专利名称：：实体器官移植慢性排斥的预防的制作方法
技术领域：
：本发明属于实体器官移植领域，特别的，属于预防所述移植器官免疫介导的排斥的更有效的方法。
背景技术：
：实体器官移植的成功受限于宿主免疫系统对移植器官的排斥。急性移植排斥是指移植后立即发生的免疫反应，慢性排斥是指长期的排斥，其特征是同种异体反应性抗体的形成、白细胞浸润和积累的移植动脉病，正如在心脏移植中看到的那样。尽管全身的整体免疫抑制能用来预防器官排斥，但是这样的整体免疫抑制使受治者暴露于被感染、癌症(诸如血癌)和包括骨质疏松、高血压、肥胖、糖尿病、伤口愈合困难、库兴氏症、情绪波动、骨髓抑制、肝功能障碍、脱发、肾毒性、心肌症、胃肠问题在内的其它不希望的并发症的可能中，特别是当长期应用整体免疫抑制来抗击慢性排斥时。对避免慢性排斥的改良实体器官移植方法的需求是存在的。IL-10是一种免疫抑制调节因子，它在外周T细胞耐受中扮演了重要的角色。已经表明，IL-10使细胞因子的生产从Thl转变为Th2，而Th2与长期存活的器官移植相关。通过抑制Thl分化细胞因子IL-12的合成，IL-10阻塞了T1的发展、细胞因子INF-Y和IL-2的生产，并因此阻止了潜在的CTL反应产生的移植破坏。也已经证明，IL-10也能通过Fas/FasL途径促进同种异体反应性T细胞的凋亡,这是移植器官存活的机制之一。另外，IL-10下调MHC类型II和APC的辅刺激因子CD40、CD80和CD86的表达。因此，在IL-10存在时带同种抗原的T细胞的反复刺激诱发了能产生具抑制活性的IL-10和TGF-P的调节性T细胞并导致了移植排斥的预防。IL-10基因治疗已经在各种移植模型(表l)中得到检验。表l中的数字是指描述相关研究的参考文献。表l器官移植中IL-10基因治疗实验(引用的文献)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>使用编码IL-10的质粒DNA和腺病毒载体的研究已经证明了IL-10在急性移植排斥中的有效性。然而，从诸如腺病毒、疱疹病毒和逆转录病毒等质粒或病毒载体获得的IL-10表达由于在移植中受限的基因转运效率和短暂的转基因表达，在延长同种异体移植中仅取得了有限的成功(3-9，15)。对于IL-10基因治疗实体器官移植的改良的方法的需求是存在的，该改良方法导致了足以降低慢性移植排斥发生可能的持续局部IL-10表达。
发明内容一方面，本发明涉及到使用带有编码诸如IL-10的免疫调节多肽的核酸序列的重组腺相关病毒(rAAV)载体来转导待移植实体器官细胞，上述核酸序列的表达降低了宿主免疫系统对移植器官的排斥的可能。在另一个实施方案中，除了rAAV转导待移植实体器官外，本发明还包含使用免疫调节剂抑制急性排斥。在一个实施方案中，免疫抑制剂在大约移植的时间给予。在另一个实施方案中，免疫抑制剂在移植前给予。在另一个实施方案中，免疫抑制剂是从包括但不限于IL-10和FK506的组中选出的一种或多种试剂。在另一个实施方案中，一旦rAAV介导的诸如IL-10的免疫调节多肽的表达开始，用免疫调节剂进行的治疗将被縮减或停止。在另一个方面，本发明涉及到在将该器官移植到受治者前，通过给予编码IL-10的rAAV载体到分离的实体器官来提高实体器官移植的效率的方法。在一个实施方案中，IL-10在给予rAAV载体后在分离的器官中的至少某些细胞中表达。在另一个实施方案中，IL-10的表达引起了Thl样到Th2样免疫反应的转变。在各个实施方案中，待转导的实体器官是心脏、肾脏、肝脏、胰岛、肺和肠。具体实施方式在一个实施例中，本发明涉及在将分离的实体器官移植到受治者前，用编码诸如IL-10的免疫调节多肽的rAAV载体处理该器官。编码免疫调节多肽的核酸序列在本文中是指转基因。在所述的移植器官的细胞和组织中的转基因表达可能会延迟或/和预防移植排斥。可能用于本发明方法中的合适免疫调节多肽包括但不限于IL-IO、IL-1抑制剂、CD-40配体抑制剂、TGF-P、GITR和FOXP3.尽管AAV载体提供了伴随轻微组织炎症的持久转基因表达，但是从AAV载体而来的转基因表达的开始通常延迟1-2周，与此相对照，腺病毒载体仅延迟几个小时。因此，可能可以同免疫调节剂组合的AAV载体的使用在大约同移植同时的时间给予，并且，在另一个实施方案中，一旦转基因表达开始，免疫调节剂就可以縮减或停止。在另一个实施方案中，一旦转基因以足以预防移植排斥的水平表达，免疫调节剂的给予就停止。如本文中所用，免疫调节剂是指任何诸如小分子、多肽或蛋白质等不被基因治疗作为转基因传递的免疫调节物质。免疫调节剂包括但不限于IL-10蛋白，FK506、环孢霉素、雷帕霉素、咪唑硫嘌呤、霉酚酸酯、环磷酰胺、来氟米特和糖皮质激素。在本发明的各个实施方案中，可以单独使用一种免疫调节剂，也可依次或同时组合使用两种或更多种免疫调节剂。根据本发明的方法，本领域的技术人员能通过动物实验或临床实验容易地确定给予免疫调节剂到接受实体器官移植的受治者的最佳时间。相类似地，本领域的技术人员能做实验来确定已知免疫调节剂中哪一种在预防急性排斥方面是最好的，直到rAAV介导的IL-10表达开始。移植器官中长期的IL-10表达是否预防了慢性排斥可通过测定在心脏移植中所见到同种异体抗体形成、白细胞浸润和积累的移植动脉病来部分测定。实施例1RAAV-IL-10在同源心脏和肾脏移植中的应用下述实验被进行来确定AAV2-大鼠IL-10(rIL-10)在同源心脏和肾脏移植中的转导效率，使用AAV空载体处理的大鼠作为对照。这个实验用于建立体外转导后移植器官中转基因rIL-10表达的开始时间、水平和持续时间。*顺行性(anterograde)/分离的心脏或肾脏在冷环境中用lX10g载体灌注20分钟。*器官移植回自体同源宿主。*转导效率在第7、14、28、56和180天时进行测定。1、DNAFISH用于转基因rlL-10DNA的测定，IF用于rlL-10蛋白在移植器官中表达的测定。2、rIL-10在包括心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏和PBMC等的各种组织中的生物分布通过PCR和RT-PCR进行测量。3、系统的rIL-10生产通过血清rIL-10水平的ELISA实验进行测量。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>实施例2RAAV-IL-10在心和肾同种异体移植中的应用下述实验被进行来确定AAV2-rIL-10转导在延长同种异体移植存活期上的效率。接受用AAV载体转导的移植器官的大鼠的组如表3中所示。在某些实验中，rIL-10蛋白作为免疫调节剂给予来度过转导和转基因表达之间的时间间隔。因为系统给予IL-10己经被证明会恶化小鼠的心脏同种异体移植排斥，因此，在其它实验中，传统的免疫调节剂FK506替代IL-10被给予，直到AAV介导的IL-10表达建立。对照实验包括非处理组；用AAV2空载体处理组；和用不含AAV载体的传统免疫调节剂处理组。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>进行下述的分析。测定移植器官存活期。测定属于单核因子的Thl细胞因子的表达来确定它们在用AAV2-rlL10转导的移植器官中是否被下调。假如需要，可以使用细胞因子蛋白质芯片来筛选更广的被IL-10调控的细胞因子谱。最后，测定作为同种异体特异T细胞的反应性的同种异体反应性抗体和白细胞浸润的水平。参考文献ZhangY-Claire,etal.Adeno-AssociatedVirus-MediatedIL-10GenTherapyInhibitsDiabetesRecurrenceinSyngenicIsletcellTransplantationofNODMiceDiabetes,52:708-716,2003GoudyKevin,etal.Adeno-Associatedvirusvector-mediatedIL-10genedeliverypreventstype1diabetesNODmice:PNAS98:13913-13918,2001SenLuyi,etal.Efficiency,efficacy,andadverseeffectsofadenovirusvs.Liposome-mediatedgenetherapyincardiacallografts.AmJPhysiolHeartCircPhysiol281:1433-1441,2001FischerStefanetal:InVivoTranstrachealAdenovirus-MediatedTransferofHumanInterleukin-10GenetoDonorLungsAmelioratesIschemia-ReperflisionInjuryandImprovesEarlyPosttransplantGraftFunctionintheRatHumanGeneTherapy12:1513-1526，2001KennethE.Drazan,etal:TransductionofHepaticAllograftAchievesLocalLevelsofViralIL-10whichSuppressAlloreactivityinVitroJournalofSurgicalResearch,59,219-223,1995ShojiFetal:Airway-directedgenetransferofinterleukin-10usingrecombinantSendaiviruseffectivelypreventspost-transplantfibrousobliterationinmiceGeneTherapy10:213-218,2003FuShuang,etal:SuppressionofAutoimmuneDiabetesbyViralIL-10GeneTransferProlongsNon-VascularizedCardiacAllograftSurvivalAmericanJournalofTransplantation3:552-567,2003YangZangong,etal:SuppressionofAutoimmuneDiabetesbyViralIL-10GeneTransferTheJournalofImmunology168:6479-6485,2002FischerStefan,etal.:Interleukin10genetransfectionofdonorlungsamelioratesposttransplantcelldeathbyaswitchfromcellularnecrosistoapoptosis:JournalofThoracicandCardiovascularSurgeryOctober:1174-1180,2003HongYooSun,etal:LocalizedImmunosuppressionintheCardiacAllograftInducedbyaNewLiposome-mediatedIL-10GenetherapyJHeartLungTransplant21:1188-1200,2002LaDeBruyne,etal:Lipid-mediatedgenetransferofviralIL-10prolongsvascularizedcardiacallograftsurvivalbyinhibitingdonor-specificcellularandhumoralimmuneresponsesGeneTherapy5:1079-1087,1998TungThomasC,etal:DualupregiilationofFasandBaxpromotesalloreactiveTcellapoptosisinIL-10genetargetingofcardiacallograftAmJPhysiolHeartCircPhysiol285;964-973,2003HongChu,etal:Non-ViralHumanIL-10GeneExpressionReducesAcuteRejectionInHeterotopicAuxiliaryLiverTransplantationInRats:Microsurgery23:432-436，2003ItanoHideki，etal:Lipid-mediatedexvivogenetransferofviralinterleukin10inratlungallotransplanation:GeneralThoracicSurgery122:29-38，2001GiuseppeVassallietal:GenetransferofcytoprotectiveandimmunomodulatorymoleculesforpreventionofcardiacallograftrejectionEuropeanJournalofCardio-ThoracicSurgery24:794-806,2003VerwaerdeC.etal:OculartransferofretinalglialcellstransducedexvivowithadenovirusexpressingviralLL-10orCTLA44-lginhibitsexperimentalautoimmuneuveoretinitiesGeneTherapy10:1970-1981,2003Okada,Y.etal:Doesadenovirus-MediatedviralIL-10GeneTransferProlongSurvivalofXenogeneicSpheroidalAggregate-CulturedHepatocytesTransplantationProceedings32:1021-1023，2000SalgarShashikumark.etal:ViralInterleukin-10-EngineeredAutologousHematopoieticStemCelltherapy:ANovelGeneTherapyApproachtoPreventGraftRejectionHumanGeneTherapy15:131-144,200权利要求1、一种在受治者中实施实体器官移植的方法，包括给予编码免疫调节转基因的重组腺相关病毒(rAAV)到待移植的实体器官；和移植所述的实体器官到所述的受治者。2、权利要求l所述的方法，其中，免疫调节转基因是IL-IO。3、权利要求2所述的方法，进一歩包括给予免疫调节剂到所述的受治者。全文摘要本发明涉及使用重组腺相关病毒(rAAV)载体转导待移植实体器官细胞的方法，该rAAV载体携带编码诸如IL-10的免疫调节多肽的核苷酸序列，上述多肽的表达降低了宿主免疫系统排斥该移植器官的可能。本发明也公开了在将该器官移植到受治者前通过给予编码IL-10的rAAV载体提高实体器官移植效率的方法。待转导的实体器官可能是心脏、肾脏、肝脏、胰岛、肺或肠。文档编号A01N63/00GK101217875SQ200680024719公开日2008年7月9日申请日期2006年6月30日优先权日2005年7月7日发明者G·皮尔斯,H·蒋,M·Y·恩瓦奇申请人:建新公司