miR-27b化合物作为慢性疼痛标志物的用途和在制备治疗慢性疼痛药物中的用途
【专利摘要】本发明涉及一种miR-27b化合物作为慢性疼痛标志物的用途和在制备治疗慢性疼痛药物中的用途。包括：(1)筛选miR-27b靶标基因并通过报告基因进行验证，利用完全弗氏佐剂(CFA)制作炎性慢疼痛模型小鼠；(2)利用miR-27b模拟物增加该miRNA在炎症慢性疼痛小鼠脊髓表达量；(3)利用Western?blot法检测miR-27b对CFA致炎症慢性疼痛的DOT1L蛋白表达的抑制作用；(4)利用热激法对疼痛行为进行检测。本发明工艺简单成本低，采用miR-27b有效的抑制了炎性慢性疼痛，为防治慢性疼痛提供有效干预药物。具体是miR-27b化合物作为慢性疼痛标志物的用途和在制备治疗慢性疼痛药物中的用途。进一步对慢性疼痛病人的血液临床标本进行了定量分析，表明miR-27b能作为慢性疼痛发生的标志物。
【专利说明】miR-27b化合物作为慢性疼痛标志物的用途和在制备治疗 慢性疼痛药物中的用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微小RNA分子的用途，尤其是涉及miR-27b化合物的用途，具体 是miR-27b化合物作为慢性疼痛标志物的用途和在制备治疗慢性疼痛药物中的用途。属于 生物医学材料【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 疼痛是临床上最常见的症状之一，长期存在的病理性疼痛伴发着心理和情绪疾病 给慢性疼痛患者在生活上带来了难以忍受的折磨。据统计，全球慢性疼痛的患者高达3. 2 亿，全世界各国政府投入了大量的人力及每年上千亿美元的财力试图去攻克这一难题，仅 在中国就存在数以亿计的疼痛患者，这无疑是人类目前迫不及待需要解决的难题。
[0003] 神经细胞中含miRNA较其他组织细胞多，miRNA在突触部位的选择性聚集或缺失， 可以调节突触局部的基因表达和蛋白合成，影响神经细胞突触功能。神经系统疾病，比如帕 金森、精神分裂症、老年痴呆、亨廷顿病、神经母细胞瘤等都与miRNA表达和功能异常相关。
[0004] 关于miR-27b作为一种抑制慢性疼痛基因靶点的用途和作为慢性疼痛诊断的一 种标志物的用途目前尚未见报道。
【发明内容】
[0005] 为解决上述问题，本发明提供一种miR_27b化合物作为慢性疼痛标志物和在制备 治疗慢性疼痛药物中的应用，该方法工艺简单，成本低，采用miR-27b有效降低了炎性慢疼 痛小鼠热激疼痛阈值，从而达到预防和治疗炎性慢性疼痛的目的。具体：
[0006] 一种应用miRNA制备抑制炎症性性疼痛药物，包括：
[0007] (1)筛选miR_27b靶标基因，并进行验证，利用完全弗氏佐剂对小鼠足底进行注 射，制作炎性慢疼痛模型小鼠；
[0008] (2)利用miR_27b模拟物增加该miRNA在小鼠脊髓的表达量；
[0009] (3)利用Western blot法检测miR-27b模拟物对CFA诱导的D0T1L蛋白表达的抑 制作用；
[0010] ⑷利用热激法对小鼠疼痛阈值进行测定。
[0011] 所述步骤⑴中的CFA注射量为40微升。
[0012] 所述步骤（2)中的miR-27b模拟物为包含miR-27b核酸序列"茎一环"结构的发 夹状结构，其主序列如下：5' -UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC-3'。
[0013] 本发明首次发现miR-27b在慢性疼痛发生和维持过程中均能通过调控D0T1L信号 传导通路进行。作为疼痛抑制基因，miR-27b能显著抑制慢性疼痛的发生。研究结果表明 通过检测或干涉中枢神经中miR-27b的表达可为慢性疼痛的诊断或治疗提供新的方案。
[0014] 有益效果：
[0015] 本发明工艺简单，成本低，采用化学合成的miR-27b有效的降低了炎症慢性疼痛 热激阈值，从而进一步明确了炎性慢性疼痛的发病机制，为防治提供有效的干预靶点。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 图1是miR-27b在CFA疼痛模型小鼠脊髓中的差异表达；
[0017] 图2是鞘内注射miR-27b模拟物对CFA炎性疼痛模型小鼠痛行为学影响。制备CFA 炎性慢疼痛模型小鼠，第三天开始隔天微注射miR-27b模拟物，注射2小时后测定小鼠对热 激疼痛反应，发现注射miR-27b后明显减轻CFA小鼠疼痛反应。可看出人为增加 miR-27b 可以减轻CFA小鼠疼痛行为,起镇痛作用；
[0018] 图3为计算机软件分析显示D0T1L的3'非翻译区存在1个miR-27b的作用靶点；
[0019] 图4为miR-27b能够抑制携带D0T1L靶序列萤光素酶的相对活性；
[0020] 图5为miR-27b能够抑制CFA诱导的D0T1L在蛋白质水平的表达；
【具体实施方式】
[0021] 1、CFA慢性关节炎疼痛模型制备及脊髓水平miR-27b表达：
[0022] SPF级雄性6周昆明雄性小鼠在异氟醚麻醉下，围绕左后足足跖关节部选择两点 皮内注射无菌完全弗氏佐剂（complete Freund'sadjuvant, CFA;Sigma公司）40μ1,该注 射浓度可诱导产生关节炎。在注射后的24小时即出现热和机械痛觉阈值的降低并可维持 3周以上。
[0023] MiR-27b的表达分析：运用miRNA检测试剂盒对miR-27b进行荧光定量分析，结果 显示，CFA三天小鼠脊髓表达量发生显著下调表达（附图1)。
[0024] 2、采用miR-27b模拟物在体过量表达脊髓miRNA。
[0025] 采用合成11^1?-2713的1?^序列。先将1^1?-2713用脂质体包裹：脂质体与5%葡萄 糖液按2:3比例混匀后，迅速加入等体积的miR-27b (25 μ M)溶液，充分混匀，室温下静置 10分钟后应用，即为脂质体miR-27b混合物。再将混合物进行鞘内注射：每只小鼠每天麻 醉后，注射2次miR-27b (25 μ M)，每次10 μ 1，每次时间12小时，注射后注射器停留组织内 60s，共2天，最后一次注射2h后开始检测。
[0026] 疼痛行为监测：热痛觉过敏：将有机玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上，按Hargreaves 法用热辐射刺激以照射大鼠足底紧贴玻璃板部位。记录照射开始至大鼠出现抬足时间，截 止时间为20s。每只动物测定3次，取其平均值，每次测定时间间隔5min。结果表明，鞘内 注射miR-27b模拟物后可显著降低疼痛阈值（附图2)。
[0027] 3、miR_27b靶标基因的筛选方法
[0028] 运用TargetScan, PicTar等软件检索miR_27b可能的祀基因，发现D0T1L基因的 3'非翻译区（3'UTR)含有miR-27b的靶位点（附图3)，靶标序列见附表1(2)。选定该基因 作为候选基因。
[0029] 4、报告基因验证D0T1L是miR-27b的靶基因
[0030] 构建psiCHECK2-D0TlL-3' UTR重组质粒，与miR-27b模拟物共转染工具细胞293T， 转染24h后冻融细胞一次，用专用裂解液裂解细胞，每孔100ul,吹打均匀，充分裂解后样品 备用。采用Promega公司的萤光素酶检测试剂盒，在1. 5ml离心管中加入LAR工工50ul和裂 解液5ul混匀，酶标仪检测萤火虫萤光素酶；加入50ulStop&Glo溶液灭活萤火虫萤光素酶， 酶标仪检测海肾萤光素酶。结果显示，转染scRNA对萤光素的表达无影响。而转染miR-27b 模拟物后萤光素的表达分别下降了约40%左右（见附图4)。
[0031] 5、利用Western blot法检测miR-27b模拟物对CFA诱导的D0T1L蛋白表达的抑制 作用
[0032] 制备CFA炎性慢疼痛小鼠，鞘内注射miR_27b模拟物，2天后取小鼠脊髓腰膨大区 蛋白样品进行电泳。电泳时，按每孔20ug蛋白上样量等量上样。以150V电泳1.5h，100V 电压下转膜lh。将膜放入自封袋中，加入5 %脱脂奶粉/TBST，完全浸泡膜并封口，于室温 下振荡封闭lh。加入TBST稀释后D0T1L或对照GAPDH抗体一抗（抗血管紧张素1型受体 抗体按1:1000稀释，抗GAPDH抗体按1:1000稀释），4°C振荡孵育过夜。吸净一抗，TBST漂 洗膜5min X3 ;加入稀释后的二抗（均为1:5000稀释），水平摇床室温孵育lh。吸净二抗， TBST漂洗膜，5min X3,等体积混合ECL (AB液），充分覆盖湿润NC膜表面，静置lmin ;于暗室 中用保鲜膜将NC膜封好，将X光片平放于NC膜上显影并记录数据。结果可见，在CFA的刺 激下，脊髓腰膨大区D0T1L蛋白的表达量明显升高。然而鞘内增加了 miR-27b模拟物的表 达量后，CFA诱导的D0T1L蛋白的表达量明显下降。（见附图5)
【权利要求】
1. 一种miR-27b化合物作为慢性疼痛标志物的用途。
2. -种应用miRNA制备抑制炎症性性疼痛药物，包括： (1) 筛选miR-27b靶标基因，并进行验证，利用完全弗氏佐剂对小鼠足底进行注射，制 作炎性慢疼痛模型小鼠； (2) 利用miR-27b模拟物增加该miRNA在小鼠脊髓的表达量； (3) 利用Western blot法检测miR-27b模拟物对CFA诱导的D0T1L蛋白表达的抑制作 用； (4) 利用热激法对小鼠疼痛阈值进行测定。
3. 根据权利要求1所述的一种应用miRNA制备抑制炎症性性疼痛药物，其特征在于： 所述步骤（1)中的CFA注射量为40微升。
4. 根据权利要求1所述的种应用miRNA制备抑制炎症性性疼痛药物，其特征在于：所 述步骤（2)中的miR-27b模拟物为包含miR-27b核酸序列"茎一环"结构的发夹状结构，其 主序列如下：5' -UUCACAGUGGCUAAGUUCUGC-3'。
【文档编号】A61P29/00GK104046688SQ201410251419
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年6月7日 优先权日:2014年6月7日
【发明者】郭羽白, 尹翠, 韩文灿 申请人:徐州医学院