专利名称：用于预防和/或治疗慢性排斥的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及下列通式(I)或(II)的化合物用于制造预防和/或治疗移植器官或组织中慢性排斥的药物的用途。
背景技术肝、肾、肺和心脏的器官移植作为晚期器官疾病的治疗正在有规律地进行。移植结果已经随着组织分型、手术技术、和更有效的免疫抑制治疗方面改进的发展而逐渐提高。然而，由于慢性排斥的问题，器官移植对于不可逆的器官疾病仍然不是一种临床上可使用的解决方法。
慢性排斥，其表现为渐近性和不可逆的移植物机能障碍，是临床移植中晚期器官移植失败的其中一个主要原因。
具有预后的典型的慢性排斥是一种动脉硬化-样改变，如移植物血管病变、移植物脉管疾病、移植物动脉硬化、移植物冠状疾病、血管狭窄、间质纤维化等。这种血管损害的特征在于平滑肌细胞的迁移和增殖，即，可导致内膜增殖和变厚，平滑肌细胞肥大修复，并最终导致逐渐性腔闭塞(血管改型)。特别是，在肾中，慢性排斥可被称作慢性同种异体移植肾病。
慢性排斥看起来是残酷和不可控制的，这是因为还没有已知的有效疗法或预防形式。因此，仍然存在着对有效预防和/或治疗临床器官移植中慢性同种异体移植排斥药物的需要。
有关本发明中所用的化合物(I)或(II)，在USP 5,308,865中已知该化合物(I)或(II)可用于治疗类风湿性关节炎、免疫或非-免疫源的慢性炎性疾病，和癌症。虽然慢性炎性疾病已经在该专利中公开，但它与特征在于血管损害的移植器官中慢性排斥不同，因此移植器官中的慢性排斥没有被公开。
在EP 0665013中，已知来氟洛米和相关化合物可在血管损伤后减少平滑肌细胞的过度增殖，因此这些化合物可用于预防和治疗血管损伤后的血管狭窄和动脉硬化。然而，本发明的化合物(I)或(II)并没有在该专利申请中公开。此外，本发明的慢性排斥是由于宿主免疫和非-免疫应答而在移植器官的所有脉管中发现的，而该专利申请中描述的疾病似乎是位于损害恢复的受损部分中。因此，这些疾病在胚胎学方面彼此完全不同。
在USP 5,624,946和USP 5,688,824中，已知一般的来氟洛米化合物对控制或逆转移植器官中的慢性排斥具有活性。然而，本发明的化合物(I)或(II)并没有在这些专利中公开。
因此，完全不知道化合物(I)或(II)对预防和/治疗移植器官或组织中慢性排斥具有活性。
发明内容
本发明的发明人已经发现化合物(I)或(II)可有效预防和/或治疗哺乳动物受体中移植器官或组织中的慢性排斥。
因此，本发明提供了用于预防和/或治疗移植器官或组织中慢性排斥的新方法，包括在哺乳动物受体需要时给予其治疗有效量的化合物(I)或(II)。
此外，本发明提供化合物(I)或(II)用于制造预防和/或治疗移植器官或组织中慢性排斥的药物的新用途。
此外，本发明提供了用于预防和/或治疗移植器官或组织中慢性排斥的新药物组合物，其包含治疗有效量的化合物(I)或(II)以及药学上可接受的载体或赋形剂。
能够预防慢性排斥的药物是预防慢性排斥的功能或组织学征兆发生的药物，可在慢性排斥开始前通过长期或短期给药开始。因此，本发明所用的预防慢性排斥是指移植器官或组织的长期保护或维持。
本发明所用的术语“治疗”是指既包括“控制”又包括“逆转”所述疾病的治疗。且能够控制慢性排斥的治疗是一种能够减缓疾病过程发展的治疗，可分别在慢性排斥的功能或组织学征兆后开始。此外，能够逆转慢性排斥的治疗是一种，当在慢性排斥的功能或组织学征兆(分别)出现后开始时，可逆转疾病过程并恢复与正常接近的功能和组织学结果的治疗。
关于本发明的化合物(I)，即(2Z)-2-氰基-3-羟基-N-[4-(三氟甲基)苯基]-2-庚-6-炔酰胺、或化合物(II)，即5-(3-丁炔基)-N-[4-(三氟甲基)苯基]-4-异噁唑甲酰胺，可按照USP 5,308,865的说明书，实施例14或其相似方式生产，且应当理解还存在构像异构体和立体异构体，而这种构像异构体和立体异构体也包括在本发明的范围之内，且化合物(I)可以是另一种互变异构体形式。例如，化合物(I)可以是其烯醇(I)或酮形式(III)，即2-氰基-3-氧代-N-[4-(三氟甲基)苯基]-6-庚炔酰胺，如下列反应方案所示，且这种互变异构体形式也包括在本发明的范围内。
反应方案 烯醇 酮化合物(I)或(II)可以是溶剂化物，其包括在本发明的范围内。所述溶剂化物优选包括水合物及乙醇化物。
本发明的化合物(I)或(II)可以药物制剂的形式，例如，固体、半固体或液体形式使用，其包含化合物(I)或(II)作为活性成分以及适于口服、非肠道如静脉内、肌内、皮下或关节内，外部如局部，肠内、直肠内、经阴道、吸入、眼用、鼻用或舌下给药的有机或无机载体或赋形剂。活性成分可与，例如，通常的非-毒性、药学上可接受的、用于片剂、丸剂、胶囊剂、滴眼剂、栓剂、溶液(例如生理盐水)、乳剂、混悬液(例如橄榄油)、软膏剂、喷雾剂、霜剂、皮肤硬膏剂和适于使用的任何其它形式的载体混合。可使用的载体是固体、半固体、或液体形式的水、葡萄糖、乳糖、阿拉伯胶、明胶、甘露糖醇、淀粉糊剂、三硅酸镁、玉米淀粉、角蛋白、胶态二氧化硅、马铃薯淀粉、尿素或适于制造制剂的其它载体，此外还可使用辅助的稳定剂、增稠剂和着色剂以及香料。活性目标化合物以足以预防和/或治疗移植器官或组织中慢性排斥的有效量包含在药物组合物中。
本发明治疗的哺乳动物包括家畜哺乳动物如母牛、马等，家养动物如狗、猫、大鼠等，和人，优选人。
器官或组织可从供体移植到同一个体(自体移植)、同基因物种(同基因移植)、相同物种(同种异体移植)、或不同物种(异种移植)的受体中。这种移植器官或组织可以是肝、肾、心脏、肺、合并心肺、气管、脾、胰腺(完全或部分，例如，胰岛)、皮肤、小肠、角膜、骨髓、四肢、肌肉、神经、椎间盘、成肌细胞或软骨、或上述任意组合。
用于预防和/或治疗慢性排斥的化合物(I)或(II)可单独给药或与一种或多种其它免疫抑制剂，例如环孢菌素A、他克莫司、瑞帕霉素、硫唑嘌呤、皮质类固醇、抗-淋巴细胞球蛋白或OKT3；特别是环孢菌素A或他克莫司同时、分开或顺序联合给药。此外，用于此用途的化合物(I)或(II)可以药物组合物与上述一种或多种其它免疫抑制剂的混合物形式给药。这种组合或混合药物包括在本发明范围之内。
治疗有效量的化合物(I)或(II)的剂量可发生改变，并取决于所治疗每个个体患者的年龄和情况，通常给予约1mg-10g/体重、优选5mg-5g/体重、更优选10mg-2g/体重的活性成分每日剂量用于预防和/或治疗这种疾病，且通常给予约0.5-1mg、5mg、10mg、50mg、100mg、250mg、500mg、1g、2g和3g的平均单一剂量。用于预防或治疗慢性排斥的人类给药的每日剂量是约0.1-50mg/kg。在组合或混合药物中，例如，他克莫司可以约0.01-5mg/kg、优选0.05-0.5mg/kg的每日剂量给予人类。
给予化合物(I)或(II)预防慢性排斥的期限可根据物种、所预防疾病的性质和严重程度而改变，化合物(I)或(II)通常可短期或长期给予人类，即移植后给予1周-1年或更长，除非慢性排斥开始。
化合物(I)或(II)预防和治疗慢性排斥的可能机理与抗-小球基底膜(GBM)抗体的减少，接着是TGF的持续抑制有关。
下列实施例进一步详细描述本发明。应当理解那些实施例不是对本发明范围的限制。
实施例1.慢性排斥的预防(1)方法将重250-300g的近交雄性Lewis大鼠(LEW)(RT1I)用作肾移植受体。将重250-350g的近交雄性LEW和Fisher(F344)(RT1IVI)分别用作同基因移植和同种异体移植的供体大鼠。肾移植是使用Fisher和Lee.[Fisher等人，Surgery，58904-914，1965]的改进技术进行的。随受体大鼠存活的时间测量肾移植物的存活。每周一次采集血液和24小时尿液样品用于血浆肌酸酐、蛋白尿和抗供体小球基底膜蛋白(GBM)的抗体滴定度的测量。在移植后第90天采集肾移植物，并经过组织学和逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)分析。在移植后第0天-第9天，每天口服给予受体大鼠10mg/kg和20mg/kg剂量的化合物(I)。对照同基因移植受体和同种异体移植受体在移植后没有接受药物。
受体的肾脏功能是通过每周一次测量它们的血浆肌酸酐和蛋白尿共90天而测定的。采集上述具有肾移植物的受体的血液和尿液样品。利用Sigma肌酸酐试剂盒检测血浆肌酸酐，并利用Bio-Rad蛋白测定法检测蛋白尿。
在移植后第90天采集受体的肾移植物组织用于组织学分析。将移植物样品固定在10％NBF中，随后加工，然后立即包埋在ParaPlastTM石蜡包埋培养基中。将样品切成3μm的切片、预温热、脱石蜡、再水合，随后用下列4种方法中的1种染色苏木精和曙红染色法、过碘酸希夫染色法、维尔赫夫结合弹性三色染色法和过碘酸银六亚甲基四胺染色法。由两名组织学家在不知情的情况下评估组织学切片，并以用于移植病理学的改进Banff’标准为基础进行半定量评分。[Solez等人，Kidney Int.，44411-422，1993]TGFβ被认为对引起慢性同种异体移植排斥起着决定性作用。使在移植后第90天从受体采集的肾移植物组织经过RT-PCR用于TGFβ基因的表达。利用TRIZOL提取移植肾脏组织中的总RNA。按照Overbergh等人[Overbergh等人，Cytokine，11305，1999]所述，使用ABI Prism7700序列检测系统和PE Biosystems的试剂进行实时RT-PCR，并将其标准化至啮齿动物的GAPDH。大鼠TGFβ的引物和探针是5’-GCTGCTGACCCCCACTGAT-(正义)、5’-GCCACTGCCGGACAACTC-(反义)，和CGCCTGAGTGGCTGTCTTTTGACGT-TAMRA。啮齿动物GAPDH的引物和探针是利用PE Biosystem设计的。
通过使用ELISA测定法，还在移植后近20、40、和90天，用10mg/kg和20mg/kg剂量的化合物治疗过的同种异体移植物、未治疗过的同种异体移植物和同基因移植物中测量了具有F344肾脏的LEW受体血浆中抗F344大鼠小球基底膜蛋白的特异性抗体。
(2)结果同基因移植物存活超过90天。相反，仅有40％的对照同种异体移植物在移植后存活超过90天。接受10mg/kg剂量化合物(I)和20mg/kg剂量化合物(I)的那些的同种异体移植物在移植后存活超过90天的分别为80％和100％。(表1)表1
在没有进行化合物(I)治疗的情况下，受体血浆肌酸酐在第7周增加，蛋白尿在第5周检测为阳性。用10mg/kg和20mg/kg剂量的化合物(I)治疗过的受体可在随后的周期内维持与天然大鼠和同基因移植受体相同的正常肌酸酐和检测不到的蛋白尿。(
图1-4)在未治疗过的同种异体移植对照中可观察到渐近性组织学慢性排斥的发展。与未治疗过的同种异体移植对照相比，用10mg/kg和20mg/kg化合物(I)治疗过的受体肾脏移植物Banff’得分的近似累积减少分别如下间质炎症50％和67％，tubulitis100％和100％，结节性脉管炎33％和50％，mesangiolysis83％和100％，肾小球炎75％和38％，管萎缩40％和85％，肾小球硬化症83％和100％，纤维-内膜增生63％和<p>实施例2将‘生物杀伤剂D’加入到在烧杯中的河水(pH7.8)中达到各种浓度，和‘生物杀伤剂D’的抗菌活性按如上所述那样测量。结果也示于下表4中。如在表4中所示，当水用超过50ppm的量的‘生物杀伤剂C’处理时微生物个数显著地减少，表明‘生物杀伤剂D’具有强烈的抗菌活性。
表4
实施例3为了将根据本发明的方法制备的‘生物杀伤剂C’和‘生物杀伤剂D’的抗菌活性与‘生物杀伤剂A’和‘生物杀伤剂B’的那些进行对比，在收集河水(pH7.8)后，所制备的生物杀伤剂在添加到含有河水的烧杯中达到各种浓度之后被测试抗菌活性，以及总微生物个数和总卤素残留水平按如上所述测量。结果示于表5和6中。
每周1次采集具有肾移植物的受体的血液和尿液样品共90天，用于测量它们的血浆肌酸酐和蛋白尿。血浆肌酸酐是利用Sigma肌酸酐试剂盒检测的，蛋白尿是通过Bio-Rad蛋白测定法检测的。
使用实施例1中描述的方法，分析慢性同种异体移植排斥的组织学改变。由两名组织学家在不知情的情况下评价组织学切片，并以用于移植病理学的改进Banff’s标准为基础进行半定量评分。
通过使用实施例1中描述的方法，在移植后近20、40、和90天，用3mg/kg剂量的化合物(I)和1mg/kg剂量的他克莫司联合治疗过的同种异体移植物、未治疗过的同种异体移植物和同基因移植物中测量了具有F344肾脏的LEW受体血浆中抗F344大鼠小球基底膜蛋白的特异性抗体。
(2)结果同基因移植物存活超过90天。相反，仅有40％的对照同种异体移植物在移植后存活超过90天。接受1mg/kg剂量他克莫司和接受3mg/kg剂量化合物(I)以及1mg/kg剂量他克莫司的那些的同种异体移植物在移植后存活超过90天的均为100％。(表3)
表3.
在未治疗过的同种异体移植中，受体血浆肌酸酐在第7周增加，蛋白尿在第5周被检测为阳性。与未治疗过的同种异体移植对照相比，用3mg/kg剂量的化合物(I)联合1mg/kg剂量的他克莫司治疗过的受体显示出血浆肌酸酐和蛋白尿水平均降低。(图10、11)在未治疗过的同种异体移植对照中，可观察到渐近性组织学慢性排斥的发展。与未治疗过的同种异体移植对照相比，用3mg/kg剂量的化合物(I)和1mg/kg剂量的他克莫司治疗过的受体肾脏移植物Banff’得分的近似累积减少分别如下间质炎症50％，tubulitis85％，结节性脉管炎92％，mesangiolysis75％，肾小球炎38％，管萎缩55％，肾小球硬化症58％，纤维-内膜增生63％，移植性肾小球病57％。且以肾脏移植病理学的Banff’s标准为基础，(-)、(+)、(++)和(+++)的定义与表2相同。(表4)
表4.
1*炎症，2*Tubulitis，3*结节性脉管炎，4*Mesangiolysis，5*肾小球炎，6*管萎缩，7*肾小球硬化症，8*纤维-内膜增生，9*移植性肾小球病在同基因移植对照组中，没有检测到血浆抗-GBM。在未治疗过的同种异体移植对照中，它是在移植后20天检测到的，此后增加。像在同基因移植对照组中一样，用3mg/kg剂量的化合物(I)联合1mg/kg剂量的他克莫司治疗过的受体没有可检测水平的抗供体GBM的抗体。(图12)实施例3.慢性排斥的治疗(1)方法使用实施例1中描述的大鼠和肾移植方法。从显示血浆肌酸酐增加或可检测到蛋白尿的时间开始，口服给予受体大鼠20mg/kg剂量的化合物(I)共3周。将同基因移植物和未治疗过的同种异体移植物作为对照组。按照实施例1中所述，每周1次采集具有肾移植物的受体的血液和尿液样品，用于测量它们的血浆肌酸酐和蛋白尿。血浆肌酸酐是利用Sigma肌酸酐试剂盒检测的，蛋白尿是通过Bio-Rad蛋白测定法检测的。
使用实施例1中描述的方法，分析在化合物(I)的挽救治疗下，慢性同种异体移植排斥的组织学改变。由两名组织学家在不知情的情况下评价组织学切片，并以用于移植病理学的改进Banff’s标准为基础进行半定量评分。
(2)结果在未治疗过的同种异体移植对照中，受体血浆肌酸酐在第7周增加，蛋白尿在第5周被检测为阳性。虽然化合物(I)挽救治疗不能立即改善受体的肾脏功能，但在药物治疗中断后，血浆肌酸酐和蛋白尿均倾向处于正常水平。(图13、14)在未治疗过的同种异体移植对照中，可观察到渐近性组织学慢性排斥的发展。与未治疗过的同种异体移植对照相比，在进行的慢性同种异体移植排斥过程中，用20mg/kg剂量的化合物(I)治疗3周的受体肾脏移植物Banff’得分的近似累积减少分别如下间质炎症50％，tubulitis70％，结节性脉管炎92％，mesangiolysis33％，肾小球炎38％，管萎缩42％，纤维-内膜增生53％，移植性肾小球病89％。且以肾脏移植病理学的Banff’s标准为基础，(-)、(+)、(++)和(+++)的定义与表2相同。(表5)
表2
实施例3在实施例3中，两种不同的包含超级吸收材料的超薄妇女卫生衬垫被测定，以便确定这种包含多部件液体吸收结构的吸收用品与更常规市售的妇女卫生衬垫相比所具有的有效性。在该实施例中，一种具有多部件液体吸收结构的衬垫被标识为C-超薄型，更常规市售的妇女卫生衬垫是可以从在香港的Procter& Gamble公司得到的Whisper超薄型衬垫。表3显示了每种衬垫测定的特定值。
该C-超薄型衬垫具有从法国Guial Film得到的Guial多孔薄膜顶片和液体不可渗透的底片。该衬垫包括多部件液体吸收结构，其中第一液体吸收部件具有约38平方厘米的面积，第二液体吸收部件具有约131平方厘米的面积。
第一液体吸收部件具有大约1.5毫米(0.15厘米)的厚度，从而产生大约6cm3的计算体积。
第一液体吸收部件按是可以从Buckeye Technologies，Inc.得到的一种材料，商品代码为Unicore 8001。该材料具有大致230gsm的基重，具有每克材料大约6克的液体吸收能力。第二液体吸收部件是包括约60％重量的木浆绒移植物在移植后存活到90天。在移植后，单独接受1mg/kg剂量他克莫司共10天的那些的同种异体移植物显示100％的同种异体移植存活率。用简单剂量的他克莫司治疗并从移植后第28天-第60天用10mg/kg或15mg/kg化合物(I)治疗的受体的个体同种异体移植存活率将在动物病例数增加后得到。(表6)表6
受体的肾脏功能是通过每周一次测量它们的血浆肌酸酐和蛋白尿共90天而测定的。在同种异体移植对照中，血浆肌酸酐在移植7周后迅速增加，在用简单剂量的他克莫司治疗过的同种异体移植物中，血浆肌酸酐在移植8周后迅速增加，而在同基因移植对照中，血浆肌酸酐维持在正常范围内。在整个研究期间，在第28天-第60天给予10mg/kg化合物(I)可维持血浆肌酸酐水平低于1.5mg/dL的正常值。虽然用15mg/kg/天化合物(I)治疗过的受体从移植后第3周开始到第9周显示血浆肌酸酐增加，但它可在那之后逆转并维持在正常水平。(图15、16)在40％同种异体移植对照大鼠和100％用简单剂量他克莫司治疗过的同种异体移植大鼠中，在移植超过90天后都存活了下来，蛋白尿分别是在移植后第2周和第5周检测到的，且与同基因移植对照相比，此后显著增加。从第28天开始10mg/kg和15mg/kg化合物(I)的治疗到第60天，降低了肾脏受体中蛋白尿的发展。(图17、18)
化合物(I)或(II)被证实具有预防和/或治疗移植器官或组织中慢性排斥的活性。因此，本发明提供了用于预防和/或治疗移植器官或组织中慢性排斥的有效免疫抑制剂。
附图简述图1表示用10mg/kg剂量化合物(I)治疗后的血浆肌酸酐浓度。(实施例1)图2表示用20mg/kg剂量化合物(I)治疗后的血浆肌酸酐浓度。(实施例1)图3表示用10mg/kg剂量化合物(I)治疗后的蛋白尿量。(实施例1)图4表示用20mg/kg剂量化合物(I)治疗后的蛋白尿量。(实施例1)图5表示用化合物(I)治疗时TGFβ基因表达的抑制。(实施例1)图6表示在同基因移植受体中抗GBM的抗体的产生。(实施例1)图7表示在同种异体移植受体中抗GBM的抗体的产生。(实施例1)图8表示在用10mg/kg剂量化合物(I)治疗过的同种异体移植受体中GBM抗体的产生。(实施例1)图9表示在用20mg/kg剂量化合物(I)治疗过的同种异体移植受体中GBM抗体的产生。(实施例1)图10表示用3mg/kg剂量化合物(I)联合1mg/kg剂量他克莫司治疗过的移植受体中的血浆肌酸酐浓度。(实施例2)图11表示用3mg/kg剂量化合物(I)联合1mg/kg剂量他克莫司治疗过的移植受体中的蛋白尿量。(实施例2)图12表示用化合物(I)联合他克莫司治疗过的同种异体移植受体中GBM抗体的产生。(实施例2)图13表示用20mg/kg剂量化合物(I)挽救治疗过的移植受体中的血浆肌酸酐浓度。(实施例3)图14表示用20mg/kg剂量化合物(I)挽救治疗过的移植受体中的蛋白尿量。(实施例3)图15表示用10mg/kg剂量化合物(I)联合他克莫司简单治疗所治疗过的移植受体中的血浆肌酸酐浓度。(实施例4)图16表示用15mg/kg剂量化合物(I)联合他克莫司简单治疗所治疗过的移植受体中的血浆肌酸酐浓度。(实施例4)图17表示用10mg/kg剂量化合物(I)联合他克莫司简单治疗所治疗过的移植受体中的蛋白尿量。(实施例4)图18表示用15mg/kg剂量化合物(I)联合他克莫司简单治疗所治疗过的移植受体中的蛋白尿量。(实施例4)
权利要求
1.一种用于预防和/或治疗移植器官或组织中慢性排斥的方法，包括在哺乳动物受体需要时给予其治疗有效量的通式(I)或(II)的化合物
2.根据权利要求1所述的方法，其中该方法用于预防慢性排斥。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述移植是同种异体移植。
4.根据权利要求1所述的方法，进一步包括给予治疗有效量的他克莫司。
5.根据权利要求3所述的方法，进一步包括给予治疗有效量的他克莫司。
6.根据权利要求1所述的方法，其中该方法是口服给药。
7.通式(I)或(II)的化合物 用于制造预防和/或治疗移植器官或组织中慢性排斥的药物的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其中所述药物用于预防慢性排斥。
9.根据权利要求8所述的用途，其中所述移植是同种异体移植。
10.根据权利要求7所述的用于制造含有他克莫司的药物的用途。
11.根据权利要求9所述的用于制造含有他克莫司的药物的用途。
12.根据权利要求7所述的用途，其中所述药物用于口服给药。
13.用于预防和/或治疗移植器官或组织中慢性排斥的药物组合物，其包含治疗有效量的通式(I)或(II)的化合物 以及药学上可接受的载体或赋形剂。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其中该组合物用于预防慢性排斥。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述移植是同种异体移植。
16.根据权利要求13所述的药物组合物，其用于与治疗有效量的他克莫司联合给药。
17.根据权利要求15所述的药物组合物，其用于与治疗有效量的他克莫司联合给药。
18.根据权利要求13所述的药物组合物，其用于口服给药。
全文摘要
本发明涉及下列通式(I)或(II)的化合物用于制造预防和/或治疗移植器官或组织中慢性排斥的药物的用途。
文档编号A61K31/445GK1646122SQ03808499
公开日2005年7月27日 申请日期2003年4月14日 优先权日2002年4月16日
发明者小林正和, 江宏思, 潘凡, L·埃里克森, A·埃布石, C·怀恩 申请人:藤泽药品工业株式会社