专利名称：移植物排斥反应中的Vav抑制的制作方法
技术领域：
本发明与器官移植和促进移植的移植物存活有关，还与炎性疾病和自身免疫病以及恶性增生性疾病有关。在一个方面，本发明涉及抑制移植物排异反应(例如急性或慢性移植物排异反应)的方法。
更具体地，本发明涉及通过向移植物受体给予治疗有效量的Vav蛋白抑制剂抑制移植物排异反应(例如急性或慢性移植物排异反应)。
背景技术：
Vav蛋白包括Vav1、Vav2和Vav3。Vav1是一种95KD信号传导蛋白，在利用人类肿瘤DNA的成纤维细胞转化过程中首次发现了这种蛋白的致癌基因形式(Katzav等人1989，EMBO J.82283-2290)。Vav1的序列见GenBank登录号X16316，SwissProt登录号P15498和参照序列号(Ref.Seqno.)NM_005428号。Vav1蛋白只在造血细胞和滋养层细胞中表达，并响应种刺激发生迅速的酪氨酸磷酸化，这些刺激包括TCR、B细胞抗原受体(BCR)和多种细胞因子受体的刺激(Romero&Fischer，1996，《细胞信号传导》(Cell.Signaling)8545-553；Collins等人1997，《今日免疫学》(Immnol.Today)18221-225)。蛋白激酶A也通过磷酸化Vav1的440位丝氨酸而抑制Vav1活性(WO 99/62315)。Vav1是一种作用于RHO/RAC家族小GTP酶的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)，并调节钙离子的动员、肌动蛋白的聚合以及T细胞中的受体聚集和免疫突触的形成(Turner&Billadeau 2002，《国家免疫学综述》(Nat.Rev.Immunol)2(7)476-86)。这篇文献及其中所引述的文献还研究了Vav1-/-，Vav2-/-基因敲除大鼠。Vav2和Vav3也是GEF，但是表达模式更广。
Vav1由许多也能在Vav2和Vav3中找到的结构域组成。DBL同源结构域(DH)与Rac和Rho-GTP酶发生物理作用从而促进GTP交换GDP。SRC同源结构域2(SH2)与受体酪氨酸激酶和衔接蛋白的磷酸化酪氨酸残基的识别有关，导致激活的受体与Vav1蛋白偶联。酸性基序(Ac)对Vav蛋白GEF活性的自我抑制非常重要。肌钙结合蛋白(calponin)同源结构域(CH)参与调节Vav蛋白GEF活性并在多亚基免疫识别受体下游参与调节钙离子动员。普列克底物蛋白(pleckstrin)同源结构域(PH)通过与DH发生分子内相互作用以及与磷脂酰肌醇的结合参与GEF活性的调节。锌指结构域(ZF)也参与GEF活性的激活。Vav1蛋白中的脯氨酸富含区(PR)与SRC同源结构域3(SH3)相互作用，从而SH3结构域能够与生长因子受体结合蛋白2(GRB2)结合。Vav1中SH2结构域对磷酸化酪氨酸残基的识别能促进Vav1蛋白Ac结构域中酪氨酸磷酸化，导致激活DH结构域的GEF活性。
发明内容
Vav蛋白抑制剂优选是指Vav1抑制剂。“Vav1抑制剂”是指能抑制Vav1蛋白的(一种或多种)功能的试剂或配体(例如分子，化合物)。比如说，抑制剂可抑制Vav1蛋白与Rac和/或Rho-GTP酶结合，和/或抑制Vav1的GEF活性。或者，Vav1功能的抑制剂可抑制Vav1蛋白与Vav1功能激活剂的结合和/或抑制Vav1介导的信号传导。在一个实施方案中，抑制剂可抑制Vav1蛋白中一个或多个SH2结构域与活化受体之间的相互作用，和/或抑制Vav1蛋白酪氨酸的磷酸化。在另一个实施方案中，抑制剂可干扰Vav1蛋白中SH3结构域与GRB2的结合。Vav2和Vav3抑制剂可通过类似的机制抑制Vav2和Vav3的功能。
相应的，Vav1介导的(生理)过程和细胞反应(例如T和/或B细胞活化，钙离子动员，肌动蛋白聚合，受体聚集，T细胞中免疫突触的形成)能够被Vav1的抑制剂所抑制。在此处使用的“Vav1”指自然存在的Vav1，也被称为Vav或p95Vav(例如哺乳动物，优选人(智人(Homo sapiens))Vav1)，并包括自然存在的变体，比如等位基因变体和剪接变体，这些变异保持了Vav1蛋白的功能活性。
优选地，Vav1功能的抑制剂是化合物，例如有机小分子，蛋白(比如说抗体)，肽或拟肽。
蛋白质的例子包括例如抗体，如多克隆、单克隆、嵌合、人源化或人抗体及其抗原结合片段(例如Fab，Fab’，F(ab’)2，Fv)。Vav1结合抗体的例子是Vav(C-14)，Vav(H-211)，Vav(D-7)，Vav(110-320)，Vav(E-4)，p-Vav(Tyr 174)-R，它们都是抗Vav1或磷酸化Vav1的单克隆或多克隆抗体，并且这些抗体可购自Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA。抗原结合片段可通过酶裂解或通过重组技术生产。例如，使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶裂解可分别产生Fab或F(ab’)2片段。
其他的具有所需底物特异性的蛋白酶也能用于产生Fab或F(ab’)2片段。还可以生产许多截短型的抗体，方法是在抗体基因天然终止位点的上游引入一个或多个终止密码子。例如，可以设计一种编码F(ab’)2重链部分的嵌合基因，该基因包括编码CH1结构域和重链铰链区的DNA序列。单链抗体，和嵌合、人、人源化或灵长化(CDR移植的)或表面重塑(veneered)抗体，以及嵌合、CDR移植或包含了来源于其他物种的部分的表面重塑单链抗体等等，均包含在本发明和术语“抗体”中。这些抗体的不同部分可以使用常规技术通过化学反应结合在一起，或者可以使用遗传工程技术制备为邻接蛋白。例如，可以表达编码嵌合或人化抗体的核苷酸以产生邻接蛋白。参看如Cabilly等人，美国专利4,816,567；Cabilly等人，EP 0,125,023 B1；Boss等人，美国专利4,816,397；Boss等人，EP0,120,694 B1；Neuberger，M.S.等人，WO86/01533；Neuberger，M.S.等人，EP 0,194,276 B1；Winter，美国专利5,225,539；Winter，EP 0,239,400 B1；Queen等人，EP 0 451 216 B1；以及Padlan，E.A.等人，EP 0 519 596 A1。关于灵长类化抗体还参见Newman，R.等人，《生物技术》(BioTechnology)，101455-1460(1992)。关于单链抗体可参看Ladner等人，美国专利4,946,778和Bird，R.E.等人，《科学》(Science)，242423-426(1988)。
人源化抗体可以通过合成或重组DNA技术使用标准方法或其他合适的技术生产。编码人源化可变区的核酸序列(如cDNA)也可以通过PCR诱变方法来构建，以改变编码人或人源化蛋白的DNA序列，如来自先前的人源化可变区的DNA模板。使用这些或其它合适的方法，也可以容易地生产变体。在一个实施方案中，可以突变所克隆的可变区，并且可以选出编码具有期望特异性的变体的序列。
特异于哺乳动物(例如人)Vav1蛋白的抗体可针对合适的免疫原来产生，例如分离的和/或重组的人Vav1或其部分(包括合成分子例如合成肽)。例如，可以针对包含SH2结构域的部分Vav1，或针对包含DH结构域的部分Vav1，或针对磷酸化或非磷酸化的Vav1蛋白产生抗体。还可以通过使用表达Vav1蛋白的细胞如活化的T细胞免疫合适的动物(例如小鼠、大鼠)来产生抗体(如参见美国专利5,440,020，特此将其全文教导并入作为参考)。另外，表达重组Vav1蛋白的细胞如转染的细胞也可用作为免疫原或用于筛选结合Vav1的抗体(参看如Chuntharapai等人，《免疫学杂志》(J.Jmmunol.)，152；1783-1789(1994)；美国专利5,440,021)。
可以使用一切合适的技术进行免疫抗原的制备，以及多克隆和单克隆抗体的生产。当需要单克隆抗体时，可将合适的永生细胞系细胞(例如骨髓瘤细胞系如SP2/0或P3X63Ag8.653)和产生抗体的细胞融合形成杂交瘤。产生抗体的细胞，优选来自于脾或淋巴结的细胞，可由接种目的抗原的动物获得。融合细胞(杂交瘤)可通过选择性培养条件分离，并通过有限稀释克隆。产生具有期望特异性抗体的细胞可以通过合适分析选择出来(例如ELISA)。
也可以使用其他合适的方法来产生或分离具有所需特异性的抗体，例如，这些方法包括，从文库(例如噬菌体展示文库)中选择重组抗体的方法。采用适当方法可得到能生产所有人抗体的转基因动物(例如XenoMouseTM(Abgenix，Fremont，CA))。
在此处使用的术语“肽”是指由大约二到大约九十个氨基酸残基组成的化合物，其中一个氨基酸的氨基通过肽键连接于另一个氨基酸的羧基。优选的肽序列较短(例如长度3到20个氨基酸)，并具有亲脂性，从而它们能够以充分的程度跨过细胞膜到。例如，肽可以来源于或取自于天然蛋白的酶促或化学裂解，或可以使用传统的肽合成技术(例如固相合成)或分子生物学技术(参看Sambrook，J.等人《分子克隆实验手册》Cold SpringHarbor Press，Cold Spring Harbor，NY(1989))制备。“肽”可以包含任何合适的L-和/或D-氨基酸，例如，常见的α-氨基酸(比如丙氨酸，甘氨酸，缬氨酸)，非α-氨基酸(比如β-丙氨酸，4-氨基丁酸，6-氨基己酸，肌氨酸，statine)以及少见氨基酸(例如瓜氨酸，高瓜氨酸，高丝氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，鸟氨酸)。肽中的氨基、羧基和/或其他官能团可以是游离的(比如未修饰的)也可以被合适的保护基保护起来。适用于氨基和羧基的合适的保护基以及如何加入和去除保护基的方法是本领域公知的，并且公布于如Green和Wuts《有机合成中的保护基》(ProtectingGroups in Organic Synthesis)John Wiley and Sons，1991中。肽中的官能团还可通过本领域已知的方法衍生(例如烷基化)。
抑制剂可抑制Vav1与Rac和/或Rho-GTP酶的结合，和/或抑制Vav1的GEF活性。这样的抑制剂可包括影响Vav1与GTP酶结合的抗体，或见于Vav1中DH结构域的肽序列，或Rac或Rho-GTP酶中参与Vav1结合的序列。备选地，抑制剂还可以是结合在Vav1蛋白远离DH结构域的位点上的变构抑制剂，其阻止对DH结构域施加作用，从而抑制GEF活性。
合适的抑制性肽也包括通过与Vav1蛋白SH2结构域结合而干扰Vav1蛋白的磷酸化，从而抑制Vav1蛋白与活化受体偶联的肽。举例来说，抑制性肽可以是具有磷酸化酪氨酸的多肽序列，其模拟被Vav1蛋白的SH2结构域识别的序列，例如包含序列pTyr-Xaa-Glu-Pro的肽，其中Xaa为Met、Leu或Glu，条件是抑制性肽本身并不会导致Vav1蛋白的酪氨酸磷酸化和/或激活。这样的抑制性肽序列包括在受体酪氨酸激酶和衔接蛋白中发现的Vav1与之结合的序列，例如衍生自这些受体胞质结构域的包含磷酸化酪氨酸的序列，比如见于T细胞受体中的SH2结合序列，FceR受体，IgM受体，p145c-kit，IL-2受体，IFNα受体，SLP76(包含SH2结构域的76KD白细胞蛋白)，B细胞连接蛋白(BLNK；SLP65/BASH)或CD19。在备选的实施方案中，抑制剂可以是包含Vav1蛋白中SH2结构域中存在的序列的肽，例如Vav1蛋白中能够与pTyr-Xaa-Glu-Pro序列相互作用，和/或与上述受体酪氨酸激酶/衔接蛋白之一的磷酸化酪氨酸序列相互作用的序列，从而封闭Vav1蛋白与活化的受体/衔接蛋白结合。例如，肽抑制剂可包含见于人Vav1蛋白残基671-765的序列。
备选地，抑制剂还可以是干扰Vav1蛋白SH3结构域与GRB2结合的肽，例如包含见于GRB2蛋白中的SH3结合结构域、或见于Vav1SH3结构域中的GRB2结合结构域的肽，比如象在WO95/26983中所公开的那样。
在进一步的实施方案中，抑制剂还可以是这样的肽，其通过模拟Vav1蛋白的磷酸化位点如Tyr174磷酸化位点而干扰Vav1磷酸化，或与所述磷酸化位点结合。备选地，抑制剂还可以是Vav1蛋白如Ser440处的丝氨酸磷酸化的增强剂，例如，如WO99/62315中所述。
在另一个实施方案中，抑制剂还可以是包含自我抑制序列的肽，例如见于Vav1蛋白Ac结构域中的序列，在未发生酪氨酸磷酸化的条件下其能抑制Vav1蛋白的激活。
例如，可以使用上文所具体鉴定的或由如上所述的方法生产的抗Vav1抗体来探测Vav1蛋白和其他分子实体的相互作用，从而鉴定可用于这些实施方案的合适点肽序列。例如，可以使用特异性抑制Vav1与Rho-GTP酶结合的抗Vav1单克隆抗体来鉴定Vav1蛋白中(比如DH结构域中)可用作为Vav1蛋白功能抑制剂的短肽序列。
此处使用的术语“拟肽”是指能模拟多肽结构方面却非多肽的分子。例如，可以制备与能够抑制Vav1蛋白的肽具有相同官能团的多糖。例如，可以通过分析肽试剂在被Vav1结合或将与之结合的环境下的三维结构来设计拟肽。拟肽包含至少两个组件，结合部分和主链或支持结构。
结合部分指能与Vav1如处于配体结合位点上或附近的氨基酸反应或形成复合物(比如通过疏水作用或离子相互作用)的化学原子或基团。例如，拟肽中的结合部分可以与Vav1的肽抑制剂的结合部分相同。结合部分可以是以与Vav1的肽抑制剂的结合部分相同或相似的方式与Vav1反应的原子或化学基团。适用于设计针对肽中碱性氨基酸的拟肽的结合部分的实例为含氮基团，如胺、铵、胍和酰氨或磷。适用于设计针对酸性氨基酸的拟肽的结合部分的实例可以是例如羧基、低级烷基羧酸酯、磺酸、低级烷基磺酸酯以及磷酸或磷酸酯。
支持结构是这样的化学实体，当其被结合部分结合时，保证了拟肽的三维构象。支持结构可以是有机的，也可以是无机的。有机支持结构的实例包括多糖、有机合成聚合物的多聚体或寡聚体(比如聚乙烯醇或聚交酯)。优选所述支持结构具有与肽主链或支持结构基本上相同的大小和尺寸。这可以通过计算或测量肽和拟肽中原子和化学键的大小来确定。在一个实施方案中，肽键中的氮原子可以被氧或硫原子取代。在另一个实施方案中，羰基可以被磺酰基或亚磺酰基取代，由此形成聚酰胺(如聚磺酰胺)。还可以制备多肽的逆酰胺化合物(reverse amides)(如，用-NHCO-基取代一个或多个-CONH-基)。又在另一个实施方案中，可以用聚硅烷主链取代肽主链。
这些化合物都可用已知的方法制备。例如，聚酯拟肽可以这样制备，即用羟基取代氨基酸上相应的α-氨基，由此制备羟酸，继而将其酯化，任选地封闭酸性或碱性侧链以最小化副反应。期望的拟肽的化学结构一经确定，一般就能容易地确定合适的化学合成路线。
可以合成拟肽，并组合到包含数个到多个独立分子种类的文库中。这些文库都能使用众所周知的组合化学方法制备，并能如文中所述进行筛选，以确定该文库是否包含抑制Vav1功能的一种或多种拟肽。然后可通过合适的方法分离这样的拟肽拮抗剂。
利用下文所述的方法通过在文库中筛选有机化合物，可以鉴定抑制Vav1蛋白一个或多个功能的有机小分子。合适的有机小分子可通过上述的任何一种机制抑制Vav1的功能，例如，抑制Vav1与受体酪氨酸激酶的结合，模拟Ac结构域的自我抑制，保持Vav1蛋白自我抑制形式的稳定，或者优选抑制Vav1与Rho或Rac GTP酶的结合和/或抑制Vav1的GEF活性。
试剂(如蛋白、肽、自然产物、有机小分子、拟肽)对Vav1功能的抑制能力可以利用合适的筛选(如高通量筛选)测定。优选的检测方法包括在Vav1蛋白存在的情况下，测定待测试剂对鸟嘌呤核苷酸交换速率的影响，如GTP交换合适的GTP酶中的(即结合于其上的)GDP的速率，这些GTP酶包括RhoA或Rac GTP酶。试剂存在下鸟嘌呤核苷酸交换速率降低，则提示可能为Vav1抑制剂。优选的Vav1抑制剂可鉴定为能降低鸟嘌呤核苷酸交换速率至少10％，更优选至少50％，最优选至少90％的那些试剂。
例如，Vav1可以通过被合适激酶磷酸化，或者通过自我抑制性Ac结构域的裂解而被激活。备选地，在检测操作中使所用的Vav1蛋白可表现出充分的组成型活性，而无需独立的激活步骤。例如，所述方法可包括使用具有组成型活性的Vav1片段，如包含DH结构域如人Vav1蛋白残基181-375，或使用具有组成性活性的Vav1蛋白变体，如Y174F变体，其中174位酪氨酸残基被苯丙氨酸取代。可以使用任何的具有活性的Vav片段或变体，即能够被激活以表现出与全长Vav1蛋白所表现的基本上相似的GEF活性。
举例来说，可以用荧光标记的GDP(如购自Molecular Probes的BODIPY标记的GTP/GDP类似物)结合到Rac-1 GTP酶上。然后可以测量在存在GTP和Vav1时以及存在GTP、Vav1和待测试剂时荧光消失的速率。如果只加入GTP，随着GTP交换GTP酶上的荧光-GDP，荧光减弱得很慢。Vav1通过加快GTP交换GDP的过程而使荧光消失速率加快。相对于Vav1和GTP存在下的速率，Vav1抑制剂能降低荧光消失速率。优选的Vav1抑制剂可鉴定为能降低荧光消失速率至少10％，更优选至少50％，最优选至少90％的那些试剂。
或者，可以检测在存在Vav1以及存在Vav1和待测试剂时，向GTP酶中加入荧光标记的GDP后荧光增强的速率，并加以比较。Vav1能加快荧光的增强速率。Vav1抑制剂能减慢荧光的增强速率。优选的Vav1抑制剂可鉴定为能降低荧光增强速率至少10％，更优选至少50％，最优选至少90％的那些试剂。
在另一个实施方案中，可用荧光标记的GTP替换荧光标记的GDP类似物。荧光标记的GTP由GTP酶裂解以产生荧光标记的GDP，进而可以测量后者与非荧光标记的GTP的交换。在进一步的备选实施方案中，是先用未标记的GDP结合GTP酶，再加入标记的GTP，并在Vav1存在的情况下测量荧光的增强。如果存在Vav1抑制剂，荧光的增强将受减弱。
在一个实施方案中，检测法包括以下步骤-荧光标记的GDP(如购自Molecular Probes的BODIPY标记的GTP/GDP类似物)与GTP酶Rac1(如下文所述制备)共同温育。核苷酸与Rac1的结合导致荧光的增强，这是因为鸟嘌呤碱基引起的分子内(荧光)淬灭将由于其被固定在该GTP酶中的结合口袋上而克服。通过在反应混合物中纳入合适的鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)如Vav1，可加快这种结合反应(见图1)。
-加入过量未标记的GTP将替换下GTP酶上的荧光(标记的)GDP，伴随着荧光的降低。核苷酸交换因子Vav1能加快这一交换反应(见图1)。
-Vav1的活性可由交换反应的时间常数来确定，或者通过在适当选定的时间点比较有或无Vav1的样品中的荧光强度来确定。Vav1的抑制剂是可检测的，因为其封闭核苷酸交换因子的催化效应。从而在存在抑制剂时，图1中的曲线形状将从“+Vav1”所示转向“-Vav1”所示。
上述方法中使用的Rac1和Vav1可以采用标准的技术，如克隆，重组蛋白的表达和纯化等获得。
在一个实施方案中，Rac1制备如下将编码全长人Rac1(参照序列号NM_006908)(氨基酸2-192)的插入子克隆到衍生自pET系列(Novagen)的标准表达质粒中，其具有硫氧还蛋白、GST、His6-tag之类的N末端标签以便于亲和纯化，并具有PreScission蛋白酶(APBiotech)的切割位点。所述插入子编码序列位于上述所有标记的C末端。在不同的大肠杆菌菌株如BL(21)DE3 Tuner(Novagen)中进行表达，其中DE3元件包含编码T7 RNA聚合酶的DNA，这使得重组蛋白的高表达水平成为可能。表达在标准条件下，在LB培养基中，IPTG诱导和各种温育时间和温度下进行。细菌在2L的Erlenmeyer震荡培养瓶中生长。使用亲和层析(His6-tag标记的蛋白使用Ni-NTA，GST标记的蛋白使用GSH琼脂糖)进行第一步纯化。进一步的纯化可采用经典的层析技术进行，如大小排阻、离子交换，疏水相互作用等。可在标记仍连接在其上的情况下使用蛋白，也可以使用蛋白水解去除标记并层析分离所切除的标记后再使用蛋白。
在一个实施方案中，上述测量中使用的Vav1如下获得。将编码全长人Vav1蛋白(氨基酸2-845)的插入子克隆到衍生自FastBac系列(Invitrogen)的标准表达质粒中，其具有GST和His6-tag N末端标签以便于亲和纯化，并具有PreScission蛋白酶(APBiotech)的切割位点。备选地也可使用MBP和NusA N末端标签。所述插入子位于上述所有标记的C末端。用于产生杆状病毒的杆粒通过在大肠杆菌中重组产生，并使用大质粒纯化试剂盒(Qiagen)纯化。由于蛋白是在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达，作为第一步需要通过感染Sf21单层昆虫细胞产生足够量的杆状病毒。一旦当病毒达到所需量时，蛋白即可在Hi Five悬浮昆虫细胞中生产，藉此细胞在旋转培养瓶或波浪生物反应器(Wave Bioreactors)中培养。使用亲和层析(His6-tag标记的蛋白使用Ni-NTA，GST标记的蛋白使用GSH琼脂糖)进行第一步纯化。进一步的纯化可采用经典的层析技术进行，如大小排阻、离子交换，疏水相互作用等。可在标记仍连接在其上的情况下使用蛋白，也可以使用蛋白水解去除标记并层析分离所切除的标记后再使用蛋白。
包含Vav1中DH1结构域如人Vav1蛋白181-375位残基的多肽可以通过大肠杆菌采用相似方法获得。
在备选的检测方法中，Vav1抑制剂可通过测量待测试剂抑制由抗CD3和抗CD28抗体所诱导的含Vav1细胞(如胸腺细胞)的细胞凋亡的能力来鉴定。该检测方法的基础是观察到Vav1-/+胸腺细胞在抗CD3和抗CD28抗体刺激后经历细胞凋亡，而Vav1-/-胸腺细胞则不发生。该检测方法的优点是只有无毒的，能透过细胞的药物才能被鉴定出来。可将待测化合物抑制细胞凋亡的能力可与Vav1-/+和Vav1-/-细胞中的进行比较。
鉴定Vav1抑制剂的另外的检测方法包括基于Vav1激活后的下游细胞效应的方法，例如检测钙离子动员，CD69表达或肌动蛋白聚合，使用EYFP-肌动蛋白测量细胞骨架的重建。这些检测方法可与上述的鸟嘌呤交换检测法结合使用，以鉴定所述试剂是介由Vav1抑制起作用、还还是作用于下游事件。
在另一实施方案中，Vav1抑制剂的检测方法包括基于无标记的液相色谱-质谱法的高通量筛选方法，如SpeedScreen。这种方法通过亲和选择及其后的大小排阻层析和微孔-液相色谱/电喷射离子化质谱允许鉴定出结合到Vav1上的试剂。
由此鉴定出的Vav1抑制剂适用于本发明。
此处使用的术语“移植物”指这样的器官和/或组织和/或细胞，其可由第一哺乳动物(或供体)获得并被移植到第二哺乳动物(或受体)，优选为人的。例如，术语“移植物”包括皮肤、眼或眼的部分(如角膜、视网膜、晶体)、肌肉、骨髓或骨髓的细胞成分(如干细胞、祖细胞)、心脏、肺、心肺、肝脏、肾脏、胰腺(如胰岛细胞、β-细胞)，甲状旁腺、肠(如结肠、小肠、十二指肠)、神经组织、骨和血管(如动脉、静脉)。移植物可以取自合适的哺乳动物(如人或猪)，或在特定情况下在体外通过培养细胞获得，如胚胎、皮肤或血液细胞以及骨髓细胞。优选的移植物来自人。
肾脏、心脏、肝脏和肺的器官移植目前是治疗终末期器官疾病的常规手段。已经进行过同种异体和异种器官移植。但是，由于长期慢性排异反应的存在，器官移植还不是非可逆性器官疾病的永久性解决方案。急性排异反应的治疗也需要改良的试剂。
慢性排异自身主要表现为进行性和非可逆性移植物机能障碍，它是器官移植失败的主要原因，在一些病例中发生于手术后一年以上。慢性排异所造成的临床问题随着移植后存活时间而变得明显，在移植后10年左右，约一半的肾同种移植物丧失，并在接受同种异体心脏移植的患者中观察到相似的数值。
慢性排异反应被认为是一个多因素过程，其中不光是对于移植物的免疫反应，而且移植器官中的血管壁对损伤的应答(“对损伤的应答”反应)也起到一定作用。慢性排异反应中预后最差的变形是一种动脉硬化样的改变，也叫移植后血管病变、移植物血管病、移植物动脉硬化、移植冠脉病等。这种血管病变的特点是平滑肌细胞在其中由内皮细胞产生的细胞因子的作用下发生迁移和增生。最近研究证明了血液中的干细胞作为新生内膜组织(neo-intimal tissue)的前体细胞的作用。病变在宿主抗体或抗原-抗体复合物及其他因素造成的反复内皮损伤，内皮增生和增厚，平滑肌细胞增生修复等过程中不断加重，并最终发展为血管腔的阻塞。同样所谓的非免疫因素如高血压、高脂血症、高胆固醇血症等也起到一定作用。
由于没有已知的有效的治疗和预防方法，慢性排异反应似乎是不可动摇和不可控制的。因此始终需要发展一种有效的预防、控制或逆转慢性移植物血管病的表现的治疗方法。
自身免疫病和炎性疾病包括如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、桥本甲状腺炎、多发性硬化、重症肌无力、I或II型糖尿病和与之相关的紊乱，血管炎、恶性贫血、干燥综合征、眼葡萄膜炎、银屑病、Graves眼病、斑秃等，以及变态反应性疾病如过敏性哮喘、异位性皮炎、过敏性鼻炎/结膜炎、过敏性接触性皮炎，任选地存在异常反应的炎性疾病，如炎性肠病克罗恩病或溃疡性结肠炎、内源性哮喘、炎性肺损伤、炎性肝损伤、炎性肾小球损伤、动脉硬化、骨关节炎、刺激性接触性皮炎，还有湿疹性皮炎、脂溢性皮炎、免疫介导的疾病的皮肤表现、炎性眼病、角膜结膜炎、心肌炎或肝炎。
恶性增生性疾病包括非实体瘤，特别是白血病和淋巴瘤，甚至更具体地是T细胞白血病和T细胞淋巴瘤。T细胞白血病和淋巴瘤包括但不限于T细胞幼淋巴细胞白血病、T细胞粒淋巴细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、毛细胞白血病、鼻和鼻型NK/T细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿和Sezary综合征、血管免疫母细胞型T细胞淋巴瘤、未分型周围T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(HTLV1+)、间变大细胞淋巴瘤、原发表皮CD30阳性T细胞淋巴增生异常、表皮T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、肠T细胞淋巴瘤(+肠病)和肝脾γ/δT细胞淋巴瘤。
根据本发明的特别发现，本发明提供了1.1一种在接受同种异体细胞、组织或器官移植的受体中预防或治疗急性排异反应的方法，包括向所述受体给予治疗有效量的哺乳动物(如人)的Vav蛋白抑制剂的步骤；1.2一种在接受同种异体组织或器官移植的受体中预防或治疗慢性排异反应以避免、减少或限制慢性排异的方法，该方法包括向所述受体给予治疗有效量的哺乳动物(如人)的Vav蛋白抑制剂的步骤；1.3在接受同种异体组织或器官移植的受体中预防或治疗移植物血管病如移植血管病变或动脉硬化的方法，该方法包括向所述受体给予治疗有效量的哺乳动物(如人)的Vav蛋白抑制剂的步骤；1.4一种在需要预防或治疗的个体中预防或治疗血管损伤后静脉移植物狭窄、再狭窄和/或血管闭塞的方法，例如，这些损伤由插管手术或血管刮擦手术如经皮经腔血管成形术所致，该方法包括向所述个体给予治疗有效量的哺乳动物(如人)的Vav蛋白抑制剂的步骤；1.5一种在需要(预防或治疗)的个体中预防或治疗炎性疾病或自身免疫病的方法，包括向所述个体给予治疗有效量的Vav蛋白抑制剂的步骤；1.6一种在需要(预防或治疗)的个体中预防或治疗恶性增生性疾病的方法，包括向所述个体给予治疗有效量的Vav蛋白抑制剂的步骤；1.7Vav蛋白抑制剂在预防、治疗或抑制(a)同种异体细胞、组织或器官移植受体中急性或慢性移植物排异反应，(b)血管损伤后静脉移植物狭窄、再狭窄和/或血管闭塞，或(c)炎性疾病、自身免疫病或恶性增生性疾病中的用途；
1.8Vav蛋白抑制剂用于制备药物的用途，所述药物用于预防、治疗或抑制(a)同种异体细胞、组织或器官移植受体中急性或慢性移植物排异反应，(b)血管损伤后静脉移植物狭窄、再狭窄和/或血管闭塞，或(c)炎性、自身免疫性或恶性增殖性疾病。
1.9一种药物组合物，可用于如上述1.1到1.6中所限定的方法，其包括哺乳动物(如人)Vav蛋白的抑制剂(如Vav1的抑制剂)和一种或多种药学上可接受的稀释剂或载体。
关于转基因Vav-1缺陷小鼠的研究证明了Vav-1蛋白作为抑制靶标在预防或治疗移植物排异中的实用性。可重复应用以下方法，例如使用Vav-2缺陷小鼠。
A.1异位血管心脏同种异体移植使用Corry等人1973，《移植》(Transplanation)16(4)，343-350中描述的方法进行异位心脏移植，使用Balb/c(H-2d，Charles River，Wiga)小鼠作为供体，Vav-1基因敲除小鼠和野生型小鼠作为受体，MHC和mH分型完全错配。Vav-1基因敲除小鼠按Fischer等人1998，《当代生物学》(Curr.Biol.)8，554-562中描述的方法产生。简单地说，用异氟烷麻醉动物。继供体通过腹部下腔静脉肝素化，同时经主动脉放血后，开胸快速冷却心脏。结扎主动脉并向远端分离至第一个分支，右侧头臂干分离至第一个分支。结扎左肺动脉并分离，右侧分离。将其他血管切断、结扎和分离后，取出供体心脏置于冰生理盐水中。受体通过切断和夹闭肾下腹主动脉和下腔静脉制备。使用11/0单纤丝缝线，在供体的右头臂干和受体的主动脉，以及供体的右肺动脉到受体的下腔静脉之间端侧吻合地植入移植物。去除血管钳，将移植物系在腹膜后，用温盐水冲洗腹腔内容物，关腹，受体在加温条件下恢复。
每天通过腹部触诊监测移植物情况，当没有可触及的心室收缩时考虑发生了排异。
A.3治疗组动物被随机分配到以下治疗组之一(n＝5只每组)(a)Balb/c-至-Vav-1敲除；(b)Balb/c-至-Vav-1野生型(C57BL/6)A.4同种心脏移植物存活-表1
同种心脏移植物存活时间在Vav-1缺陷型小鼠中明显长于野生型对照组(如表1所示)。
A.5.1组织病理和免疫组化移植物存活时间＞100天的同种心脏移植物中血管重塑程度通过冠脉血管重塑评分来评分。
组织经4％缓冲福尔马林固定，石蜡包埋；切片厚度3-4μm的移植物用苏木精和曙红染色，采用Van Gieson染色观察内弹力层。间质细胞排异评分为无排异、轻度、中度或重度排异。血管内膜增厚评分为无、轻度、中度或重度。
对石蜡切片进行了免疫组化分析。使用抗平滑肌肌动蛋白(SMA 1A4克隆，DakoCytomation，Denmark，稀释度1∶25)、大鼠抗人CD3(T细胞，CD3-12克隆，Serotec，UK，稀释度1∶200)、大鼠抗小鼠F4/80(巨嗜细胞，CIA3-1克隆，Serotec，UK，稀释度1∶100)和大鼠抗小鼠CD45R(B细胞，RA3-6B2克隆，Serotec，UK，稀释度1∶10000)抗体作为一抗进行链抗生物素蛋白/过氧化物酶反应。使用Leica DMR显微镜进行了平滑肌细胞和浸润的CD3+、F4/80+和CD45+细胞的半定量分析。
个体的NI值经平均后按平均值±标准差方式报告。采用单向方差分析对治疗组的平均值进行假设检验，报告了概率值。当p＜0.05时考虑存在统计学显著性。
A5.2心脏同种移植物的组织学Vav-1+/+受体在7-8天后表现出严重的急性细胞排异。Vav-1-/-受体在存活＞100天时仅表现出轻度的间质排异。
A6移植(受体)小鼠血液的FACS分析和血液学在尸检期间取全血于肝素包埋的试管中进行FACS分析。取250μl全血置于EDTA包埋的试管中，试管内含有250μl PBS w/o Ca2+/Mg2+，混合后(再)加入500μl核酸纯化裂解液(Applied Biosystem#4305895)后，漩涡震荡0.5分钟，置于-20℃冷冻。取第三份血样进行H1血液学检测。
从B6 WT小鼠和Vav1敲除小鼠中采用标准方法取得脾细胞和周围血，按200000细胞/孔用以不同刺激物进行离体刺激16小时(见表2)。使用3色或4色流式细胞仪对细胞进行免疫表型分型并按照CD69的表达情况确定刺激程度。
当WT和Vav1缺陷型鼠脾细胞和周围血淋巴细胞受到不同刺激时，FACS分析显示Vav1缺陷型T细胞(CD4+，CD8+)和Vav1缺陷型B细胞(B220+)中活化标记CD69的表达明显较低。来自脾脏和周围血的T细胞和B细胞的结果类似。证明Vav1缺陷阻断了T细胞激活和依赖于T细胞的B细胞激活。
表2T和B细胞CD69的表达脾细胞 CD4+
脾细胞 B220+
哺乳动物(如人)Vav蛋白抑制剂在急性或慢性排异反应中的实用性，以及在治疗上面提到的疾病和病情中的实用性，可通过动物实验例如按照下述方法加以证明，也可以在临床中检验，例如对移植器官或组织进行定期活检操纵，若是心脏移植，还可另外使用超声扫描。
B.1急性排异举例来说，采用Balb/c(H-2d)小鼠作为供体动物，而CBA(H-2K)小鼠作为受体。采用已知手段从供体取得心脏并在冷盐水中(4℃)保存。受体动物采用异氟烷麻醉。暴露肾下腹主动脉和下腔静脉。从筋膜切开血管长3-5mm，结扎并分离任何小分支。先从近端阻断血管，再在远端阻断。切开动脉和静脉后，使用肝素化的生理盐水冲洗血管腔。端侧缝合主动脉然后是供体右肺动脉和受体下腔静脉。去除远端结扎线，再去除近端结扎线。检查缝线有无渗漏。再将移植物系在腹膜后。温盐水冲洗腹腔后缝合伤口。每日腹部触诊监测移植物功能。跳动消失则认为发生排异。
实验动物接受如下治疗之一Vav1抑制剂单独治疗或Vav1和Vav2抑制剂联合治疗。在此检测中，用Vav1抑制剂或者联合Vav1/Vav2抑制剂治疗的动物均观察到移植物功能的改善。
B.2慢性排异供体小鼠(如C3H)采用异氟烷麻醉，左右颈动脉分离并切断。放血并使用肝素盐水100I.U./mL去除残存血液。两条动脉均尽可能地分离至近远端分支处，再次用肝素盐水冲洗，并在4℃盐水中保存。受体小鼠(如B6)如上所述麻醉后在气管旁分离出左颈内动脉。在近远端分别施用微血管夹。在两个血管夹之间切开适合长度的通路，置入供体血管，修剪至所需长度。进行端端缝合。先后松开远近端血管夹，确保止血后缝合皮肤。将动物放置在红外灯下直至完全恢复。
实验动物接受如下治疗之一Vav1抑制剂单独治疗或Vav1和Vav2抑制剂联合治疗。
5-8周后处死动物，在颈动脉中灌注2mL冷磷酸盐缓冲液(PBS)后，再灌注2mL冷灌注固定液(0.01M PBS中加入2.5％戊二醛(gluteraldehyde)，2％福尔马林)。然后切下颈动脉作组织学染色分析评价。形态分析包括中膜和内膜厚度的测量。对形态改变进行定量分析，包括对外膜单核细胞浸润和坏死(血管变性，细胞增生)，中膜平滑肌细胞(SMC)核数目，SMC坏死和内膜单核细胞浸润进行评分。在这项实验中接受Vav1抑制剂单独治疗或Vav1和Vav2抑制剂联合治疗的动物均观察到移植物功能的改善。
B.3血管成型关于血管成型的研究是通过大鼠的球囊导管损伤模型进行的。在第0天进行了球囊导管术，大致按照Power等人(1989)描述的方法进行。在异氟烷麻醉后，将一条2F Fogarty导管插入(大鼠的)左颈总动脉中，产生均匀的内皮损伤。然后取出导管，在颈外动脉附近结扎以防止出血，令动物恢复。实验中使用了2组如12只RoRo大鼠(400g，约24周龄)随机分为一个对照组和一个接受Vav1抑制剂的(治疗)组。Vav1抑制剂在球囊损伤前2天(第-3天)开始输注给药，直至研究结束，即球囊损伤后14天。异氟烷麻醉后使用0.1M磷酸盐缓冲液(PBS，PH 7.4)灌注大鼠，再用含2.5％戊二醛(gluteraldehyde)的磷酸盐缓冲液(PH 7.4)灌注15分钟。切下颈动脉，从周围组织中分离，并浸入含7％蔗糖的0.1M二甲砷酸盐缓冲液(PH 7.4)中，4℃过夜温育。第二天使用Technovit7100根据制造商的建议包埋颈动脉。使用图像分析系统(MCID，多伦多，加拿大)从形态剂量学方面评价中膜、新生内膜和管腔的横截面。
Vav蛋白抑制剂(如Vav1抑制剂)可作为单独的活性成分或与免疫调节治疗的药物或者其他抗炎剂一起给药，例如用于预防或者治疗同种异体移植物的急性或慢性排斥反应，炎性或自身免疫性疾病或者恶性增生性疾病。例如，他们可联合使用下列药物钙神经蛋白抑制剂，如环孢素A、环孢素G、FK-506、ABT-281、ASM 981；mTOR抑制剂，如雷帕霉素、40-O-(2-羟基)乙基雷帕霉素、CCI779、ABT578、AP23573、AP23464、AP23675、AP23841或TAFA-93；糖皮质激素；环磷酰胺；硫唑嘌呤；甲氨蝶呤；EDG受体激动剂，如FTY 720或其类似物；来氟米特或其类似物；咪唑立宾；麦考酚酸；麦考酚酸酯；15-去氧司帕加林或其类似物；免疫抑制单克隆抗体，如白细胞受体单克隆抗体，例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD11a/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、CD137、ICOS、CD150(SLAM)、OX40、4-1BB或其配体，例如CD154；或者其他的免疫调节化合物，如至少具有CTLA4胞外结构域一部分或其突变体的重组结合分子，例如至少CTLA4胞外的一部分或其突变体结合到非CTLA4蛋白序列上，如CTLA4Ig(例如命名为ATCC 68629)或其突变体，如LEA29Y，或者其他粘附分子抑制剂，如单抗或者低分子量抑制剂，包括LFA-1拮抗剂，选择素拮抗剂和VLA-4拮抗剂；化疗剂，如抗肿瘤剂或者在肿瘤治疗中用作为佐剂的试剂，例如芳香酶抑制剂，抗雌激素类，拓扑异构酶I抑制剂，拓扑异构酶II抑制剂，微管活性剂，烷化剂，抗肿瘤性抗代谢物，铂类化合物，降低蛋白激酶活性的化合物，特别是非受体酪氨酸激酶受体，还有抗血管生成化合物，促性腺激素释放激素激动剂，抗雄激素类，二膦酸盐，曲妥单抗和各种各样的抗癌剂，如6-硫鸟嘌呤，羟基脲，甲基苄肼或者博莱霉素；或者包含白喉或假单胞菌毒素部分和适合于将融合蛋白靶向T细胞的靶向部分(例如抗CD3抗体)的抗T细胞免疫毒素融合蛋白，如DT389-sFv(UCHT1)、scFv(UCHT1)-PE38以及(Ala)dmDT390-bisFv(UCHT1*)，它们可按照WO 01/87982、WO00/41474或美国专利申请流水号09/573,797中的描述来制备和给药，特此将其内容并入作为参考，或者如EP 517829中公开的市场上商品名为ONTAK的看和白喉免疫毒素。
在更深入的方面，此抑制剂是Vav2抑制剂。“Vav2抑制剂”意指能够抑制Vav2(一种或多种)功能的试剂或者配体(例如分子或者化合物)。因此，抑制剂可以抑制Vav2的GEF活性，或者从Vav1类推，抑制Vav2的任何其他功能。优选地，Vav2功能的抑制剂是化合物，例如有机小分子、蛋白(例如抗体)、肽或者拟肽。Vav2结合抗体的实例是可由Santa CruzBiotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA获得的Vav2(D-7)和Vav2(P-18)。其他的抗Vav2抗体可以用和前述抗Vav1抗体的方法类推生产。肽、拟肽和有机小分子性质的Vav2抑制剂也可以用和前述的Vav1抑制剂相似的方法生产。Vav2抑制剂可以用于前述与Vav1有关的方法之中。
除了用Vav2替代Vav1外，Vav2抑制剂可以通过前述鸟嘌呤核苷酸交换法鉴定。更进一步，本发明提供了包含Vav1抑制剂和Vav2抑制剂的治疗联合。为了鉴定能够同时抑制Vav1和Vav2的试剂，此方法中可对Vav1抑制剂进一步筛选Vav2抑制剂活性。从而在一个方面，此抑制剂是联合Vav1和Vav2抑制剂，也就是说单个试剂能够同时抑制Vav1和Vav2。当治疗期望同时抑制T细胞和B细胞功能、活化和/或增生的病情时，优选使用联合Vav1/Vav2抑制剂，或者联合给药Vav1抑制剂和Vav2抑制剂。
向个体给药的Vav蛋白抑制剂或者其他附加药物的量将取决于个体的特征，如一般健康情况、年龄、性别、体重、所采用的化合物、给药途径和待治疗病情的严重性。技术人员将能够根据这些和其他因素决定合适的剂量。典型地，成年人有效量从约每天0.1mg到约每天100mg的范围内变动。抗体和其抗原结合片段，尤其是人、人源化或者嵌合抗体和其抗原结合片段常常能够比其他类型的治疗方法以更低的频率给药。例如，这种抗体的有效量范围是每天、每周、每两周、每月或以更低的频率从大约0.01到5或10mg/kg。
Vav蛋白抑制剂(例如Vav1抑制剂)可以通过各种常规路径给药，特别是肠内用药，例如口服，如饮用溶液、药片或者胶囊的形式，或者胃肠外给药，例如注射液或者悬浮液的形式，或者局部给药。Vav抑制剂可以作为中性化合物或者作为药学上可接受的盐类给药，比如与合适的酸或碱所获得的盐。
与前述一致，现有的发明可用于更广泛的方面5.上述的方法，包括共给药——如同时或者序贯地——治疗有效量的Vav蛋白抑制剂(例如Vav1抑制剂)和至少一种第二药物，例如，所述第二药物指上面提及的免疫抑制剂、免疫调节剂或者抗炎药或者化疗剂。
6.治疗联合，例如药盒，包含a)Vav蛋白抑制剂(例如Vav1抑制剂)和b)至少一种选自免疫抑制剂、免疫调节剂或者抗炎药或化疗剂的第二试剂。组分a)和b)可以同时组分或者序贯使用。药盒中可含有关于其使用的说明书。
7.上述的方法，包括共给药——如同时或者序贯地——治疗有效量的Vav1抑制剂和Vav2抑制剂。
8.治疗联合，如药盒，包含a)Vav1抑制剂和b)Vav2抑制剂。组分a)和组分b)可以同时或者序贯使用。药盒中可含有关于其使用的说明书。
9.鉴定试剂是否为Vav1抑制剂的筛选方法，包括在Rho或Rac GTP酶中测定鸟嘌呤核苷酸交换速率的步骤，此时需要(a)所述试剂和(b)Vav1，或者他们的活性片段或突变体的存在，试剂存在下鸟嘌呤核苷酸交换速率降低表明所述试剂是Vav1抑制剂。
10.鉴定试剂是否为Vav2抑制剂的筛选方法，包括在Rho或Rac GTP酶中测定鸟嘌呤核苷酸交换率的步骤，此时需要(a)所述试剂和(b)Vav2，或者他们的活性片段或突变体的存在，试剂存在下鸟嘌呤核苷酸交换速率降低表明所述试剂是Vav2抑制剂。
11.Vav1或Vav2抑制剂可通过前述方法得到。
图1显示了使用Rac GTP酶和BODIPY-GDP，在有或者没有Vav1时，在有关Vav1抑制剂的鸟嘌呤核苷酸交换法测定中荧光强度随时间的变化。
参照下面的非限制性实施例，将可以更精确的描述此发明。
实施例1Bodipy-GDP/Rac-1结合检测法向1536孔微量滴定板中每孔加入加入量 终浓度(加入Rac-1后)2pmol重组人Vav1蛋白 1μM0.2pmol Bodipy-GDP 100nM40pmol测试化合物20μM在0.1M、pH7.0的磷酸盐缓冲液中，各孔同时加入0.4pmol(终浓度200nM)重组人Rac-1以起始反应，各孔终体积为2μl。向各孔加入不同的测试化合物。对照孔中每孔含有上述组分，但要么没有(a)测试化合物，要么(b)没有测试化合物也没有Vav-1。
孔板在25℃温育30分钟。然后用荧光板读取计同时测量各孔的荧光(强度)，激发波长为488nM，测量波长在530nM。
含有Vav-1没有抑制剂的对照孔(a)中所测的荧光最强。不含Vav-1的对照孔(b)中记录到较弱的(基线)荧光。含有作为测试化合物的活性Vav-1抑制剂的孔可随着他们表现出比对照孔(a)更低的荧光强度而鉴定出来。
实施例2Bodipy-GDP/Rac-1解离检测法为使重组人Rac-1和荧光标记的鸟嘌呤核苷酸结合，将50mMTris-HCl pH 7.5中浓度为32μM的重组人Rac-1,1000μl 50mM Tris-HClpH 7.5，60mM NaCl，6mM MgCl2，8mM DTT和500μl 480nMBODIPY-FL-GDP混合并在室温下温育3小时。然后，向2080孔微量滴定板中每孔加入600nl混合物，其中每孔中已经加入3μM vav1，400μMGTP(溶于50mM Tris-HCl pH 7.5)和待检化合物物的预混液600nl。对照孔要么(a)不含测试化合物要么(b)不含测试化合物也不含Vav-1。
孔板置于25℃温育。反应开始30分钟后，用共聚焦或者非共聚焦荧光读取计测定每孔的荧光(强度)，按照各孔中反应开始的顺序获得荧光读数。激发与测量波长与实施例1相同。
含有Vav-1没有抑制剂的对照孔(a)中所测的荧光强度最低。不含Vav-1的对照孔(b)中记录到较高的荧光。含有作为测试化合物的活性Vav-1抑制剂的孔可基于比对照孔(a)更高的荧光强度而鉴定出来。
在另外的实施例中，实施例1和实施例2的方法可以在不同的测试化合物浓度(例如10μM，50μM)，不同的温度(例如37℃)以及不同的温育时间(例如15分钟，120分钟)条件下重复，以最大化结合或者解离的动力学范围(在测量之时对照孔(a)和(b)中荧光强度之间差额)。也可以采用其他类型的孔板，并且可以利用同时或者相继的荧光检测进行结合或者解离分析。用重组人Vav2而非Vav1，可以使用类似的方法检测Vav2抑制剂。
在另一实施方案中，可以用(a)含有DH结构域的Vav1的截短突变体或者(b)Y174F突变体来替代全长的Vav1重复上面的实施例。
权利要求
1.一种预防或者治疗(i)细胞、组织或者器官的同种异体或者异种移植受体的急性或者慢性移植物排斥、(ii)需此预防或治疗的个体的炎性疾病或者自身免疫病、(iii)静脉移植物狭窄、再狭窄和/或继发于血管外伤的血管闭塞或(iv)需此预防或治疗的个体的恶性增生性疾病的方法，包括给予受体治疗有效量的Vav蛋白抑制剂的步骤。
2.Vav蛋白抑制剂用于制备药物的用途，所述药物用于预防、治疗或抑制细胞、组织或者器官同种异体移植受体的急性或者慢性移植物排斥，或者用于治疗炎性疾病或者自身免疫病或恶性增生性疾病。
3.根据权利要求1所述的方法或权利要求2所述的用途，其中Vav蛋白是Vav-1。
4.一种治疗联合，包含Vav蛋白抑制剂和至少一种选自免疫抑制剂、免疫调节剂或者抗炎药或者化疗剂的第二试剂。
5.一种鉴定作为Vav1或者Vav2抑制剂的试剂的筛选方法，包括在存在(a)所述试剂和(b)Vav1或Vav2或其活性片段或突变体时测定Rho或Rac GTP酶中鸟嘌呤核苷酸交换速率的步骤，其中在所述试剂存在下鸟嘌呤核苷酸交换速率降低则说明所述试剂为Vav1或Vav2抑制剂。
6.根据权利要求5所述的筛选方法，包括在存在(a)所述试剂和(b)Vav1或Vav2或其活性片段或突变体时测定荧光标记的鸟嘌呤核苷酸交换GTP酶中的非标记鸟嘌呤核苷酸的速率的步骤。
7.根据权利要求6所述的筛选方法，其中所述方法包括(i)将GTP酶和荧光标记的鸟嘌呤核苷酸一起温育，和(ii)测量存在如下物质时的荧光变化(a)所述试剂(b)Vav1或Vav2或其活性片段或突变体，和(c)非标记鸟嘌呤核苷酸。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的筛选方法，其适合于高通量筛选。
9.可通过根据权利要求6至8任一项所述的筛选方法获得的Vav1或Vav2抑制剂。
10.一种药物组合物，可用于如权利要求1中所限定的方法，其包含Vav蛋白抑制剂和一种或多种与此有关的药学上可接受的稀释剂或者载体。
全文摘要
本发明提供了预防或者治疗细胞、组织或者器官的同种异体或者异种移植受体的急性或者慢性移植物排斥，炎性疾病或者自身免疫病或者恶性增生性疾病的方法，所述方法包括Vav抑制剂的使用。还提供了Vav抑制剂、其用途、包含Vav抑制剂在内的药物组合物和治疗联合以及与此有关的筛选方法。
文档编号A61P37/06GK1805756SQ200480016682
公开日2006年7月19日 申请日期2004年4月15日 优先权日2003年4月16日
发明者M·福斯特纳, M·克隆普, L·勒德尔, B·尼斯莱因-希尔德斯海姆, F·劳尔夫, G·韦克贝克 申请人:诺瓦提斯公司