专利名称：：用于抑制移植物排斥的方法和材料的制作方法用于抑制移植物排斥的方法和材料相关申请的交叉参照本申请要求2004年12月12日提交未决的美国申请系列号10/964,215的优先权.政府支持条款本发明是在政府支持下，按国立卫生研究院授予的合约AI31231完成的.美国政府在本发明中具有某些权利。
背景技术：
：1.发明领域本发明涉及移植物排斥。特别地，本发明提供有益于抑制移植物排斥的方法和组合物。2.技术发展现状当前处理移植后移植物排斥的策略一般涉及使用免疫抑制剂例如环孢霉素A(CsA)、雷帕審素、他克莫司(FK506)、皮质类固醇、和白细胞介素(IL)-2受体的抗体。这些药物一般需要长期使用，导致淋巴细胞整体耗尽，并增加严重感染、肾毒性、和癌症的风险。此外，一些患者不能耐受这些免疫抑制剂足够抑制移植物排斥的剂量。需要另外的移植物排斥抑制剂，尤其是那些对接收抑制剂的个体不会整体耗尽淋巴细胞的抑制剂。发明概迷本发明的一个实施方案提供在需要它的哺乳动物内抑制移植物排斥的方法，包括给该哺乳动物施用治疗有效量的抗体，其中该抗体与多肽的细胞外结构域起免疫反应(immunoreacts)，此处的多肽是指"脾表达的(SPEX)多肽".一些实施方案中，本方法进一步包括给该哺乳动物施用一种或多种另外的移植物排斥抑制剂。另外的移植物排斥抑制刑的实例包括CsA、雷帕霉素、FK506、皮质类固醇、和IL-2受体抗体。在抑制移植物排斥中使用本抗SPEX抗体的一个益处为对哺乳动物，包括移植物接受者，施用抗SPEX抗体，不会整体耗尽该哺乳动物的淋巴细胞，因此，本发明的一个实施方案提供在需要它的哺乳动物内抑制移植物排斥的方法，包括给该哺乳动物施用治疗有效量的抗体，其中该抗体与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应，和其中给予该抗体不会显著的减少该哺乳动物的总CD4+T细胞计数、总CD8T细胞计数、或总B细胞计数，本发明的一个实施方案提供在表达SPEX多肽的淋巴细胞上减少脾表达的(SPEX)多肽表达的方法，包括将该淋巴细胞接触与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗SPEX抗体，从而减少该淋巴细胞的SPEX多肽的表达。本发明的一个实施方案提供在需要它的哺乳动物内抑制移植物排斥的抗体的鉴定方法，包括提供包含SPEX多肽的细胞外结构域表位的氨基酸序列，其中所述的表位在长度上至少为六个氨基酸；对所述的氨基酸序列产生抗体；和在移植物排斥模型中筛选所述的抗体，从而鉴定出抑制移植物排斥的该抗体.本发明的一个实施方案提供通过活化的淋巴细胞抑制白细胞介素2(IL-2)分泌的方法，其中该淋巴细胞表达SPEX多肽受体(例如，SEQIDNO:20或SEQIDNO:62)，该方法包括将该淋巴细胞接触与SPEX多肽受体的细胞外结构域起免疫反应的抗体(SPEX受体接合和激活)。本发明的一个实施方案提供通过表达脾表达多肽(SPEX多肽)受体的活化淋巴细胞抑制白细胞介素-2受体(CD25)表达的方法，包括将该淋巴细胞接触与SPEX多肽受体的细胞外结构域起免疫反应的抗体.本发明的一个实施方案提供表达SPEX多肽受体的预活化淋巴细胞增殖的抑制方法，包括将所述淋巴细胞接触与SPEX多肽受体的细胞外结构域起免疫反应的抗体.本附图构成本发明说明书的一部分。困1提供具有细胞外、跨膜(交叉线画出阴影)、和细胞内结构域(如所标记)的基本上全长小鼠和人SPEX多肽(分别为mSPEX和hSPEX)的示意困.每个细胞外结构域包括免疫球蛋白(Ig)样结构域(水平线画出阴影)和任选地具有可裂解的信号序列(虚线区域)，其中箭头指向裂解位点.在翻译后加工过程中信号序列被切割掉以产生成熟的SPEX多肽。每个细胞内结构域包括三个基于酪氨酸的基序(垂直线画出阴影).每个基于駱氨酸的结构域依次包括酪氨酸氨基酸残基(Y，为酪氨酸单字母密码).所给出的实施方案描述酪氨酸可以任选地被砩酸化(带圃圃的P).显示了SPEX多肽在生物膜中的相对位置.斑点状区域表示在确定功能的结构域之间的每个多肽部分.图2A提供示意图，-沈明在所选hSPEX多肽和每个所选多肽的各自序列标识符之间对应的实施方案.图2B提供示意困，说明在所选hSPEX多核苷酸和每个所选多核苷酸的各自序列标识符之间对应的实施方案.困2C提供示意图，说明在所选mSPEX多肽和每个所选多肽的各自序列标识符之间对应的一些实施方案.图2D提供示意图，说明在所选hSPEX多核苷酸和每个所选多核苷酸的各自序列标识符之间对应的一些实施方案.图3说明实施例7中所描述的对照小鼠(左側板)移植后笫9天和用PJ19.1单克隆抗体治疗小鼠(左側板)移植后第U天的同源和同种皮肤移植.对照小鼠在相对皮肤移植物移植术的第-1、1、4、和6天注射PBS。PJ19.1单克隆抗体治疗小鼠在相对皮肤移植物移植术的第-1、1、4、和6天i.p.(腹膜内)注射500pg该抗体。PJR1单克隆抗体与小鼠SPEX(mSPEX)多肽的细胞外结构域起免疫反应。至第9天，对照小鼠排斥同种移植物，而维护同源移植物.PJ19.1治疗的小鼠在第13天维护同源和同种皮肤移植物。图4说明实施例7中所描述的用作移植物排斥模型系统的同种皮肤移植物的皮肤移植物存活曲线。对照鼠(正方形符号)在第0天接收同源(没有给出数据)和同种皮肤移植物和在第-1、1、4、和6天接受PBS注射，PJ19.1单克隆抗体治疗鼠(菱形符号)在第0天接收同源(没有给出数据)和同种皮肤移植物和在第-1、1、4、和6天接受500pgPJ19.1单克隆抗体i.p.注射。绘皮肤移植物存活的鼠百分数对皮肤移植物移植后天数的曲线图.对照组有五只鼠，PJ19.1抗体治疗组有四只鼠。图5说明实施例8中所描述的对照小鼠(左側板)和PJ19.1单克隆抗体治疗小鼠(左側板)的脾细胞计数.脾细胞染有CD4、CD8、和SPEX三种颜色，并通过流式细胞计量术分析.一个点表示一个CD4+T细胞计数的点位于每个板的左上象限，CD8+T细胞的表示显示在每个板的右下象限，B细胞(阴性CD4和阴性CD8细胞)的表示显示在每个板的左下象限.每个象限的数目表示样品中各自类型细胞的百分数.与对照小鼠相比，PJ19.1单克隆抗体治疗小鼠中CD4+T细胞、CD8+T细胞、和B细胞数的计数没有显著增加或减少.图6A说明SPEX受体接^(将SPEX受体在淋巴细胞上同与SPEX受体的细胞外结构域起免疫反应的抗体接触)对淋巴细胞分泌白细胞介素2(IL-2)的效杲。在大鼠IgG或PK18存在下，通过抗CD3刺激(激活)T细胞16小时后，收集培养物中的CD4+和CD8+细胞的上清液，然后分析IL-2分泌(上清液中IL-2的量)。图6B说明在细胞培养中暴露给接合有(或没有)800pg/ml和80pg/m，IL-2补充物的SPEX受体的胸腺依赖性淋巴细胞的增殖效果。如图6A中在存在或缺失的PK18下，在一些培养中添加指定浓度的重组体鼠IL-2激活T细胞.图6C说明IL-2受体(CD25)在T细胞上表达的效果，该T细胞用大鼠IgG、和抗CD3(充满灰色的直方图)或PK18和抗CD3(粗线)处理并加入重组体鼠IL-2(800pg/mi，高IL-2;80pg/mi，低IL-2)。在培养第2天，采集细胞，并通过流式细胞计量术分析CD4+和CD8+T细胞表达CD25的门控计数.图中显示三个之一的代表性实验.FIG.7说明SPEX受体接合抗SPEX抗体会抑制淋巴细胞中的CD25的表达但不抑制CD69的表达.用抗CD3和大鼠IgG(充满灰色的直方图)或抗CD3和PK18(粗线)刺激(激活)T细胞，实验重复三次，分别在CD4+和CD8+T细胞的门控计数上显示了16或48小时后培养物中CD69或CD25的表达.图8说明预激活T细胞的增殖可以被继发的SPEX信号(激活)阻断。用抗CD3滴定法将AND-TCRTg鼠分离的CD4+T细胞刺激过夜，然后转移到涂有指定浓度的抗CD3和大鼠IgG(全部以10pg/ml,实心圓)或抗CD3和PK18(空心正方形)的新板上.对照实验没有转移在抗CD3和大鼠1gG(实心圃)或抗CD3和PK18(空心正方形)存在下培养的CD4+T细胞.以三份培养的掺入^H胸苷的平均数(+/-SD)减单独T细胞培养的cpm(>1，000cpm)表示数据。实验重复二次.发明详述本发明人发现，部分地，与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体有益于抑制移植物排斥和减少淋巴细胞上SPEX多肽的表达，本发明人进一步发现，部分地，抗体的鉴定方法，该抗体抑制移植物排斥和减少淋巴细胞上SPEX的表达.1.定义本文使用时，术语"同源"是指在遣传学上相同或亲近相关的生物体、细胞、组织、和器官等.本文使用时，"同源皮肤移植物"是指这样的皮肤移植物，其中的个体，以致该移植物和该宿主没有抗原学上(antigeneically)的相互作用。本文使用时，术语"同种"是指来自同种类的个体或其衍生的生物体、细胞、组织、和器官等，但其中的生物体、细胞、组织、和器官等在遣传学上彼此是不同的。本文使用时，术语"异种移植物"是指供者和接受者为不同种类的移植物。本文使用时，"同种皮肤移植物"是指这样的皮肤移植物，其中皮肤移植物的宿主和皮肤移植物源是同种的遗传学上充分不同的个体，以致该移植物和该宿主有抗原学上的相互作用.同种移植物在缺失抑制移植物排斥干预下会及时排斥.本文使用时，术语"移植物排斥"是指部分或完全破坏该移植物受者上或中的移植的细胞、组织、或器官等。本文使用时，术语"宿主"是指生物体(优选的生物体为哺乳动物)、组织、或器官等，其为移植的细胞、组织、或器官等的接受者。当涉及移植物宿主或接受者时，本文中术语"宿主"和"接受者"可以替换地使用.本文使用时，术语"整体耗尽淋巴细胞"是指与对照动物(其没有接受免疫抑制剂)相应的淋巴细胞计数相比，给哺乳动物施用免疫抑制剂对CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、或B淋巴细胞的总计数减少50%或以上，测量淋巴细胞计数一般使用血、血清、或血清样品进行。没有"整体耗尽淋巴细胞"的免疫抑制剂是指这样的试刑，其中给哺乳动物施用该试刑导致CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、和B淋巴细胞的总计数保持在多于50%(优选保持80%或更多，更优选保持90%或更多，和还更优选保持100%).本文使用时，"抑制移植物排斥的治疗有效量"，对于与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体，是指给移植物接受者施用的抗体量，该量随时间部分地或完全地抑制移植物排斥。该抗体(和，任选地，笫二种移植物排斥抑制剂)可以在移植前、期间、和/或后施用。本文使用时，"可溶的异源多肽，"为序列上与SPEX多肽不同的多肽(其为非SPEX多肽)，并且其在水溶液中比SPEX多肽的细胞外结构域更可溶。本文使用时，术语"分离"和"纯化"可替换地使用，并表示将感兴趣的特定化合物从其它的污染物质中分离出来，以至于不含或基本上不含包括毒素物质例如内毒素在内的混杂物。本文"纯化"的意指忽略溶解物、辅料、稳定刑、緩冲剂、盐、酸、酸性盐、和药学上可接受的栽体等，这些经常被期望与活性成分(例如，与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的单克隆抗体)联用中，不把这些考虑为杂质.2.SPEX2004年4月23申请的美国系列号10/831,622和2003年4月30申请的美国系列号06/467,206中描述了SPEX的发现；这两申请在此引入作为参考，出版物NatureImnuinology(2003,4(7):670-679)中描述了SPEX，其在此引入作为参考，在NatureImmunology论文中，SPEX涉及B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)。表达SPEXmRNA和多肽的有淋巴细胞包括B和T淋巴细胞、幼稚的(naive)B和T淋巴细胞、胸腺细胞、活化的B和T淋巴细胞、脾巨噬细胞、抗原递呈细胞(APCs)和成熟骨髄衍生的树状突细胞(参见，例如Han等(2004)Journaloflmmunoiogy172:5931-5939，其在此引入作为参考).SPEX多肽为多结构域蛋白质，在细胞膜上观测到其被表达.SPEX多肽包括细胞外结构域、被认为是锚定多肽在细胞膜中的单跨膜结构域、和细胞内结构域.SPEX多肽为B7x配体(也称为B7-H4和B7S1)的受体.SPEX细胞外结构域包括免疫球蛋白(Ig)样结构域；和细胞内结构域包括三个基于酪氨酸的信号基序.基于酪氨酸的信号基序在本文中被认为是抑制的信号基序，例如其被认为可抑制、或负调节淋巴细胞的激活.SPEX被认为是免疫球蛋白超家族的类型I受体礴蛋白.图1中提供鼠和人SPEX多肽的图解表示.SPEX缺乏的鼠不显示明显的淋巴细胞发育性缺陷；然而，来自SPEX缺乏鼠的T细胞对抗CD3抗体刺激T细胞激活超敏感。基于，部分地，这种观测，SPEX被认为是淋巴细胞活化、增殖、和功能的负调节剂。3.移植物排斥的抑制本发明者制造了令人惊讶的发现与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体在移植物排斥鼠模型中抑制移植物排斥.因此，本发明的一个实施方案提供在需要它的哺乳动物内抑制移植物排斥的方法，包括给该哺乳动物施用移植物排斥抑制量的抗体，其中该抗体与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应。A.SPEX细胞外结构域如同上述讨论，本发明提供与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体，抑制移植物排斥.因此，本发明提供SPEX多肽例如有用于制造抑制移植物排斥的抗体和，提供SPEX多肽例如有用于制造所述的SPEX多肽。任何SPEX多肽可用作制造抗SPEX抗体免疫源。优选的SPEX多肽包含(或，替代选择地，基本上由其組成)至少六个连续氨基酸的细胞外结构域的SPEX多肽。特别优选的SPEX多肽包含(或，替代选择地，基本上由其组成)SPEX蛋白质Ig样结构域(参见，例如，SEQIDNO:3(人)、45(鼠)、或88(鼠，等位基因b，参见以下)).高度优选Ig样结构域，作为制造用于本发明的抗SPEX抗体的抗原。本发明的一些实施方案提供鼠、人(优选)、或其它哺乳动物源的SPEX多肽.图2A-D中图表性列出具有序列标识符的人SPEX(hSPEX)和鼠SPEX(mSPEX)的多肽和相应多核苷酸序列的实例，公开了mSPEX的等位基因，本文中其是指mSPEXb(只排列mSPEXb胞外部分的序列).未加工的mSPEXb细胞外结构域的实例列在SEQIDNO:85(包含信号序列).加工的mSPEXb细胞外结构域的实例列在SEQIDNO:86(没有信号序列)，mSPEXb优先的Ig样结构域列于SEQIDNO:88,当本文使用时，特别优选的SPEX多肽细胞外结构域包含(替代选择地，基本上由其组成)SEQIDNO:l、2、3、4、12、或13(来自hSPEX).优选的SPEX多肽细胞外结构域包含(替代选择地，基本上由其组成)SEQIDNO:43、44、45、46、54或55(来自mSPEX)或SEQIDNO:85、86、或86(来自mSPEXb)更特别优选的SPEX多肽包含(替代选择地，基本上由其组成)如同SEQIDNO:3中列出的人SPEXIg样结构域。一般而言，包含六个或更多个连续氨基酸残基的多肽能够引发免疫应答.因此，一些实施方案提供氨基酸序列包含(或基本上由其组成)SPEX细胞外结构域的六个连续氨基酸(例如，SEQIDNO:13、55、或85).—般地，增加SPEX多肽中连续氨基酸残基的数目会增强多肽的免疫源应答.因此，一些实施方案优选以增加的序列提供SPEX免疫源，其包含SPEX多肽细胞外结构域的6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、或40或更多个连续氨基酸。任意选择地，SPEX免疫源包含SPEX多肽的6至9、10至19、20至29、30至39、或40至50个连续氨基酸。本发明的一个实施方案提供"SPEX融合多肽"，其包含SPEX多肽的细胞外结构域与可溶的异源多肽有效连接.优选的可溶异源多肽包括人IgGl恒定区，更优选人IgGl铰链CH2、和CH3区域。一个实施方案中，溶解度促进性异源多肽包含SEQIDNO:97。另一个实施方案提供包含SPEX多肽与异源多肽有效连接的多肽，其SPEX多肽列在SEQIDNO:3、SEQIDNO:45、SEQIDNO:88、SEQIDNO:12、SEQIDNO:54、或SEQIDNO:86中，该异源多肽包括人IgGl恒定区；优选人IgGl铰链、CH2、和CH3区域.A蛋白与IgGI恒定区的结合用A蛋白亲合色谱法能够纯化SPEX-人IgGl融合物.I.SPEX多肽的制造根据本公开内容，使用本领域众所周知的多种制造多肽的技术可以制造本发明SPEX多肽.例如通过从天然来源(例如，淋巴细胞或脾或胸腺组织)中纯化可以制造SPEX多肽.在另一个实施例中，通过宿主细胞内编码SPEX多肽的多核苷酸的表达可以制造SPEX多肽，宿主细胞包括菌细胞(例如，K12)、真核细胞、酵母细胞、昆虫细胞、植物细胞、哺乳动物细胞、中国仓鼠(例如，CHO)细胞、鼠细胞、和人细胞(例如，使用传递重组体SPEX表达系统)。例如有用的SPEX多核苷酸的序列标识符，参见图2B和2D.在又一个实施例中，使用从头合成的方法制造SPEX多肽.例如本文中有用的SPEX多肽的序列标识符(优选其细胞外结构域)，参见图2A和2C(和SEQIDNO:85-88)。优选的实施方案中，使用本领域公知的蛋白质分离和純化方法纯化SPEX多肽.例如，根据本发明，本领域普通技术人员能够使用本文所公开的抗SPEX抗体，通过亲和分离法，分离或纯化SPEX多肽(包括其特定的片段和区域).关于上述讨论的SPEX融合多肽，A蛋白与IgGl恒定区的结合具有高亲和力.因此，使用A蛋白亲合色谦法能够纯化SPEX-人IgGl融合物。优选地，使用本领域众所周知的重组DNA技术、多肽表达、和纯化技术制成融合多肽.优选的"有效连接"包含肽键。替代选择地，可溶的异源多肽通过使用化学交联剂可有效地连接到SPEX多肽的细胞外结构域，其组合物和用途是本领域众所周知的。制造SPEX多肽有用的氨基酸残基(和核苷酸残基)的实例提供在世界知识产权组织(WIPO)工业产权信息和文件手册，标准ST.25:专利申请书中核苷酸和氨基酸序列表表示的标准(1998)，包括附件2中的表1至6;在下文中涉及"1998年WIPO标准ST.25"，在此引入作为参考。B,与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体本发明的一个实施方案中，提供与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体。本抗体有益于例如减少淋巴细胞SPEX表达和抑制移植物排斥，术语"抗体"意欲包括任何形式的抗体，包括完整的抗体分子和/或抗体分子的免疫活性部分或片段，抗体和其活性片段是本领域众所周知的，例如IgG、IgM、IgE、多克隆、单克隆、Fab、Fab'、F(ab')2、F(v)、单链抗体(SCA)、单链Fab、人源化的、和杂合的等抗体).优选地，抗体为单独分离的.优选地，抗体也包含重组体、嵌合体、另外非天然存在的抗体。在一些实施方案中，优选抗体为多价体(包含两或更多个表位结合位点).例如，双价抗体.优先的抗体为抗SPEX单克隆抗体，优选人或人源化的抗SPEX单克隆抗体，其与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应.I.抗体制造指定特异性抗原的抗体制造方法是本领域众所周知。本发明提供SPEX抗原(即，免疫原)，有用于制造与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗SPEX抗体。因此，根据本公开内容，本领域普通技术人员能够制造本发明有用的抗SPEX抗体.抗体的制造通常是在例如动物(例如兔、鼠、仑鼠、羊、山羊、马、牛)中；细胞中，原代细胞培养物，(例如细菌、植物、藻、昆虫、哺乳动物、鼠、杂交瘤、和人细胞)；通过噬菌体展示；和通过表位克隆成抗体支架栽体和基因转移入多种细胞类型之一(例如细菌、植物、藻、昆虫、哺乳动物、鼠、和人细胞).4.药物组合物本发明一个实施方案提供包含与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体的"SPEX药物组合物"，其中该抗体能够抑制移植物排斥，和其中该抗体为抑制移植物排斥的治疗有效量，与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应并能够抑制移植物排斥的抗体，优选为PJ19.1,PJ19.1与mSPEX多肽的细胞外结构域(例如，SEQIDNO:55)起免疫反应。优选地，制备SPEX药物组合物，以使其污染物最低，也优选地，制备SPEX药物组合物，以使该组合物给接受者施用中其变应性和毒性反应最低。一个实施方案中，优选的SPEX药物组合物为无热原(例如内毒素)的，或基本上无热原的.优选的实施方案中，SPEX药物组合物进一步包含第二种移植物排斥抑制剂(表示除抗SPEX抗体之外的一种或多种移植物排斥抑制剂).优选的笫二种移植物排斥抑制剂包括但不限于CsA、雷帕莓素、FK506、皮质类固醇、和与IL-2受体起免疫反应的抗体.A.药物组合物的制备根据本发明，制备SPEX药物组合物(包含与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体)可以以本领域公知的任何方式(包括，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制锭剂、乳化、装胶囊、诱陷(entrapping)、冻干、或混悬方法).优选地，根据本领域公知的药品生产质量管理规范、操作和规程制造.一些实施方案中，制造SPEX药物组合物，以进一步包括药学可接受的栽体、赋形剂、辅剂、防腐剂、或其它成分(本文共同地指的是"药学可接受的栽体")。此处术语"栽体"是指"药学可接受的栽体"。优选地，药学可接受的栽体适合给人或非人类的哺乳动物施用。制剂和施用药物组合物的进一步技术内容可以参见最新版的Remington'sPharmaceuticalSciences(MaackPublishingCo"Easton,PA).液体栽体可以包括水溶液，优选为生理学上相容的緩冲液(例如，汉克斯氏溶液、林格氏溶液、或生理学上的緩冲盐水).液体栽体也包括非水的和油的混悬液。适当的亲脂溶剂或媒介物可以包括脂肪油(例如，麻油、合成脂肪酸酯、油酸乙酯、甘油三酯、或脂质体).有用的脂质体包括阳离子脂质体、阴离子脂质体、和中性电荷密度脂质体。可以包括粘度提高剂(例如，羧甲基纤维素钠、山梨醇、或右旋糖酐)。也可以包括稳定剂、粘合剂、或增加溶解度的试剂.另外的惰性成分可以包括任一或全部的阿拉伯胶、糖浆、羊毛脂、或淀粉。另外可以使用的赋形剂为聚乙二醇(PEG)。可以将PEG混合在制剂中或连接到抗SPEX抗体分子自身上。PEG可以用作例如脱水剂或浓缩剂，因此，栽体可以为水性、非水性(疏水)、或两性栽体.緩释和/或持续释放栽体和其药物制刑是本领域公知的，并可以根据本公开内容在本文的实施方案中使用.可以以盐的形式提供SPEX药物组合物，其可用酸(例如，盐酸、硫酸、硫酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、和琥珀酸等)形成。在其它的实施方案中，SPEX药物组合物可以是冻干粉剂，优选在使用前与緩冲液结合.B.施用药物组合物本发明一些实施方案中，将SPEX药物组合物(包含与SPEX细胞外结构域起免疫反应的抗体)给需要治疗移植物排斥的患者施用.本发明包括的药物组合物的施用可以以任何想要的途径，包括但不限于口内、静脉内、肌内、鼻面、气管内、关节内、动脉内、號内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、子宫内(intraturnoral)、肠内、局部、舌下、阴道、或直肠给药途径.根据本发明，本领域普通技术人员能够选择适当的途径给患者施用SPEX药物组合物.给药途径所考虑的因素可以包括移植物的位置和患者的状况，还有，根据本发明，本领域普通技术人员能够选择适当的SPEX药物组合物(期望以指定的途径施用)，其包括具有栽体、赋形剂、辅剂、和惰性成分等的制剂。施用方法包括但不限于注射、输注、导管给药、显微注射、粒子介导的(基因枪bioUstic)传递、插管法、吸入、咽下、和从基质中扩散等。在一个实施例中，SPEX药物组合物可以通过注射该组合物进入移植器官或组织的传入血液供给中施用.优选施用SPEX药物组合物的方法包括腹腔内注射。C.药物组合物的剂量适合本发明使用的药物组合物包括与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体，其有效量或剂量可以到达具体的目的(例如，在治疗有或需要移植物的患者).根据本发明和本领域的知识，有效剂量的确定正好在本领域技术人员的能力之内.治疗有效剂量或范围最初可以在细胞培养测定或动物模型中进行估价；通常在小鼠、大鼠、兔、狗、猪、或非人灵长类动物中。动物模型也可以用于确定优选的给药浓度范围和途径.然后利用这样的信息，可以选择给人施用的优选剂量和途径.以下讨论包含鼠皮趺移植的优选动物模型。在细胞培养、实验动物、或其它的移植模型系统中通过标准的药学程序，可以确定治疗效果和毒性。例如，在模型系统中可以确定EDSO(总数50%治疗有效的剂量)和LD50(总数50%致死的剂量)。毒性和疗效的剂量比为治疗指数，它可以以LD50/ED50的比表示。具有大治疗指数的SPEX药物组合物是优选的.任选地，SPEX药物组合物包括使用第二种移植物排斥抑制剂以提高或增加治疗指数.从模型系统中获得的数据用于明确人使用的剂量范围.包含在该组合物中的剂量优选在包括具有低毒性的ED50的循环浓度范围内，或更优选为基本上没有毒性.在一个实施方案中，SPEX药物组合物包括抗体的剂量，该剂量包括治疗有效的ED50，该抗体与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应.更优选地，本SPEX药物组合物包括毒性或LD50,对于给患者(人或，任选地，非人哺乳动物)施用SPEX药物组合物，在考虑患者的相对状况和患者有移植物排斥抑制剂治疗需要后，毒性或LD50是可接受的.因此，根据需要治疗的患者相关的因素，优选由从业医生确定患者使用的SPEX药物组合物的剂量，调整剂重和用法以提供活性部分的足够水平(例如循环的和/或局部的浓度)或维持预期效应。可能应考虑的因素包括疾病状况的严重度、受治疗者的一般健康、年龄、体重、性别、饮食、给药的时间和频率、药物联用、反应灵敏度、治疗的耐受性.一般而言，SPEX药物组合物可以给予例如每天一次、隔日一次、每3至4日一次、每周一次、每两周一次、每月一次、每几个月一次、或每年一次.剂量包括例如每次剂量O.lmg/kg至20mg/kg、优选每次剂量2.5mg/kg至20mg/kg的与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体.5,减少淋巴细胞表达SPEX多肽本发明一个实施方案提供在表达SPEX多肽的淋巴细胞上减少SPEX多肽表达的方法，包括将该淋巴细胞接触与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体，从而导致该淋巴细胞表面上的SPEX多肽向下调节。优选的淋巴细胞包括但不限于CD4+T细胞、CD8+T细胞、和B细胞。优选的抗体是单克隆抗体.也优选地，本抗体为人或人源化抗体。本抗体与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应(尤其优选与Ig样结构域起免疫反应的抗体)，和，任选地，该抗体与细胞内结构域和/或该SPEX多肽的细胞内结构域不起免疫反应。在一些实施方案中本抗体与SEQIDNO:3、12、13、45、54、55、85、86、或88起免疫反应和，任选地，与SEQIDNO:17、18、59、或60不起免疫反应。6.鉴定抑制移植物排斥的抗体本发明一个实施方案提供在哺乳动物内抑制移植物排斥的抗体的鉴定方法，包括提供包含SPEX多肽的细胞外结构域表位的氨基酸序列，其中该表位在长度上至少为六个氨基酸；对该氨基酸序列生产抗体；和在移植物排斥模型中筛选该抗体，以鉴定抑制移植物排斥的抗体.A.移植物排斥的哺乳动物模型对本领域普通技术人员来说细胞、组织、和器官的大量类型的移植技术是众所周知的，包括但不限于胰烏移植、角膜移植术、骨號移植、干细胞移植、皮肤移植物移植、骨骼肌移植、大动脉或大动脉辦移植、和血管化的器官移植包括但不限于心脏、肺、心脏和肺、肾、肝、胰脏、和小脉移植(参见，桐如ExperimentalTransplantationMnde'SinSmallAnimals(1995)PublisherT&FSTM，494页)。本发明不受移植的特定类型限制.一般而言，在非同源的供者和受者之间的移植，缺乏移植物排斥抑制剂会导致移植物排斥，其特征为部分或完全地，一般为累进性地，破坏植入的细胞、织、或器官。因此，在本文中可使用任何非同源的(例如同种的或异种的xenogeneic)移植作为移植物排斥的模型系统。优选的抑制移植物排斥的模型系统包括鼠同种皮肤移植物。在一个实施方案中，在两组哺乳动物上进行非同源的移植，其中第一组不接受移植物排斥抑制剂治疗(对照组)，和第二组用包含与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体的SPEX药物组合治疗，随时间监控移植物的移植物排斥(破坏移植物)百分数的发展.抗SPEX抗体能够抑制移植物排斥例如，如果指定的时间期限内减少或消除移植物排斥百分数，或者如果对于指定量的移植物排斥，治疗组中移植物的存活比其在未治疗对照组中存活更长。在另一个实施方案中，将与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体和第二种移植物排斥抑制剂给笫一组哺乳动物施用，和将第二种移植物排斥抑制剂给第二组哺乳动物施用(第二种抑制剂不是抗SPEX抗体).本实施方案发现了例如，抗SPEX抗体和笫二种移植物排斥抑制剂在抑制移植物排斥中具有协同作用.7.抑制淋巴细胞白细胞介素2的分泌本发明发现与活化淋巴细胞上的SPEX受体的细胞外结构域起免疫反应的抗体通过活化的淋巴细胞抑制白细胞介素2(IL-2)分泌(参见，例如实施例11和图6A).淋巴细胞可以被活化，例如通过将淋巴细胞与CD3(aCD3)的抗体接触，因此，本发明一个实施方案提供通过活化的淋巴细胞抑制IL-2分泌的方法，其中该淋巴细胞表达SPEX多肽受体(例如，SEQIDNO:20或SEQIDNO:62)，该方法包括将该淋巴细胞接触与SPEX多肽受体的细胞外结构域起免疫反应的抗体(SPEX受体接合).优选地，抗体包括淋巴细胞上的SPEX受体激动刑，因此，刺激SPEX受体活化.SPEX受体优选包括淋巴细胞增殖和IL-2分泌的负调节物；因此，通过活化的淋巴细胞提供抑制或IL-2分泌的作用机理.优选的抗体包括单克隆抗体或其结合(活性)片段。优选地，该抗体与SPEX多肽的细胞内结构域不起免疫反应.在一个实施方案中，该抗体与SPEX多肽(例如，SEQIDNO:3、SEQIDNO:45、或SEQIDNO:88)的Ig样结构域起免疫反应和，更优选地，与SPEX多肽的细胞内结构域不起免疫反应。在一个实施方案中，该抗体与选自SEQIDNO:3、12、13、45、54、55、85、86、或88的序列起免疫反应。在一个实施方案中，该抗体与选自SEQIDNO:17、18、59、或60的序列不起免疫反应。在一个实施方案中，该抗体与选自SEQIDNO:3、12、13、45、54、55、85、86、或88的序列起免疫反应，但与选自SEQIDNO:17、18、59、或60的序列不起免疫反应。在一个实施方案中，该淋巴细胞包含T细胞、CD4+T细胞、或CD8+T细胞之一。本发明又一个实施方案中，在T细胞与抗体接触并以后向该T细胞中加入IL-2(参见，例如实施例11和图6B)后，通常观察到激活的T细胞中的增殖不能完全恢复，其中该抗体与SPEX受体的细胞外结构域起免疫反应(从而通过淋巴细胞抑制IL-2的分泌)。8.抑制淋巴细胞的白细胞介素2受体的表达本发明发现与活化淋巴细胞上的SPEX多肽受体的细胞外结构域起免疫反应的抗体通过活化的淋巴细胞抑制白细胞介素2(IL-2)受体(CD25)的表达(参见，例如实施例11和图6C)。因此，本发明一个实施方案提供通过活化的淋巴细胞抑制白细胞介素-2受体(CD25)表达的方法，其中该淋巴细胞表达脾表达多肽(SPEX多肽)受体，包括将该淋巴细胞接触与SPEX多肽受体的细胞外结构域起免疫反应的抗体，优选地，该抗体激活SPEX多肽受体.优选的抗体、SPEX多肽、和淋巴细胞描述在上节第七部分.9.抑制已活化的淋巴细胞的增殖本发明发现将淋巴细胞同与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体接触，会抑制淋巴细胞的增殖，即使该淋巴细胞在与抗SPEX受体接触前已经活化增殖过(参见，例如实施例11和图8).因此，本发明一个实施方案提供表达SPEX多肽受体的活化淋巴细胞增殖的抑制方法，包括将所述淋巴细胞接触与所述SPEX多肽受体的细胞外结构域起免疫反应的抗体.优选地，该抗体激活SPEX多肽受体.优选的抗体、SPEX多肽、和淋巴细胞描述在以上笫七部分。以下的实施例意图举例说明本发明，但不是限制本发明。实施例1.鉴定和克隆mSPEX阳性选择是一种发育过程，其中作为T细胞抗原受体(TCR)识别由胸腺基质表达的MHC/自身肽复合物的结果，不成熟的胸腺细胞接收成熟信号.体外将不成熟的胸腺细胞暴露于低浓度的药理活化剂佛波酯(例如PMA)和/或离子雾素(ionomycin),诱导双阳性(DP)胸腺细胞的存活和分化，提供胸腺细胞体内阳性选择公认的模型系统.使用核酸微点阵，本发明人鉴定了在胸腺细胞的阳性选择中相对于未刺激胸腺细胞的核酸表达的变化。将TCRa-链缺乏的胸腺细胞(鼠)在0.2ng/mlPMA和0.2mg/ml离子雾素存在或缺失的培养基中培养，分别提供活化的和未活化的胸腺细胞.TCRa-链缺乏的胸腺细胞由于遣传突变在发育的DP阶段受到阻断。刺激后，这些细胞的基因表达的特征为发育成胸腺细胞。将细胞孵化6小时后，用RNeasyRNA和OligotexmRNA试剂盒(Qiagen)分离聚腺苷酸RNA(poly-A+RNA)按制造商的i兌明(IncyteGenomics)使用Mouse1.02Array,将poIy-A+RNA进行比较cDNA点阵分析。微点阵信号分析使用GEMTools分析软件(IncyteGenomics)进行'基于刺激胸腺细胞与未刺激胸腺细胞的序列表达比率，本发明人选择两条序列进行进一步研究.从每个标记的cDNA分别与ESTAA1841肪和ESTAA177302的标准化杂交信号中测定表达比率，其中EST包含在MouseArray中.对于与ESTAA184189和ESTAA177302的杂交序列，在刺激胸腺细胞中每个序列的表达分别增加了9.1倍和6.6倍，这些在Mouse1.02Array的EST来源于称为Soares小鼠3NbMS文库的鼠基因库，该库又来自4周龄C57BL/6J小鼠的脾脏.使用BLAST软件(NCBI)将EST序列与鼠核酸序列数据库(每个EST相应于鼠序列数据库中一个普通序列)比较，本发明人确定ESTAA184189和AA177302是连接的.因此，测定ESTAA184189和AA177302为更完整核酸的部分，使用5'端EST(AA177302)，本发明人通过cDNA末端快速扩增(SMARTRACEcDNA扩增试剂盒，Clontech)，使用从刺激胸腺细胞制备的cDNA作为反应模板，克隆了全长基因。本基因在本文中命名为小鼠脾脏表达基因(mSPEX基因)。示例性的mSPEX核酸列于SEQIDNO:105并且包括SEQIDNO.84中提及的编码区。GenBank的BLAST检索揭示SPEXcDNA编码新颖的蛋白质。由mSPEX核酸编码的示例性mSPEX多肽列于SEQIDNO:63。在细胞加工过程中信号序列(例如SEQIDNO:43)通常被切掉，以形成SEQIDNO:62所列出示例性的成熟mSPEX多肽.在mSPEX多肽和蛋白质数据库(NCBI)的Pfam家族之间使用序列比较，本发明人在预测的多肽细胞外部分鉴定出免疫球蛋白样结构域；然而，本发明人观察到SPEX与包含超家族成员的任何特定的免疫球蛋白没有亲近的同源性。2.鉴定和克隆hSPEXcDNA使用mSPEX序列与GenBank数据库的人序列进行序列比较，发明人确定人ESTAI792952和AA931122与mSPEX多核苷酸匹配，并且人EST对应于GenBank数据库中的单一人克隆.包含人克隆以及大量污染克隆的细菌探针(AI792952)购自IMAGEConsortium(LawrenceLivermoreNationalLaboratory,Livermore，CA),从该探针中将与mSPEX同源的人基因序列纯化、亚克隆、和测序。示例性的hSPEX核酸序列列于SEQIDNO:104并且包括SEQIDNO.42中提及的编码区.由hSPEX核酸序列编码的示例性hSPEX多肽列于SEQIDNO:21.在细胞加工hSPEX蛋白质过程中信号序列(例如SEQIDNO:l)通常被切掉，以形成SEQIDNO:20所列出示例性的成熟hSPEX多肽.3.大鼠抗mSPEX单克隆抗体的制造制造了包含编码区的分离表达栽体(本文是指p-mSPEX-Ig)，其编码mSPEX细胞外结构域和人IgGl的铰链、CH2、和CH3结构域.将p-mSPEX-Ig栽体转染进入培养物中的293细胞中，如同通过具有抗人1gGl抗体的Western印迹探针所评估，p-mSPEX-Ig转染的293细胞表达和分泌mSPEX-Ig融合蛋白(SEQIDNO:99).通过A蛋白亲合色详法从转染的293细胞的上清液中纯化mSPEX-Ig融合蛋白.在鼠的基尾部用CFA中乳化的纯化重组mSPEX-Ig对大鼠进行免疫，以产生单克隆抗体。针对指定的抗原生产抗体包括单克隆抗体的程序和技术是本领域众所周知的。两周后采集中间髏骨淋巴结并通过标准方法与YB2/0细胞融合。因此，使用经转染表达细胞表面mSPEX-YFP融合蛋白(YFP是黄色荧光蛋白质的缩写)DPK和293细胞，通过FACS筛选生产的抗体对mSPEX的免疫反应性。用于筛选程序的DPK和293细胞的转染使用分离的表达栽体构建体，该构建体由克隆mSPEX基因插入物至pEYEP-Nl栽体(Clontech)而制成。pEYEP-Nl栽体供给YFP标签，并且mSPEX插入物从pEYEP-Nl的表达导致融合蛋白的表达，该融合蛋白包括有效连接YFP标签的mSPEX多肽。在筛选方法中，连续筛选直到鉴定出一个或多个与mSPEX的细胞外结构域起特异免疫反应的单克隆抗体。YFP标签能证实转染的细胞在细胞表面表达mSPEX-YFP融合蛋白，和能够将细胞抗体结合的相对水平与mSPEX-YFP融合蛋白的表达相关联。从优先的(first)筛选方法中得到三个杂交瘤PK3、PK18、和PK23'任选地，将这些杂交瘤再克隆并使用标准方法纯化抗体。4.大鼠抗hSPEX单克隆抗体的制造除了1)制备包含hSPEX细胞外结构域(包括SPEX信号序列)和人IgGl的铰链、CH2、和CH3结构域的p-hSPEX-Ig表达栽体，并用该栽体在大鼠中生产单克隆抗体，和2)将编码hSPEX多肽细胞外结构域的hSPEX多核苷酸克隆到pEYEP-Nl栽体，并在DPK和293细胞中表达，以便使用上面公开的FACS-YFP程序筛选单克隆抗体之外，使用实施例3公开的方法制备与hSPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的单克隆抗体.所产生的单克隆抗体与hSPEX的细胞外结构域起特异的免疫反应.5.小鼠抗mSPEX单克隆抗体的制造因为存在已知的鼠SPEX复等位基因(mSPEX和mSPEXb)，可能在鼠宿主内没有经受自身耐受，出现鼠抗鼠SPEX抗体。除了为p-mSPEX-Ig融合物而用来自C57BL6小鼠(其具有mSPEX等位基因)的鼠SPEX基因和在BALB/c小鼠(其具有mSPEXb等位基因)上进行免疫之外，按照实施例3的程序，生产抗mSPEX鼠单克隆抗体。在优先的筛选方法中制得许多具有与mSPEX的细胞外结构域起免疫反应的抗mSPEX抗体，包括但不限于为PJ19.1和PJ196.6.小鼠抗hSPEX单克隆抗体的制造除了用大鼠代替小鼠进行融合多肽hSPEX-Ig(SEQIDNO:98)免疫外，按照实施例4的程序生产与hSPEX的细胞外结构域起免疫反应的单克隆抗体。所产生的单克隆抗体与hSPEX的细胞外结构域起特异的免疫反应。7.抑制移植物排斥已经测定了施用与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体会抑制移植物排斥.在笫-1、1、4、和6天(相对接受皮肤移植物)，给B6小鼠(具有mSPEX等位基因，但没有mSPEXb等位基因)腹膜内注射500pg的单克隆抗体PJ19.1(其与mSPEX的细胞外结构域起免疫反应，但与mSPEXb的细胞外结构域不起免疫反应).年龄和性别配对的对照小鼠接受生理緩沖盐水(PBS)或(平行实验中)小鼠IgG注射.在笫0天各个鼠接受同源的B6和同种的BALB/c皮肤移植物，皮肤移植物的这种特定品系的组合对诱导移植耐受有高度抵抗力；因此，在本系统中由移植物抑制剂诱导移植耐受(即抑制移植物排斥)是非常有意义的。著名的PJ19.1抗体在B6移植物受体中与mSPEX的细胞外结构域起免疫反应，但是在BALB/c供体的同种皮肤移植物中与mSPEXb的细胞外结构域不起免疫反应，从第7天至第16天每日照相，以总移植物的百分数(移植物表面积的百分数)监测移植物排斥。以90%或更多的组织破坏的那天确定移植物排斥的天数。如图3中所示，该实验过程中(总共十六天)没有观察到同源皮肤移植物的排斥.又如困3中所示，对照小鼠(注射PBS)中的同种异体移植物(同种皮肤移植物)在笫九天显示出排斥，但是在用PJ19.1单克隆抗体治疗的小鼠中，其同种异体移植物的排斥受到抑制，如同以上所述和在第13天所显示，图4提供了在实验组和对照组(见下述)中以存活的移植物对两组小鼠的天数所绘出的鼠百分数曲线.如上所述，在相对鼠各自接收同源和同种皮肤移植物的笫-1、1、4、和6天，给第一组五只鼠施用PBS(对照组).在相对鼠各自接收同源和同种皮肤移植物的笫-1、1、4、和6天，给第二组四只鼠各自施用500pg的单克隆抗体PJ19.1(实验组)。每天给皮肤移植物拍照直到最后的一个移植物排斥，基于百分数记录具有存活的同种皮肤照片的动物数，并将其对皮肤移植后天数绘图。如图4所示，在PBS治疗对照鼠中同种移植物排斥(90%或更多破坏)的中位数时间是第10天(中位数)，而在PJ19.1治疗鼠中同种移植物排斥的中位数时间受到抑制，直到13.5天(中位数)，其为最后注射抗体的七天)。使用Kaplan-Meier方法确定存活分数.使用PRISM4软件(统计软件)所提供的时序检验进行存活分数比较。还使用PRISM4软件计算生存中位数.根据排斥的中位数时间，该对照和该PJ19.1治疗鼠之间的差异是非常显著，p值为0.0051,移植后用PJ19.1单克隆抗体超过6天后继续治疗(例如，每天或每隔一日给药)预期能够导致继续抑制同种异体移植物排斥.8,抗SPEX抗体不会整体耗尽淋巴细胞除了在皮肤移植15天后(最后注射抗体的9天后)处死PBS和PJ19.1治疗鼠和分析每组动物的脾细胞的总B、CD4+T和CD8+T细胞计数之外，重复实施例7,如图5所示，对照(PBS)和PJ19.1抗体治疗鼠中CD4+T、CD8+T、和B细胞的频率和数目(没有给出数据)是相似的。因此给予与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体不会整体耗尽淋巴细胞的CD4+T、CD8+T、或B细胞数。9.抗SPEX抗体向下调节淋巴细胞的SPEX表达将具有PJ196(其与SPEX细胞外结构域起免疫反应)和继发抗体(具有与PJ19.1和PJ196单克隆抗体均起免疫反应)的上述实施例8的B、CD4+T、和CD8+T细胞样品(分开收集对照鼠和PJ19,1治疗鼠的样品)在体外染色.观察到(数据没有给出)1)在PJ1义1治疗鼠中没有整体耗尽B、CD4+T、和CD8+T细胞.2)用PJ19.1治疗的鼠中B、CD4+T、和CD8+T细胞在体内被PJ19.1抗体菝盖，和3)与PBS或IgG治疗鼠相比，PJ19.1治疗鼠在B、CD4+T、和CD8+T细胞上的细胞表面表达SPEX的总数减少。因此，使用与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的单克隆抗体会减少淋巴细胞(包括B、CD4+T、和CD8+T细胞)的表面上表达SPEX.10.鉴定SPEX细胞外结构域的氨基酸残基对抗体免疫反应的重要性实施例10公开一些(但不必所有)mSPEX细胞外结构域的氨基酸残基，其对PK18、PK3、PJ196和PJ19.1抗体的免疫反应性是重要的。对抗鼠SPEX的mSPEX等位基因各自引起PK18、PK3、PJ196、和PJ19.1抗体，这些抗体与mSPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应，但是与mSPEXb多肽不起免疫反应。mSPEX等位基因的细胞外结构域的氨基酸序列在十一个氨基酸残基位置上与mSPEXb等位基因相比，存在差别，如同下表l所示。通过编码mSPEX多肽的多核苷酸的独立变异产生突变的mSPEX多肽，以致从mSPEXb序列的各个残基上取代产生mSPEX多肽，其中在mSPEX和mSPEXb多肽之间的残基存在差别(见下表1)。除了45和47位置上的氨基酸残基一起变异形成T45N/T47K双重突变型之外，这些变异是独立完成的.表l<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>残基位置52、55、63、74、85、91、和102包括在mSPEX多肽的lg样结构域中.分析突变的mSPEX多肽在结合各个PK18、PK3、PJ196和PJ19.1抗体上的变化，以分别地证实哪一个氨基酸(其在raSPEX和mSPEXb多肽的细胞外结构域之间是不相同的)对各个抗体与mSPEX多肽的免疫反应是重要的.通过电穿孔法用各自编码mSPEX突变多肽(见上表l)并融合黄色荧光蛋白(YFP)在mSPEX突变体羧基端上的多核苷酸构建体，转染JurkatT细胞(人源的细胞系).同样用野生型mSPEX-YFP融合多核苷酸完成对照转染。将包含各自构建体(每个突变体mSPEX-YFP或野生型mSPEX-YFP)的转染细胞分成等分部分，然后与抗SPEX抗体反应(以分开的等分部分与PK18、PK3、PJ196、或PJ19.1反应)，然后将所有的样品与继发的抗体反应.为了在流式细胞计量术分析中检出，将继发的抗体连接至PE荧色物(FL2，本文)。因此，生产等分部分的细胞，其中每个等分部分在JurkatT细胞的细胞表面上表达野生型mSPEX或上表l所列出的突变mSPEX多肽之一，然后将这些中的每个等分部分分别与PK18、PK3、PJ196、或PJ19.1反应.通过YFP+细胞(荧光色素1阳性，或FL1+)窄范围的电子门控细胞，然后测量FL2荧光量，完成FACS分析.对于与各个指定的JurkatT细胞表达的mSPEX多肽起免疫反应的指定初始抗体(PK18、PK3、PJ196、或PJ19.1)，其FL2荧光量的减少表明mSPEX多肽中的野生型残基是与该抗体起特异免疫反应的表位部分。将上述实验的结果列表显示于下表2.表2MSPEX的残基对抗体免疫反应的重要性<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>当与野生型(wilt-type)SPEX相比时，表2中的减号(-)表示mSPEX细胞外结构域中各自氨基酸位置的突变不会减少抗体对突变体mSPEX的结合；加号(+)表示对于在mSPEX多肽的细胞外结构域中各自分别的氨基酸位置上突变的mSPEX与每个抗体的结合中任选等级(从最低的(+)至最高的(+++))的减少程度。根据上表2所示的资料，观察到PIG免疫亲和性表位包括残基45/47、和55;PK18免疫亲和性表位包括残基41、45/47、和85;PJ19.1免疫亲和性表位包括残基85和91;和PJ196免疫亲和性表位包括残基41和45"7.上表2所示的资料也表示mSPEX的残基85和S>1是抗体PJ19.1结合的表位部分，抗体PJ19.1在本文中证实具有抑制移植物排斥.在优选的实施方案中，结合SPEX多肽细胞外结构域的抗体抑制移植物排斥.在另一个优选的实施方案中，与包括mSPEX多肽中的残基85和91(或hSPEX多肽相应的残基)的表位起免疫反应的抗体抑制移植物排斥.在又一个优选的实施方案中，与SPEX多肽的Ig样结构域起免疫反应的抗体抑制移植物排斥.在进一步优选的实施方案中，与SPEX多肽的Ig样结构域(例如SEQIDNO:3、45、或88(最优选SEQIDNO:3))起免疫反应，但与SPEX多肽的非Ig样结构域(例如，SEQIDNO:l、2、4、5、6、7、8、9、10、11、43、44、46、47、48、49、50、51、52、或53(最优选SEQIDNO:l、2、或4))不起免疫反应的抗体抑制移植物排斥。在再进一步优选的实施方案中，与基本上由SPEXIg样结构域(例如基本上由SEQIDNO:3、45、或88(最优选SEQIDNO:3)组成的)组成的氨基酸序列起免疫反应的抗体抑制移植物排斥.在又一个优选的实施方案中，包括PJ19.1结合型表位的抗体抑制移植物排斥.11.抑制IL-2分泌和CD25表达A.T细胞制备使用抗B220(克隆RA3-6B2，eBioscience)、抗AbclassIIMHC(克隆Y3P)抗体和抗大鼠IgG磁珠(Qiagen，Valencia,CA)通过负选择富集脾脏或淋巴结的T细胞，在Click氏培养基(Irvine,SantaAna,CA)中完成所有的培养试验，该培养基包含10%的热灭活胎牛血清(GibcoBRL，Carlsbad,CA)、青霉素/链審素(GibcoBRL)、200mM谷酰胺、和50pM2-疏基乙醇(Sigma,St.Louis,MO)。细胞在37"C、5。/。C02的标准条件下培养.B.T细胞激活将总数1X106T细胞培养在96孔或24孔平底板的100^或1ml中，平底板分别地涂有1:1定量的抗CDS(克隆l"4Cll，eBiosdence)与以指定总Ig浓度的大鼠IgG(JacksonlmmunoResearch，WestGrove,PA)、PK18或PJI96的组合物。C.氚化胸苷的增殖研究为了卩H]胸苷的增殖研究，将T细胞在96孔板中培养总共72小时，最后16小时加有1pCi/孔的3Hj胸苷(PerkinElraer，Boston,MA).将细胞采集到玻璃纤维过滤器上(BrandelInc.,Gaithersburg,MA)并测定311]胸苷的掺入.D.IL-2ELISA使用购自eBiosciences标准夹心醉联免疫分析，测定培养物上清液的鼠IL-2。将Maxisorb板(Nunc,Roskilde，Denmark)用抗IL-2单克隆抗体(mABs)(克隆JES6-1A12)涂渍，并使用相应的生物素化的mAB完成检测.使用抗生物素蛋白链菌素-辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺作为底物将该板发育.在板读出器上以450nm读板，并使用Softmax软件分析数据(读出器和软件来自MolecularDevicesCorp.,Sunnyvale,CA).样品以双份进行。用重组体鼠IL-2将该测定标定，检出范围为1至l，OOOpg/ml.E.由活化的淋巴细胞抑制IL-2分泌在大鼠IgG或PK18存在下通过抗CD3刺激(激活)T细胞16小时后，收集培养物中的CD4+和CD8+T细胞的上清液，然后分析IL-2分泌(上清液中IL-2的量).该结果显示在图6A中。PK1S抗体通过活化淋巴细胞在IL-2分泌中产生80倍的减少.F.向抗SPEX抑制的淋巴细胞中在后加入IL-2不能完全复苏活化'淋巴细胞的增殖如图6A中在存在或缺失的PK18下，在一些培养中添加指定浓度的重组体鼠IL-2(800pg/ml和80pg/mlIL-2)激活T细胞.外源的重组体IL-2的加入不能完全复苏抑制淋巴细胞增殖，此淋巴细胞增殖可用活化SPEX信号转导的抗SPEX抗体(例如PK18)觯化该淋巴细胞强迫其产生(参见，例如图6B)。这证明用SPEX受体的抗体激动剂接触淋巴细胞上的SPEX受体会抑制该淋巴细胞增殖，甚至在生理学的和超生理学的IL-2浓度存在下。G.向接触过SPEX抗体激动剂的淋巴细胞中在后加入IL-2不能完全地通过这些淋巴细胞复苏IL-2受体(CD25)表达在PKI8和"低IL-2"(80pg/ml)或"高IL-2"(800pg/ml)浓度存在下刺激CD4+或CD8+T细胞，然后通过FACS分析测定IL-2受体(CD25)的表达(参见，例如图6C)。根据测定，CDM表达受到SPEX受体抗体激动剂的抑制，甚至在生理学的和超生理学的IL-2浓度存在下(IL-2正常地刺激CD"和CD8+T细胞表达CD25的表达)。与CD8+T细胞相比，观察到在CD4+T细胞中抑制CD25表达更多；与CD8+T细胞相比，CD4+T细胞上的这种抑制正相关于SPEX受体表达更大.H.SPEX抗体激动刑抑制IL-2产生，但不抑制CD69诱导随着T细胞激活，增殖诱导作用是相对晚的亊件.为了确定SPEX受体抗体激动刑(本实施例为PKI8)除了IL-2分泌之外是否还阻滞由TCR接合介导的信号，测量了T细胞上的CD69表达诱导作用，CD4+和CD8+T细胞上的CD69表达诱导作用都不受PKI8抑制(参见，例如图7)'相反地，PK18抑制CD4+和CD8+T细胞上继发的CD25表达(参见，例如图7)。PK18对CD25的抑制在CD4+T细胞上比在CD8+T细胞上更大，这与CD4+T细胞对PKI8-介导的抑制增殖有更大的敏感性一致.I.SPEX受体的激活抑制预激活的T细胞增殖上面实施例11H中的数据，CD69表达诱导不受PKW抑制表明通过SPEX信号转导抑制增殖是T细胞激活中相对晚的亊件。为了进一步测验它，将分离的幼稚(naiveX非活性的)T细胞(使用ANDTCR-Tg鼠作为富集来源)在结合抗CD3的板上刺激过夜，然后转移到涂有抗CD3与PK18或大鼠IgG(阴性对照)的组合物的新板上.令人惊讶地，PK18能够抑制CD4+T细胞增殖，甚至在初期整夜用抗CD3激活后(参见例如，图8)，对于细胞暴露给PK18的整个培养期，观察到抑制增殖类似的强度.虽然参照上述实施例已经描述了本发明，应当了解变体和变种包括在本发明的精神和范围之内.因此，本发明只受相附的权利要求所限制.权利要求1.在需要它的哺乳动物内抑制移植物排斥的方法，包括给该哺乳动物施用治疗有效量的抗体，其中所述的抗体与脾表达的(SPEX)多肽的细胞外结构域起免疫反应，从而抑制所述的移植物排斥。2.权利要求l的方法，其中移植物为同种移植物.3.权利要求l的方法，其中所述的移植物为皮肤移植物.4.权利要求l的方法，其中所述的移植物为组织移植物，5.权利要求l的方法，其中所述的移植物为器官移植物.6.权利要求l的方法，其中所述的移植物为骨號移植。7.权利要求l的方法，进一步包括施用第二种移植物排斥抑制剂.8.权利要求7的方法，其中所述的第二种移植物排斥抑制刑包括CsA、雷帕霉素、FK506、皮质类固醇、或与白细胞介素(IL)-2受体起免疫反应的抗体.9.权利要求l的方法，其中所述的抗体包括单克隆抗体或其结合片段。10.权利要求1的方法，其中所述的抗体与所述SPEX多肽的细胞内结构域不起免疫反应.11.权利要求l的方法，其中所述的抗体与所述SPEX多肽的Ig样结构域起免疫反应.12.权利要求ll的方法，其中所述的抗体与所述SPEX多肽的细胞内结构域不起免疫反应.13.权利要求l的方法，其中所述的抗体与SEQIDNO:3、12、13、45、54、55、85、86、或88起免疫反应。14.权利要求13的方法，其中所述的抗体与SEQIDNO:n、l8、59、或60不起免疫反应.15.权利要求l的方法，其中所述的哺乳动物是鼠.16.权利要求l的方法，其中所述的哺乳动物是人.17.权利要求1的方法，其中所述的哺乳动物是人和所述的抗SPEX抗体为人源化抗体。18.权利要求1的方法，其中所述SPEX多肽的所述细胞外结构域包含基本上由SEQIDNO:55组成多肽的六个或更多个连续氨基酸。19.在表达所述SPEX多肽的淋巴细胞上减少表达脾表达(SPEX)多肽的方法，包括将所述淋巴细胞接触与所述SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗SPEX抗体，从而减少该淋巴细胞上所述SPEX多肽的所述表达.20.权利要求19的方法，其中所述的抗SPEX抗体为单克隆抗体.21.权利要求19的方法，其中所述的抗SPEX抗体与该SPEX多肽的细胞外结构域起特异的免疫反应.22.权利要求21的方法，其中所述的抗SPEX抗体与所述SPEX多肽的细胞内结构域不起免疫反应.23.权利要求19的方法，其中所述的抗SPEX抗体与SPEX多肽的Ig样结构域起免疫反应，24.权利要求23的方法，其中所述的抗SPEX抗体与所述SPEX多肽的细胞内结构域不起免疫反应.25.权利要求19的方法，其中所述的抗SPEX抗体与SEQIDNO:3、12、13、45、54、55、85、86、或88起免疫反应。26.权利要求19的方法，其中所述的抗SPEX抗体与SEQIDNO:17、18、59、或60不起免疫反应，27.在需要它的哺乳动物内抑制移植物排斥的抗体的鉴定方法，包括a.提供包含脾表达(SPEX)多肽的细胞外结构域表位的氨基酸序列，其中所述的表位在长度上至少为六个氨基酸；b.对所述的氨基酸序列产生抗体；和c.在移植物排斥模型中筛选所述的抗体，从而鉴定出抑制所述移植物排斥的该抗体.28.权利要求27的方法,其中移植物排斥的所述哺乳动物模型包含在鼠接受者中的同种皮肤移植物.29.权利要求27的方法，其中所述SPEX多肽的所述细胞外结构域包含SEQIDNO:3、12、13、45、54、55、85、86、或88。30.权利要求27的方法，其中所述SPEX多肽的所述细胞外结构域包含SEQIDNO:3。31.权利要求27的方法，其中所述SPEX多肽的所述细胞外结构域包含SEQIDNO:13。32.在需要它的哺乳动物内抑制移植物排斥的方法，包括给该哺乳动物施用治疗有效量的抗体，其中所述抗体与基本上由脾表达的(SPEX)多肽细胞外结构域组成的氨基酸序列起免疫反应，从而抑制所述的移植物排斥，33.在需要它的哺乳动物内抑制移植物排斥的方法，包括给该哺乳动物施用治疗有效量的抗体，其中所述抗体与基本上由SEQIDNO:12组成的氨基酸序列起免疫反应，从而抑制所述的移植物排斥.34.在需要它的哺乳动物内抑制移植物排斥的方法，包括给该哺乳动物施用治疗有效量的抗体，其中所述抗体与基本上由脾表达的(SPEX)多肽的免疫球蛋白样结构域组成的氛基酸序列起免疫反应，从而抑制所述的移植物排斥。35.在需要它的哺乳动物内抑制移植物排斥的方法，包括给该哺乳动物施用治疗有效童的抗体，其中所述抗体与基本上由SEQIDNO:13组成的氨基酸序列起免疫反应，从而抑制所述的移植物排斥，36.权利要求l的方法，其中所述抗体激活所述SPEX多肽.37.权利要求1的方法，其中所述的SPEX多肽在淋巴细胞上表达.38.权利要求37的方法，其中所述的抗体激活在所述淋巴细胞上表达的所述SPEX多舦.39.权利要求37的方法，其中所述的淋巴细胞包含T细胞.40.权利要求37的方法，其中所述的淋巴细胞包含CD4+T细胞。41.权利要求37的方法，其中所述的淋巴细胞包含CD8+T细胞。42.权利要求37的方法，其中所述的淋巴细胞包含B细胞。43.通过表达脾表达多肽(SPEX多肽)的淋巴细胞抑制白细胞介素-2(IL-2)分泌的方法，包括将该淋巴细胞接触与所述SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体.44.权利要求43的方法，其中所述抗体激活所述SPEX多肽。45.权利要求43的方法，其中所述的抗体包括单克隆抗体或其结合片段。46.权利要求43的方法，其中所述的抗体与所述SPEX多肽的细胞内结构域不起免疫反应，47.权利要求43的方法，其中所述的抗体与所述SPEX多肽的lg样结构域起免疫反应.48.权利要求47的方法，其中所迷的抗体与所述SPEX多肽的细胞内结构域不起免疫反应。49.权利要求43的方法，其中所述的抗体与SEQ1DNO:3、12、13、45、54、55、85、86、或88起免疫反应.50.权利要求49的方法，其中所述的抗体与SEQIDNO:17、18、59、或60不起免疫反应。51.权利要求43的方法，其中所述的淋巴细胞包含T细胞，52.权利要求43的方法，其中所述的淋巴细胞包含CD4+T细胞。53.权利要求43的方法，其中所述的淋巴细胞包含CD8+T细胞。54.通过表达脾表达多肽(SPEX多肽)的淋巴细胞抑制白细胞介素-2受体(CD25)表达的方法，包括将该淋巴细胞接触与所述的SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体。55.权利要求54的方法，其中所述抗体激活所述SPEX多肽.56.权利要求54的方法，其中所述的抗体包括单克隆抗体或其结合片段，57.权利要求54的方法，其中所述的抗体与所述SPEX多肽的细胞内结构域不起免疫反应。58.权利要求54的方法，其中所述的抗体与所述SPEX多肽的Ig样结构域起免疫反应。59.权利要求58的方法，其中所述的抗体与所述SPEX多肽的细胞内结构域不起免疫反应.60.权利要求54的方法，其中所述的抗体与SEQIDNO:3、12、13、45、54、55、85、86、或88起免疫反应。61.权利要求60的方法，其中所述的抗体与SEQIDNO:17、18、59、或60不起免疫反应。62.权利要求54的方法，其中所述的淋巴细胞包含T细胞。63.权利要求54的方法，其中所述的淋巴细胞包含CD4+T细胞。64.权利要求43的方法，其中所述的淋巴细胞包含CD8+T细胞。65.抑制表达脾表达多肽(SPEX)多肽的活化淋巴细胞增殖的方法，包括将所述淋巴细胞接触与所述SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体，66.权利要求65的方法，其中所述抗体激活所述SPEX多肽.67.权利要求65的方法，其中所述的抗体包括单克隆抗体或其结合片段.68.权利要求65的方法，其中所述的抗体与所述SPEX多肽的细胞内结构域不起免疫反应.69.权利要求65的方法，其中所述的抗体与所述SPEX多肽的Ig样结构域起免疫反应.70.权利要求69的方法，其中所述的抗体与所述SPEX多肽的细胞内结构域不起免疫反应.71.权利要求65的方法，其中所述的抗体与SEQIDNO:3、12、13、45、54、55、85、86、或88起免疫反应。72.权利要求71的方法，其中所述的抗体与SEQIDNO:17、18、59、或60不起免疫反应.73.权利要求65的方法，其中所述的淋巴细胞包含T细胞.74.权利要求65的方法，其中所述的淋巴细胞包含CD4+T细胞.75.权利要求65的方法，其中所述的淋巴细胞包含CD8+T细胞.全文摘要本发明提供在哺乳动物内抑制移植物排斥的组合物和方法，包括给该哺乳动物施用一种或多种移植物排斥抑制的化合物，其中至少一种化合物包括与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应的抗体。本发明也提供在表达SPEX多肽的淋巴细胞上减少SPEX多肽表达的方法。本发明进一步提供鉴定抗体的方法，该抗体与SPEX多肽的细胞外结构域起免疫反应，然后抑制移植物排斥。本发明又进一步提供抑制预激活淋巴细胞增殖的方法、抑制由淋巴细胞表达白细胞介素2(IL-2)的方法、和抑制由淋巴细胞表达白细胞介素-2(IL-2)受体(CD25)的方法，包括将该淋巴细胞与SPEX受体激动抗体接触。文档编号C07H21/04GK101432020SQ200580034544公开日2009年5月13日申请日期2005年10月12日优先权日2004年10月12日发明者J·凯申请人:斯克里普斯研究学院