限制位点处进行切割的第二限制酶将表达盒从克隆载体上切割下来；(c)将表达盒连接到含有步骤(b)的盒克隆酶限制位点的模板表达载体中，这样第一限制酶位点就在第二限制酶位点的3'，其中所述模板表达载体(i)已经用第一和第二限制酶连接，以及(ii)含有至少多一对的盒克隆酶限制位点，例如位点对的第一成员与权利要求4的位于所述基因克隆酶限制位点3'的盒克隆酶限制位点相同，而位点对的第二成员与权利要求4的位于所述基因克隆酶限制位点5'的盒克隆酶限制位点相同，其中位点对的第一成员在位点对的第二成员3'，每个盒克隆酶限制位点是模板载体上独特的，没有其它的权利要求4的盒克隆酶限制位点落在第一盒克隆酶限制位点5'的区域和第二盒式可能性酶限制位点3'的区域中，或者落在盒克隆酶限制位点对第一成员5'和盒克隆酶限制位点对第二成员3'的区域中；以及(d)至少重复一次步骤(b)和(c)，但是使用切割盒克隆酶限制位点对任一第一成员和第二成员的限制酶，而不是步骤(b)的第一和第二限制酶。本发明也提供缺乏分别编码重组蛋白A和蛋白酶III的染色体基因rec A和ptr 的大肠杆菌宿主细胞，所述宿主含有并表达包括多个串联式转录盒的表达载体，每个盒包括(1)带有编码肽产物的核酸的编码区，其符合读码框地连接到编码信号肽的核酸3'； 以及( 可操作地与编码区连接的控制区，所述控制区包括多个启动子。本发明进一步提供生产肽产物的方法，包括在培养基中培养用本发明表达载体转化或转染的本发明的宿主细胞，然后从培养宿主细胞的培养基中回收肽产物。本发明也提供生产酰胺化肽产物的方法，包括步骤(a)在培养基中培养用本发明表达载体转化或转染的本发明的宿主细胞，其中肽产物包括C-末端甘氨酸；(b)从所述培养基中回收所述肽产物；以及(c)通过将所述C-末端甘氨酸转化为氨基而将所述肽产物转变为酰胺化的肽。
生物保藏
以下生物材料保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209，具有以下分类名称、保藏号和保藏日。
权利要求
1.缺乏分别编码重组蛋白和蛋白酶III的染色体基因recA和ptr的大肠杆菌宿主细胞，所述宿主含有并表达包括多个串联式转录盒的表达载体，每个盒包括(1)带有编码肽产物的核酸的编码区，其符合读码框地连接到编码信号肽的核酸3' 端；以及(2)可操作地与编码区连接的控制区，所述控制区包括多个启动子。
2.权利要求1的宿主细胞，其是BLR菌株。
3.权利要求1的宿主细胞，其是UGL801并具有ATCC保藏号PTA-5501。
4.权利要求1的宿主细胞，其中所述表达载体是具有ATCC保藏号PTA-5567的 PUSEC-05IQ克隆载体。
全文摘要
本发明涉及用于直接表达肽的改进的细菌宿主细胞。本发明还涉及表达系统，用于将产物直接表达到遗传工程化宿主细胞所生长的培养基中。用特殊选择的宿主和/或发酵工艺获得了高产量，发酵工艺包括小心控制细胞生长速度、在生长速度期间使用诱导物以及在生长阶段期间使用诱导物。提供了用于制备表达载体的特殊的通用克隆载体，其包括具有可操作地与编码信号肽的编码区连接的多个启动子的控制区，该信号肽编码区位于编码所感兴趣的肽的编码区的上游。也使用多种转录盒来增加产量。也公开了使用表达系统来生产酰胺化的肽。
文档编号C12P21/02GK102337241SQ201110107199
公开日2012年2月1日 申请日期2005年3月10日 优先权日2004年3月12日
发明者A·P·康萨尔沃, C·P·米南, M·V·L·雷, N·M·梅塔 申请人:尤尼基因实验室公司