具有酯酶活性的多肽和编码该多肽的核酸的制作方法

专利名称：具有酯酶活性的多肽和编码该多肽的核酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有酯酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的核酸序列。本发明还涉及包含所述核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于产生和使用所述多肽的方法。
背景技术：
植物细胞壁多糖约构成植物细胞壁的90%，并且能分成三组纤维素，半纤维素和果胶。纤维素代表细胞壁多糖的主要成分。半纤维素是植物细胞壁第二丰富的成分。主要的半纤维素聚合物是木聚糖。木聚糖骨架的生物降解依赖于两类酶内切木聚糖酶和 β-木糖苷酶。内切木聚糖酶(EC 3.2. 1.8)将木聚糖骨架切割成更小的寡糖，其可以进一步由β-木糖苷酶(EC 3.2. 1.37)降解成木糖。其它与木聚糖降解有关的酶包括，例如，乙酰木聚糖酯酶，阿拉伯糖酶，α -葡糖醛酸糖苷酶，酯酶，和对-香豆酸酯酶。W002/12472公开了能够立体选择性水解手性酯和水解阿魏酸酯的酯酶。Faulds 和 Williamson，1991，J. Gen. Microbiol. 137 :2339-2345 描述了来自橄榄色链霉菌(Sti^ptomyces olivochromogenes)的4_羟基-3-甲氧基-肉桂(阿魏)酸酯酶的纯化和表征。Faulds 和 Williamson，1994，Microbiology 140 :779_787，描述了来自黑曲霉(Aspergillus niger)的阿魏酸酯酶的纯化和表征。Kroon等，1996，Biotechnol. Appl. Biochem. 23 :255-262描述了由糖甜菜粕上黑曲霉生长而诱导的新酯酶的纯化和表征。deVries 等，1997，Appl. Environ. Microbiol. 63 :4638-4644 公开了来自黑曲霉和塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)的酉旨酶基因。Castanares 等，1992,Enzyme Microbiol. Technol. 14 :875_884，描述了来自嗜松青霉(Penicillum pinophilu)的阿魏酰基/对-香豆酰基酯酶的纯化和性质。本发明涉及具有酯酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸。发明概述本发明人分离了具有酯酶活性的来自漆斑菌属菌种(Myrothecium sp.)的酯酶。 所述新酯酶与已知的氨基酸序列具有少于30%的非常低的同一性。本发明人还分离了编码该新酯酶的基因，并将其克隆入大肠杆菌菌株。本发明涉及具有酯酶活性的分离的多肽，所述多肽选自下组(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO 2的成熟多肽具有至
4少45%同一性；(b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少中严格条件下与以下杂交(i) SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO1的成熟多肽编码序列中的 cDNA序列，或(iii)⑴或( )的全长互补链；(c)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列具有至少45%同一性的核苷酸序列；(d) SEQ ID NO 2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或几个氨基酸的变体。本发明还涉及编码具有酯酶活性的多肽的分离的多核苷酸，所述多核苷酸选自下组(a)编码包含氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列与SEQ ID NO 2的成熟多肽具有至少45%同一性；(b)多核苷酸，其在至少中严格条件下与以下杂交(i)SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO 1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii) (i)或 ( )的互补链；(c)多核苷酸，其包含与SEQ ID NO=I的成熟多肽编码序列具有至少45%同一性的核苷酸序列；(d)多核苷酸，其编码SEQ ID NO 2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或几个氨基酸的变体。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞， 和产生具有酯酶活性的多肽的方法。本发明还涉及抑制多肽在细胞中表达的方法，其包括对细胞施用双链 RNA(dsRNA)分子或在细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中dsRNA包括本发明的多核苷酸的亚序列。本发明还涉及此种双链抑制性RNA (dsRNA)分子，其中任选地该dsRNA是siRNA 或miRNA分子。本发明还涉及降解包含木聚糖的材料的方法。本发明还涉及包含分离的多核苷酸的植物，所述多核苷酸编码此种具有酯酶活性的多肽。本发明还涉及用于产生此种具有酯酶活性的多肽的方法，其包括(a)在有助于产生该多肽的条件下培养包含多核苷酸的转基因植物或植物细胞，所述多核苷酸编码具有阿魏酸酯酶的多肽；和(b)回收所述多肽。本发明进一步涉及包含编码蛋白质的基因的核酸构建体，其中将所述基因可操作地连接于编码信号肽的核苷酸序列，所述信号肽包含SEQ ID NO :2的氨基酸1至20或由 SEQ ID NO 2的氨基酸1至20组成，其中所述基因对于所述核苷酸序列是外源的。附图
简述酯酶活性术语“酯酶活性”定义为在称作水解的与水进行的化学反应中将酯分解为酸和醇的水解酶活性(EC 3. 1. 1.)。就本发明而言，酯酶活性是根据实施例1中所述的在 PNPB底物中确定酯酶活性的方法来确定的。在本领域公知(EC 3. 1. 1.)包含的酯酶可选自例如阿魏酸酯酶(EC3. 1. 1. 73)、乙酰木聚糖酯酶(EC 3. 1.1. 72)、蛋白质-谷氨酸甲基酯酶(EC 3. 1. 1. 61)、羧基酯酶(EC 3. 1. 1. 1)、芳基酯酶(EC 3. 1. 1. 2)、乙酰基酯酶(EC 3. 1. 1. 6)、胆碱酯酶(EC 3. 1. 1. 8)、甾醇酯酶(EC 3. 1. 1. 13), α-氨基酸酯酶(EC 3. 1. 1. 43)等等。本发明的多肽具有SEQ ID NO :2的成熟多肽的酯酶活性的至少20%，优选至少 40 %，更优选至少50 %，更优选至少60 %，更优选至少70 %，更优选至少80 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，并且甚至最优选至少100 %。分离的多肽术语“分离的多肽”用于本文中指由来源分离的多肽。在一个优选的方面，多肽是如通过SDS-PAGE测定的，至少纯，优选至少5%纯，更优选至少10%纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯，并且最优选至少90%纯的多肽。基本上纯的多肽术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制备物，所述多肽制备物含有按重量计至多10 %，优选至多8 %，更优选至多6 %，更优选至多5 %，更优选至多 4%,更优选至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1 %，并且甚至最优选至多0. 5%的与其天然或重组结合的(associated)的其它多肽材料。因此，优选所述基本上纯的多肽是按存在于制备物中的全部多肽材料的重量计至少92%纯，优选至少94%纯，更优选至少 95 %纯，更优选至少96 %纯，更优选至少96 %纯，更优选至少97 %纯，更优选至少98 %纯， 甚至更优选至少99 %，最优选至少99. 5 %纯，并且甚至最优选100 %纯。本发明的多肽优选是基本上纯的形式，即，所述多肽制备物基本上(essentially)不含与其天然或重组结合的其它多肽材料。例如，这能够通过以下实现通过公知的重组方法或由经典纯化方法制备多肽。成熟多肽术语“成熟多肽”在本文中定义为具有酯酶活性的多肽，所述多肽以其在翻译和任何翻译后修饰之后的最终形式存在，所述修饰例如N-末端加工、C-末端截短、 糖基化、磷酸化等。在一个优选的方面，根据预测SEQ ID NO :2的氨基酸1至20是信号肽的SignalP程序，成熟多肽是SEQ ID NO 2的氨基酸21至520。成熟多肽编码序列术语“成熟多肽编码序列”在本文中定义为编码具有酯酶活性的成熟多肽的核苷酸序列。在一个优选的方面，根据预测SEQ ID N0:1的核苷酸1至60编码信号肽的SignalP程序，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO=I的核苷酸61至1560。同一性由参数“同一性”描述的两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性。就本发明而言，两个氨基酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS软件包 (EMBOSS :The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000, Trends in Genetics 16 :276-277)的Needle程序，优选3. 0. 0版或更高版本中执行的 Needleman-Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch，1970，J. Mol. Biol. 48 :443-453)来确定。使用的任选参数为缺口罚分(gap penalty) 10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0. 5 和EBL0SUM62取代矩阵(BL0SUM62的EMBOSS版)。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)，，(使用-nobrief选项获得)的输出结果作为百分比同一性，并计算如下(相同的残基X100)/(比对长度-比对中缺口的总数)就本发明而言，两个核苷酸序列之间的同一性程度使用如EMBOSS软件包 (EMBOSS The European Molecular Biology Open Software Suite，Rice 等，2000，见上文)的Needle程序，优选3. 0. 0或更高版本中执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman 和mmSCh，1970，见上文)来测定。使用的任选参数为缺口罚分10，缺口延伸罚分0.5和 EDNAFULL取代矩阵(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版)。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下(相同的脱氧核糖核苷酸X100)/(比对长度-比对中缺口的总数)同源序列术语“同源序列”在本文中定义为预测的蛋白质，其在用SEQ ID NO 2的漆斑菌属菌种酯酶或其成熟多肽进行的tfasty搜索(Pearson，W. R.，1999，于 Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener 禾口 S. A. Krawetz 编，pp. 185-219)中给出小于0. 001的E值(或期望值)。多肽片段术语“多肽片段”在本文中定义为从SEQ ID NO 2的成熟多肽或其同源序列的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(几个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有酯酶活性。在一个优选的方面，片段含有SEQ ID NO :2的成熟多肽或其同源序列的至少250 个氨基酸残基，更优选至少300个氨基酸残基，并且最优选至少450个氨基酸残基。亚序列术语“亚序列(subsequence) ”在本文中定义为从SEQ ID NO 1的成熟多肽编码序列或其同源序列的5’和/或3’端缺失一个或多个(几个)核苷酸的核苷酸序列；其中所述亚序列编码具有酯酶活性的多肽片段。在一个优选的方面，亚序列含有SEQ ID NO 1的成熟多肽编码序列或其同源序列的至少750个核苷酸，更优选至少900个核苷酸， 并且最优选至少1350个核苷酸。等位变体(allelic variant)术语“等位变体”在本文中表示占据相同染色体基因座的基因的任何两种或两种以上可选形式。等位变异通过突变天然地发生，并且可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。分离的多核苷酸术语“分离的多核苷酸”用于本文中指从来源分离的多核苷酸。 在一个优选的方面，多核苷酸是如通过琼脂糖电泳测定的，至少纯，优选5%纯，更优选至少10 %纯，更优选至少20 %纯，更优选至少40 %纯，更优选至少60 %纯，甚至更优选至少 80 %纯，并且最优选至少90 %纯的多核苷酸。基本上纯的多核苷酸术语“基本上纯的多核苷酸”用于本文指不含其它外来的或不期望的核苷酸的多核苷酸制备物，并且所述多核苷酸制备物处于适合于在遗传工程的蛋白质生产体系中使用的形式。因此，基本上纯的多核苷酸含有按重量计至多10%，优选至多8 %，更优选至多6 %，更优选至多5%，更优选至多4%，更优选至多3 %，甚至更优选至多2 %，最优选至多1 %，并且甚至最优选至多0. 5 %的与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。然而，基本上纯的多核苷酸可包括天然存在的5’和3’非翻译区，如启动子和终止子。优选基本上纯的多核苷酸是按重量计至少90%纯，优选至少92%纯，更优选至少94% 纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，甚至更优选至少98%纯， 最优选至少99 %，并且甚至最优选至少99. 5 %纯的。本发明所述多核苷酸优选为基本上纯的形式。具体而言，优选在本文公开的多核苷酸是“基本上(essentially)纯的形式”，即， 所述多核苷酸制备物基本上不含与其天然或重组结合的其它多核苷酸材料。所述多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的，或它们的任何组合。编码序列当用于本文时术语“编码序列”的意思是直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界通常由开读框决定，所述开读框通常以ATG起始密码子或可供选择的起始密码子例如GTG和TTG开始，并且以终止密码子例如TAA、TAG和TGA 结束。编码序列可以是DNA、cDNA、合成或重组核苷酸序列。cDNA:术语“cDNA”在本文中定义为能够通过反转录从得自真核细胞的成熟的、已剪接的mRNA分子制备的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。 起始的(initial)、初级的RNA转录物是mRNA的前体，其通过一系列的步骤加工然后作为成熟的已剪接的mRNA出现。这些步骤包括通过称为剪接的过程去除内含子序列。因而源自 mRNA的cDNA没有任何内含子序列。核酸构建体术语“核酸构建体”用于本文指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子分离自天然存在的基因，或将所述核酸分子以本来不存在于(not otherwise exist)自然界中的方式修饰以含有核酸的区段，或所述核酸是合成的。当所述核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的调控序列时，术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。调控序列(control sequence)术语“调控序列”在本文定义为包括对编码本发明多肽的多核苷酸表达是必需的所有成分。各个调控序列对于编码所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或外源的，或各个调控序列对于彼此可以是天然的或外源的。这些调控序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。最少的情况，调控序列包括启动子和转录和翻译的终止信号。调控序列可以和用于引入特异性限制位点的接头一起提供，所述特异性限制位点促进调控序列与编码多肽的核苷酸序列编码区的连接。可操作地连接术语“可操作地连接”在本文表示这样的构型，其中将调控序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得调控序列指导多肽编码序列的表达。表达术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。表达载体术语“表达载体”在本文定义为线性的或环状的DNA分子，其包含编码本发明多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的额外核苷酸可操作地连接。宿主细胞如本文中所使用的术语“宿主细胞”包括任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的 (susceptible)0修饰术语“修饰”在本文的意思是，对由SEQ ID NO 2的成熟多肽或其同源序列组成的多肽的任何化学修饰，以及对编码所述多肽的DNA的遗传操作。所述修饰可以是一个或多个(几个)氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一个或多个(几个)氨基酸侧链的置换。人工变体当用在本文时，术语“人工变体”的意思是具有酯酶活性的多肽，所述多肽由表达SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列或其同源序列的修饰的多核苷酸序列的生物体产生。所述修饰的核苷酸序列通过人为干预(human intervention)，通过修饰SEQ ID N0: 1中公开的多核苷酸序列或其同源序列来获得。发明详述具有酯酶活性的多肽
在第一个方面，本发明涉及包含氨基酸序列的分离的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO 2的成熟多肽具有优选至少45 %，更优选至少50 %，更优选至少55 %，更优选至少 65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，甚至更优选至少80 %，最优选至少85 %，且甚至最优选至少90 %，至少95 %，至少96 %，至少97 %，至少98 %或至少99 %的同一性程度，所述多肽具有酯酶活性(下文中的“同源多肽”)。在一个优选的方面，所述同源多肽具有氨基酸序列，其与SEQ ID NO :2的成熟多肽相差十个氨基酸，优选相差五个氨基酸，更优选相差四个氨基酸，甚至更优选相差三个氨基酸，最优选相差两个氨基酸，并且甚至最优选相差一个氨基酸。本发明的多肽优选包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有酯酶活性的片段。在一个优选的方面，多肽包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列。在另一个优选方面，多肽包含SEQ ID NO 2的成熟多肽。在另一个优选方面，多肽包含SEQ ID NO 2的氨基酸21至520，或其等位变体；或它们的具有酯酶活性的片段。在另一个优选方面，多肽包含SEQ ID NO 2的氨基酸21至520。在另一个优选方面，多肽由SEQ ID NO 2的氨基酸序列或其等位变体；或它们的具有酯酶活性的片段组成。在另一个优选方面，多肽由SEQ ID NO :2的氨基酸序列组成。在另一个优选方面，多肽由SEQ ID NO :2的成熟多肽组成。在另一个优选方面，多肽由SEQ ID NO 2的氨基酸21至520或其等位变体；或它们的具有酯酶活性的片段组成。在另一个优选方面，多肽由SEQ ID NO 2的氨基酸21至520组成。在第二个方面，本发明涉及具有酯酶活性的分离的多肽，所述分离的多肽由多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选非常低严格条件下，更优选低严格条件下，更优选中严格条件下，更优选中-高严格条件下，甚至更优选高严格条件下，并且最优选非常高严格条件下，与以下杂交(i) SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，(iii) (i)或(ii)的亚序列，或(iν) (i)、(ii)或(iii)的全长互补链(J. Sambrook, E. F. Fritsch,禾口 T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual，第 2 版，Cold Spring Harbor, New York)。SEQ ID NO :1 的成熟多肽编码序列的亚序列含有至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续的核苷酸。此外，所述亚序列可编码具有酯酶活性的多肽片段。在一个优选的方面，所述互补链是SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列的全长互补链。SEQ ID NO=I的核苷酸序列或其亚序列，以及SEQ ID NO 2的氨基酸序列或其片段，可用于设计核酸探针，以根据本领域内公知的方法从不同属和种的菌株鉴定和克隆编码具有酯酶活性的多肽的DNA。具体而言，根据标准的Southern印迹方法，可将这些探针用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交，以鉴定和从其中分离相应的基因。这些探针可明显短于完整序列，但长度上应为至少14，优选至少25，更优选至少35，并且最优选至少70 个核苷酸。然而，优选所述核酸探针是至少100个核苷酸长度。例如，所述核酸探针的长度可为至少200个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少400个核苷酸，或最优选至少 500个核苷酸。甚至可以使用更长的探针，例如，长度是优选至少600个核苷酸，更优选至少 700个核苷酸，更优选至少800个核苷酸，或最优选至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和 RNA探针二者均可使用。通常将探针标记以探测相应的基因(例如，用％PJH、35S、生物素或抗生物素蛋白(avidin)标记)。将这些探针涵盖于本发明中。因而，可从由这些其它菌株制备的基因组DNA或cDNA文库中筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并且编码具有酯酶活性的多肽。可以通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳， 或通过其它分离技术分离来自这些其它菌株的基因组或其它DNA。可以将来自文库的DNA 或分离的DNA转移至硝化纤维素(nitrocellulose)或其它合适的载体材料并且固定于其上。为了鉴定与SEQ ID NO :1或其亚序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料优选用在 Sounthern 印迹中。就本发明而言，杂交表示核苷酸序列在非常低至非常高的严格条件下与标记的核酸探针杂交，所述核酸探针对应于SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列；包含于SEQ ID NO=I 的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，其全长互补链；或它们的亚序列。可使用例如X射线片(X-ray film)检测在这些条件下与核酸探针杂交的分子。在一个优选的方面，核酸探针是SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列。在另一个优选方面，核酸探针是SEQ ID NO :1的核苷酸61至1560。在另一个优选方面，核酸探针是编码SEQ ID NO :2的多肽的多核苷酸序列，或其亚序列。在另一个优选方面，核酸探针是SEQ ID NO :1。在另一个优选方面，核酸探针是包含在大肠杆菌(E. coli)DSM19428中的质粒中含有的多核苷酸序列，其中所述其多核苷酸序列编码具有酯酶活性的多肽。在另一个优选方面，核酸探针是包含在大肠杆菌DSM19428中的质粒中含有的成熟多肽编码区。对于长度至少100个核苷酸的长探针，将非常低至非常高的严格条件定义为在 42°C，在5X SSPE、0. 3% SDS、200y g/ml已剪切并且变性的鲑精DNA中，并且对于非常低和低严格性为25%的甲酰胺、对于中和中-高严格性为35%的甲酰胺、或对于高和非常高严格性为50%的甲酰胺，根据标准的Southern印迹法进行预杂交和杂交最佳12至M小时。对于长度为至少100个核苷酸的长探针，使用2X SSC、0.2% SDS优选至少在 450C (非常低严格性)，更优选至少在50°C (低严格性)，更优选至少在55°C (中严格性)， 更优选至少在60°C (中-高严格性)，甚至更优选至少在65°C (高严格性)，并且最优选至少在70°C (非常高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将严格条件定义为在比牛艮据 Bolton 禾口 McCarthy 计算法(1962，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48 :1390)得出的 Tm 低大约 5 °C 至大约 10 °C，在 0. 9MNaCl，0. 09M Tris-HCl pH 7. 6,6mM EDTA，0. 5 % NP-40,1 XDenhardt 溶液，ImM 焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)，ImM舞酸二S1IffcI (sodium monobasic phosphate), 0. ImMATP 禾口 0. 2mg 每 ml的酵母RNA中，根据标准的Southern印迹步骤进行预杂交、杂交和杂交后洗涤最佳12至 24小时。对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，将所述载体材料在 6 X SSC加0. 1 % SDS中洗涤一次15分钟，并用6 X SSC在比计算的Tm低5°C至10°C的温度洗涤两次，每次15分钟。在第三方面，本发明涉及具有酸酯酶活性的分离的多肽，其由包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成的多核苷酸编码，所述核苷酸序列与SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列具有优选至少45 %，更优选至少50 %，更优选至少55 %，更优选至少65 %，更优选至少 75 %，更优选至少80 %，优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，且甚至最优选至少95 %、 96%,97^^98%或99%的同一性程度，其编码活性多肽。参见本文的多核苷酸部分。在第四方面，本发明涉及SEQ ID NO :2的成熟多肽或其同源序列的包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的人工变体。优选地，氨基酸改变对性质是较不重要的(of a minor nature)，即保守的氨基酸取代或插入，其不显著影响蛋白质的折叠和/ 或活性；通常为1至大约30个氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；多至大约20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其它功能来促进纯化的小延伸,如多组氨酸序列(poly histidine tract)、抗原表位(antigenic epitope) 或结合域(binding domain)。保守取代的实例是在以下组之内碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、 酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳族氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的，并且由例如H. Neuratt^PR. L. Hill, 1979，于The Proteins, Academic Press, New York 中描述。最普遍发生的交换是 Ala/^er、Val/Ile、 Asp/Glu、Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn.Ala/Val、Ser/Gly,Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/ Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 禾口 Asp/Gly。除了 20个基本氨基酸，非基本氨基酸(例如4-羟脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2_氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以取代野生型多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸和非天然氨基酸可以取代氨基酸残基。“非天然氨基酸”在蛋白质合成后已经过修饰，和/或在它们的侧链具有不同于基本氨基酸的化学结构。非天然氨基酸能够以化学方法合成，并且优选是商业上能够获得的，包括六氢吡啶羧酸(pipecolic acid)、噻唑烧羧酸(thiazolidine carboxylic acid)、脱氢脯氨酸、3-和 4-甲基脯氨酸，和3，3-二甲基脯氨酸。或者，氨基酸改变具有这样的性质以使多肽的物理化学性质改变。例如，氨基酸改变可改进多肽的热稳定性，改变底物特异性，改变最适PH等。能够根据本领域已知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(Cunningham 和Wells，1989，Science M4 :1081-1085)来鉴定亲本多肽中的必需氨基酸。在后一技术中，将单一丙氨酸突变引入到分子中的每个残基，并且测试所得突变分子的生物活性(即， 酯酶活性)以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。同样参见Hilton等，1996， J. Biol. Chem. 271 :4699_4708。酶的活性部位或其它的生物相互作用也能够通过结构的物理分析而测定，如通过以下这些技术如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，连同推定的接触位点氨基酸的突变来测定。参见例如de Vos等，1992，Science 255 =306-312 ； Smith 等，1992，J. Mol. Biol. 224 :899-904 ；Wlodaver 等，1992，FEBS Lett. 309 :59_64。必需氨基酸的同一性也能够从与多肽的同一性分析来推断，所述多肽与根据本发明的多肽相关。能够使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，然后是有关的筛选方法，例如由 Reidhaar-Olson 禾口 Sauer，1988，Science 241 :53-57 ；Bowie 禾口 Sauer，1989， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :2152-2156 ；WO 95/17413;或 WO 95/2洸25 公开的那些方法来进行并测试单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。能够使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，Lowman等，1991，Biochem. 30 :10832-10837 ；美国专利号 5，223，409 ；WO 92/06204)和区域定向的诱变(Derbyshire 等，1986，Gene 46 :145 ；Ner 等，1988，DNA 7 :127)。诱变/改组方法能够与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等，1999，Nature Biotechnology 17:893-896)。能够从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许快速测定感兴趣的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并且能够应用于未知结构的多肽。SEQ ID NO 2的成熟多肽，如SEQ ID NO 2的氨基酸21至520的氨基酸取代、缺失和/或插入的总数是10，优选9，更优选8，更优选7，更优选至多6，更优选5，更优选4，甚至更优选3，最优选2，并且甚至最优选1。具有酯酶活性的多肽的来源本发明的多肽可以获得自任何属的微生物。就本发明而言，用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思是核苷酸序列编码的多肽由所述来源产生，或由其中插入了来自所述来源的核苷酸序列的菌株产生。在一个优选的方面，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。本发明具有酯酶活性的多肽可以是细菌多肽。例如，所述多肽可以是具有酯酶活性的革兰氏阳性细菌多肽例如芽孢杆菌属(Bacillus)、链球菌属( ! 印tococcus)、链霉菌属(Streptomyces)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、梭菌属(Clostridium)、地芽孢杆菌属 (Geobacillus)或海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)多肽；或具有酯酶活性的革兰氏阴性细菌多肽，如大肠杆菌(E. coli)、假单胞菌属O^seudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、 弯曲杆菌属(Campylobacter) ^iIffliiM (Helicobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)或脲原体属 (Ureaplasma)多妝。在一个优选的方面，所述多肽是具有酯酶活性的嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)S" (Bacillus amyloliquefaciens) ^M^^^fM (Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、 凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulms)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆 M (Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热月旨肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)多肽。在另一个优选的方面，所述多肽是具有酯酶活性的似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酉良月农链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)或马链球菌兽痕亚禾中(Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus)多月太。在另一个优选的方面，所述多肽是具有酯酶活性的不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)多月太。本发明具有酯酶活性的多肽也可以是真菌多肽，并且更优选具有酯酶活性的酵母多肽如念珠菌属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或西洋蓍霉属(Yarrowia) 多肽；或更优选具有酯酶活性的丝状真菌多肽如枝顶孢霉属(Acremoniumm)、伞菌属 (Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、 Botryospaeria、拟錯菌属(Ceriporiopsis)、毛 _ 壳属(Chaetomidium)、金抱子菌属 (Chrysosporium)、Claviceps、Cochliobolus、鬼伞属(Coprinopsis)、Coptotermes、 棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、 色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、Filibasidium.镰孢属(Fusarium)、赤霉属 (Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属 (Irpex) λ MSM (Lentinula)、Leptospaeria、梨抱菌属(Magnaporthe)、Melanocarpus、 多孔菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新考玛脂霉属(Neocallimastix)、脉抱菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属 (Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、 假漂盘菌属(Pseudoplectania)、Pseudotrichonympha、根毛霉属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、踝节菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(fThielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属 CTrichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、包脚菇属 (Volvariella)或炭角菌属(Xylaria)多肽。在一个优选的方面，所述多肽是具有酯酶活性的卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酉良酒酵母(Saccharomyces cerevtsiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)多月太。在另一个优选方面，所述多肽是具有酯酶活性的解纤维枝顶孢霉(Acremoniudm cellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、 曰本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、漂曲霉 (Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、嗜角质金抱子菌(Chrysosporium keratinophilum)、Chrysosporium lucknowense、热带金抱子菌(Chrysosporium tropicum)、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、金抱子菌 (Chrysosporium pannicola)、Chrysosporium queenslandicum、Chrysosporium zonatum、 杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、禾谷镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢 (Fusarium crookwellense)、大刀德抱(Fusarium culmorum)、禾本禾斗德抱(Fusarium graminearum)、禾赤德抱(Fusarium graminum)、异抱德抱(Fusarium heterosporum)、 合欢木德抱(Fusarium negundi)、尖德抱(Fusarium oxysporum)、多枝德抱(Fusarium reticulatum)、粉红德抱(Fusarium roseum)、接骨木德抱(Fusarium sambucinum)、肤色德抱(Fusarium sarcochroum)、拟分枝抱德抱(Fusarium sporotrichioides)、硫色 ,廉抱(Fusarium sulphureum)、圆德抱(Fusarium torulosum)、拟丝抱,廉抱(Fusarium trichothecioides)、壤片德抱(Fusarium venenatum)、灰腐质霉(Humicola grisea)、特异腐质霄(Humicola insolens)、疏棉状腐质霄(Humicola lanuginosa)、白奉巴齿菌(Irpex lacteus)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、 绳状青霉(Penicillium funicidlosum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、 35P Jji 1(Phanerochaete chrysosporium)、Thielavia achromatica> Thielavia albomyces> Thielavia albopilosa^^yifl^ifil^ (Thielavia australeinsis) > Thielavia fimeti、小抱梭抱壳(Thielavia microspora)、卵抱梭抱壳(Thielavia ovispora)、 Thielavia peruviana^ ^ ^ (Thielavia spededonium) > ^ ^ (Thielavia setosa) > Thielavia subthermophila、^(Thielavia terrestris) > (^^7^(Trichoderma harzianum) >^tJ27^β (Trichoderma koningii)、^枝7^(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霄(Trichoderma reesei)或參录色木霄(Trichoderma viride) 多肽。在另一个优选的方面，所述多肽是漆斑菌属多肽，在一个更优选的方面，所述多肽是具有酯酶活性的漆斑菌属菌种多肽，例如，包含SEQ ID NO :2的成熟多肽的多肽。可理解的是对于前述的种，本发明包含完全和不完全阶段(perfect and imperfect states)，和其它分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而无论它们已知的种名。本领域熟练技术人员将容易地识别适合的等同物的同一性。这些种的菌株在许多培养物保藏中心对于公众能够容易地取得，所述保藏中心诸如美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection) (ATCC)、 德意志微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)(DSM)、真菌菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures) (CBS)和农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心 (Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center)(NRRL)。此外，可以使用上述的探针从其它来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等) 分离的微生物鉴定和获得这些多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可通过相似地筛选这种微生物的基因组或cDNA文库来获得所述多核苷酸。一旦用所述探针检测到编码多肽的多核苷酸序列，就能够使用本领域普通技术人员熟知的技术将所述多核苷酸分离或克隆(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。本发明的多肽还包括融合多肽或可切割的融合多肽，其中将另外的多肽融合到所述多肽或其片段的N末端或C末端。通过将编码另一个多肽的核苷酸序列(或其部分)融合于本发明的核苷酸序列(或其部分)来产生融合的多肽。产生融合多肽的技术是本领域已知的，并包括连接编码多肽的编码序列以使它们在阅读框中，并且使融合多肽的表达在相同启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以包括切割位点。一旦分泌了融合多肽，就切割所述位点，从融合蛋白质释放具有酯酶活性的多肽。切割位点的实例包括，但不限于，编码二肽Lys-Arg的 Kex2 位点(Martin 等，2003，J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3 :568-76 ；Svetina 等，2000， J. Biotechnol. 76 :245-251 ；Rasmussen-WiIson 等，1997, Appl. Environ. Microbiol. 633488-3493 ；Ward 等，1995，Biotechnology 13:498—503;禾口 Contreras 等，1991， Biotechnology 9 :378-381) ；Ile_(Glu 或 Asp)-Gly-Arg 位点，其在精氨酸残基后通过因子 Xa 蛋白酶切割(Eaton 等，1986，Biochem. 25 :505-512) ；Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 位点， 其在赖氨酸后通过肠激酶切割(Collins-fcicie 等，1995，Biotechnology 13:982-987)； His-Tyr-Glu 位点或 His-Tyr-Asp 位点，其通过 Genenase I 切割(Carter 等，1989， Proteins -Structure, Function, and Genetics 6 :240-248) ；Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser 位点，其在 Arg 后通过凝血酶切割(Stevens，2003，Drug Discovery World 4 :35-48)； Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly 位点，其在 Gln 后通过 TEV 蛋白酶切割(Stevens，2003，见上文)；和Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro位点，其在Gln后通过基因工程形式的人鼻病毒3C蛋白酶切割(Stevens，2003，见上文)。多核苷酸本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码本发明具有酯酶活性的多肽的核苷酸序列，或由编码本发明具有酯酶活性的多肽的核苷酸序列组成。在一个优选的方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO=I或由SEQ ID NO=I组成。在另一个更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌DSM19428中所含质粒中含有的序列，或由大肠杆菌DSM19428中所含质粒中含有的序列组成。在另一个优选方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO 1的成熟多肽编码序列或由SEQ ID NO 1的成熟多肽编码序列组成。在另一个优选方面，核苷酸序列包含SEQ ID NO :1的核苷酸61至1560或由SEQ ID NO :1的核苷酸61至 1560组成。在另一个更优选的方面，核苷酸序列包含大肠杆菌DSM19428中所含质粒中含有的成熟多肽编码序列或由大肠杆菌DSM19428中所含质粒中含有的成熟多肽编码序列组成。本发明还涵盖编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列或其成熟多肽，或由SEQ ID NO 2的氨基酸序列或其成熟多肽组成；由于遗传密码的简并性，所述核苷酸序列不同于SEQ ID NO :1或其成熟多肽编码序列。本发明还涉及SEQ ID N0:1的亚序列，所述亚序列编码具有酯酶活性的SEQ ID NO :2的片段。本发明还涉及突变多核苷酸，所述突变多核苷酸在SEQ ID NO 1的成熟多肽编码序列中包含至少一个突变，或由具有至少一个突变的SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列组成，其中所述突变核苷酸序列编码SEQ ID NO :2的成熟多肽。用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术是本领域内已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或其组合。可通过例如使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特性的克隆DNA片段，从而实现从这种基因组 DNA克隆本发明的多核苷酸。参见，例如，Innis等，1990，PCR :A Guide to Methods and Application,Academic Press,New York。可以使用其它核酸扩增方法，如连接酶链式反应 (LCR)、连接活化转录(ligated activated transcription ；LAT)和基于核苷酸序列的扩增 (NASBA)。可以从漆斑菌属菌株，或其它或相关生物体克隆多核苷酸，并且因此可以是例如所述核苷酸序列的多肽编码区的等位基因变体或种变体(species variant)。本发明还涉及包含核苷酸序列或由核苷酸序列组成的分离的多核苷酸，所述核苷酸序列与SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列具有优选至少45%，更优选至少50%，更优选至少65 %，更优选至少75 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，甚至更优选至少90 %，最优选至少95 %，并且甚至最优选至少96 %，至少97 %，至少98 %，或者至少99 %同一性的同一性程度，其编码具活性多肽。修饰编码本发明多肽的核苷酸序列对于合成与所述多肽基本上相似的多肽可为必需的。术语与所述多肽“基本上相似”指多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以一些工程改造的方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如，比活性、热稳定性、最适PH等方面不同的人工变体。可以在作为SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列存在的核苷酸序列，例如其亚序列的基础上，和/或通过引入如下核苷酸取代来构建变体序列所述取代不产生由核苷酸序列编码的多肽的另外的氨基酸序列，但是符合意欲产生酶的宿主生物体的密码子选择；或者所述取代可产生不同的氨基酸序列。关于核苷酸取代的概述，参见，例如，Ford 等，1991，Protein Expression and Purification 2 :95一107。对于本领域技术人员显而易见的是，这些取代能够在对于分子功能重要的区域之外进行，并且仍然产生活性多肽。对于由本发明的分离的多核苷酸编码的多肽活性关键的并且因此优选不进行取代的氨基酸残基，可以根据本领域公知的方法，例如定位诱变或丙氨酸分区诱变法(参见，例如，Cunningham和Wells，1989，见上文)来鉴定。在后一技术中，将突变引入到分子中的每个荷正电的残基处，并且测试所得突变分子的酯酶活性，以鉴定对于所述分子的活性关键的氨基酸残基。底物-酶相互作用的位点也能够通过分析三维结构测定，通过如核磁共振分析、晶体学或光亲和标记这样的技术来测定(参见，例如，de Vos 等，1992，见上文；Smith 等，1992，见上文；Wlodaver 等，1992，见上文)。本发明还涉及编码本发明多肽的分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸在非常低严格条件下，优选低严格条件，更优选中等严格条件，更优选中-高严格条件，甚至更优选高严格条件，并且最优选非常高的严格条件下，与以下序列杂交(i) SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO 1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)⑴ 或(ii)的全长互补链；或它们的等位变体和亚序列(Sambrook等，1989，见上文)，如本文所定义的。在一个优选的方面，互补链是SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列的全长互补链。本发明还涉及分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸通过以下方法获得(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高严格条件下，将DNA的群体与以下序列杂交(i) SEQ ID NO 1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO 1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列， 或(iii) (i)或(ii)的全长互补链；和(b)分离杂交的多核苷酸，其编码具有酯酶活性的多肽。在一个优选的方面，互补链是SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列的全长互补链。核酸构建体本发明还涉及包含本发明的分离的多核苷酸的核酸构建体，所述分离的多核苷酸与一个或多个(几个)调控序列可操作地连接，所述调控序列在合适的宿主细胞中在与该调控序列相容的条件下指导编码序列的表达。可以用许多方式操作编码本发明多肽的分离的多核苷酸以提供多肽的表达。依赖于表达载体，在将多核苷酸的序列插入载体之前对其进行操作可能是理想的或必需的。使用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是本领域熟知的。调控序列可以是适当的启动子序列，其是由用于表达编码本发明多肽的多核苷酸的宿主细胞识别的核苷酸序列。启动子序列含有介导多肽的表达的转录调控序列。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。用于指导本发明的核酸构建体转录，特别是在细菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下述获得的启动子大肠杆菌Iac操纵子、天蓝色链霉菌(Sti^ptomyces
16coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌 α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB 基因和原核 β -内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff 等，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75 :3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer等，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21-25)。另外的启动子在〃 Useful proteins from recombinant bacteria"于Scientific American, 1980, 242 :74-94中；禾口在Sambrook等，1989，见上文中描述。用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从下列酶的基因获得的启动子米曲霉TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(lihizomucor miehei) 天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、镶片镰孢淀粉葡糖苷酶(W0 00/56900)、镶片镰孢Daria(WC) 00/56900)、镶片镰孢Quirm(W000/56900)、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶(W0 96/00787)、里氏木霉β -葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、 里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶IV、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉β-木糖苷酶，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因和米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)；和它们的突变的、截短的和杂合的启动子。在酵母宿主中，有用的启动子从如下酶的基因获得酿酒酵母烯醇化酶(ΕΝ0-1)、 酿酒酵母半乳糖激酶(GALl)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/ GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUPl)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。对于酵母宿主细胞其它有用的启动子由Romanos等，1992,Yeast 8 :423-488描述。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，是由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止子序列与编码所述多肽的核苷酸序列的3’末端可操作地连接。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何终止子用在本发明中。对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶、 黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。对于酵母宿主细胞优选的终止子从如下酶的基因获得酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C (CYCl)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。对于酵母宿主细胞其它有用的终止子由Romanos等，1992，见上文描述。调控序列还可以是合适的前导序列，其是对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区。前导序列可操作地连接于编码多肽的核苷酸序列的5’-末端。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何前导序列用在本发明中。对于丝状真菌宿主细胞优选的前导序列从如下酶的基因获得米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶。对于酵母宿主细胞合适的前导序列从如下酶的基因获得酿酒酵母烯醇化酶(EN0-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α -因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。调控序列也可以是聚腺苷酸化序列，其是与核苷酸序列的3，末端可操作地连接的序列，并且在转录时，宿主细胞将其识别为信号以将聚腺苷残基添加至转录的mRNA。可以将在所选宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列在本发明中使用。对于丝状真菌宿主细胞优选的聚腺苷酸化序列从如下酶的基因获得米曲霉 TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉α-葡糖苷酶。对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列由Guo和aierman，1995，Molecular Cellular Biology 15 :5983-5990 描述。调控序列还可以是信号肽编码序列，其编码与多肽的氨基末端相连的氨基酸序列，并且指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列5’端可固有地包含信号肽编码序列，其与编码分泌多肽的编码序列片段一起天然地连接在翻译阅读框中。或者， 编码序列5’端可含有对于所述编码序列异源的信号肽编码序列。异源信号肽编码序列在编码序列不天然地含有信号肽编码序列时可为必需的。或者，外源信号肽编码序列可以简单地取代天然信号肽编码序列以增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选宿主细胞的分泌途径(即，分泌至培养基中)的任何信号肽编码序列可在本发明中使用。对于细菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列芽孢杆菌属NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α -淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、地衣芽孢杆菌β -内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT，nprS, nprM)、克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(Bacillus clausii alcaline protease) (aprH)和枯草芽孢杆菌prsA。另外的信号肽由Simonen和Palva, 1993， Microbiological Reviews 57109-137 描述。对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码序列是从如下酶的基因获得的信号肽编码序列米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V和疏棉状腐质霉脂肪酶。对于酵母宿主细胞有用的信号肽从酿酒酵母α -因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。其它有用的信号肽编码序列由Romanos等，1992，见上文描述。在一个优选的方面，信号肽包含SEQ ID NO :2的氨基酸1至20，或者由SEQ ID Ν0: 2的氨基酸1至20组成。在另一个优选方面，信号肽编码序列包含SEQ ID NO 1的核苷酸 1至60，或者由SEQ ID NO 1的核苷酸1至60组成。调控序列还可以是前肽编码序列，其编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得多肽称为酶原(proenzyme)或前多肽(propolyp印tide)(或在某些情况下称为酶原 (zymogen))0前多肽通常是无活性的并且能够通过前肽的催化或自催化切割从前多肽转化为成熟活性多肽。可以从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶 (nprT)、酿酒酵母α-因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉漆酶(W0 95/33836) 的基因获得前肽编码序列。当信号肽和前肽序列二者均出现在多肽的氨基末端时，将前肽序列置于紧接着 (next to)多肽氨基末端，并且将信号肽序列置于紧接着前肽序列的氨基末端。
同样理想的是添加调节序列，其允许相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。 调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激物，包括调节化合物的存在而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac、xyl和trp操纵基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GALl系统。在丝状真菌中，可以使用TAKA α-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些序列包括在氨甲蝶呤(methotrexate)存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，和以重金属(with heavy metal)扩增的金属硫蛋白基因。 在这些情况下，编码多肽的核苷酸序列可与调节序列可操作地连接。表达载体本发明还涉及重组表达载体，所述重组表达载体包含本发明的核酸序列、启动子和转录和翻译终止信号。上述的多种核酸和调控序列可以结合在一起以产生重组表达载体，所述表达载体可以包括一个或多个(几个)方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的核酸序列。或者，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述序列的核酸序列或核酸构建体来表达本发明的核酸序列。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，使得该编码序列与适当的表达调控序列可操作地连接。重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA 步骤，并且能够产生核酸序列的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体(entity)存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体(minichromosome)或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段(means)。或者，载体可以是一种当被引入宿主细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的完整DNA (total DNA)，或可以使用转座子(transposon)。本发明的载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择经转化的细胞。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性(prototrophy to auxotrophs)等。细菌选择性标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性的标记，所述抗生素抗性例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。对于酵母宿主细胞合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、 bar (草铵膦(phosphinothricin)乙酰转移酶)、hph (潮霉素磷酸转移酶)、niaD (硝酸还原酶)(nitrate reductase)、pyrG(乳清酸核苷-5，-磷酸脱羧酶(orotidine-5，-phosphate decarboxylase))、sC(硫酸腺苷酰转移酶)和trpC (邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase))以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和 pyrG 基因禾口吸水链霄菌(Streptomyces hygroscopicus)的 bar 基因。本发明的载体优选含有元件，其允许载体稳定整合入宿主细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。为了整合入宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的核苷酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至10，000碱基对，优选 400至10，000碱基对，并且最优选800至10，000碱基对，其与相应的目标序列具有高度同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可以是非编码或编码的核苷酸序列。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在所述的宿主细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子(r印licator)，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”在本文定义为能够使质粒或载体体内复制的核苷酸序列。细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177 和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUBllO、pE194、pTA1060和 ρΑΜβ 1的复制起点。用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点，ARSl, ARS4，ARSl和 CEN3的组合，和ARS4和CEN6的组合。在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMAl和ANSI (Gems等，1991，Gene 98 :61-67 ;Cullen 等，1987，Nucleic Acids Research 15 :9163-9175；WO 00/24883)。分离AMAl基因和构建包含该基因的质粒或载体能够根据公开于WO 00/24883中的方法完成。可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞以增加基因产物的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂 (selectable agent)存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝的细胞，和由此得到多核苷酸的额外拷贝。用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Sambrook等，1989，见上文)。宿主细胞本发明还涉及重组宿主细胞，其包含本发明的分离的多核苷酸，可有利地用于多肽的重组生产中。将包含本发明的多核苷酸的载体导入宿主细胞，使载体作为染色体整合体或如前所述的自复制的染色体外载体维持。术语“宿主细胞”包括由于复制过程中发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。宿主细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核或真核细胞。原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于，芽孢杆菌属、链球菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、乳杆菌属、乳球菌属、梭菌属、地芽孢杆菌和海洋芽孢杆菌。革兰氏阴性细菌包括但不限于，大肠杆菌、假单胞菌属、沙门氏菌属、弯曲杆菌属、螺杆菌属、黄杆菌属、梭杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属和脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞。在本发明的实施中有用的芽孢杆菌属细胞包括但不限于，嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌细胞。在一个优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌细胞。在一个更优选的方面，细菌宿主细胞是解淀粉芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是克劳氏芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是地衣芽孢杆菌细胞。在另一个更优选的方面，细菌宿主细胞是枯草芽孢杆菌细胞。细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞。在本发明的实施中有用的链球菌属细胞包括但不限于，似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌和马链球菌兽瘟亚种细胞。在一个优选的方面，细菌宿主细胞是似马链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是酿脓链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是乳房链球菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是马链球菌兽瘟亚种细胞。细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞。在本发明的实施中有用的链霉菌属细胞包括但不限于，不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌和浅青紫链霉菌细胞。在一个优选的方面，细菌宿主细胞是不产色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是除虫链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是天蓝链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是灰色链霉菌细胞。在另一个优选的方面，细菌宿主细胞是浅青紫链霉菌细胞。可通过如下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞例如原生质体转化(参见， 例如，Chang 和 Cohen，1979，Molecular General Genetics 168 :111-115)，使用感受态细胞(参见，例如，Young 禾口 Spizizen，1961，Journal of Bacteriology81 :823-829 或 Dubnau 和 Davidoff-Abelson，1971，Journal of Molecular Biology56 :209-221)，电穿孔(参见，例如，Shigekawa 和 Dower, 1988，Biotechniques 6 :742-751)或接合(参见， 例如，Koehler 禾口 Thorne，1987，Journal of Bacteriologyl69 :5771-5278)。可通过如下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞例如原生质体转化(参见，例如，Hanahan, 1983， J. Mol. Biol. 166 :557-580)或电穿孔(参见，例如，Dower 等，1988，Nucleic Acids Res. 166127-6145)。可通过如下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞例如原生质体转化和电穿孔(参见，例如，Gong 等，2004，R)lia Microbiol. (Praha) 49 :399-405)，接合(参见，例如， Mazodier 等，1989，J. Bacteriol. 171 :3583-3585)，或转导(参见，例如，Burke 等，2001， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 :6289-6294)。可通过如下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞，例如电穿孔(参见，例如，Choi等，2006，J.Microbiol. Methods 64:391-397)或接合(参见，例如，Pinedo 和 Smets，2005, Appl. Environ. Microbiol. 71 :51-57)。可通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞，例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry 和 Kuramitsu，1981，hfect. Immun. 321295_1四7)，原生质体转化(参见，例如， Catt 和 Jollick, 1991，Microbios. 68 :189-2070)，电穿孔(参见，例如，Buckley 等，1999， Appl. Environ. Microbiol. 65 :3800-3804)或接合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev. 45 :409-436)。然而，可以使用任何已知的将DNA引入宿主细胞的方法。宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。“真菌”用在本文包括以下门子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)禾口接合菌门(Zygomycota)(如由 Hawksworth 等，于 Ainsworth and Bisby' s Dictionary of The Fungi,8th edition, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK 中所定义)以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等，1995，见上，171页中所引用)，和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi) (Hawksworth 等，1995，见上)。在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。“酵母”用在本文包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)禾口属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽抱纲 (Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在未来可能改变，就本发明而言，将酵母定义为如 Biology and Activities of Yeast (Skinner, F. A. , Passmore, S. M.,禾口 Davenport, R. R.编，Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9,1980)中所述。在一个甚至更优选的方面，酵母宿主细胞是念珠菌属、汉逊酵母属(Hansenula)、 克鲁维酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属或西洋蓍霉属细胞。在一个最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母或卵形酵母细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是解脂西洋蓍霉(Yarrowia lipolytica)细胞。在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门 (Eumycota)和卵菌门的亚门(如由Hawksworth等，1995，见上文，所定义)的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由壳多糖(chitin)、纤维素、葡聚糖、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的菌丝体壁。通过菌丝延伸进行营养生长，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母例如酿酒酵母的营养生长通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行，而碳分解代谢可以是发酵的。在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟蜡菌属、金孢子菌属、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、Filikisidium、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新考玛脂霉属、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属(Wianerochaete)、射脉菌属 (Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、踝节菌属、嗜热子囊菌属/嗜热霉属(Thermoascus)、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。在一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、 构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉细胞。在另一个最优选方面，丝状真菌宿主细胞是杆孢状镰孢、 禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢细胞。在另一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta) > zF iffl lif (Ceriponopsis aneirina) > zF ifa |1 > Ceriporiopsis caregiea> Ceriporiopsis gilvescens> Ceriporiopsis pannocinta> Ceriporiopsis rivulosa、Ceriporiopsis subrufa、虫拟M菌(Ceriporiopsis subvermispora)、B誉角质金 包子菌、 Chrysosporium lucknowense、热带金抱子菌、Chrysosporium merdarium、Chrysosporium inops、|￡金 包子菌、Chrysosporium queenslandicum> Chrysosporium zonatum、灰盖鬼伞 (Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolus hirsutus)、特异腐质霉、疏棉状腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙脉孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Wianer0Chaete chrysosporium), 辐射射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢霉、长绒毛栓菌 (Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、 里氏木霉或绿色木霉细胞。可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化和细胞壁重建的方法以本身公知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适方法在EP238023和^lton φ, 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474 ψ 描述。用于转化镰孢属菌种的合适方法由Malardier等，1989，Gene 78 :147-156和 WO 96/00787描述。可以使用由如下文献描述的方法转化酵母=Becker和Guarente，于 Abelson, J. N.禾口 Simon, Μ. I.编，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, ppl82_187, Academic Press, Inc. , New York ；Ito 等，1983, Journal of Bacteriologyl53 :163 ；禾口 Hinnen 等，1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75 :1920o产生方法本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括(a)在有助于产生多肽的条件下培养宿主细胞；和(b)回收所述多肽。本发明还涉及用于产生本发明的多肽的方法，其包括(a)在有助于产生多肽的条件下培养重组宿主细胞，其中所述宿主细胞包含突变核苷酸序列，其在SEQ ID N0:1的成熟多肽编码序列中具有至少一个突变，其中所述突变核苷酸序列编码多肽，该多肽包含SEQ ID NO 2的成熟多肽或由SEQ ID NO 2的成熟多肽组成，和(b)回收所述多肽。在本发明的产生方法中，使用本领域已知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，则其能够从细胞裂解物(Iysate)回收。可以使用本领域已知的对于所述多肽是特异性的方法来检测多肽。这些检测方法可包括特异性抗体的使用、酯酶产物的形成或酯酶底物的消失。例如，酯酶测定法 (esterase assay)可用于测定如本文所述的多肽的活性。所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purification, J.-C. Janson 禾口 Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York,1989)。植物本发明还涉及转基因的植物、植物部分或植物细胞，其经核酸序列转化，所述核酸序列编码本发明具有酯酶活性的多肽，从而以可回收的量表达和产生所述多肽。多肽可从植物或植物部分回收。或者，同样可以将含有该重组多肽的植物或植物部分用于改进食品或饲料的质量，例如，改进营养价值、适口性(palatability)和流变性质(rheological properties),或用于破坏抗营养因子。在一个具体实施方案中，所述多肽靶向种子中的胚乳储藏液泡。这可通过将其合成为具有合适信号肽的前体来获得，参见Horvath等，于PNASJeb. 15, 2000, vol. 97，no. 4， p.1914-1919。转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)或其经工程改造的变体。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草 (blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属 (Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis (剪股颖属)；和谷类，例如，小麦、 燕麦、黑麦、大麦、稻(rice)、高粱、黑小麦(小、麦(Triticum)和黑麦(Secale)的稳定杂种)和玉蜀黍(maize)(玉米)。双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)如向日葵(Helianthus)、 棉(Gossypium)、羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugar beet)，豌豆，豆(bean)和大豆 (soybean)禾口十字花禾斗的(cruciferous)植物(十字花禾斗(family Brassicaceae)),如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。如例如美国专利5，689，054号和美国专利6，111，168号中所述的低肌醇六磷酸植物是经工程改造的植物的实例。植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(calIus)、叶(leaf)、根(root)、果实(fruit)、种子(seed)和块茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮 (epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyma)、维管组织(vascular tissue)、 分生组织(meristem)。具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质夕卜体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)禾口细胞质(cytoplasm)也被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。同样地，植物部分，如分离以促进本发明的应用的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚(embryo)、胚乳(endosperm)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。同样包含于本发明范围内的还有这些植物、植物部分和植物细胞的后代。表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞可以依照本领域已知方法构建。简言之，通过如下方法构建所述植物或植物细胞将编码本发明多肽的一个或多个表达构建体并入植物宿主基因组，并且将所得的修饰植物或植物细胞繁殖为转基因植物或植物细胞。方便地，表达构建体是包含编码本发明多肽的核酸序列的核酸构建体，所述多核苷酸与在选择的植物或植物部分中表达该核酸序列所需的适当的调节序列可操作地连接。 此外，表达构建体可包含对于鉴定宿主细胞有用的选择性标记，在所述宿主细胞中整合了
24表达构建体和将该构建体引入到所述植物中所必需的DNA序列(后者依赖于使用的DNA引入方法)。调节序列的选择，例如启动子和终止子序列和任选地信号或转运序列的选择，举例来说，基于期望何时、何处以及如何表达多肽而确定。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型的或诱导型的，或可以是发育、阶段或组织特异性的，并且基因产物可以靶向特定的细胞区室、组织或植物部分例如种子或叶。调节序列由例如league等，1988,Plant Physiology 86 :506 所述。对于组成性表达，可以使用下述启动子35S_CaMV启动子(Franck等，1980， Cell 21 :285-294)、玉米泛素 1 (Christensen AH, Sharrock RA 和 Quail 1992，. Maize polyubiquitin genes structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing,and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation)或稻肌动蛋白 1 启动子(Plant Mo. Biol. 18 ，675-689. ；Zhang 等，W, McElroy D. and Wu R 1991,Analysis of rice Actl 5' region activity in transgenic rice plants. Plant Cell 3, 1155-1165) 0器官特异性启动子可以是例如来自贮藏库组织(storage sink tissue)例如种子、马铃薯块茎和果实的启动子(Edwards & Coruzzi, 1990，Ann. Rev. Genet. 24 :275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissue)例如分生组织的启动子(Ito等，1994，Plant Mol. Biol. 24 :863-878)，种子特异性启动子诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)、醇溶蛋白(prolamin)、球蛋白(globulin)或白蛋白(albumin) 启动子(Wu 等，1998，Plant and Cell Physiology 39 :885-889)，来自豆球蛋白(Iegumin) B4和蚕豆(Vicia faba)的未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998，Journal of Plant Physiology 152 :708-711)、来自种子油体蛋白(oil body protein)的启动子(Chen 等，1998，Plant and Cell Physiology 39 :935-941)，来自欧洲油菜(Brassica napus)的贮藏蛋白napA启动子，或本技术领域公知的任何其他种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或番茄的 rbcs 启动子(Kyozuka 等，1993，Plant Physiologyl02 :991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra 和 Higgins， 1994，Plant Molecular Biology 洸85-93)，或来自稻的 aldP 基因启动子(Kagaya 等， 1995, Molecular and general genetics 248 :668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯 pin2 启动子(Xu 等，1993，Plant Molecular Biology 22:573-588)。同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理如温度、干旱或盐度变化，或通过外源施加的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones) 如乙烯、脱落酸(abscisic acid)、赤霉酸(gibberellic acid)和/或重金属。启动子增强子元件也可以用于实现酶在植物中的较高表达。例如，启动子增强子元件可以是内含子，其置于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间。例如Xu等，1993， 见上文，公开了使用稻肌动蛋白1基因的第一内含子以增强表达。仍进一步，可对于所讨论的植物物种优化密码子的使用以改善表达(参见上文引用的Horvath等)。选择性标记基因和表达构建体的任何其它部分可以选自本领域内可得到的那些。将核酸构建体根据本领域已知的常规技术并入植物基因组，所述常规技术包括土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射(microinjection)、 粒子轰击、生物射弹转化和电穿孔(Gasser等，1990，Science 244 1293 ；Potrykus, 1990, Bio/Technology 8 535 ；Shimamoto 等，1989, Nature 338 274)。目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的基因转移(gene transfer)，是产生转基因双子叶植物的优选方法(为了参考，见Hooykas和khilperoort， 1992，Plant Molecular Biology 19 :15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物其他的转化方法是更加常用的。目前，除了土壤杆菌属方法外，产生转基因单子叶植物的优选的方法，是用粒子(用转化DNA涂覆的微观的金或钨粒子)轰击胚愈伤组织 (embryonic calli)或发育中白勺(developing embryos) (Christou, 1992,Plant Journal 2 :275-281 ；Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5 :158-162 ；Vasil 等， 1992, Bio/Technology 10 :667-674)。转化单子叶植物的可供选择的方法是基于原生质体转化，如由 Omirulleh 等，1993，Plant Molecular Biology 21 :415-4所描述的。转化之后，根据本领域熟知的方法选择具有并入其中的表达构建体的转化体并且再生成为完整植物。通常设计转化方法用于通过如下方法在再生期间或在后续世代中选择性消除选择基因例如，使用带有两种独立的T-DNA构建体的共转化或通过特异性重组酶位点特异性地切除选择基因。本发明还涉及用于产生本发明多肽的方法，其包括(a)在有助于产生多肽的条件下培养包含核酸序列的转基因植物或植物细胞，所述核酸序列编码本发明具有酶活性的多肽；和(b)回收所述多肽。组合物在仍进一步的方面，本发明涉及包含本发明的多肽的组合物。可以依照本领域内已知的方法制备多肽组合物，并且可以是液体或干组合物的形式。例如，所述多肽组合物可以是颗粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。可以依照本领域内已知方法将包含于所述组合物中的多肽稳定化。下面给出的是本发明的多肽或多肽组合物的优选用途的实例。动物饲料本发明还涉及在动物饲料中使用具有酯酶活性的多肽的方法，以及涉及包含本发明多肽的饲料组合物和饲料添加剂术语动物包括所有动物，包括人。动物的实例为非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括，例如，动物如绵羊、山羊和牲畜(cattle)，例如牛(cow)如肉牛和奶牛。在一个具体实施方案中，动物是非反刍动物。非反刍动物包括单胃动物，例如猪(Pig or swine)(包括但不限于，小猪、饲育猪(growing pig)和母猪)；家禽如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉仔鸡(broiler chick)、蛋鸡)；鱼(包括但不限于鲑鱼、鳟鱼、罗非鱼、鲶鱼和鲤鱼)；和甲壳类动物(包括但不限于小虾(shrimp)和对虾(prawn))。术语饲料或饲料组合物意指任何适合或旨在由动物摄取的化合物、制备物、混合物或组合物。在本发明的用途中，酯酶可在饮食之前、之后或同时饲喂予动物。后者是优选的。在一个具体实施方案中，所述酯酶在其添加至饲料或包含于饲料添加物时的形式是明确限定的。明确限定意指酯酶制备物如通过尺寸排阻色谱确定为至少50%纯(参见W001/58275的实施例12)。在其他具体实施方案中，所述酯酶制备物如通过该方法确定为至少 60、70、80、85、88、90、92、94 或至少 95%纯。明确限定的酯酶制备物是有利的。举例而言，将基本上不含干扰或污染的其他酯酶的酯酶正确剂量添加于饲料中是容易得多的。术语正确剂量添加特别指获得一致和恒定结果的目标，以及基于所需的效果优化剂量的能力。然而，对于在动物饲料中的用途，所述酯酶无需如此之纯；其可例如包含其他酶， 在此情况下其称为酯酶制备物。所述酯酶制备物可(a)直接添加至饲料(或直接用于蛋白质的处理工艺)或(b) 可用于产生一种或多种后续添加至饲料(或用于处理工艺)的中间组合物如饲料添加剂或预混物(premix)。上述的纯度指原始酯酶制备物的纯度，无论是根据上述(a)或(b)使用的。具体而言，具有该数量级的纯度的酯酶制备物可使用重组产生方法获得，而当通过传统发酵方法产生该酯酶时，其并不那么容易获得，且其批次间(batch-to-batch)差异要高得多。当然，此种酯酶制备物可与其他酶混合。可以任何形式将酯酶添加至饲料，无论其为相对纯的酯酶或与其他旨在添加至动物饲料的组分一同混合，即以动物饲料添加剂的形式，如所谓用于动物饲料的预混物。在一个进一步的方面，本发明涉及用于动物饲料的组合物，如动物饲料和动物饲料添加剂，例如预混物。除了本发明的酯酶，本发明的动物饲料添加剂包含至少一种脂溶性维生素和/ 或至少一种水溶性维生素，和/或至少一种痕量元素和/或至少一种常量矿物质(macro mineral)0此外，可选的饲料添加剂成分为着色剂，例如类胡萝卜素如胡萝卜素、虾青素和叶黄素；香料化合物；稳定剂；抗微生物肽；多不饱和脂肪酸；产活性氧类物质；和 /或至少一种其他选自下组的酶肌醇六磷酸酶(EC 3. 1.3. 8或3. 1. 3. 26)；木聚糖酶 (EC 3. 2. 1. 8)；半乳聚糖酶(EC 3. 2. 1. 89) ；α-半乳糖苷酶(EC 3. 2. 1. 22)；蛋白酶(EC 3. 4.)；磷脂酶 Al (EC 3. 1. 1. 32)；磷脂酶 A2(EC3. 1. 1. 4)；溶血磷脂酶(EC 3. 1. 1. 5)；磷脂酶C(EC 3. 1. 4. 3)；磷脂酶D(EC 3. 1. 4. 4)；淀粉酶如例如α -淀粉酶(EC 3. 2. 1. 1) ； β -葡聚糖酶(EC 3. 2. 1. 4或EC 3. 2. 1. 6)和/或阿拉伯呋喃糖苷酶(EC 3. 2. 1. 55)。在一个具体实施方案中，这些其他酶是明确限定的(如上述对于酯酶制备物所定义的)。抗微生物肽(AMP)的例子有CAP18、Leucocin A(明串珠菌素A)、Tritrpticin, Protegrin-I、Thanatin (死亡素)、防卫素(Defensin)、Lactoferrin (乳铁蛋白)、 Lactoferricin(乳铁 素)禾口 Ovispirin 如 Novispirin(Robert Lehrer，2000)、 Plectasins (菌丝霉素)、和 Statins (他汀类)，包括 WO 03/044049 和 WO 03/048148 中公开的化合物和多肽，以及上述各项的保留抗微生物活性的变体或片段。多不饱和脂肪酸的例子有C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸、二十二碳六烯酸(docosohexaenoic acid)、二十碳五烯酸和Y -亚油酸。产活性氧类物质的例子是化学品如过硼酸盐(perborate)、过硫酸盐(persulphate)或过碳酸盐(percarbonate)；和酶如氧化酶、加氧酶或合成酶。
通常，脂溶性和水溶性维生素以及痕量矿物质形成旨在加入饲料中的所谓预混物的部分，而常量矿物质通常分开地添加到饲料中。这些组合物类型之任一，当富含本发明的酯酶时，为本发明的动物饲料添加剂。 在一个具体的实施方案中，本发明的动物饲料添加剂旨在以0. 005至10 %，具体而言0. 01至5 %，更具体而言0. 02至2 %，且甚至更具体而言0. 2至1 %的水平包含于(或被规定为必须包含于)动物饮食或饲料中(％表示每IOOg饲料的g添加剂)。对于预混物而言尤其如此。下面是这些组分的实例的非排他性列表脂溶性维生素的例子有维生素A、维生素D3、维生素E和维生素K，例如维生素K3。水溶性维生素的例子有维生素B12、生物素和胆碱、维生素Bi、维生素B2、维生素 B6、烟酸、叶酸和泛酸(盐)、例如Ca-D-泛酸。痕量矿物质的例子有锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。常量矿物质的例子有钙、磷和钠。这些组分的营养需要量(以家禽和小猪/猪为例)在WO 01/58275的表A中列出。 营养需要量是指这些组分应以指明的浓度在饮食中提供。或者，本发明的饲料添加剂包含WO 01/58275的表A中指定的各单独组分中的至少一种。至少一种意指任一种，一种或多种，一种，或两种，或三种，或四种，依此类推多至全部13种，或多至全部15种单独组分。更具体地说，该至少一种单独组分以这样的量包含在本发明的添加剂中，从而提供如表A的第4栏、或第5栏或第6栏所示范围内的饲料中浓度 (in-feed-concentration)0本发明还涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或饮食具有相对高含量的蛋白质。家禽和猪用饮食可以如WO 01/58275的表B中所示来表征。鱼用饮食可以如该表B的第4栏所示来表征。此外，此类鱼用饮食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。WO 01/58275对应于美国专利第6，960，462号，在此通过提述将其并入本文。根据本发明的动物饲料组合物的粗蛋白含量为50_800g/kg，并且还包含至少一种如本文中要求保护的酯酶。此外，或者(作为上述粗蛋白含量的替代)，本发明的动物饲料组合物的可代谢能量含量为10-30MJ/kg ；和/或钙含量为0. l-200g/kg ；和/或有效磷含量为0. l_200g/kg ； 和/或甲硫氨酸含量为0. l-100g/kg ；和/或甲硫氨酸加半胱氨酸含量为0. l-150g/kg ；和 /或赖氨酸含量为0. 5-50g/kg。在具体的实施方案中，可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸、和/或赖氨酸的含量为WO 01/58275的表B中范围2、3、4或5 (第2_5行)之任一者之内。粗蛋白如下计算氮(N)乘以因数6. 25，即粗蛋白(g/kg) =N(g/kg)x 6. 25。氮含量用凯氏定氮法(A. 0. A. C.，1984，Official Methods of Analysis 第 14 版，Association of Official Analytical Chemists, Washington DC)来测定。可代谢能量可基于下列文献来计算NRC publication Nutrient requirements in swine,修订的第 9 版，subcommittee on swine nutrition, committee on animalnutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press，Washington，D. C.，pp. 2—6，禾口 European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt centre for poultry research and extension,7361DA Beekbergen,The Netherlands. Grafisch bedrijf Ponsen &looijen bv,ffageningen. ISBN 90-71463-12-5。钙、可用磷、和氨基酸在完全动物饮食中的饮食含量基于如Veevoedertabe 1 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6,8219pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7等的饲料表来计算。动物饮食可以作为例如碎饲料(mash feed)(未制粒的)或制粒的饲料来制备。通常，将经过粉碎的饲料物料混合，并根据所述物种的具体规格加入足够量的必需维生素和矿物质。酶可以作为固体或液体酶配制物加入。例如，固体酶配制物通常在混合步骤之前或过程中加入，而液体酶制备物通常在制粒步骤之后加入。酶也可以掺入饲料添加剂或预混物中。饮食中的最终酶浓度是在每kg饮食0. 01-200mg酶蛋白的范围内，例如在 0. 2-30mg的范围内，优选每kg动物饮食0. 5至1. 5mg酶蛋白。对于包含木聚糖酶和酯酶的酶组合物，最终酶浓度通常为每kg动物饮食0. 5至lmg。毫无疑问，酯酶可以以有效量施用，即以足以改善饲料溶解和/或改善饲料营养价值的量施用。目前涵盖了酶以一种或多种下述量(剂量范围)施用0.01-200;
0. 01-100 ；0. 5-100 ； 1-50 ；5-100 ；10-100 ；0. 05-50 ；或 0. 10-10-所有范围为每 kg 饲料
的mg酯酶蛋白(ppm)。为了确定每kg饲料的mg酯酶蛋白，将酯酶从饲料组合物纯化，并使用相关测定法 (参见下述酯酶测定部分)确定所述纯化的酯酶的比活性。饲料组合物本身的酯酶活性也使用相同测定法确定，并基于此两种确定，计算了以每kg饲料的mg酯酶蛋白计的剂量。
相同原则适用于确定饲料添加剂中的mg酯酶蛋白。毫无疑问，如果可获得用于制备所述饲料添加剂或所述饲料的酯酶的样品，则从该样品确定所述比活性(无需从饲料组合物或添加剂纯化酯酶)。
实施例试剂、培养基和设备mi 除非另行指明，所用的化学品为至少试剂级的商业产品。pNP-底物pNPB 丁酸对硝基苯酯(p-Nitrophenyl Butyrate) (Sigma N9876),pNPA:乙酸对硝基苯酯(p-Nitrophenyl Acetate) (Sigma N8130)，pNPP 棕榈酸对硝基苯酯(p-Nitrophenyl palmitate) (Sigma N2752)，pNNAG 对硝基苯基N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷(p-Nitrophenyl N-Acetyl-β -D-Glucosaminide)(Sigma N9376)。EDTA (Gibco BRL 目录号 15576-028)IPTG (Promega,目录号 V3951)
X-gal (Promega,目录号 V3941)氨苄青霉素钠盐(GIBC0L目录号11593-019)LMP 琼脂糖(!Iomega，目录号 V2111)BETEB 对苯二甲酸二 O-羟乙基)酯二苯甲酸酯(Tei^phthalic acid bis (2-hydroxyethyl) ester dibenzoate)在本文中缩写为BETEB (苯甲酰-亚乙基-对苯三甲酸 _ 亚乙基一苯甲酸酉旨(benzoyl-ethylene-terephthalic-ethelene-benzoate))。其从对苯二甲酸二(2-羟乙基)酯和苯甲酸制备。培养基LB液体培养基向950ml的去离子H2O添加IOg细菌蛋白胨，5g细菌酵母提取物， IOg NaCl。振荡直至溶质溶解。用5N NaOH( 0. ^il)将pH调整至7.0。用去离子H2O将溶液体积调整至1升。以液体循环在151b/sq. in.进行高压灭菌20分钟。含氨苄青霉素/IPTG/X-Gal的LB平板将15g琼脂糖添加至1升的LB培养基。 添加氨苄青霉素至终浓度100 μ g/ml，然后补充0. 5mM IPTG和80 μ g/ml X-gal并铺板。SOC液体培养基2%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，IOmM NaCl, 2. 5mMKCl,10mM MgCl2, IOmM MgSO4, 20mM 葡萄糖TAE 缓冲液0. 04M Tris-乙酸，0. 001M EDTA1 % LMP琼脂糖凝胶将Ig LMP琼脂糖添加入100ml 1 XTAE缓冲液。YS培养基向1升水添加10g蛋白胨，IOg酵母提取物，5g葡萄糖，5g K2HPO4, Ig MgSO4. 7H20, 20ml 橄榄油。MD 培养基1. 34% YNB，4X10_5%生物素，2%右旋糖BMGY(缓冲的甘油复合培养基，Buffered Glycerol-complex Medium) ；酵母提取物，2%蛋白胨，IOOmM磷酸钾(pH6. 0),1. 34% YNB，4xl(T5%生物素，1 %甘油BMMY(缓冲的甲醇复合培养基，Buffered Methanol-complex Medium) 酵母提取物，2%蛋白胨，IOOmM磷酸钾(pH 6. 0)，1. 34% YNB，4xl(T5%生物素，0. 5%甲醇。设备，包括各种试剂盒5Κ 膜(Millipore ΒΙ0ΜΑΧ-5,13442ΑΜ)0. 45 μ m 过滤器(Nalgene 190-2545)0. 45 μ m 聚碳酸酯过滤器(Sartorius)Q Sepharose FF 柱(Amersham Pharmacia 17-0510-01)Superdex75 柱(Amersham Pharmacia 17-1047-01)Superdex Peptide PE (7. 5x 300mm)凝胶过滤柱(Global)IEF-凝胶(Amersham Pharmacia 80-1124—80)Thermomixer Comfort (Eppendorf)Spectrophotometer DU7500(Beckman)GeneAmp PCR System 9700 (PE)Vac-Man Jr. Laboratory Vacuum Manifold (Promega,目录号 A7660)BioRad GenePulser IIRNeasy Plant Mini Kit (50) (QIAGEN,目录号 74904)DNeasy Plant Mini Kit (50) (QIAGEN,目录号 69104)
3，RACE Kit(GIBC0,目录号 18373-019)，包含 Adapter 引物和 AUAPdNTP 混合物(lOOmM，Promega,目录号 U1330)TaqDNA聚合酶系统(Promega，目录号 M1661)，包含PCR缓冲液 QOOmOTris-HCl (pH 8. 4), 500mM KCl)PCR Preps DNA Purification System (Promega,目录号 A7170)pGEM-T Vector System (Promega,目录号 A3600)，包含 T4DNA Ligase 2XBufferJM109高感受态细胞(!Iomega，目录号L1001)ElectroMaxDH10B 感受态细胞(Invitrogen,目录号 18290-015)Minipreps DNA Purification System (Promega,A7100)BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit(PE Applied Biosystems,目录号 4303149)DNA WalkingSpeedUp Kit(SeeGene,目录号 #K1502)ABI Prism 377DNA 测序仪(PE)pfu DNA 聚合酶系统(!Iomega，目录号 M7741)SnaB I(Promega R6791)Not I(Promega R6431)Bgl II(Promega R6071)实施例1 酯酶测定法琼脂糖平板测定法含有磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液pH 8. 5中的琼脂糖，0. 1 % BETEB的琼脂糖平板；将20 μ 1样品施于含BETEB底物的琼脂糖平板中的d = 4mm的孔，在45°C温育12-16小时，通过清晰的晕图(halo)鉴定酶活性。BETEB fopendorf 管测定法将0. 08% BETEB底物的溶液在搅拌下悬于Tri-HCl缓冲液pH 8. 5中(对于实施例4中的pH分布部分，使用pH 3至pH 11的缓冲液系统代替)。将溶液在搅拌下分配于 Eppendorf 管中(每孔 100 μ 1)，添加 30 μ 1 酶样品，并在Eppendorf Thermomixer 中在 50°C 以1200rpm温育平板30分钟。使用变性的酶样品(在100°C煮沸20分钟)作为空白。在温育之后，通过将管转移至冰上来终止反应，然后在4°C以IOOOOrpm离心10分钟。将60 μ 1 的上清转移至微滴定板，并使用BioRad Microplate Reader测量230nm处的吸光度。等电聚焦等电聚焦是在预制的Ampholine PAG 平板 pH 3. 5-9. 5 (Pharmacia, Sweden)中根据生产商的指示进行的。将样品以一式三份施用，并在电泳之后，将凝胶一分为三。将含有
琼脂糖和缓冲液PH 8. 5中的0. BETEB的覆盖物(overlay)倾至每部分凝胶之上。 在45°C温育12-16小时。通过清晰区鉴定酶活性和酶蛋白的pi。在pNPB底物中确定酯酶活性使用丁酸对硝基苯酯作为底物确定酯酶活性。将酶制备物稀释以提供丁酸对硝基苯酯少于15%的转化，即在1. 5ml微离心管中用50mM乙酸钠pH 5. 0进行起始稀释，接着用 50mM乙酸钠pH 5. 0进行2倍系列稀释。然后将稀释酶的100 μ 1等分试样转移至96孔板的孔。
丁酸对硝基苯酯储液是通过将丁酸对硝基苯酯溶解于二甲亚砜(DMSO)以构成 0. IM溶液而制成的。在测定之前，将储液样品在50mM乙酸钠pH 5. 0中稀释100倍以制成 ImM溶液。将100 μ 1体积的ImM 丁酸对硝基苯酯与每个酶稀释物混合，然后在25°C温育10 分钟。将底物本身、酶本身和缓冲液本身作为对照运行。将0. 25,0. 2,0. 1,0. 05和0. 02mM 的对硝基苯酚标准溶液通过将IOmM储液稀释于50mM乙酸钠pH 5. 0来制备。在10分钟时， 将50 μ 1的1. OM Tris-HCl pH 8. 0缓冲液添加至每个孔(包括样品、底物对照、酶对照、试剂对照和标准)，混合，并在微滴定板读数器(BioRad)上立即测量405nm处的吸光度。一个单位的酯酶活性定义为在PH 5，25°C每分钟能够释放1微摩尔对硝基苯酚盐阴离子的酶量。实施例2 漆斑菌属菌种菌株的培养对于接种，将真菌菌种漆斑菌属菌种菌株在YS琼脂糖平板(10g/L蛋白胨，IOg/ L 酵母提取物，5g/L 葡萄糖，5g/L K2HPO4, lg/L MgSO4. 7H20，20g/L 琼脂，pH 6. 5)上在 25°C 生长7日并储藏于4°C，然后用于接种摇瓶。对于粗酶产生，将菌株接种于含50ml YS培养基(10g/L蛋白胨，10g/L酵母提取物，5g/L葡萄糖，5g/L K2HPO4, lg/L MgSO4. 7H20，橄榄油， PH 6. 5)的500ml摇瓶，并在25°C和160rpm下温育7日。通过离心收获发酵液(在4°C以 4000rpm进行20分钟)。实施例3 来自漆斑菌属菌种菌株的酯酶的纯化将来自实施例2的1200ml上清用硫酸铵(80%饱和)沉淀，并重新溶解于40ml 25mM Tris-HCl, pH 7. 4缓冲液。将所得的溶液对25mM Tris-HCl缓冲液(pH8. 0)透析以去除盐。最终体积为50ml。将浓缩的酶溶液加载于用25mM Tris-HCl缓冲液，pH 8. 0平衡的Mono Q阴离子交换柱，然后用O-IMNaCl的线性梯度洗脱蛋白质。就^Onm处的吸收检查来自柱的流出物，并通过BETEB平板测定法在pH 8. 5测定级分的酶活性。将具活性的级分汇集并浓缩，然后将上述经浓缩的级分上样于之前用25mM Tris-HCl缓冲液，pH 8. 0平衡的Superdex 75凝胶过滤柱，并用相同缓冲液洗脱蛋白。在酶测定之后，汇集具活性的级分，将其再次浓缩并对20mM乙酸钠缓冲液，pH 5.0进行透析。将经透析的样品施于第三个柱，用20mM乙酸钠缓冲液，pH 5.0平衡的Mono Q0用0_1M NaCl的线性梯度洗脱蛋白。最终，汇集具活性的级分并将其用于表征。在上述纯化步骤之后，收集样品，并对其就两种活性(琼脂糖平板测定法和用 BETEB的覆盖物技术)还有纯度(SDS PAGE和IEF凝胶)进行检查，然后用于表征。在SDS PAGE上，发现了 4个大约在分子量60kDa左右的蛋白条带，并假定其为对应的酶蛋白。对这些酶条带进行电印迹，并确定其N端序列。发现这4个蛋白条带具有相同的 N 端序列SCSPEVFSSVGIPKGEVL。在运行IEF凝胶之后的BETEB底物的覆盖物显示有单个具有约pH 3. 5的pi的活性级分。根据相同的N端序列和相同的pi推出结论其为相同的蛋白。实施例4 漆斑菌属菌种菌株的酯酶的表征温度分布温度和酶活性之间的关系是使用P-NPB和BETEB两种测定来评价的。酶在20至70°C的广泛温度范围内具活性，并表现为在50_60°C左右具有其最优温度。
pH 分布pH和酶活性之间的关系是使用实施例1的p-NPB和BETEB两种测定用pH3至pHll 的缓冲系统来进行评价的。酶表现为在pH 4至10的广泛pH范围内具活性。最优pH是约8_9。溫度稳定件对于温度稳定性测量，将酶在60度温育不同时间(0、1、3、4、6、7、14和24小时)， 然后使用PNPB作为底物在pH 8. 5测定酶活性。酶表现为稳定的。甚至在60度温育7小时之后仍具有大约30%的残留活性。DNP底物特异件所述酶的底物特异性是使用不同底物包括几种pNP底物(丁酸对硝基苯酯(Sigma N9876)，乙酸对硝基苯酯(Sigma N8130)，棕榈酸对硝基苯酯(SigmaN275》，对硝基苯基 N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷(Sigma N9376)，鞣质，BETEB)来进行评价的。结果示于下述表1。表1本发明的酶的底物特异性的比较
权利要求
1.一种具有酯酶活性的分离的多肽，所述多肽选自下组(a)包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQID NO :2的成熟多肽具有至少 45%同一性；(b)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少中严格条件下与以下杂交(i)SEQ ID NO 1的成熟多肽编码序列，(ii)包含于SEQ ID NO 1的成熟多肽编码序列中的cDNA序列，或(iii)⑴或( )的全长互补链；(c)由多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQID NO :1的成熟多肽编码序列具有至少45%同一性的核苷酸序列；(d)SEQID NO :2的成熟多肽的包含取代、缺失和/或插入一个或几个氨基酸的变体。
2.权利要求1的分离的多肽，其具有与SEQID NO :2的成熟多肽具有至少50%，或 55%，或 60%，或 65%，或 70%，或 75%，或 80%，或 85%，或 90%，或 95%，或 98% 同一性的氨基酸序列。
3.权利要求1的分离的多肽，包含SEQID NO 2的氨基酸序列，或由SEQ ID NO 2的氨基酸序列组成。
4.权利要求1的分离的多肽，包含SEQID NO 2的成熟多肽，或由SEQ ID NO 2的成熟多肽组成。
5.一种分离的多核苷酸，包含编码权利要求1的多肽的核酸序列。
6.权利要求5的分离的多核苷酸，包含编码SEQID NO :2的成熟多肽的核酸序列。
7.权利要求5的分离的多核苷酸，包含SEQID NO :1的成熟多肽编码序列或由SEQ ID NO 1的成熟多肽编码序列组成。
8.—种核酸构建体，其包含与一种或多种调控序列可操作地连接的权利要求5-7任一项的多核苷酸，所述调控序列在合适的表达宿主中指导所述多肽的产生。
9.一种重组表达载体，其包含权利要求8的核酸构建体。
10.一种重组宿主细胞，其包含权利要求8的核酸构建体或权利要求9的载体。
11.一种转基因植物或植物部分，能够表达权利要求1至4中任一项的多肽。
12.—种转基因非人动物，或其产物或元件，能够表达权利要求1至4中任一项的多肽。
13.一种用于产生权利要求1至4中任一项的多肽的方法，所述方法包括(a)培养权利要求10的重组宿主细胞以产生包含所述多肽的上清；(b)回收所述多肽。
14.权利要求1至4中任一项的多肽在动物饲料中的用途。
15.权利要求1至4中任一项的多肽在制备用于动物饲料的组合物中的用途。
16.一种用于改善动物饲料营养价值的方法，其中将至少一种权利要求1至4中任一项的多肽添加至所述动物饲料。
17.一种组合物，其包含至少一种权利要求1至4中任一项的多肽，和(a)至少一种脂溶性维生素，和/或(b)至少一种水溶性维生素，和/或(c)至少一种痕量矿物质。
18.权利要求17的组合物，其进一步包含淀粉酶、肌醇六磷酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α -半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶、β -葡聚糖酶和/或阿拉伯呋喃糖苷酶。
19.权利要求17或18的组合物，其为动物饲料添加剂。
20.一种动物饲料组合物，其包含权利要求1至4中任一项的多肽或权利要求17至19 中任一项的组合物。
21.一种用于改善动物饲料营养价值的方法，其中将权利要求1至4中任一项的多肽或权利要求17至19中任一项的组合物添加至所述饲料。
全文摘要
本发明涉及具有酯酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及用于产生和使用所述多肽的方法。
文档编号C12N9/16GK102361973SQ201080012864
公开日2012年2月22日 申请日期2010年1月15日 优先权日2009年1月21日
发明者D.彼得森, 刘晔, 吴文平, 汤岚 申请人:诺维信公司