专利名称：用于诊断和预测移植物排斥的生物标志物板的制作方法
用于诊断和预测移植物排斥的生物标志物板政府权利本发明是根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)资助的合同(R01 AI 61739-01)。政府享有本发明的某些权利。移植器官或组织从供体至宿主患者的移植是某些医学程序和治疗方案的特征。虽然努力通过宿主-供体组织配型来避免移植物排斥，但是在供体器官被导入宿主的移植程序中，通常需要免疫遏制疗法以维持供体器官在宿主中的活力。然而尽管广泛使用了免疫遏制疗法，器官移植排斥仍可发生。同种异体移植物组织的急性移植物排斥(AR)是涉及同种异体移植物中同种抗原的T-细胞识别、共刺激信号、活化T细胞对效应分子的加工和移植物内的炎性反应的复杂免疫反应。循环白细胞的活化和向同种异体移植物的募集是这一过程的关键特征。AR的早期检测是移植受体(包括肾移植受体)护理中的主要临床问题之一。肾功能障碍发作之前的AR检测允许用积极的免疫遏制成功治疗这一病症。在不具有AR的患者中降低免疫遏制以使药物毒性最小化也同样重要。因此，监测移植物受体中的AR反应，包括预测、诊断和表征AR，是本领域中关注的。本发明满足了这些和其它需要。发明概述提供了用于监测具有移植物的受治疗者的急性排斥(AR)反应，例如以预测、诊断和/或表征AR反应，包括受治疗者中的移植物存活的方法。在实践该主题方法时，评估来自所述受治疗者的样品例如血液或活检样品中至少一种基因的表达水平以监测受治疗者， 例如在核酸和/或蛋白水平进行评估。还提供了可用于实践该主题方法的组合物、系统、试剂盒和计算机程序产品。所述方法和组合物可用于多种应用。本发明的方面包括监测已接受移植物(如同种异体移植物)的受治疗者的急性排斥(AR)反应的方法，所述方法包括(a)评估来自所述受治疗者的样品中至少一种基因的表达水平以获得基因表达结果，其中所述至少一种基因选自由以下组成的组NKTR、MAPK9、 DUSPl、PBEF1(也称为NAMPT)和PSEm ；和(b)采用所述基因表达结果来在所述受治疗者中预测AR反应的发作、诊断AR反应、和/或表征AR反应，由此监测所述受治疗者的AR反应。 在某些实施方式中，评估上述5种基因的组的所有基因的表达水平。在某些实施方式中，评估步骤还包括评估选自以下的一种或多种的另外的基因的表达水平CFLAR、RNF-130、IFNGRl、ITGAX和RYBP。在某些实施方式中，评估以上所列的全部10种基因的表达水平。在某些实施方式中，评估步骤包括测定所述样品的所述至少一种基因的表达产物。在某些实施方式中，所述表达产物是核酸转录物，而在其 它实施方式中， 所述表达产物是蛋白。在某些实施方式中，评估步骤包括RT-PCR测定。在某些实施方式中， 所述RT-PCR测定是定量RT-PCR测定。在某些实施方式中，所述样品是血液样品。在某些实施方式中，所述同种异体移植物是肾同种异体移植物。在某些实施方式中，采用所述基因表达结果来提前6到3个月预测AR反应的发生。在某些实施方式中，采用所述基因表达结果来将AR反应表征为类固醇抗性AR反应。本发明的方面包括用于确定AR反应中被排斥的组织的身份的方法，所述方法包括评估来自所述受治疗者的样品中选自以下的一种或多种的至少一种基因的表达水平 NKTR、MAPK9、DUSP1、PBEF1 (也称为 NAMPT)、PSEN1、CFLAR、RNF_130、IFNGR1、ITGAX 和 RYBP， 以获得基因表达结果，并采用该基因表达结果来确定被排斥的组织的身份。这一测试不仅仅适用于许多组织的移植排斥，包括肾、心脏、肝、肺和肠移植物。本发明的方面包括用于 为已接受移植物的受治疗者确定免疫遏制方案的方法，所述方法包括(a)评估来自所述受治疗者的样品中至少一种基因的表达水平以获得基因表达结果，其中所述至少一种基因选自由以下组成的组NKTR、MAPK9、DUSPl、PBEFl (也称为 NAMPT)和PSEm ；和(b)采用所述基因表达结果以为所述受治疗者确定免疫遏制方案。在某些实施方式中，评估上述5种基因的组的所有基因的表达水平。在某些实施方式中，评估步骤还包括评估选自以下的一种或多种的另外的基因的表达水平CFLAR、RNF-130、IFNGRU ITGAX和RYBP。在某些实施方式中，评估以上所列的全部10种基因的表达水平。本发明的方面包括用于监测已接受同种异体移植物的受治疗者的急性排斥(AR) 反应的系统，所述系统包括(a)基因表达评估元件，该基因表达评估元件配置为用于评估来自所述受治疗者的样品中至少一种基因的表达水平以获得基因表达结果，其中所述至少一种基因选自由以下组成的组NKTR、MAPK9、DUSP1、PBEF1 (也称为NAMPT)和PSEm ；和(b) 表型确定元件，该表型确定元件采用所述基因表达结果来在所述受治疗者中预测AR反应的发作、诊断AR反应、和/或表征AR反应，由此监测所述受治疗者的AR反应。在某些实施方式中，评估上述5种基因的组的所有基因的表达水平。在某些实施方式中，所述基因表达评估元件包括用于测定样品的所述至少一种基因的表达产物的至少一种试剂。在某些实施方式中，所述至少一种基因的表达产物是核酸转录物，而在其它实施方式中，所述表达产物是蛋白。在某些实施方式中，所述基因表达评估元件包括所述至少一种基因特异性的PCR 引物。在某些实施方式中，所述基因表达评估元件还配置为用于评估选自以下的一种或多种的另外的基因的表达水平CFLAR、RNF-130、IFNGRl、ITGAX和RYBP。在某些实施方式中， 评估以上所列的全部10种基因的表达水平。在某些实施方式中，所述表型确定元件包括包括所述至少一种基因的参考表达值。本发明的方面包括用于监测已接受同种异体移植物的受治疗者的急性排斥(AR) 反应的试剂盒，所述试剂盒包括(a)基因表达评估元件，该基因表达评估元件用于评估样品中至少一种基因的表达以获得基因表达结果，其中所述至少一种基因选自由以下组成的组NKTR、MAPK9、DUSP1、PBEF1(也称为NAMPT)和PSEm ；和(b)表型确定元件，该表型确定元件采用所述基因表达结果来在所述受治疗者中预测AR反应的发作、诊断AR反应、和/或表征AR反应，由此监测所述受治疗者的AR反应。在某些实施方式中，评估上述5种基因的组的所有基因的表达水平。在某些实施方式中，所述基因表达评估元件还配置为用于评估选自以下的一种或多种的另外的基因的表达水平CFLAR、RNF-130、IFNGRl、ITGAX和RYBP。 在某些实施方式中，评估以上所列的全部10种基因的表达水平。在某些实施方式中，所述基因表达评估元件包括对以上所述的一种或多种基因特异的PCR引物对(如用于RT-PCR 测定基因表达)。在某些实施方式中，所述基因表达评估元件包括对所述5种基因的组的全部5种基因特异的PCR引物对，而在其它实施方式中，所述基因表达评估元件包括对以上所列的全部10种基因特异的PCR引物对。本发明的方面包括用于监测已接受同种异体移植物的受治疗者的急性排斥(AR) 反应的计算机程序产品，其中当装载于计算机上时，所述计算机程序产品配置为采用来自从所述受治疗者获得的样品的基因表达结果来确定AR监测结果，和以用户可读格式向用户提供所述AR监测结果，其中所述AR监测结果选自在所述受治疗者中预测AR反应的发作、诊断AR反应、和/或表征AR反应，其中所述基因表达结果包括选自以下的一种或多种的表达数据NKTR、MAPK9、DUSPl、PBEFl和PSENl。在某些实施方式中，所述表达结果包括来自所述5种基因的组的全部基因的表达数据。在某些实施方式中，所述表达结果包括选自以下的一种或多种的另外的基因的表达数据CFLAR、RNF-130、IFNGRl、ITGAX和RYBP。在某些实施方式中，所述表达结果包括以上所列的全部10种基因的表达数据。定义为了方便，将说明书、实施例和所附权利要求书中采用的某些术语集于此处。“急性排斥或AR”是当移植的组织为免疫学上外源时，组织移植受体的免疫系统的排斥。急性排斥的特征为移植的组织被受体的免疫细胞浸润，所述免疫细胞执行其效应功能并破坏移植的组织。急性排斥的发作是迅速的，并且在人类中通常发生于移植手术后几周内。一般而言，可用免疫遏制药物抑制或遏制急性排斥，所述免疫遏制药物诸如雷帕霉素、环孢菌素A、抗-CD40L单克隆抗体和类似药物。“慢性移植排斥或CR”在人类中一般发生于移植物移入后数月至数年，甚至发生于存在急性排斥的成功免疫遏制时。纤维化是所有器官移植物类型的慢性排斥中常见的因素。慢性排斥典型地可通过特定器官特征性的一系列具体疾患来描述。例如，在肺移植物中，此类疾患包括气道的纤维增生性破坏(闭塞性细支气管炎)；在心脏移植物或心脏组织的移植物中，诸如瓣膜换置术中，此类疾患包括纤维变性动脉粥样硬化；在肾移植物中，此类疾患包括梗阻性肾病、肾硬化(nephrosclerorsis)、肾小管间质性肾病变；和在肝移植物中，此类疾患包括消失型胆管综合征。慢性排斥的特征还在于局部缺血性损伤、移植的组织的去神经、高脂血症和与免疫遏制药物相关的高血压。术语“移植物排斥”涵盖急性和慢性移植物排斥二者。如本文所用的术语“严格测定条件”指适于产生具有充分互补性的核酸例如表面结合的核酸和溶液相核酸的结合对来提供测定中期望的特异性水平，而较不适于在不具有充足的互补性的结合成员之间形成结合对来提供期望的特异性的条件。严格测定条件是杂交和洗涤条件二者的总和或组合(总体)。在核酸杂交(如阵列杂交、DNA印迹杂交或RNA印迹杂交中)上下文中，“严格杂交条件”和“严格杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同的实验参数下是不同的。可用于鉴定本发明范围内的核酸的严格杂交条件可包括，例如，在包括50%甲酰胺、5XSSC和 1% SDS的缓冲液中在42°C下的杂交，或在包括5 X SSC和SDS的缓冲液中在65°C下的杂交，二者均以0. 2XSSC和0. 1% SDS在65°C下洗涤。示例性严格杂交条件还可包括杂在 40%甲酰胺、IM NaCl和SDS的缓冲液中在37°C下杂交和在IXSSC中在45°C下洗涤。 可选地，可采用与过滤器结合的DNA在0.5M NaHP04、7%十二烷基硫酸钠(SDS)、lmM EDTA 在65°C下的杂交和在0. 1XSSC/0. 1% SDS中在68°C下的洗涤。另外的严格杂交条件包括在60 0C或更高和3 X SSC (450mM氯化钠/45mM柠檬酸钠)下的杂交或在42 °C下在含有30 %甲酰胺、IM NaCl、0. 5%肌氨酸钠、50mM MES、pH 6. 5的溶液中的孵育。技术人员将容易理解，可利用替代但相当的杂交和洗涤条件来提供相似严格性的条件在某些实施方式中，洗涤条件的严格性列出了决定核酸是否与表面结合的核酸特异性杂交的条件。用于鉴定核酸的洗涤条件可包括，例如约PH 7下约0. 02M的盐浓度和至少约50°C或约55°C至约60°C的温度；或，约0. 15M NaCl的盐浓度，72°C，约15分钟；或， 约0. 2XSSC的盐浓度，至少约50°C或约55°C至约60°C的温度，约15至约20分钟；或，用含0. SDS的约2X SSC的盐浓度的溶液在室温下洗涤杂交复合体两次，每次15分钟，然后用含0. 1% SDS的0. IX SSC在68°C下洗涤两次，每次15分钟；或等同条件。用于洗涤的严格条件还可以是，例如，0. 2XSSC/0. 1% SDS, 420C ο严格测定条件的一个具体实例是在65°C下在总单价阳离子浓度为1. 5M的基于盐的杂交缓冲液中旋转杂交(如2000年9月5号提交的美国专利申请第09/655，482号中所述，该专利申请的公开内容通过引用并入本文)，然后在室温下在0. 5 X SSC和0. 1 X SSC下洗涤。严格测定条件是至少与以上代表性条件同样严格的杂交条件，其中如果与以上具体条件相比，在给定的条件集下大致上没有另外的缺乏提供期望特异性的足够互补性的结合复合体产生，则认为该给定的条件集是至少同样严格的，其中“大致上不多于”意指少于约5倍多、一般少于约3倍多。其它严格杂交条件是本领域已知的，并且在适当时也可采用。如本文所用，术语“基因”或“重组基因”指包括编码多肽的开放可读框的核酸，包括外显子和(任选地)内含子序列。术语“内含子”指给定基因中存在的不被翻译成蛋白质的DNA序列，并且一般发现于DNA分子的外显子之间。此外，基因可任选地包括其天然启动子(即，非重组细胞即天然存在的细胞中基因的外显子和内显子与其可操作地连接的启动子)和相关的调控序列，并可具有或不具有AUG起始位点上游的序列，并且可包括或不包括非翻译的先导序列、信号序列、下游非翻译序列、转录起始和终止序列、多腺苷酸化信号、 翻译起始和终止序列、核糖体结合位点以及类似序列。“蛋白编码序列”或“编码”特定多肽或肽的序列是当置于适当的调控序列的控制下时，在体外或体内转录(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸序列。编码序列的边界由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可包括但不限于，来自病毒、原核生物或真核生物mRNA的cDNA、来自病毒、原核生物或真核生物DNA的基因组DNA序列，和甚至合成的DNA序列。转录终止序列可位于编码序列的3'。术语“参考”和“对照”可互换地使用以指观察值可与之比较的已知值或已知值集。 如本文所用的，已知意指该值代表已被理解的参数，例如，移植物存活或损失表型中标志物基因的表达水平。术语“核酸”包括DNA、RNA (双链或单链)、其类似物(如PNA或LNA分子)和衍生物。如本文所用的术语“核糖核酸”和“RNA”意指主要由核糖核苷酸组成的聚合物。如本文所用的术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”意指主要由脱氧核糖核苷酸组成的聚合物。术语 “mRNA”意指信使RNA。“寡核苷酸”一般指约10个至100个核苷酸长度的核苷酸多聚物，而 “多核苷酸”包括具有任何数量的核苷酸的核苷酸多聚物。 本申请中使用的术语“蛋白”和“多肽，，是可互换的。“多肽，，指氨基酸的聚合物(氨基酸序列)，而不涉及该分子的具体长度。因此，多肽的定义中包括肽和寡肽。该术语也不涉及或包括多肽的翻译后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化和类似修饰。包括在该定义中的有，例如，含有一个或多个氨基酸类似物的多肽、具有置换的连接的多肽、以及本领域中已知的其它修饰，包括天然存在的和非天然存在的修饰二者。术语“评价”和“评估”可互换地使用以指 测量的任何形式，并包括确定元件是否存在。术语“确定”、“测量”、“评价”和“测定”可互换地使用，并包括定量和定性确定二者。 评价可以是相对的或绝对的。“评价…的存在”包括确定存在的某物的量以及确定该物是否存在。本申请中采用的某些缩写包括以下AR 急性排斥；AZA 硫唑嘌呤；BKV =BK病毒；CMV 巨细胞病毒；CSA 环孢菌素A ； DSA 供体特异性抗体；EBV 埃巴病毒；FDR 假发现率；FK :FK506 ；HCT 血细胞比容；LRD 活体亲属供体；MMF 麦考酚酸吗乙酯；PBL 外周血白细胞；PAM 微阵列预测分析；PRA 板反应性抗体；Q-PCR 定量实时聚合酶链反应；ROC 接收器工作特性；SAM 微阵列显著性分析；STA 稳定的；SNS :NIH-CCTPT UOl资助的随机化多中心儿科肾移植物的患者的基于类固醇对比无类固醇的移植研究(SNSOl) ；WBC:白细胞。附图简述
图1.研究设计概述。本研究划分为2个具体部分在研究的部分1中我们在3 种不同的微阵列平台，即Affymetrix、Agilent和cDNA阵列上进行了外周血样品的代表性微阵列分析。通过将转录物定位至人类基因组织(HUGO)基因名称比较从3种平台产生的阵列数据。使用共同的显著性阈值(FDR < 10% )，对每个数据集进行适当的标准化程序， 然后进行SAM分析以鉴定AR中显著调节的基因。525种基因是跨3种平台差异表达的AR 特异性基因中共同的。选择32基因-集用于选自用于微阵列的样品中的34种样品的初步验证(验证集)。在测试的32种基因中，10种最显著的基因(ρ <0.03)在42个独立的样品(确认集1)中进行进一步确认。使用来自确认集1的5种最显著的基因的表达产生回归模型。然后将这一模型应用于64个样品的第二独立集(确认集2)用于真实的AR分类。 在该研究的部分2中，我们对AR之前(preAR ；η = 27)和AR之后(postAR ；η = 30)收集的配对血液样品进行纵向5-基因Q-PCR分析，其中将回归模型应用于57个系列AR样品。图2. 5基因-集的基因表达的验证和确认。外周血样品阵列跨共同的525基因-集的聚类显示样品按诊断表型聚类。这里显示了在Affymetrix阵列上运行的59个样品的聚类(图2A)；跨在所有3种阵列平台上差异表达的525种重叠基因观察到样品按表型聚类 (参见图5)，而与样品采集、加工或多个临床混淆因素无关。样品跨525的基因按表型(AR 或STA)聚类。这里仅显示了在Affymetrix阵列上运行的样品的代表性聚类数据。显示了选择的10基因-集的总结表达，如在其中一种阵列平台(Affymetrix)上测量的(图2B)。 显示了全血样品中的Affymetrix微阵列数据的SAM分析的倍数变化和q评分。显示了表达Q-PCR样品的验证集的同样10个基因的表达(图2C)。Q-PCR的倍数变化是AR和STA 样品之间的平均差异；Q-PCR表达差异的显著性通过T检验确定，其中ρ < 0. 05视为显著的。在血液样品的独立确认集(确认集1)中，显示了最显著的5个基因的表达。未在阵列分析中使用的新的血液样品同样通过跨5种基因的表型(AR或STA)分离(图2D)。确认集 1中使用的样品的5种基因的倍数变化和ρ值显示于图2E。
图3.接收器工作特性(ROC)曲线。使用逻辑回归模型分析，从独立样品(确认集 1)的5基因Q-PCR表达数据产生预测模型。通过ROC评分=95. 2%显示该模型的特异性和灵敏度。将回归模型应用于独立样品集(确认集2)，其中5基因的表达明显地将AR与 STA分离(非监督聚类)，并且当与STA比较时，差异表达的5基因在AR中是显著不同的(ρ < 0. 02).图4.在临床移植物功能障碍之前通过5基因_集血液采样预测急性排斥。将回归模型应用于移植后前两年的不同时间在STA样品集的患者中顺序采集的样品(图4Α)， 以评估在移植后不同时间预测为AR的概率。STA样品分组为在移植后0至3个月内、3至 6个月内、6至12个月内和12至24个月内采集的样品。每个血液样品具有配对的活检以证实血液样品采集时移植物中AR的不存在。使用肾移植后不同时间的5基因-集的协调表达计算所有STA样品的AR概率的平均值和标准偏差。如所见的，任何STA样品在移植后任何时间被预测为AR的可能性少于50%。存在2个错误分类的STA样品(具有58%的AR 概率评分的S99，和具有72%的AR预测评分的S88 ；参见图9)。具有错误分类的STA样品的两个患者在血液采样6个月内显示发展活检证明的AR。在右图(图4Β)中，显示了活检证明AR时采集的血液样品、以及在AR样品之前(preAR) 1-3个月内和3_6个月内采集的样品(作为协议样品采集的一部分)的AR概率的平均值和标准偏差。如所见的，血液样品分类为AR的概率(一般为75-100% )与AR的活检诊断强烈一致。根据AR诊断强化免疫遏制(类固醇脉冲或抗体)后，AR预测概率下降，证明5基因-集特征的AR预测概率通过增强的免疫遏制降低。AR集中所有样品的AR预测概率在所有preAR、AR和postAR样品中显著高于任何STA样品(ρ < 0. 001)，表明发展AR的患者可比移植后从未发展AR的患者具有更高的免疫活化阈值。
图5提供了显示跨样品制备㈧或跨不同的微阵列平台⑶的每个发现平台内的 AR显著基因和如通过SAM(q < 10% )确认的重叠显著基因的Verm图。重叠的525基因 (标双下划线的)与STA样品相比在AR中受到统计学显著的(超几何检验；p<0. 001)调节，并且是AR共有的，不管与不同阵列平台的杂交是否使用采集外周血的不同方法。图6A显示了基因列表和使用Q-PCR测定的基因的ABI探针ID。图6B显示了跨验证集(17AR、17STA)中的34个血液样品通过Q-PCR测定的10-基因的标准化表达值。图7是参考文献中指明在AR中差异表达的3个基因的跨验证集的34个样品的阵列和Q-PCR的基因表达值的总结。图8显示了通过Q-PCR的跨确认集1中的42个独立血液样品(21AR和21STA)的 10基因的标准化表达值。图9显示了通过Q-PCR的跨确认集2的64个独立血液样品(32AR和32STA)的5 基因的标准化表达值。图10比较了跨10基因集(上图)和5基因集(下图)的AR的不同分类模型。图11显示了对所有Q-PCR实验检查的18个人口统计学和临床混淆因素。图12显示了确定图11中的18个参数作为5_基因集表达的潜在混淆因素的任何影响的Pearson关联和t_检验(如果需要)的结果。图13是图12中的结果的图形表示。图14显示了活检Banff等级、小管周C4d阳性和体液与细胞AR和AR预测概率之间的关联。 图15.图A显示AR发作之前和之后6个月内采集的配对样品的AR预测概率。图 B显示比较AR时的AR预测评分对比preAR和postAR评分的ρ值。图C是图A中的数据的图形表示。图D是显示STA样品中的AR概率的图。图E显示图D所示的图中使用的数据。图16显示使用Ingenuity系统(IPA ；2008)的跨3个阵列平台的重叠525基因的生物学相关性分析。图17是图16中显示的信息的图形表示。图18显示交叉引用进行的样品和测定的表格。
具体实施方式
描述提供了监测具有移植物的受治疗者的急性排斥(AR)反应，例如以预测、诊断、和/ 或表征AR反应的方法。在实践该主题方法中，评估至少一种基因在来自受治疗者的样品例如血液或活检样品中的表达水平，例如核酸和/或蛋白水平，以监测该受治疗者。还提供了在实践该主题方法中有用的组合物、系统、试剂盒和计算机程序产品。所述方法和组合物可用于多种应用。在更详细地描述本发明之前，应理解本发明不限于所描述的具体实施方式
，因为这些实施方式当然可以变化。还应理解，本文使用的术语仅是出于描述特定实施方式目的， 而不意图限制，因为本发明的范围将仅受所附权利要求的限制。当提供值的范围时，应理解该范围的上限和下限之间的每个中间值(除非上下文另外清楚指明，至下限单位的十分之一)和在所称范围内的其它声称值或中间值涵盖在本发明内。这些更小范围的上限和下限可独立地包括在更小的范围内，并且也涵盖在本发明内，符合所称范围内任何特别排除的限值。当所称范围包括一个或两个限值时，排除所包括的限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明中。某些范围在本文中呈现时数值前有术语“约”。术语“约，，在本文用于提供对其前的准确数字、以及接近或近似于该术语前的数字的数字的文字支持。在确定数字是否接近或近似于具体陈述的数字时，接近或近似的未陈述的数字可以是在其所呈现的上下文中， 提供所述具体陈述的数字的实质等同的数字。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员理解的含义相同的含义。虽然与本文所描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料也可用于实践或测试本发明，但是现在描述了代表性的示例方法和材料。本说明书中引用的所有出版物和专利通过引用并入本文，如同具体和单独地指明每个单独的出版物或专利通过引用并入，并通过引用并入本文以结合所引用的出版物公开和描述所述方法和/或材料。任何出版物的引用是因为其在申请日之前公开，而不应解释为承认本发明没有资格因为先前的发明而早于这样的出版物。另外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，这可能需要独立地确认。应注意，如本文和所附权利要求中所用的，除非上下文另外清楚指明，单数形式 “一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。还应注意的是，权利要求可撰写为排除任何任选的要素。因此，此声明意图充当结合引用权利要求要素使用诸如“仅仅”、“仅”和类似术语的排除性术语、或使用“负”限制的先行基础。如本领域技术人员阅读本公开后将明白的，本文描述和例证的每个单独实施方式具有离散的组件和特征，这些组件和特征可容易地与其它多种实施方式的任何实施方式的特征分离或组合，而不背离本发明的范围或精神。任何所述方法可按所述的事件顺序或以逻辑上可行的任何其它顺序进行。如上所概括的，本发明涉及在受治疗者中监测AR反应的方法、以及用于实践该主题方法的试剂和试剂盒。在进一步描述本发明时，首先描述了该主题方法，然后综述了用于实践该主题方法的试剂和试剂盒。监测急性排斥反应的方法 如以上所综述的，本发明提供用于监测已接受移植物的受治疗者的AR反应的方法。在某些实施方式中，监测受治疗者以预测是否将发生AR反应，其中所述方法可在AR反应发生前6到3个月预测AR。在某些实施方式中，监测受治疗者以确定是否存在持续的AR 反应。在某些实施方式中，监测受治疗者以表征发生或已发生的AR反应，例如来确定先前的AR反应的严重度和/或类别，例如AR反应是否为/曾为类固醇抗性AR反应。在某些实施方式中，本发明包括确定AR反应中被排斥组织的身份的方法。本发明的方面还包括用于确定已接受移植物例如同种异体移植物的受治疗者的免疫遏制方案的方法。因此，本发明的某些实施方式提供评估，例如以预测的方式，包括移植物的受治疗者中的移植物存活的方法。例如，主题方法可用于确定受治疗者是否将发动针对移植物的 AR反应，在缺乏有效的免疫遏制干预下，该AR反应将造成移植物组织的丧失。因此，本发明提供评估移植患者或受治疗者中的移植物是将存活或将丧失的方法。在某些实施方式中， 所述方法可被视为确定移植受治疗者是否具有移植物存活表型即其中移植物将存活的表型的方法。移植物存活表型是特征为长期移植物存活的存在的表型。“长期”移植物存活意指在当前取样之外移植物存活至少约5年，尽管发生AR的一次或多次先前发作。在某些实施方式中，确定已发生至少一次急性排斥(AR)发作的患者的移植物存活。因此，这些实施方式是确定或预测AR后的移植物存活的方法。在移植疗法例如免疫遏制疗法上下文的某些实施方式中，确定或预测移植物存活，其中免疫遏制疗法是本领域已知的。在又其它的实施方式中，提供了确定急性排斥的类别和/或严重度(而不仅是其存在)的方法。如移植领域已知的，移植物器官、组织或细胞可以是同种的或异种的，以致移植物可以是同种异体移植物或异种移植物。感兴趣的器官和组织包括但不限于皮肤、心脏、肾、 肝、骨髓和其它器官。在实践主题方法中，测定受治疗者或患者样品，例如细胞或其集合，例如，组织，以监测宿主的AR反应。因此，主题方法的第一步是从感兴趣的患者，即受治疗者或患者具有至少一种移植物例如同种异体移植物的患者，获得合适的样品。样品来源于任何初始的合适来源，其中感兴趣的样品来源包括但不限于许多不同的生理来源，例如脑脊液(CSF)、尿、唾液、泪液、组织来源样品例如勻浆物(诸如移植的组织或器官的活检样品(包括但不限于肾、心脏、肺活检))，和血液或其衍生物。在某些实施方式中，患者样品的合适的初始来源是血液样品。因此，这些实施方式的主题测定中采用的样品一般是血液来源样品。血液来源样品可来自全血或其级分，例如血清、血浆、细胞级分等，其中在某些实施方式中样品来源于从全血收获的血液细胞。作为样品来源特别受关注的是外周血单核细胞/淋巴细胞(PBMC/PBL)。可采用获得此类样品的任何方便方案，其中合适的方案是本领域熟知的(如全血样品的密度梯度分级分离)，并且代表性方案报道于下面的实验部分。在实践主题方法中，测定样品以获得选自表1的一种或多种基因的表达水平评估，例如表达谱，其中术语表达谱用于广泛地包括基因组表达谱，例如感兴趣的一种或多种基因的核酸转录物例如mRNA的表达谱，或蛋白质组表达谱，例如一种或多种蛋白的表达谱，其中蛋白/多肽是所述感兴趣的一种或多种基因的表达产物。因此，在某些实施方式中，仅评估表1中的1种基因的表达水平。在又其它实施方式中，评估表1中的两种或更多种基因例如表1中的3、4或全部5种基因的表达水平。在某些实施方式中，还评估表1中列出的那些之外的一种或多种另外的基因的表达水平，其中在某些实施方式中，所述另外的基因选自表2中列出的那些。这里应注意的是，包括评估表1和2中的基因的任何组合的表达水平的表达谱可用于监测在移入的组织中已发展或易发展AR反应的受治疗者，包括评估表1和2中列出的全部10种基因的表达。表1.表达水平可用于监测具有同种异体移植物的受治疗者中的AR的5种基因
权利要求
1.一种监测已接受同种异体移植物的受治疗者的急性排斥(AR)反应的方法，所述方法包括(a)评估来自所述受治疗者的样品中至少一种基因的表达水平以获得基因表达结果， 其中所述至少一种基因选自由以下组成的组NKTR、MAPK9、DUSPl、PBEFl和PSEm ；和(b)采用所述基因表达结果来在所述受治疗者中预测AR反应的发作、诊断AR反应、和 /或表征AR反应，由此监测所述受治疗者的AR反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其中评估NKTR、MAPK9、DUSPUPBEFl和PSEm的表达水平。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述评估步骤还包括评估以下的一种或多种的表达水平CFLAR、RNF-130, IFNGRl、ITGAX 和 RYBP。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述评估步骤包括测定所述样品的所述至少一种基因的表达产物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述表达产物是核酸转录物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述评估步骤包括RT-PCR测定。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述RT-PCR测定是定量RT-PCR测定。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品是血液样品。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述同种异体移植物是肾同种异体移植物。
10.根据权利要求1所述的方法，其中采用所述基因表达结果来提前6到3个月预测 AR反应的发生。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括评估来自所述受治疗者的所述样品中选自表3或4的至少一种基因的表达水平，以获得第二基因表达结果，以及采用所述第二基因表达结果来确定所述受治疗者是否具有移植物耐受表型。
12.一种用于监测已接受同种异体移植物的受治疗者的急性排斥(AR)反应的系统，所述系统包括(a)基因表达评估元件，该基因表达评估元件配置为用于评估来自所述受治疗者的样品中至少一种基因的表达水平以获得基因表达结果，其中所述至少一种基因选自由以下组成的组NKTR、MAPK9、DUSPl、PBEFl 和 PSENl ；禾口(b)表型确定元件，该表型确定元件采用所述基因表达结果来在所述受治疗者中预测 AR反应的发作、诊断AR反应、和/或表征AR反应，由此监测所述受治疗者的AR反应。
13.根据权利要求12所述的系统，其中所述基因表达评估元件包括用于测定样品的所述至少一种基因的表达产物的至少一种试剂。
14.根据权利要求13所述的系统，其中所述至少一种基因的所述表达产物是核酸转录物。
15.根据权利要求14所述的系统，其中所述基因表达评估元件包括对所述至少一种基因特异的PCR引物。
16.根据权利要求12所述的系统，其中评估全部NKTR、MAPK9、DUSPl、PBEFl和PSEm 的表达水平。
17.根据权利要求12所述的系统，其中所述基因表达评估元件还配置为用于评估以下的一种或多种的表达水平CFLAR、RNF-130, IFNGRU ITGAX和RYBP。
18.根据权利要求12所述的系统，其中所述表型确定元件包括所述至少一种基因的参考表达值。
19.一种用于监测已接受同种异体移植物的受治疗者的急性排斥(AR)反应的试剂盒， 所述试剂盒包括(a)基因表达评估元件，该基因表达评估元件用于评估样品中至少一种基因的表达以获得基因表达结果，其中所述至少一种基因选自由以下组成的组NKTR、MAPK9、DUSPU PBEFl 禾口 PSENl ；禾口(b)表型确定元件，该表型确定元件采用所述基因表达结果来在所述受治疗者中预测 AR反应的发作、诊断AR反应、和/或表征AR反应，由此监测所述受治疗者的AR反应。
20.一种用于监测已接受同种异体移植物的受治疗者的急性排斥(AR)反应的计算机程序产品，其中当装载于计算机上时，所述计算机程序产品配置为采用来自从所述受治疗者获得的样品的基因表达结果来确定AR监测结果，和以用户可读格式向用户提供所述AR 监测结果，其中所述AR监测结果选自在所述受治疗者中预测AR反应的发作、诊断AR反应、 和/或表征AR反应，其中所述基因表达结果包括选自以下的一种或多种的表达数据NKTR、 MAPK9、DUSP1、PBEFl 禾口 PSENl。
全文摘要
提供了监测具有移植物的受治疗者的急性排斥(AR)反应，例如以预测、诊断、和/或表征AR反应的方法。在实践该主题方法中，评估至少一种基因在来自受治疗者的样品例如血液或活检样品中的表达水平，例如核酸和/或蛋白水平，以监测该受治疗者。还提供了在实践该主题方法中有用的组合物、系统、试剂盒和计算机程序产品。
文档编号C12Q1/68GK102439172SQ201080012756
公开日2012年5月2日 申请日期2010年1月11日 优先权日2009年1月15日
发明者M·M·萨尔沃 申请人:利兰·斯坦福青年大学托管委员会