器官移植患者移植排斥的非侵入性诊断的制作方法

专利名称:器官移植患者移植排斥的非侵入性诊断的制作方法
器官移植患者移植排斥的非侵入性诊断
发明背景
器官移植是一个重要的医学方法，在患者出现器官衰竭或损坏的病例中可挽救生命，并且现在可以移植很多器官，包括心脏，脏，肾，和肝。在一些病例中，移植的器官被接受的病人排斥，产生威胁生命的情况。难以监控患者排异并且花费昂贵，经常需要侵入性诊断。另外，当前的监测方法缺乏足够的灵敏度。
本发明通过提供监控器官移植患者排异的非侵入性方法来解决这些问题，所述诊断敏感，迅速并且便宜。
发明概述本方面提供用于诊断和/或预测接受移植物的对象的移植状态或结果的方法，设备，组合物和试剂盒。在一些实施方式中，发明提供诊断或预测移植状态或结果的方法，所述方法包括以下步骤(i)提供已经从供体接受移植物的对象的样品；(ii)测定从供体移植的一个或多个核酸是否出现，其中供体的一个或多个核酸根据预定的标记分布鉴定；和
(iii)根据一个或多个核酸是否出现来诊断或预测移植状态或结果。
在一些实施方式中，移植状态或结果包括排异，耐受性，基于非排异的同种异体移植物损伤，移植功能，移植存活，慢性移植损伤，或免疫抑制药理学效价。一些实施方式中，基于非排异的同种异体移植物损伤选自下组缺血损伤，病毒感染，围手术期缺血，再灌注损伤，高血压，生理应激，活性氧自由基造成的损伤和药物试剂造成的损伤。
—些实施方式中，样品选自血液,血清,尿,和粪便。一些实施方式中，标记分布是多态性标记分布。一些实施方式中，多态性标记分布包括一种或多种单核苷酸多态性(SNP’S)，一种或多种限制性片段长度多态性(RFLP’S)，一种或多种短串联重复(STR)，一种或多种可变数目串联重复序列(VNTR’ S)，一个或多个超变区，一个或多个小卫星，一个或多个二核苷酸重复，一个或多个三核苷酸重复，一个或多个四核苷酸重复，一个或多个简单重复序列，或一个或多个插入兀件。一些实施方式中，多态性标记分布包括一种或多种SNP。
—些实施方式中,标记分布通过移植供体基因分型测定。一些实施方式中，所述方法还包括接受移植的对象的基因分型。一些实施方式中，所述方法还包括建立标记分布，其中标记在移植供体和接受移植的对象之间可以区分开。一些实施方式中，基因分型由选自测序、核酸阵列和PCR的方法完成。
本文描述的任何一个实施方式中，移植可以是任何固体器官和皮肤移植。一些实施方式中，移植选自肾移植，心脏移植，肝移植，胰腺移植，肺移植，肠移植和皮肤移植。
一些实施方式中，核酸选自双链DNA，单链DNA，单链DNA发夹结构，DNA/RNA杂交体，RNA和RNA发夹结构。一些实施方式中，核酸选自双链DNA，单链DNA和cDNA。一些实施方式中，核酸是mRNA。一些实施方式中，核酸得自循环供体细胞。一些实施方式中，核酸是游离循环 DNA (circulating cell-free DNA)。
一些实施方式中，一个或多个核酸是否存在由选自测序、核酸阵列和PCR的的方法测定。在一些实施方式中，所述测序是鸟枪测序。一些实施方式中，所述阵列是DNA阵列。一些实施方式中，DNA阵列是多态性阵列。一些实施方式中，多态性阵列是SNP阵列。[0012]一些实施方式中，所述方法还包括测定定量一个或多个核酸。一些实施方式中，一个或多个核酸的量指示移植状态或结果。一些实施方式中，高于预定阈值的一个或多个核酸量指示移植状态或结果。一些实施方式中，阈值是没有移植排斥或其他病变迹象的移植后患者临床稳定的标准值。一些实施方式中，不同的移植结果或状态有不同的预定阈值。一些实施方式中，一个或多个核酸量的暂时差异指示移植状态或结果。
一些实施方式中，本文所述方法有至少56%灵敏度。一些实施方式中，本文所述方法有至少78%灵敏度。一些实施方式中，本文所述方法有约70%-约100%特异性。一些实施方式中，本文所述方法有约80%-约100%特异性。一些实施方式中，本文所述方法有约90%-约100%特异性。一些实施方式中，本文所述方法有约100%特异性。
—些实施方式中，发明提供计算机可读介质,所述介质包括记录其上的使计算机执行以下步骤的一组指令(i)从接受供体移植的对象样品检测的一个或多个核酸中接收·数据，其中一个或多个核酸是得自供体移植的核酸，并且其中供体的一个或多个核酸根据预定标记分布鉴定；和(ii)根据一个或多个核酸是否出现诊断或预测移植状态或结果。
—些实施方式中，发明提供实施本文所述一种或多种方法的试剂和试剂盒。
通过引用纳入
本说明书中提到的所有发表物和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物或专利申请特别和单独地通过引用纳入本文那样。

附图简要说明
所附权利要求
书中具体说明了本发明的新特征。可参考以下详述更好地理解本发明的特征和优点，这些详述列出利用本发明原理的说明性实施方式和附图
图I显示诊断CAV后患者的存活。
图2显示接受性别不匹配移植患者的供体DNA检测。
图3显示接受性别不匹配移植和遭受3A排异事件的移植患者中供体DNA检测的时程研究。
图4显示接受性别不匹配移植和遭受3A排斥反应的移植患者中供体DNA检测的时程研究。
图5描述发明的一个实施方式中监控所有移植患者的通用策略。
图6显示测序结果,对比供体DNA和受体DNA的四个替代水平。
发明详述
下面详细说明本发明的具体优选实施方式。优选实施方式的示例在下列实施例部分阐述。
除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域技术人员通常所理解的同样含义。本发明中提及的所有专利和出版物通过引用全文纳入本文。
提供为诊断或预测接受移植物的对象的移植状态或结果的方法，设备，组合物和试剂盒。移植状态或结果可以包括排异，耐受性，基于非排异的移植损伤，移植功能，移植存活，慢性移植损伤，或免疫抑制药理学效价。
发明描述用于监控器官移植患者，和/或诊断或预测移植状态或结果(例如移植排斥)的灵敏且非侵入性方法，设备，组合物和试剂盒。一些实施方式中，采用所述方法，设备，组合物和试剂盒在移植前建立供体和受体的基因型以能够检测移植后器官受体的体液如血液或尿液中的供体特异性核酸如DNA或RNA。
一些实施方式中，发明提供测定患者或对象是否显示移植耐受性的方法。术语“移植耐受性”包括对象不排斥引入该对象内/上的移植器官，组织或细胞。换句话说，对象耐受或维持移植入的器官，组织或细胞。本文所用的术语“患者”或“对象”包括人和其他哺乳动物。
一些实施方式中，发明提供诊断或预测移植排斥的方法。术语“移植排斥”包括急性和慢性移植排斥。“急性排斥或AR”是当移植组织在免疫学上是异源时，组织移植受体免疫系统的排斥。急性 排异的特性是受体免疫细胞向移植组织浸润渗透，所述细胞行使其效应物功能并破坏移植组织。急性排斥开始迅速并一般在人体移植手术后几周内发生。通常，急性排斥能用如免疫抑制药物例如雷帕霉素，环孢素A，抗CD40L单克隆抗体等阻抑或抑制。
“慢性移植排异或CR”一般发生在人体移植后数月到数年内，甚至在急性排斥免疫抑制成功的情况下。纤维化是所有器官移植类型慢性排斥的常见因素。慢性排斥一般能描述为有具体器官特征的特异疾病范围。例如，在肺移植中，这些疾病包括破坏气道的纤维增生(闭塞性细支气管炎)；在心脏移植或心脏组织移植如瓣膜置换术中，这些疾病包括纤维化动脉粥样硬化；肾脏移植中，这些疾病包括梗阻性肾病，肾硬化，肾小管间质肾病；和肝脏移植中，这些疾病包括肝内胆管消失综合征。慢性排斥的特征也可以是缺血损伤，移植组织去神经支配，和与免疫抑制药物相关的高脂血和高血压。
一些实施方式中，发明还包括确定接受移植例如同种异体移植物的对象的免抑制疫方案。
发明的某些实施方式提供预测接受移植物的对象的移植存活的方法。发明提供诊断或预测移植患者或对象的移植物是否存活或丧失的方法。某些实施方式中，发明提供诊断或预测出现长期移植物存活的方法。“长期”移植物存活指当前取样后移植物存活至少约5年，尽管出现一个或多个之前的急性排斥反应。某些实施方式中，测定至少发生一次急性排斥反应的患者的移植存活。如此，这些实施方式提供测定或预测急性排斥后移植存活的方法。移植存活在移植治疗例如免疫抑制治疗情况下的某些实施方式中测定或预测，其中免疫抑制治疗为本领域已知。在其他实施方式中，提供测定急性排斥(并且不只是其存在)种类和/或严重性的方法。
一些实施方式中，发明提供诊断或预测基于非排异的移植损伤的方法。基于非排异的移植损伤示例包括但不限于，缺血损伤，病毒感染，围手术期缺血，再灌注损伤，高血压，生理应激，活性氧自由基造成的损伤和药物试剂造成的损伤。
如移植领域所知，移植器官、组织或细胞可以异体或异种，从而移植物可以同种异体移植物或异种异体移植物。由对象方法检测或鉴定的移植物耐受表型特征是没有免疫抑制治疗时产生的表型，即，在没有接受免疫抑制治疗的宿主中存在，从而没有将免疫抑制剂给予宿主。移植物可以是任何固体器官和皮肤移植。可以用本文所述方法分析的器官移植示例包括但不限于，肾移植，胰腺移植，肝移植，心脏移植，肺移植，肠移植，肾移植后胰腺移植，和胰肾联合移植。
应理解，给出数值范围时，除非文中另有明确说明，该范围上下限之间、到下限单位的十分之一的各中间值，以及所述范围的任何其它标注或中间值均包括在本发明范围内。所述较小范围内可独立地包含这些较小范围的上下限，它们也属于本发明范围，受到所述范围明确排除的限值制约。设定范围包含一个或两个限值时，本发明也包括排除这一个或两个所含限值的范围。
本文提出的某些范围的数值前面存在术语“约”。本文使用的术语“约”为其后准确数字以及该术语后面数字附近或逼近的数字提供字面支持。在确定数字是否接近或逼近特定提及数字时，接近或者逼近的未提及数字可能是在其所代表的内容中提供了特定提及数字的大致等同的数字。
除非另有说明，本发明的实施将采用免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA的常规技术，它们均在本领域技术范围内。参见Sambrook，Fritsch 和 Maniatis，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL (《分子克隆实验室手册》)第二版(1989) !CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (《新编分子生物学实验指南》)(F. EAusubel等编(1987));METH0DS IN ENZYM0L0GY (《酶学方法》丛书)(学术出版社公司(Academic Press, Inc. )) PCR 2 :APRACTICAL APPROACH (((PCR 2 :实践方法》)(M. J. MacPherson, B. D. Hames 和 G. R. Taylor 编(1995)), Harlow 和 Lane 编(1988)ANTIBODIES, ALAB0RAT0RY MANUAL (《抗体，实验室手册》)，和 ANIMAL CELL CULTURE (《动物细胞培养》)(R. I. Freshney 编(1987))。
导言
提供用于诊断或预测接受移植物的对象的移植状态或结果的方法，设备，组合物和试剂盒。
如上所述，难以监控移植患者的移植状态或结果且花费昂贵，经常需要非敏感和侵入性方法。例如，心脏移植患者急性排斥监控需要连续心内膜心肌活检，所述活检在移植后第一年中以每周和每月间隔常规进行，大部分患者共进行6-8次活检。免疫抑制、排斥监测和威胁生命的感染的早期识别和治疗的进展可持续改善心脏移植后的早期结果。(Taylor, D. 0.等，J Heart Lung Transplant, 27,943-956 (2008))。然而，晚期死亡率没有相应改善，大部分可归因于心脏同种异体移植物血管病变(CAV)。(图I)现在，在美国接近22，000个活心脏移植受体中，CAV仍是晚期移植失败和死亡的主要原因。在血管造影明显疾病发展、移植物功能障碍或症状发作前的CAV早期检测重要，因为冠状血管造影检测(护理标准)后的患者死亡率之高难以承受，已报道2年死亡率为50%。目前的CAV监测方法缺少足够灵敏度或需要侵入性过程，并且最经常应用的方法-冠状血管造影缺乏灵敏度(Kobashigawa，J. A.等，J Am Coll Cardiol,45,1532-1537 (2005))。低估疾病严重性造成的延误诊断是冠状血管造影的特征，其很大程度上用血管内超声(IVUS)克服。(Fitzgerald, P. J.等，Circulation, 86,154-158 (1992))然而，这两种侵入性左心脏、动脉导管方法昂贵，为资源密集型，并且与显著死亡风险和患者不适相关联。血管造影明显疾病发展、移植物功能障碍或症状发作前的CAV早期检测对指导新型治疗的合适使用至关重要，所述治疗延缓且偶尔逆转CAV的进展。开发用于急性排斥和CAV的早期、非侵入性、安全且有成本效益的检测的标记，和其快速转化成能用于临床的可行和可靠检测，对美国接近22，000个和全世界相似数目的活心脏移植受体而言，是主要的未得到满足的医疗需要。
近期研究还强调早期诊断和风险分级的紧迫需要，证明在较新的免疫抑制方案后，CAV的进展延迟和/或逆转。因为使用这些较新的疗法受到副作用、药物相互作用和成本的阻碍，重要的是鉴定受益超过风险的患者。除对死亡率和发病率的影响外，CAV监测在患者并发症的资源利用和潜力方面花费昂贵。鉴于心脏移植后前五年每年施行冠状血管造影的现行护理标准，每个存活5年的患者会接受4张血管造影照片，平均总成本是每张血管造影照片25，OOO美元。因为心脏移植后5年存活率是72%，接受心脏移植的2，000患者中约1，440患者每年会经历4次过程，总共至 少5，760次过程。每个冠状血管造影的平均成本是25，000美元，每年监控心脏移植后患者的保健花费总计144，000，000美元。鉴定低CAV风险的非侵入性测试会指出冠状血管造影可以在该组中安全避开，因此大幅降低长期管理的成本。
接受其他移植类型的患者经历相同的困难和花费。
a.循环核酸
循环或游离的DNA于1948年在人体血浆中首次检测到。(Mandel，P. Metais，P.，C R Acad.Sci.巴黎，142，241-243 (1948))。此后，在多个领域建立其与疾病的联系。(Tong, Y. K. Lo, Y. M. ,Clin Chim Acta，363，187-196(2006))。研究发现，在疾病例如癌症中观察到源自坏死或凋亡细胞血液的大量循环核酸(Giacona, M. B.等，Pancreas, 17,89-97(1998))和凋亡中核酸水平的大幅提高。(Giacona, ,M. B.等，Pancreas，17，89-97 (1998)；Fournie, G. J.等，Cancer Lett, 91, 221-227 (1995))。特别对于肿瘤，其中循环 DNA 携带包括致癌基因突变、微卫星改变在内的疾病标记信号，并且对某些癌症，病毒基因组序列、血浆中DNA或RNA已经作为疾病潜在生物标记来越来越多地进行研究。例如，Diehl等近期显示，与临床使用的标准生物标记癌胚抗原相比，总循环DNA中低水平循环肿瘤DNA的定量分析可以作为检测结直肠癌复发的更好标记。(Diehl,F.等,Proc Natl Acad Sci, 102,16368-16373 (2005) ；Diehl,F.等，Nat Med，14，985-990 (2008))。Maheswaran 等报道使用肺癌患者血浆中循环细胞基因分型来检测会影响药物治疗的表皮生长因子受体的活性突变。(Maheswaran, S.等，N Engl J Med，359，366-377 (2008))。这些结果共同建立两种循环DNA-血浆中游离的或来自循环细胞，作为癌症检测和治疗的有用物质。循环DNA也能用于健康患者的胎儿诊断，用母亲血液中循环的胎儿DNA作为性别、恒河猴D (RhD)状态，胎儿异倍体性和性别相关疾病的标记。Fan等近期显示通过对取自母体血液样品的游离DNA进行鸟枪测序来检测胎儿异倍体性的策略，所述方法能取代更具侵入性和危险的技术，例如羊膜穿刺术或绒毛采样。(Fan, H. C.，Blumenfeld, Y. J.，Chitkara, U.，Hudgins, L.，Quake, S. R. , Proc Natl Acad Sci，105，16266-16271 (2008))。
在循环核酸的所有这些应用中，存在不同于患者正常基因型的序列用于检测疾病。在癌症中，基因突变是疾病发展的信号；胎儿诊断中，与母体DNA相比，胎儿特异序列的检测可以分析胎儿健康。
一些实施方式中，发明提供用于器官移植患者的非侵入性诊断，其中器官供体的序列在其他方面对患者为“异源”，可特定定量。不希望限于任何理论，由于游离DNA或RNA常由凋亡细胞产生，循环核酸中供体特异序列的相对量应就包括但不限于心、肺、肝和肾的多种固体器官移植，提供移植患者中即将发生的器官衰竭的预测指标。
b.循环核酸和移植排斥
一些实施方式中，发明提供检测和/或定量游离在血浆或来自循环细胞的循环核酸的方法，设备，组合物和试剂盒，以诊断、预测、检测和/或治疗移植状态或结果。性别不匹配的肝和肾移植患者有供体DNA检测的权利要求
；传统PCR用于检索女性患者血液中的男性供体Y染色体序列。(Lo, Y. M.等，Lancet，351，1329-1330 (1998))然而，在后续研究中，使用更加精确的定量聚合酶链反应(qPCR)分析，Y染色体特异序列在上述背景18例患者中的16例没有检测到。(Lui, Y. Y.等，Clin Chem，49，495-496 (2003))肾移植中，分析相似性别不匹配移植患者的尿液样品，并且在患者移植后和移植排斥反应期间立即检测Y染色体 DNA。(Zhang，J.等，Clin Chem，45，1741-1746 (1999) ；Zhong, X. Y.等，Ann N YAcad Sci，945，250-257 (2001))
实施例I检测性别不匹配心脏移植受体并应用数字PCR (Warren, L. , Bryder,D.，Weissman, I.L.，Quake, S. R.，Proc Natl Acad Sci,103,17807-17812 (2006) ；Fan,H. C. Quake, S. R.，Anal Chem, 79，7576-7579 (2007))以检测与心内膜心肌活检测定 3A 或3B排斥反应同时获取的血浆样品中源自供体染色体Y信号的水平。而4例对照女性-女性移植患者中没有检测到任何重要染色体Y信号，对三例跨越四个排斥反应的男性-女性移植患者，观察到排斥时间点染色体Y信号的I. 5-8%总基因组部分(图2)。这些患者之一的时程研究显示血浆中检测的染色体Y水平在排斥前三个月血浆中可以忽略(neglible)，但是活检确定排斥的时间，增加>10倍达到2%的总基因组部分(见图3和4)。这些结果共同确立，就心脏移植患者而言血浆中出现的源自供体DNA可以作为器官衰竭开始的潜在标记。
尽管这些研究各显示不同固体器官移植体液中的供体DNA，其都限于女性接受男性器官的特定病例，并且对女性接受女性、男性接受男性或男性接受女性并不适用。这种策略的其他问题源自女性患者普遍存在微嵌合性，其中，过去男性怀孕或输血可以产生移植器官以外来源的Y染色体特异信号。(Hubacek, J. A.，Vymetalova, Y.，Bohuslavova,R. , Kocik, M. , Malek, I. , Transplant Proc,39,1593-1595 (2007) ；Vymetalova, Y 等，Transplant Proc，40，3685-3687 (2008))循环DNA中的供体特异人类白细胞抗原(HLA)等位基因检测视作器官排斥的信号，特别是肾和胰腺移植患者。(Gadi，V. K.，Nelson, J. L.，Boespflug, N. D.，Guthrie, K. A.，Kuhr, C. S.，Clin Chem，52，379-382 (2006))然而，这种策略也受限在于不能区分所有供体和受体之间的HLA等位基因，特别是对普通HLA类型，以及微嵌合体如来自输血的潜在复杂性。(Baxter-Lowe, L. A. Busch, M. P. , Clin Chem, 52,559-561 (2006))
一些实施方式中，发明提供移植患者的移植物排斥非侵入性检测的通用方法，绕开其他外源DNA微嵌合体的潜在问题，并对所有器官受体通用而不考虑性别。一些实施方式中，生成供体器官的遗传指纹。这种方法可对仅来自以独立于供体和受体性别的方式完成器官移植的序列进行可靠鉴定。
一些实施方式中，供体和受体在移植前都能作基因型分析。能用于对移植供体和移植受体基因分型的方法示例包括但不限于，全基因组测序，外显子组测序或多态性阵列(例如SNP阵列)。建立两个来源之间的相关和可区分标记组。一些实施方式中，标记组包括多态标记组。多态标记包括单核苷酸多态性(SNP’S)，限制性片段长度多态性(RFLP’S)，短 串联重复(STR)，可变数目串联重复(VNTR’ S)，超变区，小卫星，二核苷酸重复，三核苷酸重复，四核苷酸重复，简单重复序列，和插入元件例如Alu。一些实施方式中，标记组包括SNP。[0056]移植之后，能从患者得到体液例如血液，并分析标记。体液示例包括但不限于涂片，痰，活检，分泌物，脑脊液，胆汁，血液，淋巴液，唾液，和尿液。供体特异标记(例如多态标记如SNP)的检测、鉴定和/或定量能用循环核酸(例如游离DNA)的实时PCR、芯片(例如SNP芯片)、高通量鸟枪测序和包括本文所述方法的本领域其他方法进行。供体核酸比例能随着时间监控，并此比例增加能用于确定移植状态或结果(例如移植排斥)。
在所述移植是异种移植的一些实施方式中，供体特异标记的检测、鉴定和/或定量能通过对物种基因组的一个或多个核酸(例如DNA)作图进行，以确定一个或多个核酸是否来自移植供体。当所述移植是异种移植时也可使用上述多态标记。
在本文所述的任何一个实施方式中，移植可以是任何固体器官或皮肤移植。可以用本文所述方法分析的器官移植示例包括但不限于，肾移植，胰腺移植，肝移植，心脏移植，肺移植，肠移植，肾移植后胰腺移植，和胰肾联合移植。
样品
—些实施方式中，本文所述方法包括对核酸进行一个或多个遗传分析或检测步骤。一些实施方式中，靶核酸来自接受移植物对象的所获样品。这些对象能是人或驯养动物，例如牛，鸡，猪，马，兔，狗，猫，或山羊。一些实施方式中，本发明使用的细胞取自患者。获自动物例如人的样品可包括，例如全血，汗，泪水，唾液，耳流出物，痰，淋巴，骨髓悬液，淋巴，尿液，唾液，精液，阴道流，脑脊液，脑液，腹水，乳汁，呼吸道分泌液，肠道或泌尿生殖道液，组织或器官(如肺)或从器官取下的组织灌洗液，如乳腺、肺、肠、皮肤、宫颈、前列腺、胰腺、心脏、肝和胃。例如，组织样品可以包括功能相关细胞或相邻细胞区域。这些样品能包括细胞复合群，能用作群分析，或分成亚群。这些细胞和非细胞样品能用离心，淘析，密度梯度分离，脱落分离，亲和选择，淘盘洗选，FACS，泛影酸盐离心等分离。通过使用特定细胞类型鉴定的标记特异性抗体，可以得到细胞的相对均一群。或者可以使用异质细胞群。细胞还可以用滤器分开。例如，全血也能用于改造成包括选择所需细胞类型或种类的孔尺寸的滤器。使用孔尺寸为5-10 μ m的滤器，细胞能从红细胞裂解后稀释的全血中过滤出，如美国专利申请号09/790，673所公开。其他设备能从血流中分离细胞,见Demirci U,TonerM. , Direct etch method for microfluidic channel and nanoheight post-fabricationby picoliter droplets (微流体管道和皮升滴的纳米高度制作后的直接侵蚀方法)，Applied Physics Letters2006 ;88(5)，053117 JPIrimia D,Geba D,Toner Μ. ,Universalmicrofluidic gradient generator (通用微流体梯度发生器)，Analytical Chemistry2006 ;78:3472-3477。一旦得到样品，可以直接使用，冷冻，或短时间维持在适当培养基。根据本发明方法使用的分离一种或多种细胞的方法按本领域明确的标准技术和方法操作。
为得到血液样品，可使用本领域任何已知技术，例如注射器或其他吸真空设备。血液样品能任选预处理或富集前处理。预处理步骤的示例包括加入试剂，例如稳定剂，防腐齐 ，固定剂，裂解试剂，稀释剂，抗凋亡试剂，抗凝血剂，抗血栓剂，磁性调节剂，缓冲试剂，渗透压调节剂，PH调节剂和/或交联试剂。
当得到血液样品时，防腐剂例如抗凝血剂和/或稳定剂能在富集前加入样品。这能延伸分析/检测时间。因此，从得到样品时间的I周，6天，5天，4天，3天，2天，I天，12小时，6小时，3小时，2小时或I小时内，能以本文任何方法和系统分析样品,例如血液样品。
一些实施方式中，血液样品能与选择性裂解血液样品中一种或多种细胞或成分的试剂联合。例如，选择性裂解血小板和/或无核红细胞以生成有核细胞富集样品。随后使用本领域已知方法分离感兴趣细胞。
当从对象中得到样品(例如血液样品)时，数量根据对象大小和筛选情况而不同。一些实施方式中，得到多至50，40，30，20，10，9，8，7，6，5，4，3，2或11^样品。一些实施方式中，得到1-50，2-40，3-30，或4_20mL样品。一些实施方式中，得到多于5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95 或 IOOmL 样品。
核酸
能用本文方法分析的样品核酸包括双链DNA，单链DNA，单链DNA发夹结构，DNA/RNA杂交体，RNA (例如mRNA或miRNA)和RNA发夹结构。能用于核酸操作的遗传分析示例包括，例如测序，SNP检测，STR检测，RNA表达分析和基因表达。
一些实施方式中，从样品中得到少于lpg, 5pg, IOpg, 20pg, 30pg, 40pg, 50pg, IOOpg,200pg,500pg,lng,5ng,IOng,20ng,30ng,40ng,50ng,IOOng,200ng,500ng,lug,5ug,IOug, 20ug, 30ug, 40ug, 50ug, IOOug, 200ug, 500ug 或 Img 核酸以用于进一步遗传分析。一些病例中，从样品中得到大约 l~5pg, 5-10pg, 10-100pg, lOOpg-lng, l_5ng, 5-lOng, lO-lOOng,IOOng-Iug核酸以用于进一步遗传分析。
—些实施方式中，本文所述方法用于检测和/或定量祀核酸分子。一些实施方式中，本文所述方法用于检测和/或定量多个靶核酸分子。本文所述方法能分析至少I ;2 ；3 ；4 ；5 ;10，20 ；50 ；100 ；200 ；500 ;1，000 ;2，000 ;5，000 ;10，000，20，000 ;50，000 ;100，000 ；200，000 ;300，000 ;400，000 ;500，000 ;600，000 ;700，000 ;800，000 ;900，000 ;1，000，000 ；2，000, 000或3，000, 000种不同靶核酸。
—些实施方式中，本文所述方法用于区分与另一种核酸差异Int的祀核酸。一些实施方式中，本文所述方法用于区分与另一种核酸差异Int或多于1,2,3,5,10,15,20,21,22，24，25，30nt 的靶核酸。
一些实施方式中，本文所述方法用于检测和/或定量基因组DNA区。一些实施方式中，本文所述方法能区分和定量基因组DNA区。本文所述方法能区分和定量至少I ;2 ；3 ；4 ；5 ;10，20 ；50 ；100 ；200 ；500 ;1，000 ;2，000 ;5，000 ;10，000，20，000 ;50，000 ;100，000 ；200，000 ;300，000 ;400，000 ;500，000 ;600，000 ;700，000 ;800，000 ;900，000 ;1，000，000 ；2，000, 000或3，000, 000种不同基因组DNA区。本文所述方法能区分和定量变化Int或多于 1,2,3,5,10，15, 20, 21, 22, 24, 25, 30nt 的基因组 DNA 区。
一些实施方式中，本文所述方法用于检测和/或定量基因组DNA区，例如包含DNA多态性的区域。多态性指群体中出现两个或多个遗传决定的其他序列或等位基因。多态标记或位点是发生差异的基因座。优选标记至少有两个等位基因，每个优选以大于1%的频率发生，并更优选大于10%或20%的选定群。多态性可以包括一个或多个碱基改变，插入，重复，或缺失。多态性基因座可以小至一个碱基对。多态标记包括单核苷酸多态性(SNP’S)，限制性片段长度多态性(RFLP’ S)，短串联重复(STR)，可变数目串联重复(VNTR’ S)，超变区，小卫星，二核苷酸重复，三核苷酸重复，四核苷酸重复，简单重复序列，和插入元件例如Alu。两个核酸之间的多态性能自然发生，或由暴露于或接触化学物、酶或其他试剂，或暴露于能造成核酸损害的试剂例如紫外线辐射、诱变剂或致癌物所引起。一些实施方式中，本文所述方法能区分和定量包含DNA多态性的DNA区。本文所述方法能区分和定量至少I ;2 ；3；4 ；5 ;10，20 ；50 ；100 ；200 ；500 ;1，OOO ;2，000 ;5，000 ;10，000，20，000 ;50，000 ;100，000 ；200，000 ;300，000 ;400，000 ;500，000 ;600，000 ;700，000 ;800，000 ;900，000 ;1，000，000 ；2，000，000 或 3，000，000 种 DNA 多态性。
一些实施方式中，本文所述方法能区分和定量至少I ;2 ；3 ；4 ；5 ；10,20 ；50 ；100 ；200 ；500 ;1，000 ;2，000 ;5，000 ;10，000,20, 000 ;50，000 ;100，000 ;200，000 ;300，000 ；400，000 ;500，000 ;600，000 ;700，000 ;800，000 ;900，000 ;1，000，000 ;2，000，000 或3，000, 000种不同多态标记。
一些实施方式中，本文所述方法能区分和定量至少I ;2 ；3 ；4 ；5 ；10,20 ；50 ；100 ；200 ；500 ;1，000 ;2，000 ;5，000 ;10，000,20, 000 ;50，000 ;100，000 ;200，000 ;300，000 ；400，000 ;500，000 ;600，000 ;700，000 ;800，000 ;900，000 ;1，000，000 ;2，000，000 或3，000，000 种不同 SNP。、
—些实施方式中,本文所述方法用于检测和/或定量基因表达。一些实施方式中，本文所述方法提供多个基因的高度区分和定量分析。本文所述方法能区分和定量至少1，2，3，4，5，10，20，50，100，200，500，I, 000，2，000，5，000，10，000，20，000，50，000，100，000 种不
同革巴核酸的表达。
—些实施方式中，本文所述方法用于检测和/或定量有相似序列的基因表达。本文所述方法能区分和定量变化Int或多于I, 2, 3,4, 5,10,12,15, 20, 21, 22, 24, 25, 30nt的
基因表达。
一些实施方式中，本文所述方法通过对物种基因组区作图来检测和/或定量基因组DNA区，其中移植供体和移植受体来自不同物种(即异种移植)。一些实施方式中，本文所述方法能区分和定量来自一个物种的DNA区。本文所述方法能区分和定量至少I ;2 ;3 ;
4；5 ;10，20 ；50 ；100 ；200 ；500 ;1，000 ;2，000 ;5，000 ;10，000,20, 000 ;50，000 ;100，000 ；200，000 ;300，000 ;400，000 ;500，000 ;600，000 ;700，000 ;800，000 ;900，000 ;1，000，000 ；2，000，000或3，000，000种来自一个物种的DNA区。
一些实施方式中，本文所述方法能用来诊断或预测移植状态或结果(例如移植排斥)。一些实施方式中，本文所述方法能用来检测和/或定量目标核酸，以测定患者或对象是否显示移植耐受性。一些实施方式中，本文所述方法能用来检测和/或定量靶核酸，以诊断或预测移植排斥。一些实施方式中，本文所述方法能用来检测和/或定量靶核酸，以确定接受移植例如同种异体移植物的对象的免疫抑制治方案。一些实施方式中，本文所述方法能用来检测和/或定量靶核酸，以预测接受移植对象的移植存活。发明提供诊断或预测移植患者或对象的移植物是存活或是丧失的方法。某些实施方式中，本文述方法能用来检测和/或定量靶核酸，以诊断或预报长期移植存活的出现。一些实施方式中，本文所述方法能用来检测和/或定量靶核酸，以诊断或预测基于非排斥的移植损伤。基于非排斥移植损伤的示例包括但不限于，缺血损伤，病毒感染，围手术期缺血，再灌注损伤，高血压，生理应激，活性氧自由基造成的损伤和药物试剂造成的损伤。
本文所用术语“诊断”移植状态或结果的或“下诊断结论”包括预测或诊断移植状态或结果，确定移植状态或结果的倾向，监控移植患者的治疗，诊断移植患者的治疗反应，和预后移植状态或结果、移植进展和对特定治疗的反应。
供体器官核酸检测和分析[0080]一些实施方式中，所述方法，设备，组合物和试剂盒用于移植前建立供体和受体的基因型从而能在移植后从器官受体的体液(例如血液或尿液)检测供体特异核酸，例如DNA或RNA。这种方法能对仅来自以独立于供体和受体性别的方式完成器官移植的序列进行可
靠鉴定。
一些实施方式中，生成供体器 官的遗传指纹。供体和受体在移植前都作基因型分析。移植供体和移植受体基因分型使用可区分标记建立分布以检测供体核酸(例如循环游离核酸或来自循环供体细胞的核酸)。一些实施方式中，对于异种移植，供体核酸能对供体物种基因组作图。
移植之后，能从患者得到上述样品，并分析标记。供体核酸比例随着用时间监控，且此比例增加能用于确定移植状态或结果(例如移植排斥)。
一些实施方式中，基因分型包括检测和定量来自循环移植供体细胞的核酸或循环游离核酸。核酸示例包括但不限于，双链DNA，单链DNA，单链DNA发夹结构，DNA/RNA杂交体，RNA (mRNA或miRNA)和RNA发夹结构。一些实施方式中，所述核酸是DNA。一些实施方式中，所述核酸是RNA。例如，游离RNA也在人血浆中出现(Tong，Y. K. Lo, Y. Μ.，Clin ChimActa，363，187-196 (2006))并且器官特异转录物的cDNA测序提供检测源自移植器官细胞的供体特异核酸的另一选择。一些实施方式中，使用从血液中循环细胞收集的核酸。
一些实施方式中，基因分型包括检测和定量多态标记。多态标记的示例包括单核苷酸多态性(SNP’ S)，限制性片段长度多态性(RFLP’ S)，可变数目串联重复(VNTR’ S)，短串联重复(STR)，超变区，小卫星，二核苷酸重复，三核苷酸重复，四核苷酸重复，简单重复序列，和插入元件例如Alu。一些实施方式中，基因分型包括检测和定量STRs。一些实施方式中，基因型包括检测和定量VNTR。
一些实施方式中，基因分型包括检测和定量SNP。不希望限于任何理论，如果充分进行基因分型，任何供体和受体在约3百万SNP位点不同。可使用的SNP对受体必须是纯合子，并理想上对供体也是纯合子。而大部分这些位点会包括对供体或受体杂合的SNP,超过10%(或成百上千)对供体和受体都是纯合子，意味着SNP位点的直接读取能区分受体DNA和供体DNA。例如，移植供体和移植受体基因分型后，使用本领域已知的包括本文所述在内的现存基因型检测平台，能在移植供体和移植受体之间鉴定大约一百二十万个总变化。可用SNP可以包括约500，000个杂合供体SNP和约160，000个纯合供体SNP。公司(例如应用生物系统公司(Applied Biosystems, Inc.))目前提供用于SNP基因型的标准和定制TaqMan探针装置，能原则上靶向任何基于PCR分析的所需SNP位置(Livak，K. L. ,Marmaro,J. , Todd, J. A. , Nature Genetics, 9, 341-342 (1995) ；De La Vefa, F. M. , Lazaruk, K. D.,Rhodes, M. D. , ffenz, M. H. , Mutation Research, 573,111-135 (2005))。有这种大潜在 SNP库来从现存或定制探针的合适子集中选择，能选定用作任何供体/受体对的探针组。一些实施方式中，从血浆或其他生物样品中回收的核酸的数字PCR或实时PCR可以直接定量样品中可见的供体特异种类的百分比。一些实施方式中，从血浆或其他生物样品中回收的核酸的测序可以直接定量样品中可见的供体特异种类的百分比。一些实施方式中，阵列可用于从血浆或其他生物样品中回收的核酸以直接定量样品中可见的供体特异种类的百分比。
由于对患者样品中任何个体核酸(例如SNP)的期望读取数低，在分析前需要一些样品物质的预扩增以增加信号水平，但是使用预扩增，更多靶核酸位置取样(例如SNP位置)，或两者，会提供移植供体核酸部分的可靠读取。预扩增能用本领域已知的任何合适方法进行，例如多重置换扩增(MDA)(Gonzalez 等 Envircon Microbiol ；7(7) ；1024-8(2005))或巢式PCR方法中用外引物扩增。这可以检测和分析供体核酸，尽管样品(例如移植患者的血液)中供体核酸总量只达到 I μ g, 500ng, 200ng, IOOng, 50ng, 40ng, 30ng, 20ng, IOng, 5ng,lng, 500pg, 200pg, IOOpg, 50pg, 40pg, 30pg, 20p, IOpg, 5pg,或 Ipg 或者在 15 μ g, 510 μ g,或1050 μ g 间。
a. PCR
供体和受体核酸的基因分型和/或检测，鉴定和/或定量移植后供体特异核酸(例如多态标记如SNP)能用PCR完成。能用于检测，鉴定和/或定量供体特异核酸的PCR技术示例包括但不限于定量PCR，荧光定量PCR (QF-PCR)，多重荧光PCR (MF-PCR)，实时PCR(RT-PCR)，单细胞 PCR，限制性片段长度多态性 PCR (PCR-RFLP)，PCR-RFLP/RT-PCR-RFLP，热启动PCR,巢式PCR,原位菌落(polonony)PCR,原位滚环扩增(RCA),桥式PCR, picotiterPCR和乳剂PCR。其他合适扩增方法包括连接酶链反应(LCR)，转录扩增，自我维持的序列复制， 靶多核苷酸序列选择性扩增，共有序列引物聚合酶链反应(CP-PCR)，随机引物聚合酶链反应(AP-PCR)，简并寡核苷酸引物PCR (DOP-PCR)和基于核酸序列的扩增(NABSA)。能用于扩增特定多态性基因座的其他扩增方法包括美国专利号5，242，794，5，494，810，4，988，617和6，582，938所述方法。一些实施方式中，检测，鉴定和/或定量供体特异核酸(例如多态标记如SNP)用实时PCR完成。
一些实施方式中，数字PCR或实时PCR定量已在移植前起始基因分型步骤中鉴定的特定多态性的出现。与一些早期引用工作使用的定量PCR技术相比，数字PCR是更加精确和可靠的方法，用于定量包括稀有核酸种类在内的核酸种类，并且不需要供体和受体之间的特定性别关系。(Warren, L.，Bryder, D.，Weissman, I. L.，Quake, S. R.，Proc Natl AcadSci, 103，17807-17812 (2006))。一些实施方式中，可采用数字PCR或实时PCR分析在移植患者中用靶向数个SNP探针来定量供体DNA部分。
b.测序
供体和受体核酸的基因分型和/或检测，鉴定和/或定量移植后供体特异核酸(例如多态标记如SNP)能用测序例如全基因组测序或外显子组测序完成。测序能用本领域熟知的经典桑格(Sanger )测序法完成。测序也能使用高通量系统完成，其中一些可在测序核苷掺入延长链之后或掺入时立即加以检测，例如红色时间或基本实时的序列检测。一些实施方式中，高通量测序每小时产生至少1，000，至少5，000，至少10，000，至少20，000，至少30，000，至少40，000，至少50，000，至少100，000或至少500，000序列读取，每个读取有至少50，至少60，至少70，至少80，至少90，至少100，至少120，或至少150碱基。测序能用本文所述核酸完成，例如基因组DNA，从RNA转录物或RNA作为样板获得的cDNA。
一些实施方式中，高通量测序包括使用螺旋生物科学公司(Helicos BioSciencesCorporation，马萨诸塞州剑桥)的可用技术，例如合成方法的单分子测序(SMSS)。SMSS有独特性，因为它可以测序整个人基因组，而不需要预扩增步骤。因此降低核酸检测中的变形和非线性。这种测序方法也可在基本实时或实时测序中检测SNP核苷。最后，如上所述， SMSS强效，因为如MIP技术，它不需要杂交前的预扩增步骤。事实上，SMSS不需要任何扩增。SMSS 部分描述于美国公开申请号 20060024711 ；20060024678 ；20060012793 ；20060012784 ；和 20050100932。
一些实施方式中，高通量测序包括使用454生命科学公司(康涅狄格州布兰福德)的可用技术，例如包括光纤板的Pico Titer板,其传送由设备中CCD照相机记录的测序反应产生的化学发光信号。光纤的使用可以在4. 5小时内检测最少2千万碱基对。
珠扩增后光纤检测的方法描述于Marguiles, M.等，“Genome sequencing inmicrofabricated high-density pricolitre reactors (微型高密度 pricolitre 反应器的基因组测序)”，Nature, doi:10. 1038/nature03959 ;以及美国公开申请号 20020012930 ；20030058629 ；20030 1001 02 ；20030 148344 ；20040248 161 ；20050079510,20050124022 ;和 20060078909。
一些实施方式中，高通量测序使用克隆单分子芯片(Solexa公司)或使用可 逆中止化合化学物染料的边合成边测序(SBS)完成。这些技术部分描述于美国专利号6，969，488 ；6，897，023 ;6，833，246 ;6，787，308 和美国公开申请号 20040106130 ；20030064398 ；20030022207 ;和 Constans, A, The Scientist 2003，17 (13):36。
此方面的一些实施方式中，RNA或DNA的高通量测序能使用AnyDot芯片(德国Genovoxx)完成，它可以监控生物过程(例如miRNA表达或等位基因变化性(SNP检测))。特别的，AnyDot芯片使得核苷荧光信号检测提高10x-50x。AnyDot芯片和其使用方法部分描述于国际公开申请号 WO 02088382, WO 03020968, WO 0303 1947, WO 2005044836, PCTEP05105657，PCMEP05105655 ;和德国专利申请号 DE 101 49 786，DE 102 14 395，DE 10356 837，DE 10 2004 009 704，DE 10 2004 025 696，DE 10 2004 025 746，DE 10 2004025694，DE 10 2004 025 695，DE 10 2004 025 744，DE 10 2004 025 745，和 DE 102005012 301。
其他高通量测序系统包括描述于Venter, J.等，Science 16 February 2001 ；Adams, Μ.等，Science 24March 2000 ;和 M. J, Levene 等 Science 299:682-686, January2003 ;和美国公开申请号No. 20030044781和2006/0078937的系统。全部这些系统包括靶核酸分子测序，所述分子有通过核酸分子上测量的聚合反应短暂加入碱基的多种碱基，即，实时跟随待测序核酸分子模板上的核酸聚合酶活性。然后通过鉴定哪个碱基经每个碱基加入序列步骤的核酸聚合酶的催化活性来掺入靶核酸的延长互补链，可推断序列。在适合沿着靶核酸分子移动和在活性位点延伸寡核苷酸引物的位置提供靶核酸分子复合物的聚合酶。在活性位点附近提供多种经标记的核苷类似物类型，每一个可区分类型的核苷类似物与靶核酸序列中的不同核苷互补。通过使用聚合酶加入核苷类似物到活性位点的核酸链来延伸增长核酸链，其中加入的核苷类似物与活性位点的靶核酸的核苷互补。作为聚合步骤结果，鉴定聚合步骤产生的加入寡核苷酸引物的核苷类似物。重复提供经标记核苷类似物、聚合增长核酸链并且鉴定加入核苷类似物的步骤，从而核酸链进一步延伸并鉴定靶核酸序列。
在一些实施方式中，进行鸟枪测序。鸟枪测序中，DNA随机碎成大量小片段，使用链终止法测序来获得读取。靶DNA的多个重叠读取通过几轮分裂和测序完成。然后计算机程序使用不同读取的重叠末端将其组装成连续序列。
一些实施方式中，发明提供使用测序检测和定量SNP的方法。这种情况可以估计检测灵敏度。灵敏度有两个组成(i)分析的分子数目(测序深度)和(ii)测序过程的错误率。关于测序深度，个体之间变化的频率估计是约千分之一碱基差异。目前，测序仪如Illumina基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)已经读取超过36碱基对长度。不希望限于任何理论或具体实施方式
，这意味着30个分析分子中约一个有潜在SNP。而受体血液中的供体DNA部分目前不能很好确定且取决于器官类型，可以根据心脏移植患者的文献和应用研究取1%作为基线预测。作为此供体DNA部分，3，000个分析分子中约有I个来自供体并提供关于供体基因型的信息。基因组分析仪上，每个分析通道能得到约I千万分子，并且每次设备运行有8个分析通道。因此，如果每个通道加载一个样品，应该能检测鉴定来自供体来源的约3000个分子，使用上述参数足以精确测定供体DNA部分。如果通过要求检测至少100个供体分子来确立此方法灵敏度下限，那么当供体部分小至O. 03%时，应该有能够检测供体分子的灵敏度。更高灵敏度能简单通过测序更多分子得到，即使用更多通道。
测序错误率也影响此技术的灵敏度。对于平均错误率ε，误读引起的偶然鉴定为供体来源的单SNP几率约为ε/3。对每一个单独读取，这建立能确定读取是由于供体或是受体的灵敏度下限。碱基替换的典型测序错误率在不同平台上不同，但是为O. 5-1.5%。这 使得灵敏度潜在限度为O. 16-0. 50%。然而，通过多次重新测序样品模板能系统性降低测序错误率，如螺旋生物科学(Harris，T. D等，Science，320，106-109 (2008))所证明。重新测序的单独应用会使供体SNP检测的期望错误率降低到ε 2/9或少于.003%。
图5显示发明的一个实施方式，一种监控所有患者的通用方法(即不只是接受男性器官的女性患者)用于测定移植状态或结果。供体和受体的基因型能建立单核苷酸多态性(SNP)分布以检测供体DNA。分析所观察的独特SNP，血浆中游离DNA的鸟枪测序可定量％供体DNA。而考虑到成百上千或更多信号，任何单独SNP难以检测血浆中如此少的DNA，高灵敏度应可行。
c.阵列
供体和受体核酸的基因分型和/或检测，鉴定定和/或定量移植后供体特异核酸(例如多态标记如SNP)能用阵列(例如SNP阵列)完成。使用能观察收集数据强度的扫描仪以及检测和定量核酸的软件，可呈现结果。这些方法部分公开于美国专利号6，505，125。本发明设想的检测和定量核酸的另一种方法涉及使用Illumina公司(圣地亚哥)市售可得珠并描述于美国专利号7，035, 740 ;7033，754 ;7，025, 935，6，998，274 ;6，942，968 ;6，913，884 ;6，890，764 ;6，890，741 ;6，858，394 ;6，812，005 ；6，770，441 ;6，620，584 ；G, 544，732 ;6，429，027 ;6，396，995 ;6，355，431 和美国公开专利号 20060019258 ；0050266432 ；20050244870 ；20050216207 ；20050181394 ；20050164246 ；20040224353 ；20040185482 ；20030198573 ；20030175773 ；20030003490 ；20020187515 ；和20020177141 ;和 B. E. Stranger 等，Public Library of Science-Genetics, I (6), 2005 年12 月；Jingli Cai 等，Stem Cells, 2005 年 11 月 17 日在线发表；C. M. Schwartz 等，StemCells and Development, f4,517-534, 2005 ；Barnes, M. , J.等，Nucleic Acids Research,33 (181，5914-5923，2005 年 10 月；和 Bibikova M 等，Clinical Chemistry，第 50 卷，12期，2384-2386，2004年12月。珠阵列RNA制备的其他描述见Kacharmina JE等，MethodsEnzymol,303:3-18,1999 ；Pabon C 等，Biotechniques 31 (4) :8769, 2001 ；Van Gelder RN等，Proc Natl Acad Sci USA87:1663-7 (1990);和 Murray，SS. BMC Genetics B (增刊
I):SX5 (2005)。
当根据本文所述方法分析SNP时，移植供体和/或受体核酸能进行标记并与DNA微阵列杂交(例如IOOK设置阵列或其他阵列)。可用能观察收集数据强度的扫描仪和软件“呼叫”每个分析位置存在的SNP来观察结果。使用数据h m图阵列检测基因型的计算机执行方法公开于，例如，Liu等，Bioinformaticsl9:2397-2403, 2003 JPDi等，Bioinformatics 21:1958-63, 2005。使用图阵列数据连锁分析的计算机执行方法公开于，例如，Ruschendorf 和 Nusnberg, Bioinfonnatics 21:2123-5, 2005 ；和 Leykin 等，BMCGenet. 6:7,2005 ;和美国专利号 5，733，729。
此方面的在一些实施方式中，用于检测SNP的基因型微阵列能与分子倒置探针(MIPS)联用，如描述于 Hardenbol 等，Genome Res. 15 (2) : 269-275，2005，Hardenbol,P 等 Nature Biotechnology 21(6),673-8, 2003 ；Faham M 等，Hum Mol Genet. 8 月 I ;10 (16):1657-64, 2001:Maneesh Jain 博士 等，Genetic Engineering News V24:18号，2004 ；和 Fakhrai-Rad H 等，Genome Res. 7 月；14(7) : 1404-12，2004 ;和美国专利号5，858，412。使用定制MlP板操作这种基因座特定基因分型的通用标签阵列和试剂 盒可获自昂飞(Affymetrix)和ParAllele公司。MIP技术包括使用单个实验中分数多至 10，000:20，000，50，000 ;100，000 ;200，000 ;500，000 ;1，000，000 ;2，000，000 或5，000，000SNP (靶核酸)的酶反应。所述酶反应对多个探针分子间的交叉反应性不敏感，并且不需要基因组DNA和探针杂交前的预扩增。在任何实施方式中，靶核酸或SNP能从单个细胞获得。
本发明设想的检测靶核酸的另一种方法涉及珠阵列的使用(例如，如Illumina公司的市售可得芯片)，描述于美国专利号7, 040，959 ;7，035，740 ;7033，754 -J, 025，935，6，998，274 ;6，942，968 ;6，913，884 ;6，890，764 ;6，890，741 ;6，858，394 ;6，846，460 ；6，812，005 ;6，770，441 ;6，663，832 ;5，520，584 ;6，544，732 ;6，429，027 ;6，396，995 ；6，355，431 m d 美国公开申请号 20060019258 ；20050266432 ；20050244870 ；20050216207 ；20050181394 ；20050164246；20040224353 ；20040185482 ；20030198573 ；200301 75773 ；20030003490 ；20020187515 ；和 20020177141 ;和 Shen, R.等 Mutation Research 57370-82 (2005)。
d.其他技术
本文的一些实施方式中，定量核酸。定量核酸的方法为本领域已知，包括但不限于气相色谱，超临界流体色谱，液相色谱(包括分配色谱，吸附色谱，离子交换色谱，尺寸排阻色谱，薄层色谱和亲和层析)，电泳(包括毛细管电泳，毛细管区带电泳，毛细管等电聚焦，毛细管电色谱，胶束电动毛细管色谱法，毛细管等速电泳，瞬时等速电泳和毛细管凝胶电泳)，比较基因组杂交(CGH)，微阵列，珠阵列，和高通量基因分型，例如使用分子倒置探针(MIP)0
本发明设想的检测和/或定量靶核酸的另一种方法涉及纳米报告器(nanoreporter)的使用，描述于题为 “Methods for detection and quantification ofanalytes in complex mixtures (复杂混合物中分析物的检测和定量方法)”的美国专利7，473，767,题为“Methods for detection and quantification of analytes in complexmixtures (复杂混合物中分析物的检测和定量方法)”的美国专利公开号2007/0166708，题为 “Compositions comprising oriented, immobilized macromolecules and methodsfor their preparation (包括定向固定大分子的组合物和其制备方法)”的美国申请号11/645，270,题为“Nanoreporters and methods of manufacturing and use thereof (纳米报告器和其生成方法及应用)”的PCT申请号US06/049274，
靶核酸定量能用于测定供体核酸例如DNA的百分比。
e.标记
靶核酸的检测和/或定量能用本领域已知的荧光染料完成。通常荧光染料可以分成几个家族，例如荧光素及其衍生物；罗丹明及其衍生物；菁蓝及其衍生物；香豆素及其衍生物；Cascade Blue 及其衍生物；荧光素黄及其衍生物；氟化硼络合二吡咯甲川(BODIPY)及其衍生物等。荧光团的示例包括吲哚碳菁(C3)，吲哚二碳菁(C5)，Cy3，Cy3. 5，Cy5, Cy5. 5, Cy7,德克萨斯红,太平洋蓝，俄勒网绿 488, Alexa Fluor-355, Alexa Fluor488,Alexa Fluor532, Alexa Fluor546, Alexa Fluor555, Alexa Fluor568, Alexa Fluor594,Alexa Fluor647, Alexa Fluor660, Alexa Fluor680, JOE, _丝胺，罗丹明绿，B0DIPY,异硫氰酸荧光素(FITC)，羧基荧光素(FAM)，藻红蛋白，罗丹明，二氯罗丹明(dichlororhodamine)(dRhodamine ),羧基四甲基罗丹明(TAMRA ),羧基-X-罗丹明(R0X. TM. )，LIZ , VIC ,NED , PET , SYBR, PicoGreen, RiboGreen 等。荧光团和其使用的描述可见 R. Haugland，Handbook of Fluorescent Probes and Research Products (《突光探针和研究产物手册》)，第 9 增补版(2002), Molecular Probes (《分子探针》)，Eugene, Oreg. ;Μ· Schena,Microarray Analysis (《微阵列分析》)(2003),约翰威利出版公司John ffiley&Sons,Hoboken, N. J.;合成药物化学公司(Synthetic Medicinal Chemistry) 2003/2004 产品目录，Berry 和同事，Ann Arbor,Mich. ；G. Hermanson,Bioconjugate Techniques (《生物结合技术》)，学术出版社(Academic Press) (1996);和弗吉尼亚州斯特灵的格伦研究公司(GlenResearch) 2002年产品目录。近红外染料显然在术语荧光团和荧光报道基团的意义内。
本发明的另一个方面，支链DNA (bDNA)方法用于增加检测灵敏度。一些实施方式中，bDNA方法用于阵列检测分析。阵列检测分析可以是本领域已知的任何阵列分析，包括本文所述阵列分析。bDNA方法通过连接几十乃至几百碱性磷酸酶分子的支链DNA扩大信号。因此，当维持最初核酸目标丰度保真度时，信号明显扩大。
方法
发明的一个方面提供诊断或预测接受移植物对象的移植状态或结果的方法。移植状态或结果可以包括排斥，耐受性，基于非排斥的移植损伤，移植功能，移植存活，慢性移植损伤，或免疫抑制药理学效价。基于非排斥的同种异体移植损伤示例包括但不限于，缺血损伤，病毒感染，围手术期缺血，再灌注损伤，高血压，生理应激，活性氧自由基造成的损伤和药物试剂造成的损伤。移植状态或结果可包括移植器官的血管并发症或肿瘤发生。
在一些实施方式中，发明提供诊断或预测移植状态或结果的方法，所述方法包括以下步骤(i )提供接受供体移植物的对象的样品；(ii )测定是否存在来自供体移植的一个或多个核酸，其中供体的一个或多个核酸根据预定标记分布鉴定jP(iii)根据是否存在来自所述供体的一个或多个核酸来诊断或预测移植状态或结果。
在一些实施方式中，发明的方法用于移植前建立供体和受体两者的基因型。在一些实施方式中，移植前建立供体和受体两者的基因型可以如本文所述在移植后器官受体的体液(例如血液或尿液)中检测供体特异核酸例如DNA或RNA。在一些实施方式中，供体标记分布根据移植供体的基因分型确定。在一些实施方式中，移植受体的标记分布根据移植受体基因分型确定。在一些实施方式中，标记分布通过选择区分移植供体和接受移植对象的标记来建立。这种方法可对仅来自以独立于供体和受体性别的方式完成器官移植的核酸进行可靠鉴定。
移植供体和/或移植受体的基因分型可以由本领域已知的任何合适方法进行，包括本文所述方法例如测序、核酸阵列或PCR。在一些实施方式中，移植供体和/或移植受体的基因分型用鸟枪测序完成。在一些实施方式中，移植供体和/或移植受体的基因分型用DNA阵列完成。在一些实施方式中，移植供体和/或移植受体的基因分型用多态性阵列例如SNP阵列完成。
一些实施方式中，标记分布是多态标记分布。多态标记分布包括一种或多种单核苷酸多态性(SNP’S)，一种或多种限制性片段长度多态性(RFLP’S)，一种或多种短串联重复(STR)，一种或多种可变数目串联重复(VNTR’S)，一个或多个超变区，一个或多个小卫星，一个或多个二核苷酸重复，一个或多个三核苷酸重复，一个或多个四核苷酸重复，一个 或多个简单重复序列，或一个或多个插入元件。一些实施方式中，标记分布包括至少I ;2 ；
3；4 ；5 ;10，20 ；50 ；100 ；200 ；500 ;1，000 ;2，000 ;5，000 ;10，000，20，000 ;50，000 ;100，000 ；200，000 ;300，000 ;400，000 ;500，000 ;600，000 ;700，000 ;800，000 ;900，000 ;1，000，000 ；2，000, 000或3，000, 000种不同多态标记。
—些实施方式中，多态标记分布包括一种或多种SNP。一些实施方式中，标记分布包括至少 I ；2 ；3 ；4 ；5 ;10，20 ；50 ；100 ；200 ；500 ;1，000 ;2，000 ;5，000 ;10，000，20，000 ；50，000 ;100，000 ;200，000 ;300，000 ;400，000 ;500，000 ;600，000 ;700，000 ;800，000 ；900，000 ;1，000，000 ;2，000，000 或 3，000，000 种不同 SNP。
移植之后，可从患者获取上述样品并分析是否存在来自移植供体的一个或多个核酸。在一些实施方式中，所述样品是血液，血浆，血清或尿液。供体核酸比例和/或数量能随着时间监控，且此比例增加能用于确定移植状态或结果(例如移植排斥)。
移植受体是否存在来自移植供体的一个或多个核酸可以由本领域已知的任何合适方法测定，包括本文所述方法例如测序，核酸阵列或PCR。一些实施方式中，移植受体是否存在来自移植供体的一个或多个核酸由鸟枪测序确定。一些实施方式中，移植受体是否出存在来自移植供体的一个或多个核酸由DNA阵列测定。一些实施方式中，移植受体是否存在来自移植供体的一个或多个核酸用多态性阵列例如SNP阵列测定。
在所述移植是异种移植的一些实施方式中，供体特异标记的检测、鉴定和/或定量能通过对物种基因组的一个或多个核酸(例如DNA)作图来完成，以确定一个或多个核酸是否来自移植供体。上述多态标记也能用于移植是异种移植的情况。
一些实施方式中，移植受体是否存在来自移植供体的循环DNA或RNA可用于测定移植状态或结果。DNA可以是双链DNA，单链DNA，单链DNA发夹结构，或cDNA。RNA可以是单链RNA或RNA发夹结构。一些实施方式中，移植受体是否存在来自移植供体的循环DNA/RNA杂交体可用于测定移植状态或结果。一些实施方式中，移植受体是否存在来自移植供体的循环mRNA可用于测定移植状态或结果。一些实施方式中，移植受体是否存在来自移植供体的循环DNA可用于测定移植状态或结果。一些实施方式中，cDNA用于测定移植状态或结果。DNA或RNA能从循环供体细胞中获得。或者，DNA或RNA可以是循环游离DNA或循环游离 RNA。[0125]本文所述的任何一个实施方式中，移植可以是任何固体器官和皮肤移植。移植状态或结果能用本文所述方法测定的移植示例包括但不限于，肾移植，心脏移植，肝移植，胰腺移植，肺移植，肠移植和皮肤移植。
一些实施方式中，发明提供测定患者或对象是否显示移植耐受性的方法。一些实施方式中，发明提供诊断或预测移植排斥的方法。术语“移植排斥”包括急性和慢性移植排斥。一些实施方式中，发明还包括确定接受移植物例如同种异体移植物的对象的免疫抑制方案的方法。一些实施方式中，发明还包括测定接受移植物对象的免疫抑制方案效果的方法。发明的某些实施方式提供预测接受移植物对象的移植存活的方法。发明提供诊断或预测移植患者或对象的移植物是存活或是丧失的方法。某些实施方式中，发明提供诊断或预测出现长期移植物存活的方法。一些实施方式中，发明提供诊断或预测基于非排斥移植损伤的方法。基于非排斥移植损伤的示例包括但不限于，缺血损伤，病毒感染，围手术期缺血，再灌注损伤，高血压，生理应激，活性氧自由基造成的损伤和药物试剂造成的损伤。一些实施方式中，发明提供诊断或预测移植器官的血管并发症或肿瘤发生的方法。、
—些实施方式中,移植受体样品中来自移植供体的一个或多个核酸量用于测定移植状态或结果。因此，一些实施方式中，发明方法还包括定量来自移植供体的一个或多个核酸。一些实施方式中，来自供体样品的一个或多个核酸量测定为样品中总核酸的百分比。一些实施方式中，来自供体样品的一个或多个核酸量测定为样品中总核酸的比例。一些实施方式中，来自供体样品的一个或多个核酸量测定为相较样品中一个或多个参比核酸的比例或百分比。例如，来自移植供体的一个或多个核酸量能测定为样品中总体核酸的10%。或者，来自移植供体的一个或多个核酸量相较样品中总核酸的比例可以为1:10。此外，来自移植供体的一个或多个核酸量能测定为10%的参比基因例如β-球蛋白或与之比例为1:10。一些实施方式中，来自移植供体的一个或多个核酸量可测定为浓度。例如，供体样品的一个或多个核酸量能测定为lug/mL。
一些实施方式中，高于预定阈值的一种或多种移植供体核酸量指示移植状态或结果。例如，能测定移植后没有移植物排斥或其他病变迹象的临床稳定患者的标准值。高于移植后临床稳定患者标准值的一种或多种移植供体核酸量增加能指示移植状态或结果例如移植排斥或移植损伤的变化。另一方面，低于或处在移植后临床稳定患者标准值的一个或多个移植供体核酸量能指示移植耐受或移植存活。
一些实施方式中，不同的预定阈值指示不同的移植结果或状态。例如，如上面所讨论，高于移植后临床稳定患者标准值的一个或多个移植供体核酸量增加能指示移植状态或结果例如移植排斥或移植损伤的变化。然而，高于移植后临床稳定患者标准值，但是低于预定阈值的一个或多个移植供体核酸量增加可以指示不太严重的病症，例如病毒感染而不是移植排斥。大于更高阈值的一个或多个移植供体核酸量增加可以指示移植排斥。
一些实施方式中，来自移植供体的所述一个或多个核酸量的暂时差异指示移植状态或结果。例如，移植患者能随着时间监控以测定移植供体的一个或多个核酸量。来自移植供体的一个或多个核酸量暂时增加，随后恢复到正常值，可以指示不太严重的病症而不是移植排斥。另一方面，来自移植供体的一个或多个核酸量持续增加可以指示严重病症例如移植排斥。
一些实施方式中，来自移植供体的所述一个或多个核酸量的暂时差异能用于监控免疫抑制治疗的效果或选择免疫抑制治疗。例如，来自移植供体的一个或多个核酸量能在免疫抑制治疗之前和之后测定。治疗后移植供体的一个或多个核酸降低可以指示所述治疗成功防止移植排斥。或者，来自移植供体的一个或多个核酸量能用于选择免疫抑制治疗，例如不同强度的免疫抑制治疗。例如，来自移植供体的一个或多个核酸量更高可以指示需要非常强力的免疫抑制剂，而移植供体的一个或多个核酸量更低可以指示使用不太强力的免疫抑制剂。
发明提供敏感且特异的方法。一些实施方式中，本文所述诊断或预测移植状态或结果的方法有至少56%，60%, 70%, 80%, 90%, 95%或100%灵敏度。一些实施方式中，本文所述方法有至少56%灵敏度。一些实施方式中,本文所述方法有至少78%灵敏度。一些实施方式中，本文所述方法有约70%-约100%特异性。一些实施方式中，本文所述方法有约80%-约100%特异性。一些实施方式中，本文所述方法有约90%-约100%特异性。一些实施方式中，本文所述方法有约100%特异性。
本文也提供方法筛选和鉴定识别能用于本文所述方法的供体核酸的标记，例如诊断或预测移植状态或结果。一些实施方式中，供体核酸是游离DNA或从循环供体细胞中分离的DNA。
供体核酸能用本文所述方法鉴定，包括实施例中描述的方法。鉴定这些之后，可以观察供体核酸和检测其与移植状态和结果的相关性，例如慢性移植损伤、排斥和耐受。一些实施方式中，研究供体核酸的纵向改变。如果临床明显，这些水平可以跟随免疫抑制药理学效价，或作为耗尽靶标加以研究。
试剂盒
也提供试剂和其试剂盒以使用一个或多个上述描述方法。对象试剂和其试剂盒可有很多变化。感兴趣的试剂包括特定设计用于上述生成的试剂(i)移植供体和移植受体的基因型；(ii)标记分布的鉴定jP(ii)检测和/或定量获自移植受体样品的一个或多个移植供体核酸。
一种这类试剂是一个或多个探针或探针阵列以用于基因分型和/或检测和/或定量一个或多个核酸。各种不同阵列形式为本领域已知，有多种不同探针结构、底物组合物和连接技术。
对象发明的试剂盒可以包括上述阵列。这些试剂盒可额外包括一种或多种治疗齐U。试剂盒还包括数据分析软件包，包括用于与检测分布比较的参考分布。
试剂盒可以包括试剂例如缓冲液，和水。试剂盒可以包括使用本文所述方法例如PCR和测序进行核酸提取和/或核酸检测所需的试剂。
这些试剂盒也可以包括信息，例如科学参考文献，说明书材料，临床试验结果，和/或这些概述等，可以指示或建立组合物活性和/或优点，和/或描述剂量，给药，副作用，药物相互作用，或其他对医疗服务人员有用的信息。试剂盒也可以包括数据库访问指令。这些信息可根据不同研究结果，例如使用涉及体内模型的实验动物的研究和根据人临床试验的研究。可提供本文所述试剂盒，销售和/或推销给卫生工作者，包括医师、护士、药剂师、处方人员等。一些实施方式中，试剂盒也可直接销售给消费者。
计算机程序上述任何方法能用包括计算机可读介质记录的计算机可执行逻辑的计算机程序产品完成。例如，计算机程序能执行以下功能的一些或全部(i)控制从样品中分离核酸，
(ii)从样品中预扩增核酸，(iii)扩增，测序或排列样品中的特定多态性区域，(iv)鉴定和定量样品中的标记分布，(V)比较样品中检测的标记分布数据和预定的阈值，(Vi)测定移植状态或结果，(Vi)宣布正常或不正常移植状态或结果。特别的，计算机可执行逻辑能分析多态性(例如SNP)检测和定量的数据。
计算机可执行逻辑能在任何计算机上工作，所述计算机可以是多种通用计算机类型中的任一种，例如个人计算机、网络服务器、工作站、或其他现在或稍后开发的计算机平台。一些实施方式中，计算机程序产品描述包括其中存储有计算机可执行逻辑(计算机软件程序，包括程序代码)的计算机使用介质。计算机可执行逻辑能通过处理器执行，使得处理器执行本文所述功能。另一些实施方式中，一些功能主要在硬件上完成，例如使用硬件状态机。启用硬件状态机以行使本文所述功能对相关领域技术人员显而易见。
通过访问反映移植供体和移植患者基因型的数据，和/或移植后移植患者循环中 是否出现来自移植供体的一个或多个核酸，程序能提供评价移植受体中移植状态或结果的方法。
一个实施方式中，计算机执行本发明的计算机逻辑也可包括数字输入设备，例如扫描仪。数字输入设备能提供核酸信息，例如多态性水平/数量。例如，本发明扫描仪能根据本文方法提供多态性图像(例如SNP)。例如，扫描仪能通过检测荧光，放射性物质，或其他发射；通过检测传输，反射，或散射辐射；通过检测电磁属性或其他特性；或通过其他技术来提供图像。检测数据通常以数据文件形式存储在存储设备上。一个实施方式中，扫描仪可鉴定一个或多个标记靶标。例如，第一 DNA多态性可标记有在特定特征频率发荧光的第一染料，或响应特定频率激发源的窄带频率。第二 DNA多态性可标记有在不同特征频率发荧光的第二染料。第二个染料的激发源可以但不必须具有与激发第一染料不同的特征频率，例如激发源可以是相同的或不同的激光。
—些实施方式中，发明提供计算机可读介质,包括记录其上的一组指令以使计算机执行以下步骤(i )从接受供体移植的对象样品中检测的一个或多个核酸接收数据，其中所述一个或多个核酸是来自所述供体移植的核酸，且其中来自所述供体的所述一个或多个核酸根据预定标记分布来鉴定jP(ii)根据是否存在一个或多个核酸来诊断或预测移植状态或结果。
实施例
实施例I :检测器官移植受体中的供体DNA
使用前述数字PCR (Warren, L.，Bryder, D.，Weissman, I. L.，Quake, S. R.，ProcNatl Acad Sci,103,17807-17812 (2006)；Fan,H. C. Quake,S. R. ,Anal Chem,79，7576-7579(2007))，就女性患者接受男性或女性心脏而言，与心内膜心肌活检测定3A或3B级排斥反应同时获取的血浆样品中定量染色体Y和染色体I标记量。
尽管血液灌注/男性小孩出生是女性患者中有可检测CY信号的已知机制，图2显示接受男性供体心脏的患者的总cY水平普遍更高。4例对照女性-女性移植患者中没有检测到显著染色体Y信号。另一方面，染色体Y信号的I. 5-8%总体基因组部分在针对3例男性-女性移植患者跨越4个排斥反应的排斥时间点观察到。[0150]血浆中染色体Y水平在一些这类患者移植后的数个时间点监控，并且与器官排斥的活检时间点作比较。对于患者6，在移植后21个月活检测得3A级排斥。血浆中检测的染色体Y水平在排斥前3个月血浆中可以忽略，但在活检确定排斥时增加>10倍到2%总基因组部分。此时观察到血浆DNA中的最高cY水平(图3)。图3的结果表明血浆中游离DNA的整体水平不诊断器官衰竭，并且不追踪“供体特异” DNA信号。
另一个患者观察到相似的趋势，当活检测定3A级排斥时，移植后5个月cY水平增力口(图4)。cY的百分比(或％ “供体”)DNA在排斥时间前增加并且在该时间最高。与上面相同，总游离DNA量看起来不诊断心脏排斥。
这些结果共同建立，对于心脏移植患者，血浆中出现源自供体的DNA可以作为器官衰竭开始的潜在标记。
实施例2 :移植供体和移植受体的基因分型
图5显示监控所有移植患者的通用方法。供体和受体的基因分型能建立单核苷酸多态性(SNP)分布来检测供体DNA。分析观察到的独特SNP，血浆中游离DNA的鸟枪测序可定量样品中的％供体DNA。而考虑到成百上千或更多信号，任何单独SNP难以检测血浆中如此少的DNA，高灵敏度应可行。
混合的基因型库能用两个CEU (犹他州摩门)HapMap图线创立。使用现存基因型检测平台(例如Illumina Golden Gate)已经建立这两者之间约一百二十万种总变化。可使用的SNP对受体必须是纯合子，并理想上对供体也是纯合子。可用的SNP包括(i)约500，000种杂合供体SNP (计数是总供体部分的1/2)，(ii)约160，000种纯合供体SNP。
测序结果Illumina测序的4条泳道用于比较4种不同水平的供体DNA取代受体DNA (见图6)。对于碱基替换，测序的错误率目前是约3-0. 5%。使用提高过滤SNP读取的质量分，或使用重新测序，应降低错误率和增加灵敏度。使用更多SNP定位(来自全部基因型)也应提高信号产率，方案不改变。
虽然本文显示和描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员显然了解这些实施方式仅以举例方式提供。本领域技术人员在不背离本发明的情况下可以作出多种改变、变化和取代。应理解，本文所述的本发明实施方式的各种替代形式可用于实施本发明。所附权利要求
书确定了本发明范围，这些权利要求
范围内的方法和结构以及其等同物均为本发明所覆盖。
权利要求
1.一种诊断或预测移植状态或结果的方法，所述方法包括 提供接受了供体移植的对象的样品； 确定是否存在一个或多个来自所述供体移植的核酸，其中，来自所述供体的所述一个或多个核酸是根据预定的标记分布鉴定；和 根据是否存在所述一个或多个核酸来诊断或预测移植状态或结果。
2.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述移植状态或结果包括排斥，耐受性，非排斥的同种异体移植物损伤，移植功能，移植存活，慢性移植损伤，或免疫抑制药理学效价。
3.如权利要求
2所述的方法，其特征在于，所述基于非排斥的同种异体移植物损伤选自下组缺血损伤，病毒感染，围手术期缺血，再灌注损伤，高血压，生理应激，活性氧自由基造成的损伤和药物试剂造成的损伤。
4.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述样品选自血液，血清，尿液，和粪便。
5.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述标记分布是多态标记分布。
6.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述多态标记分布包括一种或多种单核苷酸多态性(SNP’S)，一种或多种限制性片段长度多态性(RFLP’S)，一种或多种短串联重复(STR)，一种或多种可变数目串联重复(VNTR' S)，一个或多个超变区，一个或多个小卫星，一个或多个二核苷酸重复，一个或多个三核苷酸重复，一个或多个四核苷酸重复，一个或多个简单重复序列，或一个或多个插入元件。
7.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述多态标记分布包括一种或多种SNP。
8.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述移植选自肾移植，心脏移植，肝移植，胰腺移植，肺移植，肠移植和皮肤移植。
9.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述核酸选自双链DNA，单链DNA，单链DNA发夹结构，DNA/RNA杂交体，RNA和RNA发夹结构。
10.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述核酸选自双链DNA，单链DNA和cDNA。
11.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述核酸是mRNA。
12.如权利要求
9-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸得自循环供体细胞。
13.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述核酸是循环游离DNA。
14.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述一个或多个核酸是否存在由选自测序、核酸阵列和PCR的方法确定。
15.如权利要求
14所述的方法，其特征在于，所述测序是鸟枪测序。
16.如权利要求
14所述的方法，其特征在于，所述阵列是DNA阵列。
17.如权利要求
16所述的方法，其特征在于，所述DNA阵列是多态性阵列。
18.如权利要求
17所述的方法，其特征在于，所述多态性阵列是SNP阵列。
19.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述方法还包括定量所述一个或多个核酸。
20.如权利要求
19所述的方法，其特征在于，所述一个或多个核酸的量可指示移植状态或结果。
21.如权利要求
20所述的方法，其特征在于，所述一个或多个核酸的量高于预定阈值可指示移植状态或结果。
22.如权利要求
21所述的方法，其特征在于，所述阈值是没有移植排斥或其他病变迹象的移植后临床稳定患者的标准值。
23.如权利要求
21所述的方法，其特征在于，所述不同的移植结果或状态有不同的预定阈值。
24.如权利要求
20所述的方法，其特征在于，所述一个或多个核酸量的短暂差异可指示移植状态或结果。
25.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述标记分布由所述移植供体的基因型确定。
26.如权利要求
25所述的方法，其特征在于，所述方法还包括接受所述移植的所述对象的基因分型。
27.如权利要求
26所述的方法，其特征在于，所述方法还包括建立标记式样分布，其中所述标记在所述移植供体和接受所述移植的所述对象之间可区分。
28.如权利要求
25-27中任一项所述的方法，其特征在于，所述基因分型用选自测序、核酸阵列和PCR的方法完成。
29.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述方法有至少56%灵敏度。
30.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述方法有至少78%灵敏度。
31.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述方法有约70%-约100%特异性。
32.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述方法有约80%-约100%特异性。
33.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述方法有约90%-约100%特异性。
34.如权利要求
I所述的方法，其特征在于，所述方法有约100%特异性。
35.一种计算机可读介质，所述介质包括 在其上记录的一组指令，使计算机执行以下步骤 (i)接收来自接受了供体移植的对象样品中测得的一个或多个核酸的数据，其中，所述一个或多个核酸是来自所述供体移植的核酸，且其中来自所述供体的所述一个或多个核酸根据预定的标记分布来鉴定；和 (ii)根据是否存在所述一个或多个核酸来诊断或预测移植状态或结果。
专利摘要
本发明提供用于诊断或预测接受移植的对象的移植状态或结果的方法、设备、组合物和试剂盒。所述方法包括确定是否存在一个或多个来自所述供体移植的核酸，其中，来自所述供体的所述一个或多个核酸是根据预定的标记分布鉴定，和根据是否存在所述一个或多个核酸来诊断或预测移植状态或结果。
文档编号C12Q1/68GKCN102712954SQ201080060469
公开日2012年10月3日 申请日期2010年11月5日
发明者H·瓦朗坦, S·R·奎克, T·M·斯尼德 申请人:小利兰·斯坦福大学托管委员会导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan