肾移植排斥反应抑制剂的制作方法

专利名称：肾移植排斥反应抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及肾移植排斥反应抑制剂。特别是，本发明涉及抗C D80抗体或者其抗原亲和性片段，以及抗CD86抗体或者其抗原亲和性片段在制备肾脏移植排斥反应抑制剂中的应用。
背景技术：
器官移植是内科疗法以及外科处置中，对那些无法选择其他的方法进行治疗的疾患所采取的疗法。接受脏器移植的患者，为了抑制T细胞所导致的急性排斥反应，手术后必须每天投与非特异性免疫抑制剂。然而，像预防肾移植器官排斥反应的钙调神经磷酸酶抑制剂(calcineurin repressor)以及类固醇等的免疫抑制剂，都有可能导致由于免疫力异常低下引起的感染，高血压，高脂血症，肾脏毒性以及癌症的发生。
为了克服上述非特异性免疫抑制剂所存在的问题，最好是能够有针对性地抑制具有同种异体反应性(alloreactivity)排斥反应的T细胞，诱导其产生对移植器官的免疫宽容。用于诱导免疫宽容的一个方法，就是对共同的刺激分子使用单克隆抗体(以下用[mAb]表示)，在短期内进行免疫宽容诱导处置。已经证明，只要阻断啮齿类动物体内CD28/B7或者是CD40/CD40L的反应途径，就能够延长同种心脏移植器官的存活时间(Lenschow，D.J.et al.(1992)Science.257789-791；Lenschow，D.J.et al.(1995) Transplantation. 601171-1178；Bashuda，H.et al.(1996)Transplant. Proc.281039-1041；Larsen，C.P.et al.(1996)Transplantation.614-9；Larsen，C.P.et al.(1996) Nature.381434-438)。然而也有报告称，对于小鼠器官移植动物模型，实施阻断共同的刺激分子的方法没有奏效(Li，Y.et al.(1999)Nat.Med.51298-1302；Dharnidharka，V.R.，Schowengerdt，K.，and Skoda-Smith，S.(2000)Nat.Med.6115)。
使用mAb进行免疫宽容诱导处置的其他例子还有，通过对猕猴使用抗CD40L mAb以及CTL-associated antigen-4(CTLA-4)Ig(Kirk，A.D.et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.948789-8794)，或者使用抗CD40L mAb进行单独免疫宽容诱导处置(Kirk，A.D.et al.(1999)Nat.Med.5686-693)，证明可以有效地延长同种肾移植的存活时间，并被认为有应用于临床治疗的前景。然而，这种试验药物的临床试验，近几年却由于意想不到的血栓栓塞性的合并症而被中止了(Kawai，T.，Andrews，D.，Colvin，R.B.，Sachs，D.H.，and Cosimi，A.B.(2000)Nat.Med.6114；Boumpas，D.T.et al.(2003)Arthritis Rheum.48719-727)。对人类使用mAb抑制CD40的效果，不像对猕猴那么理想，(Pearson，T.C.et al.(2002)Transplantation.74933-940)。像这样，对于大型动物模型，尽管采取了种种旨在减少使用同种移植免疫抑制剂的尝试(Kirk，A.D.(2003)Immunol.Rev.196176-196)，但对于包括人类在内的灵长类来说，要达到对同种移植器官的免疫宽容仍然是非常困难的。
近年来通过在活体外和活体内的试验，已经证实了无细胞免疫反应性T细胞，具有抑制因子活性的功能(Lombardi，G.，Sidhu，S.，Batchelor，R.，and Lechler，R.(1994)Science.2641587-1589；Chai，J.G.et al.(1999)Eur.J.Immunol.29686-692；Luo，Z.J.et al.(2000)Transplantation.692144-2148)。无细胞免疫反应性T细胞被应用于移植器官对于宿主的风险相对较低的，人的组织不适应性骨髓移植上(Guinan，E.C.et al.(1999)N.Engl.J.Med.3401704-1714)。

发明内容本发明的目的在于对接受肾移植的患者，即便不投与以前的非特异性免疫抑制剂，也可以有效地抑制肾移植的排斥反应。即提供一种新型的肾移植排斥反应抑制剂。
经过本专利发明者的潜心研究，在抗CD80抗体或者其抗原亲和性片段，以及抗CD86抗体或者其抗原亲和性片段存在的情况下，通过使用肾脏供体的同种抗原(alloantigen)，刺激从肾脏移植受体上采取的T细胞，并通过将这些接受过肾脏供体同种抗原刺激的T细胞，输送回肾脏移植受体体内的方法，达到诱导肾脏移植受体产生对供体肾脏的免疫宽容，从而抑制肾脏移植后的排斥反应。这就是本专利发明所要达到的，即使不使用长期以来所使用的免疫抑制剂，也能够达到防止排斥反应的效果。
本发明提供了一种肾移植排斥反应抑制剂，其通过以下方式制备在所述抗CD80抗体或者其抗原亲和性片段，以及抗CD86抗体或者其抗原亲和性片段存在下，通过使用来自肾脏供体外周血的同种抗原刺激从肾脏移植受体上采取的T细胞，其中经刺激的受体T细胞为肾脏移植排斥反应抑制剂的有效成分。
本发明提供了抗CD80抗体或者其抗原亲和性片段，以及抗CD86抗体或者其抗原亲和性片段在制备肾脏移植排斥反应抑制剂中的应用，其中，所述肾脏移植排斥反应抑制剂在所述抗CD80抗体或者其抗原亲和性片段，以及抗CD86抗体或者其抗原亲和性片段存在下，通过使用肾脏供体同种抗原刺激从肾脏移植受体上采取的T细胞得到，其中，所述受体T细胞为肾脏移植排斥反应抑制剂的有效成分。
即本发明所提供的是一种通过使用肾脏供体的同种抗原，在抗CD80抗体或者其抗原亲和性片段以及抗CD86抗体或者其抗原亲和性片段存在的情况下，刺激从肾脏移植受体上采取的T细胞所取得的，将上述受体T细胞作为有效成分的肾移植排斥反应抑制剂。
本发明使接受肾移植的患者，不必再长期接受免疫抑制剂，也能够有效地抑制肾移植后的排斥反应。在解除了接受肾移植的患者长期接受免疫抑制剂的烦恼的同时，还可以避免由于接受免疫抑制剂而可能伴随的免疫力异常低下而引起的感染，高血压，高脂血症，肾脏中毒以及癌症发生的危险。
附图简要说明

图1表示使用本发明的肾移植排斥反应抑制剂进行治疗的实例概略图，在有星状记号的日期表示进行了CsA(8mg/kg/d)的肌肉内投与。在术后第6，7，8天进行了CP(30mg/kg)的肌肉内投与。在手术期间，供体以及受体都作了脾脏摘除。来自受体的脾脏T细胞，在有抗CD80/CD86 mAb存在的情况下，同经过13天放射线处理的供体脾细胞进行了共同培养，然后注射到受体体内，其后未进行任何其他的免疫抑制剂的投与。
图2通过进行肾移植后的A群(n＝6)的血清肌酸酐浓度指标，反映移植腎的肾脏功能的一个图表。涂黑的箭头表示没有发生排斥反应的生存状态。
图3表示受体(A群)CsA的全血中浓度(ng/ml)的一个图表。从肾移植手术的当天到第7天以及第9，11，13天都进行了CsA(8mg/kg)的肌肉内注射。实线表示生存1年以上的动物(n＝3)；虚线表示1年以内死亡了的动物(n＝3)。
具体实施方式本发明是一种通过使用肾脏供体同种抗原(alloantigen)，在抗CD80抗体或者其抗原亲和性片段，以及抗CD86抗体或者其抗原亲和性片段存在的情况下，刺激从肾脏移植受体上采取的T细胞所取得的，将上述来自受体的T细胞作为有效成分的肾移植排斥反应抑制剂。通过给上述肾脏移植受体投与本发明的肾移植排斥反应抑制剂，能够诱导受体产生对来自供体的肾脏的免疫宽容，从而达到抑制肾移植后排斥反应的目的。
在制作本发明的肾脏移植排斥反应抑制剂有效成分时，为了能在阻断CD80以及CD86反应途径的状态下，使用供体的同种抗原刺激受体的T细胞，需要使用CD80以及CD86各自的抗体或抗原亲合性片段(以下称为″抗体等″)。抗体可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。所谓的抗原亲和性片段是指和抗原有亲和性的抗体片段，包括像Fab片段以及F(ab′)2片段那样的抗体片段，抗体的轻链(light chain)和抗体的重链(heavy chain)，以及他们各自的可变域(Variable region)所组成的包括像ScFVs(single chain fragment of variable region)那样的人工直链抗体。上述的抗体或抗原亲和性片段，在制作本发明的肾移植排斥反应抑制剂有效成分时，最好是使用单克隆抗体。
来自受体的T细胞一般是从脾脏，或者是从末梢血中采取。
供体的异种抗原刺激最好是将来自受体的T细胞，和发现异种抗原的供体细胞进行共同培养后再实施，作为供体异种抗原来源的供体细胞，最好是从供体的脾细胞或者是从供体的末梢血，采取抗原提呈细胞(antigen presenting cell)。
来自受体的T细胞，最好是在抗CD80抗体或者其抗原亲和性片段，以及抗CD86抗体或者其抗原亲和性片段存在的情况下，和上述来自供体的细胞一起进行共同培养。共同培养最好放在液体培养基中进行浮游培养。开始培养时培养液中的来自受体T细胞的细胞密度，虽然没有特殊的规定，一般为4×105个/mL～4×107个/mL左右、能控制在2×106个/mL～8×106个/Ml左右更好。来自受体的T细胞和来自供体细胞的混合比率虽然没有特殊的规定，一般受体T細胞数和供体細胞数的比率为1∶0.5～1∶2左右、如果能控制在1∶0.7～1∶1.3左右更好、最好能达到1∶1左右。另外，供体细胞最好是经过放射线处理，使其丧失增殖能力后再进行培养。再有，添加在培养液中的抗CD80抗体以及抗CD86抗体等的浓度、虽然没有特殊的规定，一般各自应控制在1μg/mL～100μg/mL左右、如果能控制在5μg/mL～20μg/mL更好。共同培养的时间、虽然没有特殊的规定，一般应为6～24天左右、最好是在8～16天左右。
培养基可以使用过去培养T细胞所使用的培养基，例如，可以用市售的AIM-V培养基(Invitrogen Corp.)。培养基中最好添加受体的血清，浓度要求虽然没有特殊的规定，一般来说培养基的最终浓度为0.5～2重量％左右、最好是控制在0.7～1.5重量％左右。培养条件最好在培养人的细胞所常用的加湿5％CO2，37℃的环境下进行。但也不必拘泥于这个条件。另外，共同培养分为2次进行，将经过第一次共同培养生存的T细胞回收后，最好是将该回收的T细胞和新鲜的来自供体的T细胞混合在一起，进行第二次共同培养。每次的共同培养都需要在抗CD80的抗体或者是抗原亲和性片段，以及抗CD86的抗体或者是抗原亲和性片段存在的情况下进行、每回共同培养的时间最好在3～12天左右。第一次和第二次共同培养需要的条件如上所述。通过上述的共同培养，受体T细胞对于供体细胞的敏感性将会消失，也就是说会成为无细胞免疫反应性的T细胞。
本发明的肾移植排斥反应抑制剂是，经过上述共同培养后即可成为将来自受体的T细胞，作为有效成分的制剂。从培养基中回收经过上述共同培养后的T细胞，最好是让其浮遊在像生理盐水等，适合输送回受体体内的等浸透压液体中，成为本发明的肾移植排斥反应抑制剂。此时不必将受体的T细胞和供体的细胞进行分离，即使含有供体的细胞也没有关系。因为此时供体的细胞经过放射线处理已经丧失了增殖的能力，所以在共同培养中它不能增殖且数量较少，即使输送到受体体内也不能分裂，不久会自行消亡。另外，投与用的浮游液中的受体T细胞的细胞密度，虽然没有特殊的规定，一般控制在1×106个/mL～1×107个/mL左右。再者，进行共同培养所用的抗CD80抗体以及抗CD86抗体等，最好不要将其混入肾移植排斥反应抑制剂中，所以进行上述的共同培养以后，使用不含有这些抗体的培养基培养0.5-2天，然后进行清洗。在上述的浮游液中，可以含有1种或者是2种以上的添加剂，但是这些添加剂，是以不影响适合输送回受体体内，而且具有等浸透压等的生理学特性，并且不妨碍其有效成分的上述T细胞的效果为前提的。
本发明的肾移植排斥反应抑制剂，是非经口投与到受体体内的。作为非经口投与的方法有静脉内，动脉内，肌肉内，腹腔内以及皮下投与等各种方法，最好的方法是通过静脉内给肾移植受体投与。另外，投与量要根据受体的状态，体重，年龄等条件进行适当的选择。一般来说，受体T细胞的投与量一般每次为107个～109个左右，最好是能控制在5×107个～5×108个左右。作为本发明的肾移植排斥反应抑制剂，虽说可以分为多次进行投与，但只进行一次的投与也可以收到预期的效果。投与的时间一般在接受肾移植后的6-20天进行，最好是在10-16天后至少投与一次。另外，从肾移植后到投与本发明的肾移植排斥反应抑制剂这段时间内，最好是通过三甲基环己醇A等的免疫抑制剂的投与来防止排斥反应。
为了充分地发挥本发明的肾移植排斥反应抑制剂的效果，在投与肾移植排斥反应抑制剂前，通过cychlophosphamide(CP)等的投与，使受体体内的淋巴细胞减少，这一点是很重要的。减少淋巴细胞的处置，最好是在投与本发明肾移植排斥反应抑制剂前的3-9天进行。然后进行2-4天cychlophosphamide(CP)的连续投与。投与本发明的肾移植排斥反应抑制剂时，从抑制肾移植排斥反应的角度来看，此时受体血液中的淋巴细胞能应控制在1600个/mm3以下、最好是能控制在200～800个/mm3左右。
以下通过实验例和比较例对本发明进行具体地说明，但绝不是说本发明仅局限于下列的实施例和比较例。(1)动物，MHC标记以及供体和受体的选择从Hamri公司购入了一些对猴免疫不全病毒以及乙型肝炎病毒呈血清阴性反应的，非近亲交配的年轻雄性猕猴Macaca mulatta(年龄2～3岁、体重3～4kg)，这些猕猴的外科处置以及手术后的处理，都是遵照非人灵长类实验的基本原则(日本灵长类学会制定)，并得到了顺天堂大学动物研究专门委员会的承认，有关供体和受体的组合以及第三者群的个体，选择了MHC1组和2组遗传基因排列不同的两组。1组的不一致性正如Knechtle，S.J.et al.(1997)Transplantation 631-6中所记载的那样、在作血清学的判断以后又进行了1维等电聚焦电泳的鉴别。通过试管MLR测定了受体T细胞对于供体的敏感性。为了证实各种动物所具有的移植排斥性，对所有可能做为供体的动物进行了检查。有关遗传基因排列的不一致性正如Knapp，L.A.，et al.(1997)Immunogenetics 45171-179中所记载的那样，通过变性剂浓度曲线凝胶电泳以及DRB の第二外显子的直接顺序进行了验证。
(2)抗体从eBioscience Inc.(加利福尼亚州San Diego)获取了针对人CD80及CD86的mAb抗体(分别为2D10和IT2.2)。又从BD Bioscience的Pharmingen购入了猕猴CD3-FITC(SP34)，猕猴CD4-PE(L200)，人CD20-PE(2H7)以及猕猴CD14-PE(M5E2)抗体。还有从eBioscience Inc获取了CD25-FITC(M-A25 1)以及CD152-PE(14D3)抗体。
(3)肾移植排斥反应抑制剂的调制采用无菌操作取出脾脏，用机械方法将其切成碎末，放进含有自身的血清(来自受体本身)的AIM-V培养基(Invitrogen Corp.)中制成悬浊液，然后用尼龙筛网进行过滤，用同性质的溶液进行处理清除红血球。来自受体的T细胞则是通过nylon column法过滤取得的。为了获得无细胞免疫反应性细胞，我们将添加了受体血清的AIM-V培养基50ml的一个大的带盖玻璃细菌培养器(标号430599；Coming Inc.)中，在抗CD80/CD86 mAb(各10μg/ml)存在的情况下、对2×108个受体脾脏T细胞和经过30 Gy放射线照射过的供体脾细胞2×108个进行了共同培养。在加湿5％CO237℃的条件下培养了6天后，再对生存细胞进行了收集和计数。然后使用相同数量的经过放射线照射过的供体脾细胞，对这些脾细胞在抗CD80/CD86 mAb存在的情况下，进行了6天的再刺激。经过3次清洗后，再放在没有mAb抗体的培养基中培养1天，对生存细胞进行收集后，用50ml的生理盐水制成悬浊液，做好进行受体静脉内投与的准备。
(4)混合淋巴细胞培养反应(MLR)从猕猴身上取得的末梢血，通过Separate-L(Muto Pure ChemicalsCo.，Ltd.)的离心后制取PBMC(末梢血単核细胞)。CD4+T細胞是通过非标记CD4+8T細胞的Untouched CD4+T cell Isolation Kit(MiltenyiBiotec)阴极板提纯方式制取的。CD4+T細胞或者经过上述培养获得的无细胞免疫反应性T细胞(105个)，是在圆形96孔板(标号3799；ComingInc.)中、在使用或者不使用10μg/ml的抗CD80/CD86 mAb，或者10单位的替换IL-2(盐野义制药公司产品)的情况下、进行了与经过30Gy放射线处理过的相同数量的供体脾细胞的共同培养。该细胞的培养大约需要3-7天，在培养的最后的18小时使用10μCi的[3H]胸腺嘧啶脱氧核苷进行了脉冲刺激。所取得的放射能量是通过1450 MicroBetacounter(PerkinElmer)进行測定的。
(5)肾移植腎移植在上述通过MHC以及MLR的分析，被判定为组织不适应性的一对供体和受体之间进行。供体和受体的动物的麻醉是通过按1mg/kg肌肉内注射氯胺酮(三共公司产品)，以及按1mg/kg注射XYLAZINE.(Bayer AG公司产品)进行的。供体和受体在手术过程中都进行了脾脏摘除。在摘取移植肾时，对供体进行了肝素处理(100U/kg)。在进行同种肾移植时，为了有利于供体的肾动脉同受体的远端大动脉之间的缝合，以及供体的肾静脉同受体的大静脉之间的缝合，采用了标准的显微血管技术。接着实施了一次尿管新膀胱的缝合。在腹腔缝合以前进行两侧未处置肾的摘除。对于这些动物，在它们恢复进食以前提供了48小时的静脉营养。作为外科手术后的抗菌预防措施，实施了3天头孢美唑(三共公司产品)的投与。
(6)肾移植后的处置从手术当天到术后第7天以及术后的第9，11，13天时，都要对肾移植受体进行脂溶性三甲基环己醇A(CsA)8mg/kg(Sandimmune；Novartis Pharma AG)的肌肉内投与，为了在乙醇抽出后，使用放射性分析测定CsA的浓度，每周抽取了2次EDTA血样，为了减少受体的白血球，肾移植后的第6天到第8天，每天都要进行30mg/kg的cychlophosphamide(CP)的肌肉内投与(盐野义制药公司产品)。术后第13天进行无细胞免疫反应性细胞的静脉内接种，以后再没有进行任何免疫抑制剂的投与(A群、n＝6、図1)。对血清肌酸酐，血中尿素氮，全蛋白质以及血红蛋白浓度，红细胞压积，白血球数，血小板数等，移植后3个月内要每周测定2次，以后要每2周测定1次。
(7)统计学的解析数据用平均值±SD来表示，将2种处置群所获得的数值用StatView 4.5 for Macintosh(SAS Institute Inc.)统计软件进行处理、并通过非参数的(non-parametric)Mann-Whitney U检测进行比较，以有意概率P＜0.05作为判断基准。
(8)移植肾没有成活的个体的判断和处置依据美国实验动物管理认定协会(American Association forAccreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC))的标准，当血清的肌酸酐不断上升导致发生了肾功能不全，或者是确认体重同移植前比较下降了15％的时候，可以对进行实验的猕猴实施安乐死。
(9)组织像的观察方法为了进行组织学的评价，使用有20种规格针孔的装置(Biopsy-Cut；Bard)，从一部分动物实验个体上获取了肾脏活检的试料。对于那些死亡的猕猴进行了全面彻底的分析，以及组织病理学的解析。为了对肾脏活检以及剖检的样品进行光学显微镜检查，在稀释的10％的甲醛溶液中将组织固定，并用石蜡包埋。为了做组织学的检查，进行了H&E和PAS的染色。使用Movat pentachrome进行弹性纤维染色，确认了血管中的变化。
(10)A群个体肾移植后情况的观察在A群中有3只(猕猴)的生存时间很长(实验结束后生存了410天-880天)。正如后面叙述的那样，有1只猕猴由于患急性肾功能不全在手术后75天死亡(见表1)。为了进行组织学性状的解析所做的肾活检的1只猕猴，由于肾活检后的出血无法控制，在手术后81天死亡。而在手术后212天死亡的1只猕猴，虽然死亡前曾出现过血清肌酸酐浓度上升的现象，但死亡的原因并不是典型的急性或者是慢性的排斥反应，而被推测为死于尿路狭窄引起的肾积水。A群移植肾的平均生存天数为416±365天。生存期较长的3只猕猴，虽然手术后14天以内血清肌酸酐的浓度略有上升，但是，在进行无细胞免疫反应性细胞接种以后，再没有出现过移植肾的肾功能异常的情况(见图2)，血清CsA的浓度接种时为92～142ng/ml，以后数值逐渐降低，最后一次投与约经过45～60天以后，已经无法测出血清CsA的浓度(见图3)。至实验结束时为止，这些猕猴都没有发生感染和恶性疾患。
(11)关于无细胞免疫反应性细胞的数量和肾移植排斥反应抑制剂的效果投与了含有6×107个以上的无细胞免疫反应性细胞的肾移植排斥反应抑制剂的个体、血清肌酸酐浓度在手术后第7天达到1.2±0.4mg/dl、其后逐渐降低。但是，投与了含有4×106个无细胞免疫反应性细胞的肾移植排斥反应抑制剂的个体、血清肌酸酐浓度在手术后第67天开始逐渐上升，在手术后第75天死于因细胞性排斥反应引起的急性肾功能不全(见表1)。由此可见如果不含有足够的无细胞免疫反应性细胞的话，恐怕无法达到肾移植排斥反应抑制剂所预期的效果。
表1
表2
表中的数值是平均值±SD。对所有的受体都进行了脾脏摘除。[生存]栏的数值是表示本群各动物的相关数值。分别为A急性腎功能不全引起的死亡；B4×106个細胞接种；C腎活检查后因失血而引起的死亡；D因尿管狭窄导致肾积水而引起的死亡等。
(12)A群个体移植腎的组织像对术后75天，810天以及尸检个体的移植肾上获取部分肾脏组织进行了检查。结果发现，在A群猕猴中，移植肾的构造保持良好，移植肾中没有发现肾小管炎以及肾小球炎的迹象，血管中也没有内膜的过度形成或者是肥厚的现象，在生存期较长的动物的细胞壁里，也没有偶发性炎症细胞的出现。上述在术后81天和212天死亡的2只猕猴中，也没有发现肾小管浸润和肾小球的损伤，以及软组织坏死等的迹象。
比较例1B群(n＝5)在肾移植后除了没有投与本发明的肾移植排斥反应抑制剂以外，其他的条件均与A群相同，观察的结果，5只猕猴在手术后15-28天以内，全部死于急性排斥性反应(见表1)，移植肾的平均生存天数为22±6.5日；n＝5；P＜0.005、显示出了同A群的明显的差异。
比较例2对于个体群C群(n＝5)使用的肾移植排斥反应抑制剂，不是用来自供体的T细胞而是用来自第三者群采集的细胞进行共同培养而制成的，对于除此之外其他的条件均与A群相同，术后观察的结果，5只猕猴全部死于急性排斥性反应(见表1)。移植肾的平均存活天数为47.0±19.0日；n＝5；P＜0.005、显示出了同A群的明显的差异。
参考例对除了在肾移植手术后不进行CP的投与外，其他的条件均与A群相同的个体群D群(n＝2)术后观察的结果，A群的个体、在投与本发明肾移植排斥反应抑制剂时的淋巴细胞数为200～800个/mm3、嗜中细胞以及血小板数分别为1,540±470个/mm3，37.4×104±4.0×104个/mm3、相比之下、D群的淋巴细胞数为3,920±120个/mm3。对于D群的猕猴，尽管投与了含有9×107±0.5×107个无细胞免疫性细胞的腎移植排斥反应抑制剂，但是，在术后27天和28天，死于急性排斥反应。由此可见，在投与本发明的肾移植排斥反应抑制剂时，受体体内的淋巴细胞的数量在没有降低到适当的程度时，恐怕无法达到肾移植排斥反应抑制剂所预期的效果。
比较例3对来自供体的T细胞和来自受体的T细胞进行共同培养时，除了使用在培养基中只添加抗CD86 mAb来制作肾移植排斥反应抑制剂以外，其他的条件均与A群相同的个体群E群(n＝4)，以及除了使用在培养基中只添加抗CD80 mAb来制作肾移植排斥反应抑制剂以外，其他的条件均与A群相同的个体群F群(n＝1)进行术后观察的结果，发现这些个体只是移植肾的生存时间延长了43-111天，效果并不十分理想。这些个体死亡前5-7天血清肌酸酐的浓度有所上升。在对E群出现排斥反应的所有移植肾的组织学检查中，发现了有并发肾小管炎、肾小管损伤以及肾小球的损害、间质中的単核細胞导致的散在性的浸潤，以及由于小动脉的内膜增厚而引起的严重的内皮炎、由此可以证明了发生过急性細胞性排斥反应。
比较例4由于从供体的脾脏取得供体T细胞的方法大大限制了本发明在实践中的应用，发明者在上述其他条件相同的情况下，采用从供体外周血中采取T细胞的方法进行了试验。所用抗CD80/CD86抗体的浓度分别为1、5、10ug/ml。结果参见表2。在抗体浓度为5和10ug/ml时，采用从外周血取得的T细胞处理的方法同样使得生存时间得到了显著性的延长。
参考文献非专利文献1Lenschow，D.J.et al.(1992)Science.257789-79非专利文献2Lenschow，D.J.et al.(1995)Transplantation.601171-1178非专利文献3Bashuda，H.et al.(1996)Transplant.Proc.281039-10非专利文献4Larsen，C.P.et al.(1996)Transplantation.614-9非专利文献5Larsen，C.P.et al.(1996)Nature.381434-438非专利文献6Li，Y.et al.(1999)Nat.Med 51298-130非专利文献7Dharnidharka，V.R.，Schowengerdt，K.，andSkoda-Smith，S.(2000)Nat.Med 611非专利文献8Kirk，A.D.et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.948789-879非专利文献9Kirk，A.D.et al.(1999)Nat.Med.5686-69非专利文献10Kawai，T.，Andrews，D.，Colvin，R.B.，Sachs，D.H.，and Cosimi，A.B.(2000)Nat.Med.611非专利文献11Boumpas，D.T.et al.(2003)Arthritis Rheum.48719-72非专利文献12Pearson，T.C.et al.(2002)Transplantation.74933-940非专利文献13Kirk，A.D.(2003)Immunol.Rev.196176-19非专利文献14Lombardi，G，Sidhu，S.，Batchelor，R.，andLechler，R.(1994)Science.2641587-1589非专利文献15Chai，J.G.et al.(1999)Eur.J.Immunol.29686-69非专利文献16Luo，Z.J.et al.(2000)Transplantation.692144-2148非专利文献17Guinan，E.C.et al.(1999)N.Engl.J.Med.3401704-171非专利文献18Alexander，J.W.et al.(1984)Transplantation.37467-470非专利文献19Knechtle，S.J.et al.(1997)Transplantation631-非专利文献20Knapp，L.A.，et al.(1997)Immunogenetics45171-179
权利要求
1.一种肾移植排斥反应抑制剂，其通过以下方式制备在所述抗CD80抗体或者其抗原亲和性片段，以及抗CD86抗体或者其抗原亲和性片段存在下，通过使用来自肾脏供体外周血的同种抗原刺激从肾脏移植受体上采取的T细胞，其中经刺激的受体T细胞为肾脏移植排斥反应抑制剂的有效成分。
2.根据权利要求1的肾移植排斥反应抑制剂，其中所述同种抗原刺激，是在所述受体T细胞和发现了同种抗原的供体细胞共同培养的条件下进行的。
3.根据权利要求2所述的肾移植排斥反应抑制剂，其中抗CD80抗体以及抗CD86抗体是单克隆抗体。
4.根据权利要求2任一项所述的肾移植排斥反应抑制剂，其中所述供体细胞是已经丧失了增殖能力的细胞。
5.根据权利要求4的肾移植排斥反应抑制剂，其中供体细胞是经过放射线处理丧失了增殖能力的细胞。
6.根据权利要求2的肾移植排斥反应抑制剂，其中共同培养需要6-24天的时间。
7.根据权利要求6的肾移植排斥反应抑制剂，其中共同培养需要经过8-16天的时间。
8.根据权利要求2的肾移植排斥反应抑制剂，其中共同培养分为两次进行，将第一次共同培养中存活的T细胞，提供给第二次共同培养使用。
9.根据权利要求8的肾移植排斥反应抑制剂，其中第一次和第二次的共同培养各需要经过3-12天的时间。
10.根据权利要求1-9任一项的肾移植排斥反应抑制剂，其中所述的抗CD80抗体或者其抗原亲和性片段，以及抗CD86抗体或者其抗原亲和性片段的浓度是5μg/ml。
11.根据权利要求2的肾移植排斥反应抑制剂，其中受体T細胞数和供体細胞数的比率为1∶0.5～1∶2。
12.根据权利要求2的肾移植排斥反应抑制剂，其中受体T細胞数和供体細胞数的比率为1∶1。
13.抗CD80抗体或者其抗原亲和性片段，以及抗CD86抗体或者其抗原亲和性片段在制备肾脏移植排斥反应抑制剂中的应用，其中，所述肾脏移植排斥反应抑制剂在所述抗CD80抗体或者其抗原亲和性片段，以及抗CD86抗体或者其抗原亲和性片段存在下，通过使用来自肾脏供体外周血的同种抗原刺激从肾脏移植受体上采取的T细胞得到，其中，所述受体T细胞为肾脏移植排斥反应抑制剂的有效成分。
14.根据权利要求13的应用，其中所述同种抗原刺激，是在所述受体T细胞和发现了同种抗原的供体细胞共同培养的条件下进行的。
15.根据权利要求14所述的应用，其中抗CD80抗体以及抗CD86抗体是单克隆抗体。
16.根据权利要求14任一项所述的应用，其中所述供体细胞是已经丧失了增殖能力的细胞。
17.根据权利要求16的应用，其中供体细胞是经过放射线处理丧失了增殖能力的细胞。
18.根据权利要求14的应用，其中共同培养需要6-24天的时间。
19.根据权利要求18的应用，其中共同培养需要经过8-16天的时间。
20.根据权利要求14的应用，其中共同培养分为两次进行，将第一次共同培养中存活的T细胞，提供给第二次共同培养使用。
21.根据权利要求20的应用，其中第一次和第二次的共同培养各需要经过3-12天的时间。
22.根据权利要求13-21任一项的应用，其中所述的抗CD80抗体或者其抗原亲和性片段，以及抗CD86抗体或者其抗原亲和性片段的浓度是5μg/ml。
23.根据权利要求14的应用，其中受体T細胞数和供体細胞数的比率为1∶0.5～1∶2。
24.根据权利要求14的应用，其中受体T細胞数和供体細胞数的比率为1∶1。
全文摘要
本发明提供了一种肾移植排斥反应抑制剂。本发明的肾脏移植排斥反应抑制剂在抗CD80抗体或者其抗原亲和性片段，以及抗CD86抗体或者其抗原亲和性片段存在下，通过使用肾脏供体同种抗原刺激从肾脏移植受体上采取的T细胞得到，其中，所述受体T细胞为肾脏移植排斥反应抑制剂的有效成分。
文档编号A61P37/06GK1969883SQ200610146509
公开日2007年5月30日 申请日期2006年11月14日 优先权日2005年11月14日
发明者奥村康, 場集田寿, 陈建君 申请人:科罗斯生物技术株式会社