专利名称：癌症生物标志物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及诊断或预后生物标志物或用于筛检或检测胃癌的生物标志物。
背景技术：
胃癌(gastric cancer或stomach cancer)是指在食管下部、胃内或小肠最上部产生的肿瘤。胃癌是在世界范围内与癌症相关的死亡的主要原因，其中毎年有近一百万新病例被确诊(Lam, K. ff.，Lo, S. C.，Proteomics Clin. Appl. 2008，2，219—228)。全球的五 年存活率为 20%左右，除了日本是近 60% (Kamangar F，et al. J Clin Oncol 2006 ；24 2137-50)。已报道西方和东方人群在该疾病的早期检测和预后的次数上存在有趣的差异，这可能是由在胃癌的流行病学、分期系统和治疗上的不同造成的(Davis，P. A.，Japanesejournal of clinical oncology 2000,30,463-464)。早期检测被认为是治疗胃癌的核心支柱。在日本和其他东方国家使用的通过内镜进行的人群筛检使得近70%的胃癌在早期被确诊，而相比之下，在筛检仍然难以进行的西方国家，只有15%的胃癌在早期被确诊(Cunningham and Chua, The New England journal of medicine 2007,357,1863-1865)。然而在除了日本和韩国的其他国家中，人群筛检的花费收益还不确定。对高风险对象的筛检可能是一个可行的选择(Yeoh, K. G. , Journal of gastroenterology and hepatology2007, 22,970-972. Leung,ff. K. , et al. , The lancet oncology 2008,9, 279-287)。然而，目前还没有特异性的可临床用于胃癌的筛检和诊断的生物标志物，常用的标志物如CA19-9、胎蛋白抗原、胃蛋白酶原1/11、癌胚抗原(CEA)等则不灵敏(Lam and Lo 2008)。显然有发现更好的分子标志物的需求。传统的肿瘤标志物如CA19-9、CA72-4和CEA都不够灵敏且/或不具有对胃癌检测的特异性。ー份最近的评论总结了肿瘤标志物在胃癌检测中的灵敏度，包括CEA在16%到 63% 间，CA19-9 在 20% 到 56% 间，和 CA72-4 在 18% 到 51% 间(Ebert, Μ· P.，Rocken,C. , European journal of gastroenterology & hepatology 2006,18,847-853.;)这些标志物的特异性则不确定。M2丙酮酸激酶被描述为与肿瘤相关的代谢标志物，也在胃癌检测中被评估，其灵敏度和特异性分别在57%到67%和89%到95%的范围内(Kumar，Y. , et al. European journal of gastroenterology & hepatology 2007,19,265—27(3」Hardt, P.D., et al. Anticancer research 2000,20,4565-4568. ；Cervenka, H. , et al.,Anticancer research 1999,19,849-851。大体上可从以上报告中得出两点结论i)目前备选的肿瘤标志物对胃癌的灵敏度低于67%，和ii)它们中的多数都不具有对任意癌症类型的特异性。胃癌的分类通常是基于劳伦分类。这可能是目前最成功和广泛使用的分类(Vauhkohen,M. , et al. Best practice & research 2006, 20,651-674)。根据劳伦分类，胃癌可被分为两种主要的癌症发病机制_(i)肠亚型(IGCA)和(ii)弥漫亚型(DGCA)。这两种亚型在流行病学和预后特征上具有显著的差异，这使得临床医生和肿瘤医生去进ー步理解该分类基础(Kountouras, J. , et al. Hepatogastroenterology 2005, 52,1305-1312)。肠型(IGCA)的比例约占50%，弥漫型(DGCA)为35%，剩下的15%被定义为“未分类”或混合型癌症。肠型(IGCA)的特征为粘合的赘生细胞形成腺体样管状结构的，而在弥漫型(DGCA)细胞中不存在粘合，使得独立的细胞渗透或增厚胃壁而不形成分散的块。这种微观生长模式上的差异也反映在这两种组织学亚型的不同宏观外观上。在肠型(IGCA)中，其宏观边缘大致与其宏观扩散相对应，而弥散型(DGCA)作为ー种低分化癌可在粘膜下延伸至远超出其宏观边缘。这两种劳伦分类类型在肿瘤扩散上的差异在确定适当的治疗方案方面具有临床意义。肠型(IGCA)主要占据高风险区域，更经常发生在远端胃，且经常在之前有长期的癌前阶段，而弥漫型(DGCA)肿瘤主要发生在年轻患者和女性中，且遗传因素在其诱因中比例较高。根据劳伦分类对胃癌进行的分类需要侵入性取样方法。分析工具和质谱分析平台的发展刺激了生物标志物的发现。用于发现生物标志物的蛋白质组学方法在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、卵巢癌上取得了成功，在胃癌上取得了较 小程度的成功，其中通过肿瘤组织(He，Q. Y.，et al.，Proteomics 2004，4，3276-3287)和细胞系(Takikawa, Μ.，et al.，Oncology reports 2006，16，705-711)确定了潜在的备选物。例如，ー项研究使用ニ维凝胶电泳(2-DE)的方法来描述胃液中的疾病特异性蛋白的表达(Lee, K. , et al.，Proteomics 2004，4，3343-3352)。另ー种 2-DE 方法进ー步确定了 14种在胃癌和正常组织中差异表达的蛋白(Ryu, J. ff. , et al. , Journal of Korean medicalscience 2003，18,505-509)。尽管对于肿瘤和胃液的研究为该疾病提供了深入的理解，但基于这些方法的生物标志物的发现需要侵入性取样方法，从临床角度看不够理想。—些小组使用蛋白质芯片(ProteinChip)系统研究用血样挖掘生物标记物,该系统是基于表面增强激光解吸/电离(SELDI)方法(Liang, Y. , et al. , Experimental andmolecular pathology 2006,81,176-180) ； (Ebert, M. P. , et al. , Journal of proteomeresearch 2004,3,1261-1266) ； (Poon, T. C. , et al. , Gastroenterology 2006,130，1858-1864)。尽管在肽质量指纹谱中发现了差异，该信息却由于不能确定蛋白质的身份而不完整。尽管最近的一篇论文成功地开发了ー种使用蛋白质芯片和串联质谱联合鉴定SELDI 谱峰的方法(Peng, J. , et al. ,Proteomics 2009,9,492-498),但需要注意，由于各种内在的和外在的因素，使用SELDI重现血清谱可能会比较困难。另ー方面，ー项研究使用传统的2-DE凝胶联合质谱分析并掲示了在胃癌患者的血清中的组织蛋白酶B的上调可用作预后标志物，但不能用于早期诊断(Ebert,M. P. , et al. ,Proteomics 2005，5，1693-1704)。然而2-DE方法的灵敏度仍然是个问题，而低丰度蛋白的检测仍具有挑战性。而由于血液中的蛋白具有涵盖了 10个数量级的较宽的蛋白质动力学范围，该问题就更加严重。C9通常作用在先天免疫系统中，该系统是宿主对抗外来物的防御系统之一。C9是补体系统的末端途径的一部分，并与C5b、C6、C7和C8 —起用于导致细胞溶解的膜攻击复合物的组装
发明内容
本发明致カ于提供新型的胃癌检测或筛检方法以改善一些上述困难，并对现有的胃癌的检测或筛检方法进行补正。本发明还致カ于提供用于检测或筛检胃癌的试剂盒。我们发现，相对于不具有胃癌症状的正常患者的体液中的蛋白质表达，补体蛋白C9和/或其它蛋白在胃癌患者的体液中过表达。因此，本发明的ー个方面提供了ー种用于检测疑似患有癌症或处于患癌症风险的个体内癌症存在的方法，该方法包含以下步骤(a)測定补体组分C9蛋白在获得自所述个体的合适的流体样品中补体组分C9蛋白的浓度，和(b)将步骤(a)中测得的浓度与健康个体的补体组分C9蛋白浓度的标准数值范围相比较，其中当所述个体的补体组分C9蛋白浓度与健康个体的补体组分C9蛋白浓度的标准数值范围相比升高时，表明可能存在癌症。本发明的另一方面提供了一种检测疑似患有胃癌或处于患胃癌风险的个体内胃癌存在的方法，该方法包含以下步骤(a)測定获得自所述个体的合适的流体样品中补体组分C9蛋白的浓度，和(b)将步骤(a)中测得的浓度与健康个体的补体组分C9蛋白浓度 的标准数值范围相比较，其中当所述个体的补体组分C9蛋白浓度与健康个体的补体组分C9蛋白浓度的标准数值范围相比升高时，表明可能存在胃癌。本发明的另一方面提供了ー种在合适的流体样品中检测潜在胃癌的试剂盒，其包含能够选择性结合补体组分C9蛋白的抗体和用于检测所述抗体与补体组分C9蛋白形成的复合物的试剂。本发明的另一方面提供了合适的流体样品中的补体组分C9蛋白的浓度作为胃癌生物标志物的用途。本发明的另一方面提供了能够选择性结合补体组分C9蛋白的分离的抗体，其用于通过測定合适的流体样品中的补体组分C9蛋白的浓度来检测胃癌。本发明的另一方面提供了能够选择性结合补体组分C9蛋白的适体，其用于通过測定合适的流体样品中的补体组分C9蛋白的浓度来检测胃癌。
图I(A)本研究的工作流程和实验设计的概述，包括收集血液、制备血浆样品和所使用的蛋白质组学方法。独立进行了三个iTRAQ实验。(B)根据C9免疫印迹对血浆样品进行(I)验证和(2)盲试研究的方案的示意图。将验证研究的样品之一(在图中用黒点表示)加入用于盲试的凝胶中以作为内部标准。该内部标准用于⑴在测试印迹间和(ii)在测试印迹和验证印迹间进行归ー化。每个验证和测试印迹都各进行三个印迹。图2⑷由iTRAQ实验III产生的代表性MS/MS谱，表示了 ISEGLPALEFPNE的iTRAQ报告离子的相对丰度，该多肽是双电荷的肽，前体质量为780. 4158，属于补体成分C9前体。iTRAQ标记与样品性质的关系如下114-正常，115-早期胃癌，和116-晚期胃癌。(B) iTRAQ结果和C9蛋白的代表性验证印迹。备注*由3个iTRAQ实验得到的平均比例(其比例为1.34、1.74和1.84)用于表示晩期胃癌的趋势。縮写⑴早期GC-早期胃癌(Ι-II期)，
(ii)晩期GC-晩期胃癌(I II-IV期)和(iii)LC-肺癌。(C)条形图，表示在早期胃癌、晚期胃癌和肺癌的血浆样品的三份验证印迹中C9蛋白条带的密度计量读数，该读数根据正常对照进行归ー化。(D)正常对照、早期和晚期胃癌对象及肺癌对象的混合血浆样品中的总蛋白谱。使用SYPRO Ruby对凝胶染色以便在分析时保证相同的上样量。
图3 (A)三重验证印迹之ー表示iTRAQ实验中的患者个体中的C9表达。在验证中包含了另外11个肺癌样品以将样本大小由原先的5个增加到16个。对每个样品的三重C9验证印迹的平均密度读数进行评估。(B)根据样品的性质，即正常、早期胃癌(Ι-II期)、晚期胃癌(III-IV期)和肺癌组，将这些平均读数以条形图的形式绘制出来。在图中计算并列举出每个样品种类的平均C9密度计量读数。(C)表示C9表达在每个样品种类中的分布的箱形图。使用每个样品种类的平均C9密度计量读数进行方差分析(ANOVA)。在正常与癌症组(早期、晩期胃癌和肺癌)间发现了 C9表达水平的显著差异(P值< O. 05)。縮写GC=胃癌和LC =肺癌。图4由Tan Tock Seng医院(TTSH)组取得的血浆样品的三重盲试的代表性图像。对总共55个盲样进行C9表达检測。将验证研究中的一个样品加入分析凝胶中以作为用于在(i)三重盲试印迹之间和(ii)验证印迹和盲试印记间进行归ー化的内部标准。
图5用于该研究(验证+盲试)的所有単独血浆样品中的C9表达。条形图表示在对经过验证和盲试印迹分析的血浆样品进行免疫印迹后C9蛋白条带的密度计量读数，血浆样品来自㈧所有胃癌样品(早期和晩期，即I-IV期)，⑶早期胃癌(Ι-II期)，(C)晩期胃癌(III-IV期)和⑶肺癌样品。(E)点状图表示患者的血浆样品中的C9表达水平，该类患者的癌症被分为弥漫型、肠型或混合型胃癌。虚线表示在正常対照的血浆中C9印迹表达的平均值。图6在胃癌细胞系中增加的C9表达。(A)胃癌细胞系裂解物的C9免疫印迹。(B)正常与胃癌细胞系裂解物的C9表达密度图。(C)在条件培养基中的正常和胃癌细胞系分泌的C9表达的密度图。HFE145为正常的胃上皮细胞系。将肌动蛋白的免疫印迹作为上样对照。
具体实施例方式描述了ー种用于检测、诊断或预后癌症的方法，该方法包括(a)測定合适的流体样品中补体组分C9蛋白(C9)的浓度，该流体样品包括体液样品，如从个体取得的血液、血浆或血清样品，和(b)将步骤(a)中测得的浓度与健康个体的合适流体样品中的补体组分C9蛋白浓度的标准值相比较，其中当补体组分C9蛋白浓度与健康个体的补体组分C9蛋白浓度的标准值相比升高时，表明可能存在癌症。所述癌症可以是肺癌、胃癌或其它类型的癌症，如膀胱、大脑、乳腺、血液、鼻咽、子宮、宫颈、结肠、直肠、食管、口腔、头部、皮肤、肾脏、肺、卵巣、颈部、胰腺、前列腺、睾丸、肝脏和腹腔内的肿瘤，然而优选所述癌症为胃癌。与健康个体的C9蛋白浓度的标准值相比，优选步骤(a)中測定的C9蛋白浓度的升高是至少3倍的升高。患有早期胃癌的个体的体液中C9蛋白的浓度的升高可能是约3倍的升高，而患有晩期胃癌或肺癌的个体的体液中的C9蛋白的浓度的升高可能是约3倍到45倍或更多的升高。合适的流体样品可包括体液样品，如血浆、胃液、尿液等。流体样品可被缓冲液或其它试剂如检测试剂稀释。个体可以是任何动物，但优选人类。该方法还可进一歩包含鉴定肠型胃癌，其中与健康个体的合适流体样品中的补体组分C9蛋白浓度的标准值相比，补体组分C9蛋白的浓度3到4倍的升高表明存在肠型胃癌。由此可进行肠型胃癌的预后。该方法还可进一歩包含鉴定弥漫型胃癌，其中与健康个体的血液、血浆或血清中的补体组分C9蛋白浓度的标准值相比，补体组分C9蛋白的浓度4到45倍的升高表明存在弥漫型胃癌。由此可以进行弥漫型胃癌的预后。以上鉴定方法具有可以快速并有效地判断胃癌类型的优点。由于肠型和弥漫型胃癌的预后不同，可以想到对于这两种不同类型而言此后的治疗手段也会有所不同。因此使用C9表达水平来区分这两种类型的胃癌的方法在无需进行重复和过量的侵入性试验的情况下可有效地确定使用哪种治疗手段更为有效并在治疗过程中监测治疗是否成功。该方法可进ー步包括以下步骤(C)測定获得自所述个体的合适的流体样品中的癌胚抗原(CEA)蛋白的浓度，和(d)将步骤(c)中测得的浓度与健康个体的癌胚抗原浓度的标准值相比较，其中癌胚抗原浓度与健康个体的癌胚抗原浓度的标准值相比的升高表明可能存在胃癌。C9在合适流体样品如血液、血浆或血清样品中的存在可通过使用本领域中已知方法检测C9蛋白来确定。本发明不限制用于测定C9或C9活性的测试的类型。例如，可通过 使用C9特异性抗体的免疫测试来检测C9。该抗体可选择性结合补体组分C9蛋白和/或CEA。该抗体可用于，例如，一维或ニ维凝胶的蛋白质印迹、高通量方法如酶联免疫测试和/或细胞总蛋白或部分纯化蛋白的点印迹(抗体夹心)测试中。合适流体中的C9浓度可通过本领域中已知方式使用ELISA来測定。酶联免疫吸附测试(ELISA)是广泛使用的体外方法。在ー个测试实例中，血清样品被稀释400倍，并被施加到连接有来自ー种动物来源的补体组分C9蛋白(C9)抗体(一杭)的板上。如果血清中存在足量的C9，则C9可结合这些C9抗体。之后将板进行清洗以除去血清中所有其它组分。将ー种特别制备的“ニ杭”(其动物来源与ー抗不同，是ー种与一抗结合的抗体)加到板上，之后进行再一次清洗。ニ抗预先与酶化学连接。因此，板上所含有的酶与结合到板上的ニ抗的量成正比。加入这种酶的底物，在该酶的催化下会导致颜色或荧光的变化。以数值报道ELISA的结果；阳性结果和阴性结果间的“截断”点可通过将其与已知标准比较得到。所产生的信号强于已知非癌样品的样品为“阳性”。所产生的信号弱于已知非癌样品的样品为“阴性”。另外，可使用测谱方法如LC-MS/MS质谱、GSMS质谱、SDS PAGE方法(之后通过密度计量或质谱方法定量)或其它本领域已知的类似的对蛋白质定量的方法来检测C9蛋白，从而确定合适流体中补体组分C9蛋白的浓度。抗体本发明还提供了对本发明中的C9多肽具有特异性的标记和未标记的单克隆和多克隆抗体，及产生本发明中的单克隆抗体的永生化细胞系。优选的抗体可选择性结合补体组分C9蛋白以通过測定血液、血浆或血清中补体组分C9蛋白的浓度来检测胃癌。根据本发明的抗体制备包括(a)将C9多肽与载体蛋白缀合；(b)用与佐剂混合的步骤(a)中的C9多肽片段-载体蛋白缀合物免疫宿主动物；和(c)从免疫的宿主动物获得抗体。根据本发明，通过重组或化学合成产生的C9多肽，及其片段或其它衍生物或类似物，包括融合蛋白，可用作免疫原以产生可识别C9多肽的抗体。这样的抗体包括但不局限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库。因此，本发明还提供了多克隆和/或单克隆抗体及其片段，和其免疫结合等效物，它们可以特异性结合C9多肽及其片段，或结合来自C9多肽如ISEGLPALEFPNE多肽(SEQ IDNO :1)，特别是来自C9基因序列或其一部分的核苷酸序列。因此这样的抗体包括但不局限于，例如，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段和Fab表达文库。C9多肽或其片段的特异性抗体的产生将在下文进行描述。当分子可与免疫系统中的抗原识别分子(如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体)特异性相互作用时，其是“抗原”分子。抗原多肽含有至少约5个，优选至少约10个氨基酸。分子的抗原部分可为对抗体或T细胞受体识别为免疫显性的部分，也可以为通过将所述抗原部分与用于免疫的载体分子缀合来产生所述分子的抗体的部分。抗原分子本身不需要是免疫原性的(即能够不需载体而引起免疫应答)。“抗体”为任何结合特异性表位的免疫球蛋白，包括抗体及其片段。该术语包括多克隆、单克隆和嵌合抗体(后者在美国专利号4，816，397和4，816，567中被进ー步详细描述)，以及抗体的抗原结合部分，包括Fab、F(ab’)2和F(v)(包括单链抗体)。因此，文中所用的各种语法形式的短语“抗体分子”包括完整的免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的含有抗体结合位点的免疫活性部分。“抗体结合位点”是包含可特异性结合抗原的重、轻链可变区和高变区的抗体分子的结构部分。 示例性的抗体分子为完整的免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子含有互补位的部分，包括本领域已知的如Fab、Fab’、F(ab’)2和F(V)的部分，所述部分优选用于文中所述的诊断、预后和筛检的方法。抗体分子的Fab和F(ab’)2部分分别使用已知方法通过木瓜蛋白酶和胃蛋白酶在基本完整的抗体分子上的蛋白水解反应制备。例如參见美国专利4，342，566号。Fab'抗体分子部分也是已知的，并可从F(ab’)2部分产生，如使用巯基こ醇还原连接两个重链部分的双硫键，接着使用如碘代こ酰胺的试剂对所得蛋白质硫醇进行烷基化。本文优选含有完整抗体分子的抗体。以多种语法形式出现的术语“单克隆抗体”是指只具有一种能够与特定抗原进行免疫反应的抗体结合位点的抗体。因此单克隆抗体通常显示对与其进行免疫反应的任何抗原的単一结合亲和力。因此单克隆抗体可含有具有多个抗体结合位点的抗体分子，其中每一位点对不同的抗原具有免疫特异性；如，双特异性(嵌合)单克隆抗体。术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫应答的化合物或混合物。佐剂可作为缓慢释放抗原的组织仓库，也可作为非特异性增强免疫应答的淋巴系统激活剂。没有佐剂而只有抗原自身的一级攻击通常不会引发体液或细胞免疫应答。佐剂包括，但不局限于，弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、皂苷、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油或乳化烃、钥孔血蓝蛋白、ニ硝基苯酚、和可能有用的人类佐剂如BCG(卡介苗(bacilli Calmette-Guerin))和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum.)。优选地，所述佐剂为药物学可接受的。C9多肽、或其片段、衍生物或类似物的多克隆抗体可通过多种本领域中已知的方法制备。可注射C9多肽或其衍生物(如片段或融合蛋白)以使多种宿主动物免疫，从而产生抗体，宿主动物包括但不局限于兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等。在一个实施方式中，C9多肽或其片段可缀合于免疫原性载体，如牛血清白蛋白(BSA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)。根据宿主物种，可使用多种佐剂以增强免疫应答，所述佐剂包括但不局限于弗氏佐剂(完全或不完全)、矿物凝胶如氢氧化铝、表面活性物质如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油乳液、钥孔血蓝蛋白、ニ硝基苯酚、和可能有用的人类佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。任何通过培养连续细胞系来生产抗体分子的技术都可被用于制备针对C9多肽或其片段、类似物或衍生物的单克隆抗体。这包括但不局限于首先由Kohler et al.，Nature, 256 :495-497(1975)开发的杂交瘤技术、三源杂交瘤技术、人类B细胞杂交瘤技术[Kozbor et al. , Immunology Today, 4 :72 (1983)]和产生人类单克隆抗体的 EBV-杂父瘤技术[Cole et al. , in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96,Alan R. Liss, Inc. , (1985)]。永生化的产生抗体的细胞系也可通过融合以外的技术产生，如将致癌DNA直接转化B淋巴细胞,或用Epstein-Barr病毒转染。參见，如，M. Schreieret al. ,“ Hybridoma Techniques”(1980) ； Hammer ling et al., Monoclonal Antibodiesand T-cell Hybridomas”(1981) ；Kennett et al. , “Monoclonal Antibodies”(1980);还參见美国专利 4，341，761 号；4，399，121 号；4，427，783 号；4，444，887 号；4，451，570 号；4，466，917 号；4，472，500 号；4，491，632 号；和 4，493，890 号。 在本发明的另ー个实施方式中，可使用最近的技术从无菌动物体内生产单克隆抗体(PCT/US90/02545)。根据本发明，可使用人类抗体，其可通过人杂交瘤[Cote et al.，Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 80 :2026-2030 (1983)]或通过在体外用EBV病毒转化人类B细胞而获得(Cole et al. , 1985, supra)。事实上,根据本发明，可使用通过将来自小鼠C9多肽特异性抗体分子的基因与来自具有适当的生物活性的人类抗体分子的基因剪接在一起以获得“嵌合抗体”的技术[Morrison et al. , J. Bacteriol. , 159-870 (1984) ；Neuberger etal.，Nature, 312 :604-608(1984) ；Takeda et al.，Nature, 314 :452-454(1985)];这样的抗体在本发明的范围内。由于人抗体或人源化抗体自身不像异种抗体那样容易弓I发免疫应答，特别是过敏反应，所述人抗体或人源化嵌合抗体优选用于治疗人类的疾病或紊乱(将会在以下描述)。根据本发明，可使用用于产生单链抗体(美国专利4，946，778号)的技术来产生C9多肽特异性单链抗体。本发明的另ー个实施方式使用用于构建Fab表达文库的技术[Huse et al.，Science，246 :1275-1281 (1989)]来快速简便地鉴定对C9多肽或其衍生物或类似物具有所需特异性的单克隆Fab片段。可使用已知技术来产生含有抗体分子的独特型的抗体片段。例如，该片段包括但不局限于可通过胃蛋白酶消化抗体分子制备的F(ab’ )2片段；可通过还原F(ab’)2片段中的ニ硫键制备的Fab’片段，和可通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子制备的Fab片段。在制备抗体时，可使用本领域已知的技术筛选所需抗体，如放射免疫测试、ELISA(酶联免疫吸附测试)、夹心免疫测试、免疫放射测试、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测试、原位免疫测试(使用例如胶体金、酶或放射性同位素标记)、蛋白质印迹、沉淀反应、凝集测试(如凝胶凝集测试、血凝测试)、补体结合测试、免疫荧光测试、蛋白A测试和免疫电泳测试等。在一个实施方式中，通过检测ー抗上的标记来检测抗体的结合。在另ー个实施方式中，通过检测ニ抗或试剂与ー抗的结合来检测ー抗。在另一个实施方式中，ニ抗被标记。本领域中有很多已知方法用来检测免疫测试中的结合，并都在本发明的范围内。例如，为了选择识别C9多肽的特异性表位的抗体，可测试所产生的杂交瘤，測定其与含有所述表位的C9多肽片段结合的产物。
示例性抗体可包括亲和纯化的兔抗肽LQYENVDEDSSDSDA抗体。以上抗体可用于涉及C9多肽的定位和活性的本领域中已知方法中，如蛋白质印迹、C9多肽的原位成像、測定其在合适的生理样品中的含量等。在ー个具体的实施方式中，使用根据蛋白质序列合成的肽或通过细菌表达载体制备的重组蛋白来使兔免疫以产生抗体。合成多肽的选择是在根据上文所述对所预测的蛋白结构进行仔细分析后做出的。具体地，选择在假定裂解位点间的多肽序列。使用碳ニ亚胺将合成多肽缀合至到载体，如KLH血蓝蛋白或BSA，并将其用于弗氏佐剂中使兔免疫。为了制备重组蛋白，可使用载体来表达C9多肽。或者可以只使用亲水结构域来生成融合蛋白。所表达的蛋白会被大量制备并与弗氏佐剂一起使兔免疫。在另ー个实施方式中，使用重组C9多肽使兔免疫，并在进一歩使用前对多克隆抗体进行免疫純化。纯化的抗体在半定量测试中特别有用，特别是用于检测C9多肽的存在。优选地,用于本发明中的诊断、预后和筛检方法的抗调节剂(anti-modulator)抗体是亲和纯化的多克隆抗体。更优选地，所述抗体是单克隆抗体(mAb)。另外，本文所用的抗调节剂抗体分子优选以完整抗体分子的Fab、Fab’、F(ab’)2或F(V)部分的形式存在。在本发明的ー个优选实施方式中，抗体会将C9蛋白从溶液中免疫沉淀出来，也会在聚丙烯酰胺凝胶的Western印迹或免疫印迹上与C9蛋白反应。优选的实施方式涉及到检测C9蛋白或其变体的方法，包括酶联免疫吸附测试(ELISA)、放射免疫测试(RIA)、免疫放射测试(IRMA)和免疫酶促测试(IEMA)，包括使用单克隆和/或多克隆抗体的夹心测试。根据本发明，提供了一种诊断或预后生物标志物，C9，其可以区分胃癌个体和不患有癌症的健康个体。优选的C9核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO :2。优选的C9多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO :3。在一个优选的实施方式中，将所提取的血液、血浆或血清中的补体组分C9蛋白浓度用作胃癌的生物标志物。补体组分C9蛋白可以是胃癌的血液、血浆或血清生物标志物。适体本发明还提供了本发明中的C9多肽的特异性适体。优选的适体可选择性结合补体组分C9蛋白，用于通过測定补体组分C9蛋白的血液、血浆或血清浓度来检测胃癌。根据本发明，通过重组或化学合成制备的C9多肽及其片段或衍生物或类似物，包括融合蛋白，可以用作免疫原以生成识别所述C9多肽的适体。因此，本发明还提供了适体及其片段和其免疫结合等效物，它们可特异性结合C9多肽和其片段，或结合来自C9多肽如ISEGLPALEFPNE肽(SEQ ID NO 1)的核苷酸序列(特别是来自于C9基因序列或其部分)。下文将会描述C9多肽或其片段的特异性适体的制备。术语“适体”是指与靶化合物(如特异性抗原、治疗药物标记物或替代标记物)具有特异性作用的非天然存在的寡核苷酸链或肽分子。特异性作用包括但不局限干，结合靶化合物、催化改变靶化合物、和以改性/改变靶化合物或靶化合物的功能活性的形式与靶化合物反应。由于其分子识别特性，适体可用于很多应用中，如癌症诊断和治疗。癌症细胞需要与不同类型的分子进行物理相互作用以生长、复制和扩散。在诊断领域中，对那些在癌症早期阶段呈现异常的蛋白质具有高度特异性的适体可作为癌症的早期检测工具。适体也可能比抗体的免疫原性低。因此，它们也不太可能引起并发症如宿主排异。可通过重复的多轮体外选择或SELEX (通过指数富集的配体系统进化)改造适体以结合不同的分子靶如小分子。尽管存在修改，但适体的制备/合成及选择方法与以下论文中所述大体相同Elington, A. D.，Szostak, J. ff. , 1990. in vitro selection ofRNA molecules that bind specific ligands. Nature 346,818-822 ;Tuerk,C., Gold, L.,1990. Systematic evolution of ligandsby exponential enrichment RNA ligands tobacteriophage T4 DNA polymerase. Science 249,505-510.“SELEX ”方法包括将选择核酸配体与所选核酸的扩增相结合，其中所述配体与特异性表位以所需形式相互作用，如与蛋白結合。这种选择/扩增步骤的任选的迭代循环可以从含有大量核酸的库(pool)中选择ー种或少量与特异性表位相互作用最強的核酸。继续该筛选/扩增循环过程，直到达到所选定目标。SELEX方法在以下美国专利和专利申请中被描述美国专利序列号07/536，428和美国专利号5，475，096和5，270, 163。 在本发明的一个优选的实施方式中，适体会将C9蛋白从溶液中免疫沉淀出来，也会在聚丙烯酰胺凝胶的Western或免疫印迹上与C9蛋白反应。涉及到检测C9蛋白或其变体的方法的优选的实施方式包括但不局限于酶联免疫吸附测试(ELISA)，这是由于其高通量的特性和易于设置和操作。诊断试剂盒检测试剂盒可含有抗体、扩增系统、检测试剂(发色剂、荧光团等)、稀释缓冲液、洗涤溶液、复染剂或其任意組合。试剂盒组分可被包装用于手动或部分或全部地自动化实施前述方法。在另ー个涉及到试剂盒的实施方式中，本发明考虑了试剂盒，其包含本发明中的组合物以及任选的关于其使用的说明书。该试剂盒具有多种用途，包括，例如，对患者人群分类、诊断、预后、指导治疗性治疗决策及其它应用。优选的用于在合适的流体如血液、血浆或血清样品中检测可能的胃癌的试剂盒包含可选择性结合补体组分C9蛋白和用于检测所述抗体与补体组分C9蛋白形成的复合物的试剂的抗体。该试剂盒还可包含可选择性结合癌胚抗原和用于检测所述抗体与CEA形成的复合物的试剂的抗体。该试剂盒还可包含ELISA试剂和板。假设肿瘤特异性标志物由癌组织释放到体液如血液、血浆、血清和尿液中。这些体液任何一种都是用于发现生物标记物的理想基质，因为其获取过程具有最小的侵入性并可重复进行而不会产生不良后果。不局限于任何理论，可以预期人体免疫系统对癌细胞发出反应，而这会导致提高血液中C9蛋白的产生。还可以预期在癌症患者的血浆内检测到升高的C9量是由于胃癌细胞相对于正常细胞分泌较多的C9(图6)。优选实施方式的实施例胃癌是在世界范围内与癌症相关的死亡的主要原因。目前还没有特异性标志物可临床用于胃癌的筛检和诊断。通过使用基于抗体的消除、用于相对和绝对定量的同位素标签(iTRAQ)和串联质谱的组合获得取自正常对象、早期(I-II)和晩期(III-IV)胃癌患者的临床血浆样品中的蛋白质表达水平谱，本研究尝试发现用于胃癌的潜在标志物。使用三个独立的iTRAQ实验分析取自总共25个正常对象和36个胃癌对象的样品。
在该研究中，我们使用了血浆蛋白质组学的方法来发现胃癌的潜在生物标志物。由于其在取样过程中的简易性，对血浆/血清中的标志物进行分析是最具吸引力的方法之一。我们的工作验证了相对于正常对照而言，C9蛋白在多数胃癌患者的血浆中高度表达。至今还没有报道过C9表达的升高与胃癌相关。本研究使用了用于相对和绝对定量同位素标签(iTRAQ)来获得早期和晩期胃癌阶段相对于正常対照的血浆中的蛋白质表达水平谱。本研究的目的为(i)使用蛋白质组学的方法鉴定和验证还未显示与胃癌相关的蛋白质，和(ii)检验这些备选物相对于CEA在用于胃癌诊断中的特异性和灵敏度。血液采集和血浆样品的制备自2006年I月以来，在新加坡的国立大学医院和Tan Tock Seng医院被新近诊断出胃癌的患者在知情同意的情况下预先加入到研究(胃癌生物标记物的发现II，GASCAD II)，收集其血液、配对的正常和肿瘤组织及胃液样品以及临床和病理注释。在手术或化疗前获得血样。通过组织病理学结合所有临床信息确定分期信息。不存在其它恶性肿瘤的迹象。使用了美国癌症联合协会(AJCC)的胃癌分期系统和胃癌性质的劳伦分类。从各机构的审查委员会取得了伦理批准。从在临床研究中经过上消化道内镜筛检被排除患有胃癌的对象中获得非癌对照。使用同样的血液采集方案。对象已知情同意且研究方案取得了各机构的审查委员会的批准。本研究中各中心使用的血液采集和血浆制备的标准方案參照血浆蛋白组计划(PPP)中的报道(Omenn，G. S.，et al.，Proteomics 2005，5，3226-3245)。通过静脉穿刺从每个患者体内取出约5mL的血液并转移到涂有K2EDTA(cat#362788，真空采血管；BD，美国)的真空采集管中。之后将管轻轻倒转8次，之后在室温下静置30分钟。将装有血样的管保存在冰上并转移到实验室中。接着以1，IOOx g的速度在4°C下离心10分钟将血浆与红细胞分离，向血衆样品中加入蛋白抑制剂并使用O. 22m的过滤单元(MiIlipore,MA,美国)净化。将ImL等份的血浆样品储存在-80°C下等待进ー步分析。为了保证血浆制备的一致性，需要进行质量控制测试，其中所有的血样需要在临床采集血液后一小时内(包括在室温下30分钟的培养)在实验室中被处理为血浆。进行ID SDS PAGE并使用SyproRuby荧光染料染色来检测可能存在的大規模蛋白质降解或样品恶化以进ー步验证各血浆样品的完整性。不满足这些特定的时间范围或完整性检测的样品会被储存起来但不会被用于该研究。三个实验中共同的37种蛋白的表达被验证为在正常对象和癌症对象的血浆中存在ー贯性差异。通过使用免疫印迹，验证了胃癌患者血浆中的补体组分C9蛋白的表达显著高于正常対象。该观察结果并不是由于患者间的差异，且不受到患者的胃炎和幽门螺杆菌(H. pylori)状况的影响。我们还观测到患有肠型和弥漫型癌症的患者间存在C9蛋白表达水平的统计学显著差异(P<0. 04)。在取自两个不同医院的总共119个血浆样品上进行的两个各自独立的关于C9表达的盲试研究显示其灵敏度为78%到89%，且其特异性为69%到78%。血清中的C9表达相对于CEA来说更为灵敏(CEA在7%到29%的范围内)。这表明由于其对胃癌是灵敏的和特异的，C9可作为人群筛检或诊断的癌症标记物。免疫检测试剂从Abcam(Cambridge,英国)购得小鼠单克隆C9抗体。增强化学发光(ECL)检测试剂盒购自通用 General Electric Healthcare,Bio-sciences (Uppsala,瑞典)；预染色的分子量标记物和丙烯酰胺/双丙烯酰胺29 I来自Bio-Rad (Hercules，CA)，蛋白酶抑制剂混合物来自Roche (Mannheim,德国)。原I凡酸钠和TEMED电泳试剂购自SigmaAldrich (StLouis,MO) ο BCA 蛋白质测试试剂盒来自 Pierce (Thermo Fisher Scientific,美国)，用于Hu-7消除(depletion)的缓冲液A和B购自Agilent Technologies (CA,美国)。测序级胰蛋白酶购自Promega (WI,美国)。本研究中的分组(cohort)样本的表征我们通过3个iTRAQ实验研究了 15个早期胃癌患者和8到22个晚期胃癌患者，如表I中所示。这里我们将那些根据美国癌症联合协会(AJCC)的分期系统诊断为I期和II期的胃癌定义为早期胃癌，而晚期胃癌为III期和IV期的胃癌。进行三个相对独立的定量研究以保证所得结果的可靠性。由于该课题在早期阶段样品的限制，从第一个到第三个实验所用的样品量逐渐增加。増加的样品量应会产生更具代表性的数据，并減少患者间的潜在偏差和差异。在每个实验中，用作対照的取自正常/健康对象的血浆样品的数量与所用的实验血浆样品(胃癌样品)相同。将对照和测试样品按照年龄和性别配对。正常血浆样品采自健康个体，他们没有癌症，但由于其家族胃癌病史被归类为胃癌高风险人群。在基于iTRAQ的质谱分析中还包括采自5个新近被诊断为肺癌的患者的血浆样品，以作对比。用于iTRAQ实验的样品的详细临床数据如表I所示。 表I.用于3个iTRAQ实验的样品的表征和临床数据
权利要求
1.一种检测疑似患有癌症或处于患癌症风险的个体中的癌症存在的方法，其包含 (a)测量获得自所述个体的合适的流体样品中的补体组分C9蛋白浓度，和 (b)将步骤(a)中测得的浓度与健康个体的补体组分C9蛋白浓度的标准数值范围相比较， 其中当获得自所述个体的补体组分C9蛋白浓度与健康个体的补体组分C9蛋白浓度的标准数值范围相比升高时，表明可能存在癌症。
2.一种检测疑似患有胃癌或处于患胃癌风险的个体中的胃癌存在的方法，其包含 (a)测量获得自所述个体的合适的流体样品中的补体组分C9蛋白浓度，和 (b)将步骤(a)中测得的浓度与健康个体的补体组分C9蛋白浓度的标准数值范围相比较， 其中当获得自所述个体的补体组分C9蛋白的浓度与健康个体的补体组分C9蛋白浓度的标准数值范围相比升高时，表明可能存在胃癌。
3.权利要求I或2的方法，其中与健康个体的补体组分C9蛋白浓度的标准数值范围相t匕，所述补体C9蛋白的浓度的升高是至少三倍的升高。
4.权利要求2的方法，进一步包含以下步骤 (c)测量获得自所述个体的合适的流体样品中的癌胚抗原蛋白浓度，和 (d)将步骤(C)中测得的浓度与健康个体中的癌胚抗原蛋白浓度的标准数值范围相比较， 其中当获得自所述个体的癌胚抗原蛋白的浓度与健康个体的癌胚抗原蛋白浓度的标准数值范围相比升高时，表明可能存在胃癌。
5.权利要求I或4的方法，其中使用能够选择性结合补体组分C9蛋白和/或癌胚抗原的抗体测量所述补体组分C9蛋白和/或癌胚抗原的浓度。
6.权利要求5的方法，其中通过ELISA测量所述补体组分C9蛋白的浓度。
7.权利要求5或6的方法，其中所述抗体能够选择性结合包含SEQIDNo 1或SEQ IDNo 3的补体组分C9蛋白抗原。
8.权利要求I或4的方法，其中使用分光光度法测量所述补体组分C9蛋白和/或癌胚抗原的浓度。
9.权利要求2的方法，进一步包含表征肠型胃癌，其中与健康个体的合适的流体样品中的补体组分C9蛋白浓度的标准值相比，补体组分C9蛋白的浓度3到4倍的升高表明存在肠型胃癌。
10.权利要求2的方法，进一步包含表征弥漫型胃癌，其中与健康个体的血液、血浆或血清中的补体组分C9蛋白浓度的标准值相比，补体组分C9蛋白的浓度4到45倍的升高表明存在弥漫型胃癌。
11.一种用于在合适的流体样品中检测可能的胃癌的试剂盒，其包含能够选择性结合补体组分C9蛋白的抗体和用于检测由所述抗体和补体组分C9蛋白形成的复合物的试剂。
12.权利要求11的试剂盒，进一步包含能够选择性结合癌胚抗原的抗体。
13.权利要求11或12的试剂盒，其中所述抗体能够选择性结合包含SEQID No :1或SEQ ID No 3的补体组分C9蛋白抗原。
14.能够选择性结合在合适的流体样品中的补体组分C9蛋白的抗体作为胃癌生物标志物的用途。
15.能够选择性结合补体组分C9蛋白的分离的抗体，其用于通过测量合适的流体样品中的补体组分C9蛋白浓度来检测胃癌。
16.补体组分C9蛋白，其作为合适的流体样品中的胃癌生物标志物。
17.能够选择性结合补体组分C9蛋白的适体，其用于检测或治疗胃癌。
全文摘要
胃癌是在世界范围内与癌症相关的死亡的主要原因。目前还没有可用于胃癌筛检的特异性标志物。鉴定了37种蛋白的表达谱在正常对象和胃癌对象的血浆之间存在一贯性差异。已证实胃癌患者的血浆中的补体组分C9蛋白的表达显著高于正常对象。而这与患者的胃炎和幽门螺杆菌状况无关。我们还观察到了肠型和弥漫型胃癌患者的C9表达水平间的统计学显著差异(p＜0.04)。两个独立的盲试研究证实了胃癌检测的高灵敏度和特异性。C9蛋白是用于筛检胃癌的生物标志物。
文档编号G01N33/574GK102687011SQ201080042262
公开日2012年9月19日 申请日期2010年7月23日 优先权日2009年7月23日
发明者Y·P·林 申请人:新加坡国立大学