专利名称：一种bk病毒的检测方法、其试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种病毒的检测方法和试剂盒，具体讲，涉及一种BK病毒的检测方法及其试剂盒。
背景技术：
BK病毒(BKV)是多瘤病毒(Polyomaviruses)的一种，原发感染多发生在儿童时期，成人BK病毒血清阳性率高达80%以上。原发感染后病毒以潜伏状态主要存在于肾脏组织及尿道上皮组织中，另外淋巴组织及肝、肺、眼、脑等也有潜伏病毒的存在。免疫正常的人群无症状，当宿主免疫功能降低或受到抑制时病毒可以重新激活复制，并且致病。器官移植后长期服用抗排斥药物(免疫抑制剂)导致患者免疫功能低下是BK病毒激活复制的主要诱因。6 10%的肾移植患者因BK病毒感染可致BK病毒相关性肾病(BKVAN)，50 70%的BKVAN患者最终会移植失败。BKVAN已成为肾移植术后最严重的并发症及影响肾移植长 期疗效和功能的关键因素之一。BK病毒的感染还与骨髓移植患者的出血性膀胱炎，进行性多灶性脑白质病、肺部疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等有关。目前临床上对BK病毒相关性肾病最有效的治疗方式就是早期诊断，从而控制抗排斥药物(免疫抑制剂)的用量，同时配合抗病毒药物(如西多福韦)的使用。所以，BK病毒感染的早期诊断对肾移植患者预后具有重要的临床意义。BK病毒相关性肾病(BKVAN)诊断的金标准是肾组织活检。由于BKVAN病灶的局限性导致准确取样困难，灵敏度会受到影响。并且肾组织穿刺带有创伤性，不易被病人接受。同时肾组织活检还要排除急性排斥反应，药物毒性和其他潜在疾病的影响。患者BK病毒激活复制后尿液首先表现为病毒尿症，可通过尿液decoy细胞镜检判断。decoy细胞为来源于尿道上皮的脱落细胞，显微镜下可见核内病毒包涵体及细胞病变效应。但这种方法受限于尿液病理差异及尿道结构的个体差异，结果判定主观，难以做到标准化。国外有研究定量检测移植患者尿液及血液中BK病毒载量，用于BKVAN的预测及治疗监测，显示了很好的效果。国内对BK病毒的研究才刚刚起步，没有成熟的BK病毒检测试剂盒。我国器官移植发展迅速，2009年移植病例数已达10000例，居世界第二位，肾移植最多，占总数的60%以上。其中BK病毒感染所致的BKVAN已成为影响移植成败的关键因素之一。综上亟需能够实现快速、有效且准确检测BK病毒的产品，以用于BK病毒载量的检测，BKVAN的预测及治疗监测。
发明内容
本发明的首要目的是提供一种用于检测BK病毒的方法；本发明的第二发明目的在于提出检测BK病毒的试剂盒；本发明的第三发明目的在于提出该检测BK病毒试剂盒的应用。为了完成本发明的目的，采用的技术方案为本发明涉及一种BK病毒的检测方法，包括以下步骤
(I)针对BK病毒基因组设计特异性引物BKV-F和BKV-R，Taqman荧光探针BKV-P，Taqman荧光探针BKV-P的5’端标记有荧光基团，在除5’端外的任意一个位置上标记有淬灭基团，优选为3’端；(2)处理待测样本，进行PCR反应；(3)通过荧光定量PCR仪检测反应结果；其中，BKV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示，或由SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；BKV-R的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，或由SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；BKV-P的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，或由SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列 经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。其中，SEQID NO 1 的核苷酸序列为 AGAACTGCTCCTCAATGGATG ；SEQ ID NO 2 的核苷酸序列为 AGCTGCCCCTGGACACTCT ；SEQ ID NO 3 的核苷酸序列为 TGCTCTTGAAGCATATGAAGATGGCCCCA。本发明的第一优选技术方案为，所述的Taqman突光探针的突光报告基团选自由6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基_4’，5’ - 二氯_2’，7’ - 二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花菁5. 5中的至少一种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂I、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少一种；优选的，当荧光淬灭基团选自4-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’- 二氯_2’，7’- 二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素、花菁3中的至少一种；当荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基-4’，5’ - 二氯-2’，7’ - 二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯或六氯-6-甲基荧光素中的至少一种；当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂I时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基_4’，5’ - 二氯_2’，7’ - 二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素或花菁3中的至少一种；当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂2时，荧光报告基团选自6-羧基四甲基罗丹明、花菁3、羧基-X-罗丹明或磺酰罗丹明中的至少一种；当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂3时，荧光报告基团选自花菁5或花菁5. 5中的一种。最优选地，所述荧光报告基团为6-FAM ;所述荧光淬灭基团为BHQl。本发明的第二优选技术方案为，步骤(2)中PCR反应的反应体系包括PCR反应液19.8“1、0嫩聚合酶0.2“1、待检模板5.(^1 ；其中，PCR反应液的组成为10X反应缓冲液2. 5μ I, BKV-F (10 μ Μ) O. 5 μ I,BKV-R(IOyM)O. 25 μ 1，BKV-P (10 μ Μ) O. 5 μ I, dNTP 2. O μ 1，最后用无菌超纯水将反应体系补至 19. 8 μ I。
本发明的第三优选技术方案为步骤⑵中PCR反应的反应条件为92 95°C，3 5分钟；然后92 95°C，10 15秒，55 65°C，10 35秒，共40个循环；优选94°C，4分钟；然后94°C，15秒，60°C，35秒，共40个循环。本发明的第四优选技术方案为所述的PCR反应均设置阴性质控组和BK病毒定量标准品I IV组，其中阴性质控组的待测模板为纯水，BK病毒定量标准品I-IV的待测模板分别为BKV定量标准品I、BKV定量标准品II、BKV定量标准品III、BKV定量标准品IV。本发明的第五优选技术方案为BKV定量标准品I IV的构建方法包括以下步骤(I)配制检测反应体系，加入提纯的病毒基因组，进行PCR反应；(2)将扩增产物插入T载体构建重组质粒，重组质粒转化细菌后扩增；
(3)提纯重组质粒后利用紫外分析法测定吸光度，计算质粒浓度，最后将重组质粒稀释成4个梯度5X IO5 5X 108copies/ml，分别作为试剂盒的BKV定量标准品I、BKV定量标准品II、BKV定量标准品III、BKV定量标准品IV。本发明的第六优选技术方案为所述的待测样本的处理方法包括磁珠提取法、柱提法、煮沸裂解法和十六烷基三甲基溴化铵法。本发明的第七优选技术方案为荧光定量PCR仪检测反应结果；如果检测通道没有出现S型扩增曲线，判为BK病毒阴性；如果检测通道出现S型扩增曲线，利用BKV定量标准品检测所生成的标准曲线计算待测样本的浓度(copies/ml)。本发明的第八优选技术方案为荧光定量PCR仪检测反应结果，采用ABI7500荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为FAM荧光素，荧光信号收集设在60°C。本发明还涉及一种BK病毒的检测试剂盒，所述的试剂盒包括PCR反应液、耐热DNA聚合酶、待检模板、阴性质控组和BK病毒定量标准品I IV组。其中，其中，BKV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，或由SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；BKV-R的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，或由SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；BKV-P的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，或由SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。下面对本发明的技术方案做进一步的解释和说明本发明的首要目的是解决缺乏BK病毒检测的产品的问题，提供一种用于检测BK病毒的方法，使用该方法可以实现对BK病毒的快速、有效且准确的定量或定性检测，来保证及时的BK病毒载量的检测，BKVAN的预测及治疗监测。本发明还涉及一种用于检测BK病毒的试剂盒，该试剂盒具有敏感性高、特异性好、反应快速且成本低的优势，适合于大规模临床开展；可以实现对BK病毒的快速、有效且准确的定量检测，因而能保证及时的病例诊治及治疗效果监测。本发明针对BK病毒基因组设计特异性引物BKV-F和BKV-R，Taqman荧光探针BKV-P7Taqman荧光探针BKV-P的5’端标记有荧光基团，在除5’端外的任意一个位置上标记有淬灭基团，优选为3’端；本发明在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的突光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告突光基团和一个淬灭突光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时Taq酶的5’_3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。所述荧光报告基团和所述荧光淬灭基团选自由6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein, FAM)、四氯-6-羧基突光素(tetrachloro-6-carboxyfIuorescein, TET)、六氣 _6_ 甲基突光素(Hexachloro-6-methylfluorescein, HEX)、6_ 竣基四甲基罗丹明(6-carboxytetramethylrhodamine, TAMRA)、横酸罗丹明(Sulforhodamine 101,Texas Red)、羧基-X-罗丹明(Carboxy-x-rhodamine, ROX)、花菁 3 (cyanine3, Cy3)、花菁3. 5 (cyanine3. 5, Cy3. 5)、花菁 5 (cyanine5，Cy5)、花菁 5· 5 (cyanine5. 5, Cy5. 5)、生物搜索技术公司(Biosearch Technologies, Inc)的黑洞萍灭剂 I (Black Hole Quencher 1，BHQ1)、黑洞淬灭剂 2 (Black Hole Quencher 2, BHQ2)、黑洞淬灭剂 3 (Black Hole Quencher3，BHQ3)、4_(4_ 二甲基氛基苯偶氣基)苯甲酸(4-(4，-dimethylaminophenylazo)benzoic acid, DABCYL)、6_羧基-4’，5’ -二氯-2’，7’ -二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯 (6_Carboxy-4，，5，dichloro_2’，7’ -dimethoxyf luorescein, JOE)和美国应用生物系统公司的VIC荧光染料所组成的组中。优选地，所述荧光报告基团选自由6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基_4’，5’ - 二氯_2’，7’ - 二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5和花菁5. 5所组成的组中；所述荧光淬灭基团选自由6-羧基四甲基罗丹明、4- (4- 二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸DABCYL、BHQ1、BHQ2和BHQ3所组成的组中。更优选地，按照下表I所不来选择突光报告基团和突光淬灭基团。表I :
荧光淬灭基团荧光报告基团
DABCYL6-FAM、TET> JOE、HEX、Cy3 中的至少一种 TAMRA6-FAM、TET> JOE、HEX 中的至少一种
BHQl6-FAM、TET> JOE、HEX、Cy3 中的至少一种
BHQ2TAMRA、Cy3、ROX> Texas Red 中的至少一种
BHQ3Cy5 或 Cy5.5最优选地，所述荧光报告基团为6-FAM ;所述荧光淬灭基团为BHQl。然后处理待测样品，待测样品的处理可采用现有的DNA处理试剂盒，也可以采用的病毒核酸提取方法为磁珠提取法、柱提法、煮沸裂解法和CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)法，并优选煮沸裂解法处理样本与提取核酸。所述的煮沸裂解法处理样本与提取核酸的方法包括血液样本取100 μ I血清或血浆样本与50 μ I浓缩液混匀，13000rpm/min离心IOmin后去除上清，加入25 μ I裂解液混匀沉淀，100°C煮沸lOmin，离心lOmin，上清即为纯
化的病毒核酸。尿液样本取1000 μ I尿液样本，13000rpm/min离心IOmin后去除上清，加入50 μ I裂解液混匀沉淀，100°C煮沸lOmin，离心lOmin，上清即为纯化的病毒核酸。本发明采用PCR方法进行检测，其中PCR反应的反应体系包括PCR反应液19.8111、0應聚合酶0.2111、待检模板5.(^1 ;其中，PCR反应液的组成为10X反应缓冲液 2. 5 μ 1，BKV-F(IOyM)O. 5 μ 1，BKV-R(IOyM)O. 25 μ 1，BKV-P (10 μ Μ) O. 5 μ 1，dNTP2. O μ I,最后用无菌超纯水将反应体系补至19. 8 μ I。PCR反应的反应条件为94°C，4分钟；94°C，15秒；60°C，35秒，40个循环。在PCR反应过程中，均设置阴性质控组和BK病毒定量标准品I IV组，其中阴性质控组的待测模板为纯水，BK病毒定量标准品I-IV的待测模板分别为BKV定量标准品I、BKV定量标准品II、BKV定量标准品III、BKV定量标准品IV。BKV定量标准品I IV的构建方法包括以下步骤
(I)配制检测反应体系PCR反应液19. 8 μ 1、DNA聚合酶O. 2 μ I、提纯的病毒基因组5.0 μ 1，进行PCR反应，PCR反应的反应条件为94°C，4分钟；94°C，15秒;60°C，35秒，40个循环；(2)将扩增产物插入T载体构建重组质粒，重组质粒转化细菌后扩增；(3)提纯重组质粒后利用紫外分析法测定吸光度，计算质粒浓度，最后将重组质粒稀释成4个梯度5X IO5 5X 108copies/ml，分别作为试剂盒的BKV定量标准品I、BKV定量标准品II、BKV定量标准品III、BKV定量标准品IV。本发明采用荧光定量PCR仪检测反应结果采用ABI7500荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为FAM荧光素，荧光信号收集设在60°C ;如果检测通道没有出现S型扩增曲线，判为BK病毒阴性；如果检测通道出现S型扩增曲线，利用BKV定量标准品检测所生成的标准曲线计算待测样本的浓度(copies/ml)。本发明还涉及一种BK病毒的检测试剂盒，所述的试剂盒包括PCR反应液、DNA聚合酶、待检模板、阴性质控组和BK病毒定量标准品I IV组；其中，所述的PCR反应液中含有 BKV-F、BKV-R 和 BKV-P0本发明的BK病毒检测试剂盒中还可以包括DNA提取试剂盒，DNA提取试剂盒可采用现有的DNA提取技术。本发明还涉及所述的BK病毒的检测试剂盒在检测和/或诊断BK病毒相关性疾病中的应用。BK病毒的感染与BK病毒相关性肾病、骨髓移植患者的出血性膀胱炎、进行性多灶性脑白质病、肺部疾病、肿瘤、自身免疫性疾病等有关。利用本发明的试剂盒可以快速、简便的对BK病毒相关性肾病进行筛查，改变了现有技术中需要进行组织活检的现状。本发明的检测方法敏感性高，最低检出可达到2X103copies/ml ;同时还具有特异性好的优势，不和其他的病毒发生交叉反应，例如乙肝病毒(HBV)，丙肝病毒(HCV)，EB病毒(EBV)，人巨细胞病毒(HCMV)，人类细小病毒B19 (HPVB19)和JC病毒(JCV);本发明的检测方法反应快速，一般I. 5到2小时即可得到反应结果，并且成本低、无假阳性，适合于大规模临床开展。从而实现对BK病毒的快速、有效且准确的定量检测，因而能保证及时的病例诊治及治疗效果监测。
图I为采用荧光定量PCR仪检测待测样本得到的曲线；
图2为采用荧光定量PCR仪检测BKV定量标准品得到的曲线。本发明的具体实施方式
仅限于进一步的解释和说明本发明，并不对本发明的内容构成限制。本发明所采用的试剂均为市售。
具体实施例方式实施例II.引物与探针的设计针对BK病毒基因组设计特异性引物BKV-F和BKV-R，与Taqman荧光探针BKV_P。Taqman荧光探针BKV-P的5’端标记的荧光基团是6_羧基荧光素(6-carboxyfluorescein, FAM),3’端标记的淬灭基团是黑洞淬灭剂I (Black HoleQuencher 1,BHQ1)。BKV-F AGAACTGCTCCTCAATGGATG BKV-R AGCTGCCCCTGGACACTCTBKV-P TGCTCTTGAAGCATATGAAGATGGCCCCA(序列方向5’ -3’)2. BK病毒DNA聚合酶链式反应液的配制将各成分(引物、探针和反应缓冲液)按一定比例混合在一起。单个反应聚合酶链式反应液包括IOX反应缓冲液2. 5 μ I,BKV-F(IOyM)O. 5 μ 1，BKV-R(IOyM)O. 25 μ 1，BKV-P (10 μ Μ) O. 5 μ 1，dNTP 2. O μ 1，最后用无菌超纯水将反应体系补至19. 8 μ I。3.检测反应取NDM-I聚合酶链式反应液19. 8 μ I和DNA聚合酶O. 2 μ I (I个单位)配制成反应体系，然后加入5. O μ I待检模板。每批次反应均设置阴性质控(H2O)和BK病毒定量标准品I-IV。反应条件94°C，4分钟；94°C，15秒；60°C，35秒，40个循环。采用ABI7500荧光定量PCR仪，荧光信号收集时设定为FAM荧光素，荧光信号收集设在60°C。4. BK病毒样本(尿液与血液)的处理与DNA提取采用煮沸裂解法处理样本与提取核酸。血液样本取100 μ I血清或血浆样本与50 μ I浓缩液混匀，13000rpm/min离心IOmin后去除上清，加入25 μ I裂解液混匀沉淀，100°C煮沸lOmin，离心lOmin，上清即为纯
化的病毒核酸。尿液样本取ΙΟΟΟμ I尿液样本，13000rpm/min离心IOmin后去除上清，加入50 μ I裂解液混匀沉淀，100°C煮沸lOmin，离心lOmin，上清即为纯化的病毒核酸。5.构建BKV定量标准品I-IV。6.结果判断如果检测通道没有出现S型扩增曲线，判为BK病毒阴性。如果检测通道出现S型扩增曲线，利用BKV定量标准品检测所生成的标准曲线计算待测样本的浓度(copies/ml)。检测反应时，BKV定量标准品I-IV (浓度分别是5 X IO5 5 X 108copies/ml)与样品同时检测，BKV定量标准品I-IV的靶基因浓度已知。根据定量标准品浓度与检测结果CT值，系统自动生成一条标准曲线。根据待测样品的检测CT值，可计算出样品中靶基因的浓度。利用上述方法对2例BK病毒血清样本、2例BK病毒尿液样本、5例健康人尿液样本，5例健康人血液样本、乙肝病毒(HBV)血液样本、丙肝病毒(HCV)血液样本、EB病毒(EBV)血液样本、人巨细胞病毒(HCMV)血液样本、人类细小病毒B19 (HPV B19)血液样本和JC病毒(JCV)血液样本，共计20份样本进行检测，结果如图I所示其中，2例BK病毒血清样本及2例BK病毒尿液样本检测均为阳性，有S型扩增曲线；通过计算机生成的标准曲线，从左至右，计算4个阳性样本的浓度分别为7. I X 106copies/ml, 2. 8X 105copies/ml, 4. 7X 104copies/ml, 5. I X 103copies/ml。健康人尿液样本(5例)，血液样本(5例)，及临床常见的其他病原体，包括乙肝病毒(HBV)，丙肝病毒(HCV)，EB病毒(EBV)，人巨细胞病毒(HCMV)，人类细小病毒B19 (HPVB19)和JC病毒(JCV)检测均为阴性，无S型扩增曲线。从而证实了本发明检测方法的特异性。7.结果验证将检测阳性的扩增产物进行基因测序，测序结果经BLAST比对后证实为BK病毒基因序列。
实施例2 BKV定量标准品I-IV的构建(I)配制检测反应体系PCR反应液19. 8 μ 1、DNA聚合酶O. 2 μ I、提纯的病毒基因组5.0 μ 1，进行PCR反应，PCR反应的反应条件为94°C，4分钟；94°C，15秒;60°C，35秒，40个循环；PCR 反应液包括 IOX 反应缓冲液 2. 5 μ 1，BKV-F(IOyM)O. 5 μ 1，BKV-R(IOyM)O. 25 μ 1，BKV-P (10 μ Μ) O. 5 μ I, dNTP 2. O μ 1，最后用无菌超纯水将反应体系补至 19. 8 μ I。(2)将扩增产物插入T载体构建重组质粒，重组质粒转化细菌后扩增。将所得的DNA序列通过Τ4噬菌体DNA连接酶直接连接到pSTV28DNA载体上，PSTV28 DNA载体购自宝生物(Takara)公司。然后将重组质粒载体转化大肠杆菌(使用北京全式金生物技术有限公司的Trans5 a Chemically Competent Cell),筛选阳性克隆后 提取质粒(使用天根生化科技(北京)有限公司的高纯度质粒小提试剂盒，TIANpure MiniPlasmid Kit)。对所得质粒DNA的一部分扩增产物进行测序，证明所述扩增得到的DNA片段具有目的序列。将带有重组质粒载体转化大肠杆菌大量培养，提取质粒，紫外分光光度法测量并计算靶基因的浓度。(3)提纯重组质粒后利用紫外分析法测定吸光度，计算质粒浓度(copies/ml)。最后将重组质粒稀释成4个梯度(5 X IO5 5X 108COpieS/ml)，分别作为试剂盒的BKV定量标准品、BKV定量标准品II、BKV定量标准品III、BKV定量标准品IV ；将BKV定量标准品进行梯度稀释后进行检测，如图2所示，从左至右分别是2 X IO9Copies/ml, 2 X IO8Copies/ml, 2 X IO7Copies/ml, 2 X IO6Copies/ml, 2 X 105copies/ml, 2X 104copies/ml, 2X 103copies/ml, 2X 102copies/ml 的扩增曲线。2X lC^copies/ml 浓度检测阴性(无S型扩增曲线)。线性范围为2X103 2X108COpieS/ml。最低检出限为2 X 103copies/ml。
权利要求
1.ー种BK病毒的检测方法，其特征在于，所述的检测方法包括以下步骤 (1)针对BK病毒基因组设计特异性引物BKV-F和BKV-R，Taqman荧光探针BKV-P，Taqman荧光探针BKV-P的5’端标记有荧光基团，在除5’端外的任意ー个位置上标记有淬灭基团，优选连接于3’端； (2)处理待测样本，进行PCR反应； (3)通过荧光定量PCR仪检测反应结果； 其中，BKV-F的核苷酸序列如SEQ ID NO :I所示，或由SEQ ID NO :I所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列； BKV-R的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，或由SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列； BKV-P的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示，或由SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列。
2.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述的Taqman荧光探针的荧光报告基团选自由6-羧基荧光素、六氯-6-甲基荧光素、VIC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗丹明、6-羧基_4’，5’ - ニ氯_2’，7’ - ニ甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酷、花菁3、花菁5或花菁5. 5中的至少ー种；所述荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明、4-(4-ニ甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、黑洞淬灭剂I、黑洞淬灭剂2或黑洞淬灭剂3中的至少ー种； 优选的，当荧光淬灭基团选自4- (4- ニ甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸吋，荧光报告基团选自6-羧基突光素、四氯-6-羧基突光素、6-羧基-4’, 5’- ニ氯-2’, V - ニ甲氧基突光素玻珀酰亚胺酯、六氯-6-甲基荧光素、花菁3中的至少ー种； 当荧光淬灭基团选自6-羧基四甲基罗丹明时，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基_4’，5’ - ニ氯_2’，7’ - ニ甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯或六氯-6-甲基荧光素中的至少ー种； 当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂I吋，荧光报告基团选自6-羧基荧光素、四氯-6-羧基荧光素、6-羧基_4’，5’ - ニ氯_2’，7’ - ニ甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酷、六氯-6-甲基荧光素或花菁3中的至少一种； 当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂2吋，荧光报告基团选自6-羧基四甲基罗丹明、花菁3、羧基-X-罗丹明或磺酰罗丹明中的至少ー种； 当荧光淬灭基团选自黑洞淬灭剂3吋，荧光报告基团选自花菁5或花菁5. 5中的ー种；最优选的，所述荧光报告基团为6-羧基荧光素；所述荧光淬灭基团为黑洞淬灭剂I。
3.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中PCR反应的反应体系包括PCR反应液19. 8 μ 1.DNA聚合酶O. 2 μ I和待检模板5. O μ I ; 其中，PCR反应液的组成为10Χ反应缓冲液2. 5 μ 1，BKV-F(IOyM)O. 5 μ I,BKV-R(IOyM)O. 25 μ I, BKV-P (10 μ Μ) O. 5 μ I, dNTP 2. O μ 1，最后用无菌超纯水将反应体系补至 19. 8 μ I。
4.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，步骤⑵中PCR反应的反应条件为92 95°C，3 5分钟；92 95°C，10 15秒，55 65°C，10 35秒，共40个循环；优选为94°C，4分钟；94°C，15秒，60°C，35秒，共40个循环。
5.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中的PCR反应设置阴性质控组和BK病毒定量标准品I IV组，其中阴性质控组的待测模板为纯水，BK病毒定量标准品I IV的待测模板分别为BKV定量标准品I、BKV定量标准品II、BKV定量标准品III、BKV定量标准品IV。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在干，BKV定量标准品I IV的构建方法包括以下步骤 (1)配制检测反应体系，加入提纯的病毒基因组，进行PCR反应； (2)将扩增产物插入T载体构建重组质粒，重组质粒转化细菌后扩增； (3)提纯重组质粒后利用紫外分析法測定吸光度，计算质粒浓度，最后将重组质粒稀释成4个梯度5 X IO5 5X 108copies/ml，分别作为试剂盒的BKV定量标准品I-IV。
7.根据权利要求I 6所述的检测方法，其特征在于，所述的待测样本的处理方法包括磁珠提取法、柱提法、煮沸裂解法和十六烷基三甲基溴化铵法，优选煮沸裂解法。
8.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，荧光定量PCR仪检测反应结果时，如果检测通道没有出现S型扩增曲线，判为BK病毒阴性；如果检测通道出现S型扩增曲线，利用BKV定量标准品检测所生成的标准曲线计算待测样本的浓度。
9.ー种BK病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括PCR反应液、耐热DNA聚合酶、待检模板、阴性质控组和BK病毒定量标准品I IV组，其中，所述的PCR反应液中含有特异性引物BKV-F、特异性引物BKV-R和Taqman荧光探针BKV-P。
10.权利要求9所述的BK病毒的检测试剂盒在检测和/或诊断BK病毒相关性疾病中的应用，BK病毒相关性疾病选自BK病毒相关性肾病、骨髄移植患者的出血性膀胱炎、进行性多灶性脑白质病、肺部疾病、肿瘤或自身免疫性疾病。
全文摘要
本发明涉及一种病毒的检测方法和试剂盒，具体讲，涉及一种BK病毒的检测方法及其试剂盒。本发明的检测方法包括以下步骤首先针对BK病毒基因组设计特异性引物BKV-F和BKV-R，Taqman荧光探针BKV-P，Taqman荧光探针BKV-P的5’端标记有荧光基团，在除5’端外的任意一个位置上标记有淬灭基团；然后处理待测样本，进行PCR反应；最后通过荧光定量PCR仪检测反应结果。本发明的检测方法可进行定性、定量检测，具有敏感性高、特异性好、反应快速且成本低的优势。本发明还涉及BK病毒的检测试剂盒及其应用。
文档编号C12Q1/70GK102690894SQ20111015268
公开日2012年9月26日 申请日期2011年6月8日 优先权日2011年6月8日
发明者叶锋, 宋玉亮, 王新颖, 石炳毅, 范宇, 蔡明 , 解俊杰, 钱叶勇, 韩永 申请人:中国人民解放军第三〇九医院, 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司