专利名称：具有佐剂活性的新型核酸及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种含有佐剂活性的新型核酸以及含有该核酸的药物组合物、IFN-β 表达促进剂、NK细胞活化剂、细胞阻断性T细胞诱导剂、免疫赋活剂、疫苗佐剂以及癌治疗药。
背景技术：
作为一种癌症的治疗法有所谓的癌症免疫疗法，该方法提高对患者自身的癌细胞的免疫力，诱导癌的衰退。该癌症免疫疗法的主流是给予作为癌抗原的肽疫苗的方法，但作为提高有效率的方法提倡在给予癌抗原的同时给予活化树突状细胞的佐剂。
本发明人针对用于癌免疫疗法中的佐剂进行研究，发现来源于麻疹病毒的diRNA (defective interference RNA)具有佐剂的功能,并公开在专利文献I中。具体来说是, 该diRNA针对人细胞，诱导IFN- β表达，增强NK细胞的NK活性，和癌抗原表位一起对已移植Β16黑色素瘤细胞的患癌小鼠给与时，表现出显著的癌衰退效果。但是，因为细胞外的该 diRNA不能到达内体上的TLR3 (Toll样受体3，Toll-1ike受体3)，因此在细胞外给药时， 发现佐剂活性不充分的问题。另一方面，作为TLR3的合成配体而周知的聚IC (聚肌胞)虽然即使在细胞外给药也具有很强的佐剂活性，但是担心有细胞因子过剩产生(细胞因子风暴)等副作用，存在不能应用于临床的问题。
另一方面，本发明人发现了寡核苷酸(Oligo DNA)，该寡核苷酸可阻断聚IC通过 TLR3来诱导IFN-β表达，并报道了该寡核苷酸通过和聚IC共同的受体进入到细胞内，进入的寡核苷酸一部分局部存在于TLR3 (非专利文献I)。但是，在非专利文献I中没有记载该 寡核苷酸和其他核酸连接而送达到内体上的TLR3的启示，不能预测非专利文献I中所述的寡核苷酸与专利文献I中所述的具有茎环结构的diDNA连接而是否能够送达至内体上的 TLR3。
专利文献1:国际公开第2008/065752号
非专利文献1:The Journal of Immunology, 2008, 181:5522-5529 发明内容
本发明的目的在于提供一种副作用少，可到达内体上的TLR3，且具有很强佐剂活性的核酸。
本发明为了解决上述课题，包含以下各发明。
[I] 一种核酸，至少包括送达至树突状细胞的内体的单链DNA和具有TLR3活化能力的双链RNA。
[2]根据所述[I]中所述的核酸，所述单链DNA为以下(a) ⑷中的任意一个，
(a)具有TLR9配体活性的B型或C型CpG-DNA ；
(b)在上述(a)中将CpG转换为GpC的DNA ；
(c)在上述(b)中将GpC转换为TpC的DNA ；
(d)在上述(b)中将GpC转换为CpC的DNA。
[3]根据所述[2]中所述的核酸，其特征在于，所述单链DNA包括序列号I 4、 11 14中任意一种所示的碱基序列或该碱基序列的部分序列。
[4]根据所述[I] [3]中任意一项所述的核酸，其特征在于，所述单链DNA具有 15个碱基以上的长度。
[5]根据所述[I] [4]中任意一项所述的核酸，其特征在于，构成所述单链核酸 DNA的核苷酸的全部或一部分经硫代磷酸酯修饰。
[6]根据所述[I] [5]中任意一项所述的核酸，其特征在于，所述具有TLR3活化能力的双链RNA具有来源于RNA病毒的RNA序列。
[7]根据所述[6]中所述的核酸，其特征在于，所述RNA病毒选自麻疹病毒、仙台病毒、RS病毒、丙肝病毒、脊髓灰质炎病毒以及轮状病毒。
[8]根据所述[7]中所述的核酸，其特征在于，所述具有TLR3活化能力的双链RNA 为包括序列号5 7、15 20中的任意一个所示的碱基序列或其互补序列组成的RNA。
[9]根据所述[8]中任意一项所述的核酸，其特征在于，所述具有TLR3活化能力的双链RNA具有40 200个碱基对的长度。
[10]根据所述[9]中任意一项所述的核酸，其特征在于，所述单链DNA和所述双链 RNA通过接头序列连接。
[11]根据所述[I] [9]中任意一项所述的核酸，其特征在于，所述单链DNA和所述双链RNA直接连接。
[12] 一种药物组合物，含有所述[I] [11]中任意一项所述的核酸。
[13] 一种IFN-β表达促进剂,含有所述[I] [11]中任意一项所述的核酸作为有效成分。
[14] 一种NK细胞活化剂，含有所述[I] [11]中任意一项所述的核酸作为有效成分。
[15] 一种细胞阻断性T细胞诱导剂，含有所述[I] [11]中任意一项所述的核酸作为有效成分。
[16] 一种免疫赋活剂，含有所述[I] [11]中任意一项所述的核酸作为有效成分。
[17] 一种疫苗佐剂，含有所述[I] [11]中任意一项所述的核酸作为有效成分。
[18] 一种癌症治疗药，含有所述[I] [11]中任意一项所述的核酸作为有效成分。
[19] 一种癌症治疗方法，对哺乳动物给予上述[I] [11]中任意一项所述的核酸的有效量。
[20]所述[I] [11]中任意一项所述的核酸在制备癌症治疗药中的应用。
[21]所述[I] [11]中任意一项所述的核酸在治疗癌症中的应用。
根据本发明，可提供一种副作用小，可达到内体上的TLR3，具有强的佐剂活性的核酸。因为可促进IFN-β的表达、活化NK细胞、诱导细胞阻断性T细胞，所以本发明的核酸作为免疫赋活剂、疫苗佐剂的有用性高。另外，由于在单独给药时有好的肿瘤衰退效果，因此作为癌症治疗药有用。
图1为表示使用不含FCS的培养基并评价本发明的核酸对IFN- β启动子活化的结果的图。
图2为表示使用含FCS的培养基并评价本发明的核酸对IFN-β启动子活化的结果的图。
图3为表示评价本发明的核酸对移植荷瘤的衰退效果的试验(第一次)结果的图， Ca)为蒸馏水(DW)给药组的结果、(b)为聚IC给药组的结果、(C)为核酸2给药组的结果、 Cd)为核酸3给药组的结果。
图4为表示评价本发明的核酸对移植荷·瘤的衰退效果的试验(第二次)结果的图， Ca)为蒸馏水(DW)给药组的结果、(b)为聚IC给药组的结果、(C)为核酸I给药组的结果、 Cd)为核酸2给药组的结果、Ce)为核酸I的内体转移序列(核酸10DN)给药组的结果。
图5为表示评价本发明核酸中双链RNA的长度对IFN- β启动子性能的影响的结果的图。
图6 (A)为表示使用含FCS的培养基并评价本发明核酸中内体转移序列(单链DNA) 的碱基序列对IFN-β启动子活化的影响的结果的图。
图6(B)为表示使用不含FCS的培养基并评价本发明核酸中内体转移序列(单链 DNA)的碱基序列对IFN-β启动子活化的影响的结果的图。
图7为表示使用不含FCS的培养基并评价本发明核酸中内体转移序列(单链DNA) 的长度对IFN-β启动子活化的影响的结果的图。
图8(A)为表示使用含FCS的培养基并评价本发明核酸经RIG-1/MDA5路径对 IFN-β活化的结果的图。
图8(B)为表示使用含FCS的培养基并评价本发明核酸经RIG-1/MDA5路径对 IFN-β活化的结果的图。
图9(A)为表示使用来源于野生型小鼠以及TICAM-1基因敲除小鼠的脾脏树突状细胞来体外评价本发明核酸对IL-6产生的结果的图。
图9(B)为使用来源于野生型小鼠以及TICAM-1基因敲除小鼠的脾脏树突状细胞来体外评价本发明核酸对TNF-α产生的结果的图。
图9(C)为表示使用来源于野生型小鼠以及TICAM-1基因敲除小鼠的脾脏树突状细胞来体外评价本发明核酸对IFN-β产生的结果的图。
图10㈧为表示使用来源于野生型小鼠以及TICAM-1基因敲除小鼠的骨髓树突状细胞来体外评价本发明核酸对IL-6产生的结果的图。
图10⑶为表示使用来源于野生型小鼠以及TICAM-1基因敲除小鼠的骨髓树突状细胞来体外评价本发明核酸对TNF- α产生的结果的图。
图1l(A)为表示在本发明核酸对体内细胞因子产生的评价中，核酸2对TNF-α产生的结果的图。
图1l(B)为表示在本发明核酸对体内细胞因子产生的评价中，核酸2对IL-6产生的结果的图。
图1l(C)为表示在本发明核酸对体内细胞因子产生的评价中，核酸22、核酸23对TNF-α产生的结果的图。
图1l(D)为表示在本发明核酸对体内细胞因子产生的评价中，核酸22、核酸23对 IL-6产生的结果的图。
图1l(E)为表示在本发明核酸对体内细胞因子产生的评价中，核酸22、核酸23对 IL-10产生的结果的图。
图12为表示在本发明核酸对移植荷瘤的衰退效果评价中，对Β16黑色素瘤荷瘤野生型小鼠的衰退效果的结果的图。
图13为表示在本发明核酸对移植荷瘤的衰退效果评价中，对EL4荷瘤野生型小鼠的衰退效果的结果的图。
图14(A)为表示在本发明核酸对移植荷瘤的衰退效果评价中，对Β16黑色素瘤荷瘤野生型小鼠的衰退效果的结果的图。
图14(B)为表示在本发明核酸对移植荷瘤的衰退效果评价中，对Β16黑色素瘤荷瘤TICAM-1基因敲除小鼠的衰退效果的结果的图。
图15为表示在本发明核酸对移植荷瘤的衰退效果评价中，对Β16黑色素瘤荷瘤野生型小鼠，用体内转染试剂在肿瘤附近皮下给予本发明核酸时的衰退效果的结果的图。
具体实施方式
[本发明的核酸]
本发明的核酸只要为至少含有可送达至树突状细胞内体的单链DNA和具有TLR3 活化能力的双链RNA的核酸即可。
不特别限定可送达至树突状细胞内体的单链DNA，只要可从树突状细胞外部进入到细胞内，并达到内体即可。优选的上述单链DNA可举出以下(a) (d)。
(a)具有TLR9配体活性的B型或C型的CpG-DNA
(b)在上述(a)中将CpG转换为GpC的DNA
(c)在上述(b)中将GpC转换为TpC的DNA
(d)在上述(b)中将GpC转换为CpC的DNA
CpG-DNA是具有在细菌和病毒的遗传因子中特有的CpG基序的DNA。B型CpG-DNA 具有强烈诱导B细胞的反应的作用，C型的TLR9配体同时具有B型的作用和A型的作用 (强烈诱导NK细胞、浆细胞样树突状细胞的反应)。作为符合上述(a)的单链DNA，可举出 0DN2006、0DNM362、0DN2395、0DN1668、0DN1826、0DN2007 (以上均为商品名、来自 InvivGen 公司制)。另外，本发明人确认了将上述(a)中CpG转换为GpC的DNA也可送达至树突状细胞内体。而且，本发明人进一步确认了将上述(b)中GpC转换为TpC或CpC的DNA也可送达至内体。
作为可送达至树突状细胞内体的单链DNA，优选举出包括表I中所述的序列号I 4所示的碱基序列的单链DNA。
[表 I]
商品名减基序列序列号
权利要求
1.一种核酸，其特征在于，至少包括送达至树突状细胞的内体的单链DNA和具有TLR3 活化能力的双链RNA。
2.根据权利要求1中所述的核酸，所述单链DNA为以下(a) (d)中的任意一个，Ca)具有TLR9配体活性的B型或C型的CpG-DNA ；(b)在上述(a)中将CpG转换为GpC的DNA；(c)在上述(b)中将GpC转换为TpC的DNA；Cd)在上述(b)中将GpC转换为CpC的DNA。
3.根据权利要求2中所述的核酸，其特征在于，所述单链DNA包括序列号I 4、11 14中任意一种所示的碱基序列或该碱基序列的部分序列。
4.根据权利要求1 3中任意一项所述的核酸，其特征在于，所述单链DNA具有15个碱基以上的长度。
5.根据权利要求1 4中任意一项所述的核酸，其特征在于，构成所述单链DNA的核苷酸的全部或一部分经硫代磷酸酯修饰。
6.根据权利要求1 5中任意一项所述的核酸，其特征在于，所述具有TLR3活化能力的双链RNA具有来源于RNA病毒的RNA序列。
7.根据权利要求6中所述的核酸，其特征在于，所述RNA病毒选自麻疹病毒、仙台病毒、 RS病毒、丙肝病毒、脊髓灰质炎病毒以及轮状病毒。
8.根据要求要求7中所述的核酸，其特征在于，所述具有TLR3活化能力的双链RNA为包括序列号5 7、15 20中的任意一个所示的碱基序列及其互补序列的RNA。
9.根据权利要求1 8中任意一项所述的核酸，其特征在于，所述具有TLR3活化能力的双链RNA具有40 200个碱基对的长度。
10.根据权利要求1 9中任意一项所述的核酸，其特征在于，所述单链DNA和所述双链RNA通过接头序列连接。
11.根据权利要求1 9中任意一项所述的核酸，其特征在于，所述单链DNA和所述双链RNA直接连接。
12.一种药物组合物，含有权利要求1 11中任意一项所述的核酸。
13.—种IFN-β表达促进剂，含有权利要求1 11中任意一项所述的核酸作为有效成分。
14.一种NK细胞活化剂，含有权利要求1 11中任意一项所述的核酸作为有效成分。
15.—种细胞阻断性T细胞诱导剂，含有权利要求1 11中任意一项所述的核酸作为有效成分。
16.一种免疫赋活剂，含有权利要求1 11中任意一项所述的核酸作为有效成分。
17.—种疫苗佐剂,含有权利要求1 11中任意一项所述的核酸作为有效成分。
18.—种癌症治疗药,含有权利要求1 11中任意一项所述的核酸作为有效成分。
全文摘要
本发明提供一种核酸，该核酸至少含有送达至树突状细胞的内体的单链DNA和具有TLR3活化能力的双链RNA，该核酸可到达内体上的TLR3，具有强的佐剂活性，但副作用少，因此作为免疫赋活剂、疫苗佐剂、癌症治疗药等的有效成分有用。
文档编号A61K31/713GK103003427SQ20118003503
公开日2013年3月27日 申请日期2011年7月27日 优先权日2010年7月28日
发明者濑谷司, 松本美佐子 申请人:国立大学法人北海道大学