专利名称：一种猪链球菌7型高密度发酵培养基及专用菌株的制作方法
技术领域：
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种适合猪链球菌7型的高密度发酵培养基及应用，本发明还包括适用于上述培养基的专用菌株的筛选。
背景技术：
猪链球菌感染已经成为全世界养猪业的主要问题之一。其可引起猪的脑膜炎，关节炎，心内膜炎，肺炎及败血症等，也可引起人的死亡。目前，根据其荚膜抗原的不同，已发现33种血清型，其中能引起人和动物发病的致病性猪链球菌血清型主要是I型(SSl)、2型(SS2)、7型(SS7)和9型(SS9) [Wisselink等，2002]。猪链球菌2型是流行最广的血清型，除2型菌株之外，7型菌株也是被经常分离到的血清型之一[赵战勤，2007 ;江甜等，2009 ；杨筱微等，2010]。随着7型菌株在我国病猪中的频繁发现，对其各方面特征的研究也就显得非常必 要。研究发现国内分离的猪链接菌7型菌株，其毒力因子分布与国外同种血清型的分离株均不同，与国内流行的2型菌毒力因子分布差异显著，且对小鼠有致病性[赵冉，2006]。在国内的一些地方，猪链球菌7型比其他菌株更流行[沈萍等，2009]。而长期地滥用抗生素又导致了国内分离株的多重耐药性，因此针对猪链接菌7型菌的疫苗开发显得尤为紧迫与必要。对于猪链球菌7型的培养目前还没有固定的培养基，国内外较多应用商品化TSB培养基培养。这种培养基虽然使用方便，但在培养过程中，具有菌体生长缓慢，成本高等缺点，其培养基的成分不适合猪链球菌7型的培养，且发酵终点的活菌数仅为10 20亿，不适合大规模增菌使用。因此，完全有必要研制并开发适合工业规模化生产，且原料来源广泛，价格低廉，能大幅度提闻活菌数的培养基。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提出一种猪链球菌7型的高密度发酵培养方法，专用培养基及专用菌株。本发明既能保证猪链球菌7型菌的旺盛生产，进行正常代谢，又能提高其生长速度，缩短生产时间。本发明还提供了适用于上述培养方法的专用培养基及专用菌株(猪链球菌7-YZ)以解决目前猪链球菌7型活菌数不高的难题。本发明的技术方案如下所述申请人:从湖南省永州市某猪场送检的病料中分离得到一株具有致病性的猪链球菌7型菌株，申请人将其命名为猪链球菌(Sti^ptococcus suis)7-YZ，该菌株于2011年5月5日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为 CCTCCNO M2011160o一、猪链球菌7-YZ的分离、筛选和鉴定I、猪链球菌7-YZ的分离待分离的病料——各组织病料是申请人于2005年8月从湖南省永州市某猪场送检的病料中分离得到。其具体分离方法为无菌采集心血、肺组织、脾组织、关节液接种于TSA平皿上，37°C培养12-24小时后观察。挑取直径为O. lmm-1. Omm、灰白色、半透明、表面光滑、圆形、边缘整齐的小菌落接种于TSB液体培养基中37°C摇床培养过夜。将纯培养后的细菌进行革兰氏染色镜检。然后用光学显微镜观察，革兰氏染色呈阳性、成双或短链状球菌(图I)，对其传代纯化。初步判定其为一株猪链球菌。2、猪链球菌7型的分类鉴定采用PCR方法、生化鉴定及玻片凝集试验进行了鉴定，具体步骤如下(I)PCR方法鉴定根据参考文献合成猪链球菌通用引物和猪链球菌7型特异性引物。其中猪链球菌通用引物JP4和JP5是根据谷氨酸盐脱氢酶基因(gdh，基因登录号gblEF539838. 11)设计，
上游引物为JP4(5’ -CCATGGACAGATAAAGATGG-3’ )；下游引物为JP5 (5’-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3，)，可扩增长度为 689bp 的目的 DNA片段(其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :I所述，其PCR图片见图2)。猪链球菌7型的特异性引物是根据猪链球菌具有型特异性的荚膜多糖抗原基因cps7(基因登录号gblFT572226. 11)设计，上游引物为 cps7_F(5’-AGCTCTAACACGAAATAAGGC-3，)，下游引物为cps7-R(5’ -GTCAAACACCCTGGATAGCCG-3’)，可扩增长度为 252bp 目的DNA片段(其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所述，PCR图片如图3)。(2)生化鉴定从TSA平板上挑取步骤(I)中鉴定为阳性的单菌落，进行常规的生化鉴定试验。微量生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司，按照该公司产品说明书进行操作。结果猪链球菌YZ株的各项生化指标均符合。(3)玻片凝集试验将分离的猪链球菌YZ株接种TSB培养基，置37°C摇床170rpm/min,培养8小时，使OD6tltl达到I. 3 I. 5，采用玻片凝集的方法对该菌液进行血清学分型鉴定。操作方法如下取洁净玻片I张，用微量移液器吸取3 μ I猪链球菌(SS)标准阳性血清(购自丹麦哥本哈根国立血清研究所)滴于载玻片上，另吸取3μ I生理盐水做对照，然后吸取3μ I菌液分别加入血清和生理盐水中，充分混匀，(注每次加样都要更换移液器的TIP头)。轻轻摇动载玻片，I 2min后观察结果。血清与待检菌液混合后出现明显可见的凝集块，液体变为透明，而盐水对照滴仍为均匀混浊状态，即为凝集反应阳性。若血清与菌液混合后为均匀混浊状态，没有出现明显可见的凝集块视为为阴性。玻片凝集试验表明，猪链球菌YZ株仅与猪链球菌7型标准阳性血清发生凝集反应，不与其他血清型凝集。根据革兰氏染色、PCR方法、生化鉴定和玻片凝集试验，确定上述猪链球菌YZ株为猪链球菌7型菌株，命名为猪链球菌7-YZ。本发明提供了一种适用于猪链球菌7-YZ菌株的高密度发酵方法，其包含如下步骤(I)制备一级种子取保减号为CCTCC NO M2011160的猪链球菌7-YZ在TSA平板上划线，置37°C培养16 24小时，然后挑取直径为O. lmm-1. 0mm、灰白色、半透明、表面光滑、圆形、边缘整齐的小菌落，接种TSA平板若干个，置37°C培养16 24小时，做为一级种子。2 8°C保存，应不超过5日，在培养基上传代，应不超过5代。
(2)制备二级种子液用接种环取一环步骤(I)的一级种子的单菌落，接种于TSB液体培养基中，置37°C摇床170rpm/min，培养6小时，使OD6tltl达到O. 7 O. 9，得到二级种子液。(3)发酵培养取步骤(2)的二级种子液以V/V计为I 4%的接种量接入装有50 IOOmL发酵培养基的250mL摇瓶中进行发酵培养，控制摇床温度为37°C，转速为150 200rpm,起始pH为7. O 7. 5，发酵周期为8 10小时， 得到猪链球菌7-YZ菌；或取步骤(2)的二级种子液以V/V计为I 4%的接种量接入装有按V/V计的50 70%发酵培养基的发酵罐中，控制发酵温度为37°C，通气量为O. 5 lwm，转速为100 200rpm, pH值为7. O 7. 5，发酵周期为6 8小时，得到猪链球菌7-YZ菌；其中发酵培养基的组分如下按g/L 计胰蛋白胨 10-30g/L，酵母粉 10_30g/L，(NH4)2SO4 l_5g/L，MgSO4 · 7H20O. 1-1. Og/L, K2HPO4 ·3Η20 5-lOg/L，KH2PO4 l_5g/L，葡萄糖 1-lOg/L，牛血清 30_100ml/L，余量是水；上述发酵培养基按以下步骤制备A、按配方量，将胰蛋白胨，酵母粉，(NH4)2SO4, MgSO4 · 7H20，用蒸馏水溶解后，定容至IOOOml ;灭菌前调pH至7. O 7. 6 ;在115 121 °C高压蒸汽下灭菌15 25min,得到A液；B、称取葡萄糖100g，用蒸馏水定容至IOOOml ;在110 115°C高压蒸汽下灭菌15 25min，得到B液；C、称取K2HPO4 ·3Η20 22. 8g，加蒸馏水定容至100ml，配制得到磷酸氢二钾溶液；称取KH2P0413. 6g，用蒸馏水定容至100ml，配制得到磷酸二氢钾溶液；取磷酸氢二钾溶液84ml和磷酸二氢钾溶液16ml，使二者混合，得到磷酸盐缓冲溶液母液；在121°C高压蒸汽下灭菌15 25min ；D、将步骤B的B液，步骤C的磷酸盐缓冲母液及过滤除菌的牛血清按配方量加入到A液中，得到猪链球菌7-YZ高密度发酵培养基；其中步骤B中的B液的添加量按体积比计为I 10 %，步骤C中的磷酸缓冲母液添加量按体积比计为3 9%，牛血清按体积比计的添加量为5 15%。申请人:提供了一种适用于猪链球菌(streptococcus suis) 7-YZ株的高密度发酵专用培养基，其组分如下按g/L 计胰蛋白胨 10-30g/L，酵母粉 10_30g/L，(NH4)2SO4 l_5g/L，MgSO4 · 7H200. 1-1. 0g/L, K2HPO4 ·3Η20 5-lOg/L，KH2PO4 l_5g/L，葡萄糖 1-lOg/L，牛血清 30_100ml/L，余量是水；上述发酵培养基按以下步骤制备A、按配方量，将胰蛋白胨，酵母粉，(NH4)2SO4, MgSO4 · 7H20，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml ;灭菌前调pH至7. O 7. 6 ;在115 121 °C高压蒸汽下灭菌15 25min,得到A液；B、称取葡萄糖100g，用蒸馏水定容至1000ml ;在110 115°C高压蒸汽下灭菌15 25min，得到B液；C、称取K2HPO4 ·3Η20 22. 8g，加蒸馏水定容至100ml，配制得到磷酸氢二钾溶液；称取KH2P0413. 6g，用蒸馏水定容至100ml，配制得到磷酸二氢钾溶液；取磷酸氢二钾溶液84ml和磷酸二氢钾溶液16ml，使二者混合，得到磷酸盐缓冲溶液母液；在121°C高压蒸汽下灭菌15 25min ；D、将步骤B的B液，步骤C的磷酸盐缓冲母液及过滤除菌的牛血清按配方量加入到A液中，得到猪链球菌7-YZ高密度发酵培养基；其中步骤B中的B液的添加量按体积比计为I 10 %，步骤C中的磷酸缓冲母液添加量按体积比计为3 9%，牛血清按体积比计的添加量为5 15%。 本发明提供的用于猪链球菌疫苗生产的大规模增殖培养基，所用材料和工艺均以疫苗生产为最终目的。采用上述培养基培养猪链球菌7型，有利于细菌的生长代谢，与其他培养基相比能获得较高的菌量，而且材料来源广泛且价格低廉，在疫苗生产过程中能得到高纯度的细菌，生产成本比商用TSB培养基降低30 50%。使用本发明提供的液体培养基进行大规模培养，可有效扩增猪链球菌7型，获得纯化的猪链球菌7型菌液，以供疫苗生产。
序列表SEQ ID NO 1是本发明中猪链球菌通用引物鉴定扩增后的DNA片段。序列表SEQ ID NO 2是本发明中猪链球菌7型特异性引物扩增后的DNA片段。图I为猪链球菌革兰氏染色图片。图2为猪链球菌通用引物扩增的PCR图(图中1 4:挑取的待鉴定的猪链球菌；5 :猪链球菌7型标准菌株，6 :猪链球菌YZ分离株)。图3为猪链球菌7型引物扩增的PCR图(图中1 :猪链球菌7_YZ ;2 4 :挑取的待鉴定的猪链球菌5 :阴性对照)。图4为猪链球菌7-ΥΖ同时培养在商业化培养基TSB与本发明的发酵培养基的生长曲线图。
具体实施例方式实施例I :猪链球菌7-ΥΖ的分离和鉴定I、猪链球菌7-ΥΖ株的分离待分离的病料——各组织病料是申请人于2005年8月从湖南省永州市某猪场送检的病料中分离得到。其具体分离方法为无菌采集心血、肺组织、脾组织、关节液接种于TSA平皿上，37°C培养12-24小时后观察。挑取直径为O. lmm-1. 0mm、灰白色、半透明、表面光滑、圆形、边缘整齐的小菌落接种于TSB液体培养基中37°C摇床培养过夜。将纯培养后的细菌进行革兰氏染色镜检。然后用光学显微镜观察，革兰氏染色呈阳性、成双或短链状球菌，对其传代纯化，初步判定为猪链球菌。2、猪链球菌7型的分类鉴定采用PCR方法、生化鉴定及玻片凝集试验进行了鉴定，具体步骤如下(I)PCR方法鉴定根据参考文献合成猪链球菌通用引物和猪链球菌7型特异性引物。其中猪链球菌通用引物JP4和JP5是根据谷氨酸盐脱氢酶基因(gdh，基因登录号gblEF539838. 11)设计，上游引物JP4 (5，-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3’ )；下游引物JP5 (5 ’ -CCATGGACAGATAAAGATGG-3 ’)，扩增得到长度为 689bp 的目的DNA片段。猪链球菌7型的特异性引物是根据猪链球菌具有型特异性的荚膜多糖抗原基因cps7(基因登录号RblFT572226. Il)设计，上游引物cpS7_F (5， -AGCTCTAACACGAAATAAGGC-3，)，下游引物cps7-R (5，-GTCAAACACCCTGGATAGCCG-3’ )，扩增得到长度为 252bp 目的DNA片段。PCR模板的制备 取Iml菌液到无菌的I. 5ml离心管中，12000r/min离心5分钟，去掉上清，用200 μ I无菌水悬浮混匀，100°c水浴中煮10分钟，然后迅速置于冰上冷却5分钟，12000r/min离心2分钟，上清即为PCR模板。PCR反应体系(总体积25 μ I)IOXTaq Buffer2. 5 μ 1，2μΜ dNTPs I. 5 μ 1，20 μ M 上、下游引物各 I μ 1，TaqDNA聚合酶I μ I，无菌水14 μ I,模板4 μ I。退火温度为94°C 30秒，56°C 60秒，72°C 40秒，30循环PCR结果观察取PCR扩增反应产物10 μ I和Mark2000plus 5 μ 1，加到含EB的O. 8%琼脂糖胶中，在80伏电压下电泳30分钟，然后在紫外线灯下观察。(2)生化鉴定从TSA平板上挑取步骤(I)中鉴定为阳性的单菌落，进行常规的生化鉴定试验。微量生化鉴定管购自杭州微生物试剂有限公司，按照说明书进行操作。结果猪链球菌YZ株的各项生化指标均符合(见表I)。(3)玻片凝集试验将分离的猪链球菌7-ΥΖ株接种商购的TSB培养基，置37°C摇床170rpm/min，培养6小时，使0D_达到I. 3 I. 5，采用玻片凝集的方法对该菌液进行血清学分型鉴定。操作方法如下取洁净玻片I张，用微量移液器吸取3 μ I猪链球菌(SS)标准阳性血清(购自丹麦哥本哈根国立血清研究所)滴于载玻片上，另吸取3μ I生理盐水做对照，然后吸取3μ I菌液分别加入血清和生理盐水中，充分混匀，(注每次加样都要更换移液器的TIP头)。轻轻摇动载玻片，I 2min后观察结果。血清与待检菌液混合后出现明显可见的凝集块，液体变为透明，而盐水对照滴仍为均匀混浊状态，即为凝集反应阳性。若血清与菌液混合后为均匀混浊状态，没有出现明显可见的凝集块视为为阴性。玻片凝集试验表明，猪链球菌7-YZ株仅与猪链球菌7型标准阳性血清发生凝集反应，不与其他血清型凝集。表I猪链球菌7-YZ生化鉴定试验
权利要求
1.一种适用于猪链球菌(streptococcus suis) 7-YZ株的高密度发酵方法,其特征在于包含如下步骤 (1)制备一级种子取保藏号为CCTCCNO M2011160的猪链球菌7-YZ在TSA平板上划线，置37°C培养16 24小时，然后挑取直径为O. lmm-1. Omm，灰白色，半透明，表面光滑，圆形，边缘整齐的小菌落，接种TSA平板上，置37°C培养16 24小时，得到一级种子； (2)制备二级种子液用接种环取一环步骤(I)的一级种子的单菌落，接种于TSB液体培养基中，置37°C摇床170rpm/min，培养6小时，使OD6tltl至O. 7 O. 9，得到二级种子菌液； (3)发酵培养取步骤(2)的二级种子菌液以V/V计为I 4%的接种量接入装有发酵培养基的摇瓶中进行发酵培养，控制摇床温度为37°C，转速为150 200rpm，起始pH为7.O 7. 5，至发酵周期为8 10小时，得到猪链球菌7-YZ菌液；或 取步骤(2)的二级种子菌液以V/V计为I 4%的接种量接入装有按V/V计的发酵培养基的发酵罐中，控制发酵温度为37°C，通气量为O. 5 lvvm，转速为100 200rpm，pH值至7. O 7. 5，至发酵周期为6 8小时，得到猪链球菌7-YZ菌液； 其中 发酵培养基的组分如下 按 g/L 计胰蛋白胨 10-30g/L，酵母粉 10-30g/L，(NH4)2SO4 l_5g/L，MgSO4 · 7Η200· 1-1. Og/L，K2HPO4 · 3H20 5-lOg/L，KH2PO4 l_5g/L，葡萄糖 1-lOg/L，牛血清30-100ml/L，余量是水； 上述发酵培养基按以下步骤制备 A、按配方量，将胰蛋白胨，酵母粉，(NH4)2SO4,MgSO4 · 7H20，用蒸馏水溶解后，定容至IOOOml ;灭菌前调pH至7. O 7. 6 ;在115 121 °C高压蒸汽下灭菌15 25min,得到A液； B、称取葡萄糖IOOg,用蒸懼水定容至IOOOml;在110 115°C高压蒸汽下灭菌15 25min,得至Ij B 液； C、称取K2HPO4· 3H20 22. 8g，加蒸馏水定容至100ml，配制得到磷酸氢二钾溶液；称取KH2PO413. 6g，用蒸馏水定容至100ml，配制得到磷酸二氢钾溶液；取磷酸氢二钾溶液84ml和磷酸二氢钾溶液16ml，使二者混合，得到磷酸盐缓冲溶液母液；在121°C高压蒸汽下灭菌15 25min ； D、将步骤B的B液，步骤C的磷酸盐缓冲母液及牛血清按配方量加入到A液中，得到猪链球菌7-YZ高密度发酵培养基； 其中 步骤B中的B液的添加量按体积比计为I 10%，步骤C中的磷酸缓冲母液添加量按体积比计为3 9%，牛血清按体积比计的添加量为5 15%。
2.一种适用于猪链球菌(streptococcus suis) 7-YZ株的高密度发酵专用培养基,其组分如下 按 g/L 计胰蛋白胨 10-30g/L，酵母粉 10-30g/L，(NH4)2SO4 l_5g/L，MgSO4 · 7Η200· 1-1. 0g/L, K2HPO4 · 3H20 5-lOg/L，KH2P04l_5g/L，葡萄糖 1-lOg/L，牛血清30-100ml/L，余量是水； 上述发酵培养基按以下步骤制备 A、按配方量，将胰蛋白胨，酵母粉，(NH4)2SO4, MgSO4 · 7H20，用蒸馏水溶解后，定容至IOOOml ;灭菌前调pH至7. O 7. 6 ;在115 121 °C高压蒸汽下灭菌15 25min,得到A液； B、称取葡萄糖IOOg,用蒸懼水定容至IOOOml;在110 115°C高压蒸汽下灭菌15 ·25min,得至Ij B 液； C、称取K2HPO4· 3H20 22. 8g，加蒸馏水定容至100ml，配制得到磷酸氢二钾溶液；称取KH2PO413. 6g，用蒸馏水定容至100ml，配制得到磷酸二氢钾溶液；取磷酸氢二钾溶液84ml和磷酸二氢钾溶液16ml，使二者混合，得到磷酸盐缓冲溶液母液；在121°C高压蒸汽下灭菌·15 25min ； D、将步骤B的B液，步骤C的磷酸盐缓冲母液及牛血清按配方量加入到A液中，得到猪链球菌7-YZ高密度发酵培养基； 其中 步骤B中的B液的添加量按体积比计为I 10%，步骤C中的磷酸缓冲母液添加量按体积比计为3 9%，牛血清按体积比计的添加量为5 15%。
3.专用于权利要求I所述方法的猪链球菌(streptococcus suis) 7-YZ株,保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO :Μ2011160。
全文摘要
本发明属于农业微生物技术领域，具体涉及一种猪链球菌7型株的分离筛选及发酵培养。分离得到一株猪链球菌7-YZ株菌，其保藏号为CCTCC NOM2011160。其发酵工艺是1)取猪链球菌7-YZ株斜面种子在TSA培养基平板上划线培养得到一级种子；2)接种一级种子单菌落至TSB培养基摇瓶中，使OD600至0.7～0.9，得二级种子；3)接种二级种子至摇瓶进行发酵培养，得到猪链球菌7-YZ菌液。本发明有利于猪链球菌7-YZ的生长代谢，菌体生长速度快，能获得较高菌量，培养猪链球菌7-YZ活菌数可达到60～70亿。生产成本比商用TSB培养基降低30～50％。
文档编号C12N1/20GK102807961SQ201110152040
公开日2012年12月5日 申请日期2011年5月31日 优先权日2011年5月31日
发明者金梅林, 陈关平, 陈守文, 徐高原, 康超, 王杨波, 陈波, 何伟, 韩进, 曹毅, 陈焕春 申请人:华中农业大学, 武汉科前动物生物制品有限责任公司