癌症和传染病治疗的组合物及方法

专利名称：癌症和传染病治疗的组合物及方法
技术领域：
本发明涉及预防或治疗癌症或恶性疾病以及传染病的新的组合物和方法。特别地，本发明涉及促进1型免疫应答(如Thl细胞)的诱导和/ 或扰乱调节性T (Treg)细胞的一种组合物和方法。本发明进一步将本发明 的组合物的应用延伸到了疾病治疗中。
背景技术：
自身免疫系统细胞，尤其是树突状细胞(DC),主导原态CD4+T细胞 分化为功能各异的Thl、 Th2或调节性T (Treg)细胞亚型。由保守的 (conserved)微生物分子与病原识别受体(PRR)如Toll样受体(TLR)和 粘合素等的结合引起的未成熟DC的激活，伴随着成熟和向淋巴结的归巢， 在淋巴结中成熟的DC将抗原(Ag)呈递至原态T细胞。由病原来源分子 引起的DC的激活对于调控原态CD4+ T细胞分化为不同的T细胞亚型起 重要作用。Thl细胞可赋予针对细胞内感染和肿瘤的保护作用，但也与炎 症反应和自身免疫疾病偶联，而Th2细胞参与过敏反应。Treg细胞可抑制 Thl和Th2反应。免疫活性个体中的肿瘤发展可能反映出免疫系统对肿瘤抗原识别失 败，或可能由通过调节性T细胞的诱导和激活导致的抗肿瘤免疫应答的受 扰乱引起，调节性T细胞的诱导和激活可能受到了肺瘤生长环境的进一步 影响。自身和适应性免疫应答可被诱导来抗肿瘤，保护性效应细胞包括 CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL )、产生IFN-y的CD4+和CD8+ T细胞、 NK细胞和巨噬细胞。虽然T细胞通常含一个结合于肿瘤位点的主要免疫 细胞群，但它们经常对杀死胂瘤无效，有证据表明这可能由调节性T细胞 的功能引起(Woo, E. Y" et al., 2002 ￡wr J/mmw"o/ 32;3267 )。自然CD4+ CD25+调节性T细胞表达转录抑制因子Foxp3，作为胸腺来 源的成熟T细胞出现，在维持对自身抗原的耐受和防止自身免疫作用中起 重要作用(Sakaguchi， S. 2000. Ce〃 101:455-458 )。分泌IL-10 (定名为Trl细胞)或TGF - |3 (定名为Th3细胞)的诱导性 的调节性T细胞响应病原和自身抗原而在外周区域产生。在感染过程中， 自然的和诱导性的T细胞可通过防止病原诱导的免疫病症而对寄主起有益 作用。然而，也有报道称由病原诱导或激活的调节性T细胞可能是扰乱保 护性免疫的一种策略，且显示CD4+ CD25+调节性T细胞的损耗提高了特 定感染的存活率(Mills, K.H. and P. McGuirk. 2004. 5fem/" /附附w"o/ 16:107-117)。 CD4+CD25+调节性T细胞的损耗也可加强抗胂瘤免疫。效应 性和调节性T细胞之间的平衡可能也受肿瘤生长环境的影响，与肿瘤生长 的消散或发展可能存在相关。因此如果调节性T细胞受阻遏，使得效应性 T细胞反应加强，可能会使抗胂瘤疫苗或药剂更有效。Toll样受体Toll样受体(TLR)超家族对入侵病原的识别和免疫应答的启动起中 心作用。迄今已发现了 13个人类TLR。每个TLR识别不同的病原相关的 分子模式(PAMP)，导致信号转导级联反应的激活，然后激活转录因子 NF- k B及促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)、 p38、 c-jun、 N末端激酶(JNK) 和p42/44。 TLR-3和TLR-4也激活另一途径，在转录因子、干扰素调节因 子3 (IRF3)的激活中效应最大，干扰素调节因子3结合于干扰素敏感效 应元件(ISRE)，诱导包括IFN-P的一系列基因。TLR为一更大的超家族 的成员，称为白介素-1受体(IL-R) /TLR超家族，其也包含IL-1R1亚 群和含TIR结构域接头亚群。所有三个亚群都具有细胞质Toll/IL-l受体 (TIR)结构域，它对信号转导是重要的。TLR具有胞外富含亮氨酸的重 复序列，而IL-1R1亚群具有胞外免疫球蛋白结构域。接头分子为细胞质定 位的，不含胞外结构域。Toll样受体(TLR)激动剂已作为肿瘤疫苗的佐剂在临床试验中得到 检验。此疗法是基于TLR激动剂促进1型反应，尤其是激活分泌IFN-y的 Thl细胞、NK细胞和CD8CTL。迄今的结果已显示此疗法增强了抗肿瘤 免疫应答，但无真实迹象显示可防止肿瘤生长，虽然在小鼠模型中的数据 显示可能有一定的效果(Micronnel， I., S. et al. 2002. J7mww"o/ M&72")。疫苗抗传染病疫苗一般通过抗原特异性效应T细胞的产生，赋予机体对传 染的保护性(预防性)免疫，效应T细胞促进中和抗体的产生及介导抗病 原的细胞免疫。这些反应可在记忆性T和B细胞产生后被召回，在量和质 上受疫苗配方中佐剂的影响。佐剂可为加入抗原配方中的外源免疫调节剂 或减活或灭活的病毒或细菌疫苗的内源组分，它通过与TLR和其它病原识 别受体的相互作用而非特异性地激活自身免疫应答。TLR激动剂包括LPS、 CPG -寡聚脱氧核苷酸(CpG-ODN)和PolyIC，和全细菌体，包括百日咳 4干菌(5ordete〃a /7eWwss^)和结才亥分牙支杆菌(AfycoZj<3cfeWw/M fwZjerci/Zos^), 都具有佐剂活性，可促进效应T细胞和对共注射抗原的抗体反应。抗炎性细胞因子抑制剂已知环氧合酶-2(Cox-2)抑制剂被用作对多种癌症有一定效果的药 物。Cox-2是一种由炎症刺激诱导的酶，可在肿瘤组织内诱导前列腺素 E2(PGE2)合成。PGE2是IL-10的有效诱导剂。Cox-2促进血管形成、细胞 增殖，使细胞对细胞凋亡具有抗性，这解释了 Cox-2的选择性抑制剂(如 塞来昔布(CELECOXIB)和NS-398)对肿瘤生长的作用。MAP激酶抑制剂对炎症疾病的作用已得到临床验证，且之前ERK和 p38在体外细胞死亡和肺瘤细胞存活中被提到。本发明的惊人发现是用免疫系统已知调节剂的一种特殊联合给药可 使这些调节剂的效价得到协同提高，这使得发明人得出了改进的治疗组合 物，其通过阻遏可抑制促炎性免疫应答的抗炎性反应，而对治疗和/或预防 癌性疾病和传染病具有作用。已知调节性t细月包可表达抗炎性细胞因子如il-10和/或tgf-P，已知 这些细胞因子的表达可阻遏免疫应答。调节性T细胞也通过细胞-细胞接 触阻遏免疫应答。当被阻遏的免疫应答定向为抗肿瘤细胞发展时，免疫应
答的阻遏可促进肿瘤生长。因此，抗炎性细胞因子如IL-10和/或TGF-卩或 调节性T细胞的抑制剂，可对提高抗癌症治疗或传染病治疗的效果，尤其 是疫苗的效果有用。发明内容根据本发明的第一方面，提供了一种组合物用于治疗需要增强Thl介 导的免疫应答的疾病，所述组合物包括(i) 至少一种Toll样受体(TLR)激动剂，和(ii) 至少一种免疫调节剂，其可抑制对免疫应答的阻遏，这种阻遏由对 调节性T细胞功能的选择性抑制引起，或其引起细胞因子表达的调节，导 致至少一种抗炎性细胞因子受到阻遏和至少一种促炎性细胞因子上调。受到阻遏的抗炎性细胞因子可能为IL-10和/或TGF-P。上调的促炎性 细胞因子可能为IL-12,或任何其它促炎性细胞因子如干扰素Y、 IL-1和 TNF國P。促炎性细胞因子的上调可促进由效应细胞如Thl细胞和CTL(细胞毒 性T淋巴细胞)介导的炎性反应。免疫调节剂是一种抑制性化合物，其阻遏或抑制至少一种参与介导抗 炎免疫应答的分子，或参与介导某种抗炎免疫应答的途径。抗炎反应的特征是细胞因子IL-10的产生和Treg细胞的产生，如Trl 或Th3细月包。对IL-10和/或TGF-P的产生和/或IL-12的上调的适宜的抑制作用，是 在自身免疫系统细胞如树突状细胞中进行调节。免疫调节剂引起IL-10的产生受到适当阻遏或IL-10的功能受到适当抑 制。免疫调节剂可进一步引起TGF-(3的功能受到阻遏或抑制。这种对细胞 因子响应(IL-10和/或TGF-p)的调节，尤其是对自身免疫系统细胞的细 胞因子表达谱的调节可抑制Treg细胞的诱导，它是具有免疫抑制活性的T 细胞亚群。本发明的化合物除可调节IL-10和TGF-P外，也可调控更多的
已知可诱导抗炎效果的细胞因子的表达。免疫调节化合物可进一步阻遏调节性T细胞和免疫系统的其它细胞之 间的细胞-细胞直接接触，阻止由此机制介导的对促炎免疫应答的阻遏作 用。"调节性T细胞功能的选择性抑制，，意为调节性T细胞受到抑制，以 至其不能阻遏促炎性免疫应答或介导抗炎性免疫应答，特别是通过细胞_ 细胞直接接触的方式。如此处所定义，术语"上调"的^f吏用涉及细胞因子产生增加时，意为 其活性或表达强于静止细胞中所观察到的。如此处所定义，名词"阻遏"的使用涉及细胞因子产生减少时，意为 其活性或表达低于静止细胞中所观察到的。如此处所定义，名词"抑制，，的使用涉及细胞因子产生受到抑制时， 意为其活性或表达与静止细胞中所观察到的活性或表达水平相比受到抑 制或基本受到抑制。在一实施方案中，至少一种Toll样受体(TLR)激动剂可为本领域技 术人员所知的任何合适的TLR激动剂。TLR激动剂具有对TLR的结合亲 和力和特异性，它的结合可激活TLR并介导下游信号转导。TLR激动剂可对TLR-2、 TLR-3、 TLR-4、 TLR-5、 TLR-6、 TLR-7、 TLR-8和TLR-9中的至少一种具有结合特异性。适宜的TLR激动剂的特 例包括但不限于Pam3CSK4、酵母多糖、PolyIC、双链RNA、 LPS(月旨多糖)、 单磷酰脂A(MPL)、鞭毛蛋白、CpG-ODN(CPG-寡脱氧核香酸)、咪壹莫 特、R838和R837。此外，全细菌体如百日咳杆菌(万or&te/to/ emmk ) 和结核分4支杆菌(鄉co6ac&Www ft^woz/ow; )也可作为TLR激动剂(Toll 激动剂)。此外，上面所列的TLR激动剂的合适的类似物也可被利用，此 处所称类似物的功能可激活至少一种Toll样受体。免疫调节剂是一种可抑制免疫应答的下游介质的功能的合适的化合 物。调节效应对靶具有合适的选择性。抑制剂对靶的活性的抑制具有数量
号转导和信号调节的能力。在更多实施方案中，免疫调节剂可包括以下至少 一种物质的至少 一种抑制剂MAP激酶蛋白、Cox-2、 ERK、 p38或pl3k。免疫应答是一种抗炎反应或自身免疫应答，可适当促进调节性T细胞 的诱导。在一个实施方案中，免疫调节剂为MAP激酶蛋白或MAP激酶途 径的抑制剂，合适地为选择性抑制剂。MAP激酶(促分裂原活化激酶)是 参与细胞反应、炎症和生长的蛋白。p38激酶(p38 )是MAP激酶的应激活化蛋白激酶(SAPK)亚群的一 个成员。在哺乳动物细胞中，p38激酶信号转导途径参与细胞对胁迫的反 应，已知其也对细胞凋亡的上调具有功能。已知p38激酶的激活可增加使 炎性反应形成的分子如IL-1、 TNF和Cox-2的产生。在一个实施方案中抑制剂为一种p38激酶抑制剂。该抑制剂可抑制至 少一种p38激酶异型体的功能。因而此抑制剂被用于抑制p38信号转导途 径的功能。优选地，p38激酶抑制剂为SB203580或其药学上可接受的盐或 溶剂化物或类似物，此类似物具有p38抑制剂活性。选择性地，抑制剂可 为SB220025或SB239063或其药学上可接受的盐或溶剂化物或类似物，此 类似物具有p38激酶抑制剂活性。ERK(胞外调节的激酶)是MAP激酶的一个族，可调控细胞的生长和增殖。在一个实施方案中抑制剂为ERK抑制剂，合适地为选择性ERK抑制 剂。优选地，ERK抑制剂为U0126或其药学上可接受的盐或溶剂化物或类 似物，此类似物具有ERK抑制剂活性。选择性地，抑制剂可为PD98059 或类似物，此类似物具有ERK抑制剂活性。在一另外的实施方案中ERK 抑制剂与p38抑制剂化合物同时提供。在另外的实施方案中免疫调节剂可为更多的MAP激酶如MEK1或 MEK2的抑制剂，可能是抑制或封闭Thl信号转导途径中位于MAP激酶 下游某点的转录因子的化合物。这种转录因子的其中一例是c-Fos。在另外一实施方案中，免疫调节剂为磷酯酰肌醇激酶-3的抑制剂，
适宜地为选择性抑制剂。磷酯酰肌醇激酶-3 (pI3K)为一种调控细胞寿 命的原癌基因。在一实施方案中pBK抑制剂为LY294002,其药学上可接受的盐或溶 剂化物或类似物，其类似物具有pI3K抑制剂活性。选择性地，pI3K抑制 剂可为渡曼青霉素(WMN)。在另外一实施方案中，免疫调节剂为Cox-2(环氧合酶2)抑制剂。合适 的Cox-2抑制剂包括塞来昔布(CELEBREX (NS-398), Pfizer公司)、 BEXTRA (Pfizer公司)、罗非可昔(Rofecoxib) (VIOXX， Merck)或其药学上 可接受的盐或溶剂化物或类似物，其类似物具有Cox-2抑制剂活性。合适 的Cox-2抑制剂为选择性抑制剂。通过抑制能够生成IL-10或TGF-p的诱导的调节性T细胞或表达 Foxp3的天然调节性T细胞的诱导，Cox-2抑制剂的给药使免疫应答向Thl 途径偏移。依据本发明的此方面，Cox-2抑制剂和TLR激动剂的共同给药 可使天然的和诱导的调节性T细胞都受抑制。发明人意外发现当与TLR激动剂一起给药时，Cox-2的抑制可阻遏抗 炎性细胞因子IL-10和TGF-p的产生。此外在受Toll样受体激动剂刺激后， Cox-2抑制剂也显示可诱导IL-27 mRNA的产生，进一步也观察到可增加 由树突状细胞产生的IL-12p40和IL-12p35,而同时减少了 IL-10mRNA的 表达。组合物可另含至少一种肿瘤特异性抗原。肿瘤特异性抗原可来源于热 激蛋白与从癌细胞或癌性疾病个体中分离的抗原性肽之间形成的复合物。在一实施方案中，组合物可另含抑制可增强肿瘤细胞生长的肿瘤细胞 产物的化合物。此化合物可能引起肿瘤存活时间的延长，通过例如赋予耐 药性或赋予对细胞凋亡的抗性。本领域技术人员将熟知此类化合物的例 子。如此处所定义的，"需要Thl介导的免疫应答得到加强的疾病"可为癌 症或恶性疾病，或进一步地，所称疾病可为传染病。此种疾病的例子将在 下文描述。 本发明的另一方面提供了 一种药物组合物用于加强Thl介导的免疫应 答，此组合物包括至少一种Toll样受体激动剂和至少一种能够抑制对免疫 应答的阻遏的免疫调节化合物，此处的阻遏作用由对调节性T细胞的功能 的选择性抑制引起，或其导致对细胞因子表达的调节，如伴随药学上可接 受的赋形剂、稀释液或载体的使用，使至少一种抗炎性细胞因子受到阻遏 及至少一种促炎性细胞因子上调。在一实施方案中，免疫调节剂选择性抑制调节性T细胞的功能，导致 其不能阻遏细胞-细胞接触介导的促炎性免疫应答。在一实施方案中，抗炎性细胞因子IL-10的生成受到调节剂的抑制或 阻遏而促炎性细胞因子IL-12的生成得到增强。免疫调节剂是能够抑制免疫应答的下游介质的功能的合适的化合物， 且可能为一种特殊的MAP激酶蛋白的抑制剂。抑制剂可能为p38激酶抑 制剂、ERK抑制剂、MEK1或MEK2抑制剂、pI3K抑制剂或Cox-2抑制 剂中的至少一种。合适的TLR激动剂包括但不局限于Pam3CSK4、酵母多糖、PolyIC、 双链RNA、 LPS(月旨多糖)、单磷酰脂A(MPL)、鞭毛蛋白、CpG-ODN(CPG-寡脱氧核苷酸)、咪喹莫特、R838和R837。此外，全细菌体如百日咳杆菌 (^ordefe/Aa / erftwsis )和纟吉才亥分4支杆菌(柳co6acfen'w附/w6e/rw/os/s )也可 作为TLR激动剂(Toll激动剂)。在一实施方案中，Thl免疫应答的增强使得该药物组合物可被用于治 疗或预防癌症或恶性疾病或传染病。在一实施方案中，组合物可能另含能够抑制肿瘤生长和发育或能够抑 制或阻遏可促进肺瘤生长的产物或介质的功能的调节化合物。此调节化合 物可能抑制或阻遏任何引起肺瘤存活延长的分子或途径的功能。例如调节 化合物可抑制肿瘤细胞的耐药性或抑制其对细胞凋亡的抗性。本发明的另一方面提供了一种治疗或预防需要加强Thl介导的免疫应 答的疾病的方法，此方法含以下步骤-用至少一种Toll样受体激动剂的治疗有效量给药，以及 -用至少 一种能够抑制对免疫应答阻遏的免疫调节剂的治疗有效量给药，此处的阻遏作用由对调节性T细胞的功能的选择性抑制引起，或其 导致对细胞因子表达的调节，使至少 一种抗炎性细胞因子受到阻遏及至少 一种促炎性细胞因子上调。在一实施方案中，抗炎性细胞因子IL-10的生成受到免疫调节剂的抑 制或阻遏而促炎性细胞因子IL-12的生成得到增强。免疫调节剂引起至少IL-10的功能的阻遏或抑制。调节剂可进一步引 起TGF-P的功能的阻遏或抑制。这种对细胞因子响应的调节，尤其是对自 身免疫系统细胞的细胞因子表达谱的调节可抑制Treg细胞的诱导，其为T 细胞的亚群，具有阻遏活性。除对IL-10和TGF-(3进行调控外，本发明的 化合物可能调控更多的已知可诱导抗炎效果的细胞因子或介质的表达。另外，免疫调节剂可介导IL-12的表达或功能活性的增强。也可观察 到更多促炎性细胞因子如IL-1、 TNF-P或IFN-y的上调。IL-10和/或TGF-卩的产生的适当抑制和/或IL-12的适当的上调是在自 身免疫系统的细胞中受到调控的，如树突状细胞。免疫调节剂是一种抑制免疫应答的下游介质的功能的适当化合物，可 特别作为一种MAP激酶蛋白抑制剂。抑制剂可能为以下物质中的至少一 种p38激酶抑制剂、ERK抑制剂、MEK1或MEK2抑制剂、pI3K抑制 剂或Cox-2抑制剂。合适的TLR激动剂包括但不局限于Pam3CSK4、酵母多糖、PolyIC、 双链RNA、 LPS(月旨多糖)、单磷酰脂A (MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN(CPG-寡脱氧核苷酸)、咪喹莫特、R838和R837。此外，全细菌体如百日咳杆菌 (Sorde/e〃a/^Wmss/s )和纟吉斗玄分才支杆菌(聊co6acte〃'ww ^/Z)ercw/as7.51)也可 作为TLR激动剂(Toll激动剂)。在一个实施方案中，将Toll样受体激动剂和免疫调节化合物对接受者 进行共同给药。可选地，将Toll样受体激动剂和免疫调节化合物分开或先 后给药，且在此实施方案中，Toll样受体激动剂和免疫调节化合物的给药 方法可能不同。
接受者一般为哺乳动物。在另外的实施方案中，接受者为人。 本发明可用于提供一种治疗或预防任何已知类型的癌症或恶性疾病的方法。癌症或恶性疾病可包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨 肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮 肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文肿瘤、平滑肌肉瘤、横紋肌肉瘤、结肠癌、 胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、 汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、嚢腺癌、髓样癌、支气管癌、 肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎性癌、肾母细胞 瘤、宫颈癌、睾丸癌、肺癌、肺小细胞癌、膀胱癌、上皮癌、胶质瘤、星 形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、 听神经瘤、少突神经胶i瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤、^L网膜 母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症和重链病。本发明的组合物、药物组合物和方法用于治疗传染病，传染病可包含 但不限于以下细菌或病毒引起麻风杆菌、结核分枝杆菌、利什曼原虫、 百日咳杆菌、疟疾、流感病毒、艾滋病病毒、丙型肝炎病毒。本发明的另 一方面是提供了 一种组合物的应用，它含至少一种Toll样 受体激动剂和免疫调节剂，其可通过选择性抑制调节性T细胞的功能或调 控细胞因子的表达而引起至少一种抗炎性细胞因子受到阻遏及至少一种 促炎性细胞因子上调而抑制对免疫应答的阻遏，用于治疗需要增强Thl介 导的免疫应答的疾病。在一个实施方案中此疾病为恶性或癌性疾病。在另 一个实施方案中此 疾病为传染病。在一个实施方案中抗炎性细胞因子IL-10的产生受到免疫调节剂的抑 制或阻遏，而促炎性细胞因子IL-12的产生得到增强。免疫调节剂引起至少IL-10的功能的适当阻遏或抑制。此调节剂可能 进一步引起TGF-P的功能的阻遏或抑制。这种对细胞因子响应的调节，尤 其是对自身免疫系统细胞的细胞因子表达谱的调节可抑制调节性T细胞的 诱导，它是T细胞的亚群，具有阻遏活性。除了对IL-10和TGF-卩调控夕卜,
本发明的化合物可能调控更多的已知可诱导抗炎效应的细胞因子或介质的表达。此调节剂也可能抑制调节性T细胞对细胞-细胞接触的阻遏。另外，此免疫调节剂可介导IL-12的表达或功能活性的增强。也可观 察到更多的促炎性细胞因子如IL-1、 TNF-p或IFN-y的上调。对IL-10和/或TGF-P的产生的适当抑制和/或IL-12的适当上调的调节 作用是在自身免疫系统细胞中进行的，例如树突状细胞。合适的TLR激动剂包括但不局限于Pam3CSK4、酵母多糖、PolyIC、 双链RNA、 LPS(月旨多糖)、单磷酰脂A(MPL)、鞭毛蛋白、CpG-ODN(CPG-寡脱氧核苷酸)、咪喹莫特、R838和R837。此外，全细菌体如百日咳杆菌 (Bordetella pertussis)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)也可 作为TLR激动剂(Toll激动剂)。免疫调节剂是一种适当抑制免疫应答的下游介质的功能的化合物，可 特别作为一种MAP激酶蛋白抑制剂。抑制剂可能为p38激酶抑制剂、ERK 抑制剂、MEK1或MEK2抑制剂、pI3K抑制剂或Cox-2抑制剂中的至少 一种。本发明的另 一方面是提供了至少 一种Toll样受体激动剂和免疫调节剂 的应用，此调节剂通过选择性抑制调节性T细胞的功能或调控细胞因子的 表达而引起至少一种抗炎性细胞因子受到阻遏及至少一种促炎性细胞因 子上调而抑制对免疫应答的阻遏，用于制备治疗需要增强Thl介导的或其 它效应的免疫应答的疾病的药物。在一个实施方案中此疾病为恶性或癌性疾病。在另 一个实施方案中此 疾病为传染病。免疫调节剂是一种适当抑制免疫应答的下游介质的功能的化合物，可 特别作为一种MAP激酶蛋白抑制剂。抑制剂可能为p38激酶抑制剂、ERK 抑制剂、MEK1或MEK2抑制剂、pI3K抑制剂或Cox-2抑制剂中的至少 一种。合适的TLR激动剂包括但不局限于Pam3CSK4、酵母多糖、PolyIC、 双链RNA、 LPS(月旨多糖)、单磷酰脂A (MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN(CPG-
寡脱氧核苷酸)、咪会莫特、R838和R837。此外，全细菌体如百日咳杆菌 (5orafefe〃a/ eWwswi)和结4亥分才支4干菌(iVfycc^acferfKm fw&ercM/osi's)也可 作为TLR激动剂(Toll激动剂)。在另外的特殊实施方案中，本发明延伸为改进抗癌症或黑色素瘤疫苗 的效价。发明人意外发现一种组合物，其含抗癌疫苗成分(如肿瘤特异性 疫苗)和抑制调节性T细胞或IL-10产生的免疫调节化合物，可作为治疗 癌症和恶性疾病的异常有效的药物组合物。以非活性物质如蛋白接种一般会引起抗体反应和CD4+辅助性T细胞 反应以及Thl或Th2反应。另一方面，以活性物质如活病毒或细胞内细菌 接种或感染一般会引起CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。Thl和 CTL反应对针对癌症、病原性病毒和细胞内细菌的保护作用是重要的。Th2 反应对针对细胞外细菌和寄生虫的保护作用是重要的。相应地，本发明的更多方面提供了一种治疗癌症或恶性疾病的组合 物，包括(i) 组合物，其包括至少一种可引发免疫应答的肿瘤特异性抗原，所 述应答对癌症或恶性疾病特异，(ii) 至少一种Toll样受体激动剂；和(iii) 免疫调节剂，其通过选择性抑制调节性T细胞的功能或调控细 胞因子的表达而引起至少一种抗炎性细胞因子受到抑制及至少一种促炎 性细胞因子上调而抑制对免疫应答的阻遏。含至少一种肿瘤特异性抗原的组合物为一种合适的癌症疫苗，或含至 少一种抗原(Ag)的疫苗成分。肿瘤特异抗原可进一步为一种已知的代表 某一特殊类型肿瘤的抗原。合适的TLR激动剂和免疫调节化合物已在上文中描述。对细胞因子响应特别是免疫系统细胞的细胞因子表达谱的调控可抑 制调节性T细胞的诱导。这可能由对IL-10的阻遏或抑制而介导。肿瘤疫苗可为任何合适的疫苗或疫苗片l殳，例如全细胞疫苗、DNA疫
苗、亚单位疫苗或肽疫苗。免疫调节化合物与抗原一起给药，IL-10的产生可能进一步上调细胞 因子IL-12的产生。IL-12可使免疫应答向'Thl，途径偏移。在另外的情 况中，IL-10抑制剂可能并不特异地诱导IL-12产生，但是这可能由IL-IO 产生的减少而间接引起。Thl免疫应答的诱导一般伴随着对调节性T细胞免疫应答的扰乱。本发明的另 一 方面提供了 一种药物组合物，用于治疗或预防癌症或恶 性疾病，此组合物包括至少一种引发免疫应答的肿瘤特异性抗原，至少一 种TLR激动剂和免疫调节化合物以及药学上可接受的赋形剂、稀释液或载 体。合适的TLR激动剂和免疫调节化合物已在上文中描述。在一个实施方案中，胂瘤特异抗原来源于癌症疫苗或疫苗成分。本发明的另一方面提供了一种用于治疗癌症或恶性疾病的方法，此方 法包括以下步骤-用抗癌疫苗或其含至少一种肿瘤特异性抗原的抗原性片段或决定 簇给药；-用至少一种Toll样受体激动剂给药，以及-用治疗有效量的至少一种免疫调节化合物向需要的接受者给药，此 化合物可在自身免疫系统的细胞中，通过抑制IL-10和/或TGF-P和/或上 调IL-12而调控细胞因子的反应。调节剂通过选择性抑制调节性T细胞的功能或调控细胞因子的表达而 引起至少一种抗炎性细胞因子受到阻遏及至少一种促炎性细胞因子上调 而适当抑制对免疫应答的阻遏。合适的TLR激动剂和免疫调节化合物已在上文中描述。接受者一般为哺乳动物。在另外的实施方案中，接受者为人。本发明还有另一方面是提供了包括至少一种肿瘤特异性抗原、至少一 种Toll样受体激动剂和免疫调节化合物的组合物用于治疗癌症或恶性疾病
的应用，该免疫调节化合物可通过选择性抑制调节性T细胞的功能或调控 细胞因子的表达而引起至少一种抗炎性细胞因子受到阻遏及至少一种促 炎性细胞因子上调而抑制对免疫应答的阻遏。本发明还有另一方面是提供了包括至少一种肿瘤特异性抗原、至少一 种Toll样受体激动剂和免疫调节化合物的组合物用于制备治疗癌症或恶性 疾病的药物的应用，该免疫调节化合物可通过选择性抑制调节性T细胞的 功能或调控细胞因子的表达而引起至少一种抗炎性细胞因子受到阻遏及 至少一种促炎性细胞因子上调而抑制对免疫应答的阻遏。合适的TLR激动剂和免疫调节化合物已在上文中描述。接受者一般为哺乳动物。在另一实施方案中，接受者为人。另一方面，本发明延伸为一种疫苗组合物，其包括从癌症细胞或具有 癌症疾病的个体中分离的热激蛋白，且一种抗原性肽与其非共价复合。此 热激蛋白-抗原性肽复合物(HSP-Ag)可向个体施药，以诱导抗原性肽定 向的免疫应答。发明人意外发现用于抑制免疫系统的免疫介质如Cox-2抑 制剂的共同给药，能够引起针对复合了 HSP的抗原的免疫应答增强。 HSP-Ag复合体的分离使得抗原可被抗原呈递细胞呈递至免疫系统，使在 抗原被识别为非自身物质时产生免疫应答。这种HSP-Ag复合物的实例之一为热激蛋白HSP-70与肿瘤特异性肽 形成的复合体。在此方面，本发明提供的用于治疗癌症或恶性疾病的组合 物包括(i) 与抗原性肽复合的热激蛋白；和(ii) 免疫调节化合物，其通过选择性抑制调节性T细胞的功能或调 控细胞因子的表达而引起至少一种抗炎性细胞因子受到阻遏及至少一种 促炎性细胞因子上调而抑制对免疫应答的阻遏。免疫调节剂通过自身免疫系统细胞抑制IL-10和/或TGF-卩和/或上调 IL-12而适当调控细^<因子反应。对自身免疫系统细胞细胞因子反应的调节，尤其是对细胞因子表达谱 的调节可抑制调节性T细胞的诱导。
合适的TLR激动剂和免疫调节化合物已在上文中描述。与热激蛋白复合的抗原为一种合适的肿瘤特异性抗原，且来源于肿瘤 细胞。当免疫调节剂为Cox-2抑制剂时，HSP-70-抗原复合物与Cox-2抑制 剂一起给药可引起树突状细胞上CD80表达的增强。在一实施方案中以树突状细胞HSP-70疫苗的形式提供了 HSP-60/抗原 复合物。本发明在此方面进一步延伸为对来源于癌症细胞或感染了癌性疾病 的寄主的不同热激蛋白的应用。相应地，热激蛋白可为HSP-60、 HSP-90 和gp96,但不限于上述的种类，且可能延伸至任何本领域技术人员所知的 热激蛋白。本发明还有另 一方面提供了与肿瘤特异性抗原复合的热激蛋白与至 少 一种Toll样受体激动剂和免疫调节剂 一起用于治疗癌症或恶性疾病的应 用，这种免疫调节剂可通过选择性抑制调节性T细胞的功能或调控细胞因 子的表达而引起至少一种抗炎性细胞因子受到阻遏及至少一种促炎性细 胞因子上调而抑制对免疫应答的阻遏。本发明另 一方面延伸为与肿瘤特异性抗原复合的热激蛋白与至少一 种Toll样受体激动剂和免疫调节剂一起在制备用于治疗癌症或恶性疾病的 药物中的应用，这种免疫调节剂可通过选择性抑制调节性T细胞的功能或 调控细胞因子的表达而引起至少一种抗炎性细胞因子受到阻遏及至少一 种促炎性细胞因子上调而抑制对免疫应答的阻遏。树突状细胞疫苗树突状细胞(DC)是高效的抗原呈递细胞(APC),具有活化对外来 和自身抗原特异的初始T淋巴细胞的独特能力。树突状细胞在骨髓中产生，经血流迁移到机体的所有组织。这些细胞 通常发现于一些结构区室如胸腺、淋巴结和脾之类的淋巴器官。然而它们 也^L发现于血流和机体的其它组织。情况适合时树突状细胞俘获抗原并迁 移到引流淋巴结，此处启动免疫应答。
树突状细胞通过主要组织相容性复合物(MHC)-肽复合体加工和呈递 肽至抗原特异性初始T、淋巴细胞。本发明进一步将本发明的化合物和方法的使用延伸为诱导成熟树突 状细胞的一种特殊亚群的产生，其具有能够促进由一些细胞类型如Thl和 CTL介导的效应性T细胞反应，并进一步阻遏调节性T细胞的产生的表型 和细胞因子表达语。髓系和淋巴树突状细胞群在本发明中都有用途。期望能够对树突状细胞进行调控，以将其表型修饰为能够表达可诱导 Thl细胞谱和CTL反应的细胞因子谱。此树突状细胞亚群的诱导用于避免 产生半成熟树突状细胞，半成熟树突状细胞的特征为可产生IL-10和 TGF-P，此种细胞因子语可引起调节性T细胞的产生或CD80或CD86的 高表达而CD40低表达。本发明进一步延伸为树突状细胞疫苗。上文定义的组合物可向需要癌 性疾病或传染病相关治疗的个体施药以向其提供预防性或治疗性治疗。此 介导抗传染病免疫应答的疫苗组合物一般是进行预防性施药以预防个体 的感染。但是当用于传染病如丙型肝炎和艾滋病病毒，疫苗为进行治疗性 施药时，会有例外情况。然而， 一般由于受治疗者的免疫妥协状态， 一般 不将传染病疫苗以治疗方式施药。当将疫苗向具有癌性疾病的个体施药时一般是进行治疗性施药，因为 疫苗将包含肿瘤细胞或来源于胂瘤细胞的抗原。发明人已发现了树突状细胞疫苗与癌性疾病治疗有关的用途。另外， 发明人意外发现用包括树突状细胞、Toll样受体激动剂和免疫调节剂的疫 苗组合物给药可提高药物的效价。因此，本发明的另一发明延伸为一种用于治疗癌性疾病的疫苗组合 物，其包括-树突状细胞，-至少一种肿瘤细胞抗原，-至少一种Toll样受体激动剂，和-免疫调节化合物，其通过选择性抑制调节性T细胞的功能或调控细 胞因子的表达而引起至少一种抗炎性细胞因子受到阻遏及至少一种促炎 性细胞因子上调而抑制对免疫应答的阻遏。合适的TLR激动剂和免疫调节化合物已在上文.中描述。合适的树突状细胞可通过过继转移树突状细胞提供，其在存在或不存 在Toll样受体激动剂和可对于抗肿瘤或恶性疾病或传染病有效的抑制 IL-10及可诱导Thl细胞反应的免疫调节化合物时以肿瘤特异性抗原冲激 (pulse)。合适的树突状细胞具有半成熟表型。在一实施方案中，至少一种肿瘤抗原可通过用与抗原复合的热激蛋白 给药提供。与抗原性蛋白复合的热激蛋白可来源于癌症细胞或具有癌性疾 病的个体。本发明的另一方面提供了一种治疗癌症或恶性疾病的方法，此方法包 括以下步骤-用在肿瘤特异性抗原存在下冲激的树突状细胞给药， -用至少一种Toll样受体激动剂给药，和-用至少一种治疗有效量的可抑制对免疫应答的阻遏的免疫调节化 合物向需要的接受者给药，该阻遏作用由对调节性T细胞的功能的选择性 抑制引起，或其引起细胞因子表达的调节而导致至少一种抗炎性细胞因子 受到阻遏及至少 一种促炎性细胞因子上调。合适的TLR激动剂和免疫调节化合物已在上文中描述。本发明的另一方面提供了树突状细胞、至少一种肿瘤特异性抗原、至 少一种Toll样受体激动剂和免疫调节化合物用于治疗癌性疾病的应用，该 化合物通过选择性抑制调节性T细胞的功能或引起细胞因子表达的调节， 导致至少一种抗炎性细胞因子受到阻遏和至少一种促炎性细胞因子上调 而抑制对免疫应答的阻遏作用。本发明的另一方面提供了树突状细胞、至少一种肿瘤特异性抗原、至 少一种Toll样受体激动剂和免疫调节化合物在制备用于治疗癌性疾病的疫 苗组合物中的应用，该化合物通过选择性抑制调节性T细胞的功能或引起 细胞因子表达的调节，导致至少一种抗炎性细胞因子受到阻遏和至少一种 促炎性细胞因子上调而抑制对免疫应答的阻遏作用。发明者进一步发现了一种可向个体施药的树突状细胞疫苗，用于癌症 或恶性疾病的治疗，此组合物未提供肿瘤特异性抗原，而提供了被施用疫 苗组合物的个体来源的肿瘤特异性抗原。因此，本发明的另一方面为提供了一种用于癌性疾病的治疗的疫苗组 合物，其包括-树突状细胞，-至少一种Toll样受体激动剂，和-免疫调节化合物，其通过选择性抑制调节性T细胞的功能或调控细 胞因子的表达而引起至少一种抗炎性细胞因子受到阻遏及至少一种促炎 性细胞因子上调而抑制对免疫应答的阻遏。合适的TLR激动剂和免疫调节化合物已在上文中描述。本发明的另一方面提供了一种治疗癌症或恶性疾病的方法，此方法包 括以下步骤-用在肿瘤特异性抗原存在下冲激的树突状细胞给药，和-用至少一种治疗有效量的可抑制对免疫应答的阻遏的免疫调节化 合物向需要的接受者给药，该阻遏作用由对调节性T细胞的功能的选择性 抑制引起，或其引起细胞因子表达的调节而导致至少一种抗炎性细胞因子 受到阻遏及至少一种促炎性细胞因子上调。合适的免疫调节化合物已在上文中描述。本发明的另一方面提供了树突状细胞、至少一种Toll样受体激动剂和 免疫调节化合物用于治疗癌性疾病的应用，该化合物通过选择性抑制调节 性T细胞的功能或引起细胞因子表达的调节，导致至少一种抗炎性细胞因 子受到阻遏和至少一种促炎性细胞因子上调而抑制对免疫应答的阻遏作 用。
本发明的另一方面提供了树突状细胞、至少一种Toll样受体激动剂和 免疫调节化合物在制备用于治疗癌性疾病的疫苗组合物中的应用，该化合 物通过选择性抑制调节性T细胞的功能或引起细胞因子表达的调节，导致 至少一种抗炎性细胞因子受到阻遏和至少一种促炎性细胞因子上调而抑 制对免疫应答的阻遏作用。因此本发明的另一方面提供了一种适合治疗癌症或传染病的在接受 者体内诱导Thl反应的方法，此方法包括以下步骤-为使树突状细胞达到可促进效应细胞功能的成熟程度，在疫苗和/ 或TLR激动剂和免疫调节化合物存在下将分离的树突状细胞间接体内暴 露于疾病特异性抗原，此化合物可抑制由自身免疫系统细胞产生IL-10和/ 或TGF-P或上调IL-12产生，-向接受者施用树突状细胞，使接受者产生足够强的免疫应答，来防 止癌症攻击或选艮或预防病原性#:生物的感染以预防传染病。在一个实施方案中，本发明的此方面的树突状细胞为接受者自体的。 在一个实施方案中此树突状细胞为成熟树突状细胞。疾病特异性抗原为合适的肿瘤特异性抗原。合适的TLR激动剂和免疫调节化合物已在上文中描述。本发明的另一方面涉及到对利用间接体内方法暴露于疫苗和/或TLR 激动剂和免疫调节化合物的树突状细胞在制备治疗癌性疾病或传染病的 药物中的应用，该化合物抑制对免疫应答的阻遏作用，这种阻遏作用通过 选择性抑制调节性T细胞的功能或引起细胞因子表达的调节，导致至少一 种抗炎性细胞因子受到阻遏和至少一种促炎性细胞因子上调引起。在可选实施方案中本发明此方面的树突状细胞可被任何其它合适的 抗原呈递细胞代替。合适的抗原呈递细胞为巨喧细胞、单核细胞和B细胞。 在另外的实施方案中，通过间接体内方法对树突状细胞进行了调变。在优选实施例中，再给药的抗原呈递细胞、优选的树突状细胞为接受 者自身固有的。接受者一般为人。
本发明的另一方面提供了一种组合物用于预防或治疗癌症、恶性疾病或传染病，所述组合物包括(i) 在可引发传染病、癌症或恶性疾病的特异性免疫应答的疫苗或疫 苗成分存在下冲激的树突状细胞，(ii) 佐剂，如Toll样受体激动剂；和(iii) 可抑制对免疫应答的阻遏作用的化合物，这种阻遏作用通过选 择性抑制调节性T细胞的功能或引起细胞因子表达的调节，导致至少一种 抗炎性细胞因子受到阻遏和至少一种促炎性细胞因子上调引起；以及药学 上可接受的赋形剂、稀释液或载体。对IL-10和/或TGF-(3产生的抑制和/或IL-12的上调是在自身免疫系统 中进行适当调节的，例如树突状细胞。在一个实施方案中，用全细胞癌症疫苗如热激的受辐射的B16肿瘤细 胞与和可作为MAP激酶抑制剂的化合物ERK —起的TLR激动剂CpG共 同处理树突状细胞。在另外的实施方案中，ERK抑制剂可能^皮替换为p38 抑制剂、pI3K抑制剂或Cox-2抑制剂。在另外的实施方案中，DC可能受由癌症细胞或感染了传染病的细胞 来源的HSP-70沖激，所述DC进一步暴露于可抑制抗炎性细胞因子产生 的化合物， 一个特殊例子为可抑制IL-10和/或抑制天然Treg表达的Cox-2 抑制剂的施药。
具体实施方式
初始CD4+T细胞可分化为效应Thl或Th2细胞或Treg细胞，这些不 同亚型的选择性诱导可能由许多因素决定，包括树突状细胞(DC)的成熟 程度和自身免疫系统细胞分泌的调节性细胞因子。 一些病原来源的免疫调 节性分子如TLR配体促进Thl细胞的诱导。别的病原来源的分子，如来 自百日咳杆菌和CT的FHA和Cya，选择性地或与Th2细胞一起促进Tr 细胞的诱导。Treg细胞与效应T细胞的同时诱导可能是一种寄主保护性策 略，以控制过度的Thl和Th2反应，由此限制病原诱导的炎症和免疫病理。Thl细胞被TLR配体诱导与它们的功能关联，即促进从自身细胞，尤其是 巨噬细胞和DC中产生IL-12和IL-27。然而，也显示TLR配体可诱导IL-10 从巨噬细胞产生，且显示促进Th2的TLR-2激动剂Pam3Cys可诱导IL-10 从DC中产生。
本发明的发明者最近证明表达IL-IO和TGF-P的CD4+和CD8+ Treg细 胞可能干扰抗肿瘤免疫和促进肿瘤生长。他们证明，T细胞对旁观者抗原 的反应在CT26肿瘤生长区域的抗原皮下免疫的小鼠中受到阻遏。生长的 肿瘤中的T细胞表达IL-IO、 TGF-p和Foxp3的mRNA, CD4+和CD8+ T 细胞高频率浸润肿瘤，引流'淋巴结中T细胞分泌IL-10,而分泌IFN-y的 频率低。分泌IL-10的巨噬细胞和树突状细胞也浸润生长中的肿瘤。CD8+ CTL反应在患有肺转移瘤的小鼠中检测不到，在皮下注射CT26结肠癌细 胞后可微量瞬时检测到，但在抗IL-10和抗TGF-p存在下得到增强。体内 使CD4+或CD25+ T细胞损耗后显著增加了 CD8+ T细胞IFN-y的产生，减 小了皮下肿瘤的体积、减少了肺转移瘤以及提高了存活率。相反，CD8+T 细胞的去除取消了 CTL反应，促进了皮下肿瘤的发展但减少肺转移癌。这 些发现表明肿瘤生长使分泌IL-10和TGF-P的CD4+ Treg细胞能够被诱导 和募集，并阻遏效应CD8+T细胞反应。然而表达IL-IO和TGF-P的008+ Treg细胞也被肺的免疫抑制环境募集或激活，它们在此处可能阻遏抗肿瘤 免疫的诱导。
本发明的发明人此前证明了 TLR激动剂给药的同时诱导了分泌IL-10 的Treg和Thl细胞。TLR配体诱导分泌IFN-y、 IFN-y和IL-10或仅IL-10 的T细胞。另外，这些不同类群的分泌IL-10的Trl和分泌IL-lO和IFN-y 的Thl样Treg细胞阻遏Thl细胞产生IFN- y ,表明TLR配体同时诱导不 同类群的调节性和效应T细胞。此前报道了自身IL-12和IL-10分别主导 Thl和Tregl细胞的谈导。发明人证明TLR-2、 TLR-4、 TLR-5、 TLR-7、 TLR-8和TLR-9可激活DC的IL-10和IL-12的产生。另外，TLR配体诱 导ERK和p38 MAP激酶的磷酸化，ERK和P38的抑制剂能阻遏TLR配 体诱导的IL-10并促进树突状细胞产生IL-12。
本发明的发明人不希望受理论的束缚，确信p38抑制剂、pI3K抑制剂、ERK抑制剂和/或Cox-2抑制剂通过阻遏自身细胞(例如树突状细胞)产 生IL-10和促进IL-12产生，由此促进Thl和CTL而非Treg细胞的诱导， 从而增强TLR激动剂和/或HSP-70疫苗的效价。此作用限制了与Treg细 胞的诱导和激活相关的抗肿瘤免疫应答的扰乱。定义如此处所用，术语"T细胞，，包括CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。术语 T细胞也包括1型辅助性T细胞和2型辅助性T细胞和细胞毒性T淋巴细 胞(CTL )。本发明上下文中的"接受者"包括哺乳动物如人类、灵长类动物和家 畜(例如绵羊、猪、牛、马、驴)，实验动物如小鼠、兔、大鼠和豚鼠， 以及伴倡动物如狗和猫。处理/治疗此处所用的术语"治疗"指任何对人和非人类动物有益的处理方式。 治疗可针对存在的疾病或可为预防性的(预防性治疗)。治疗可包括治愈、 减轻或预防效果。更特殊的是，此处提及的"治疗性，，和"预防性"治疗应从其最广泛 的意义考虑。术语"治疗，，并不一定表示将接受者治疗至完全康复。类似 地，"预防"不一定表示接受者最终将不患病。因此，治疗性和预防性治疗包括对某一特殊疾病症状的改善或预防或 减少某种特定疾病发展的风险。术语"预防"可看作减少某种特定疾病的 严重程度或发作。"治疗"也可减少某一存在疾病的严重程度。施药本发明所使用的活性成分可分开向同一接受者给药或作为药物组合 物共同给药。药物组合物一般包括根据预期的给药途径选择的合适的赋形 剂、稀释液或载体。活性成分(任选地采取药物组合物的形式)可通过任何合适的途径向 需治疗的受治疗者施药。准确的剂量依赖于一系列因素，以下将作更详细 的讨论。一种合适的给药途径为肠道外给药(包括例如利用滴注器皮下给药、 肌肉给药、静脉内给药)。其它合适的给药途径包括(但不限于)经口腔 给药、直肠给药、鼻内给药、局部给药(包括口腔和舌下)、输注给药、 阴道给药、皮层内给药、腹膜内给药、颅骨内给药、鞘内给药和硬脑膜外 给药或利用雾化器、吸入器通过口或鼻吸入，或通过植入。为进行静脉内注射，活性成分将采取肠道外可接受的液体溶液形式，其无热原，具有合适的pH、等渗性和稳定性。本领域技术人员能够利用例 如等渗赋形剂如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格氏液制备合适的溶 液。需要时可包括防腐剂、稳定剂、緩冲液和抗氧化剂和/或其它添加物。用于口服给药的药物组合物可以为片剂、胶嚢、粉剂或液体形式。片 剂可能含固体载体如明胶或佐剂。液体药物組合物一般含液体载体如水、 石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可能包括生理盐水、葡萄糖或其 它糖类溶液或二醇类如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。此组合物的给药也可能通过孩i球、脂质体、其它樣t粒输送系统或置于 特定组织包括血液中的持续释放制剂。持续释放载体的合适例子包括可共 享文献中的形式的半透性高分子基质，例如栓剂或微胶嚢。可植入的或微 胶嚢持续释放基质包括L-谷氨酸的聚乳酸(US专利号3773919或欧洲专 利申请号0058481 )共聚物和y乙酉旨-L-谷氨酸(Sidman et al， Biopolymers 22(1):547-556，1985)、聚曱基丙烯酸-2-羟基乙酯或乙烯醋酸乙烯酯(Langer et al, J. Biomed. Mater. Res， 15:167-277, 1981, and Langer, Chem. Tech. 12:98-105， 1982 )。以上提到的技术与操作方法的例子和其它根据本发明可能用到的技 术和才喿作方法可见于《Remington，s Pharmaceutical Sciences》第18版，作 者Gennaro, A.R. ,Lippincott Williams & Wilkins;第20版(December 15,2000 ) ISBN 0-912734-04國3和《Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Dellivery Systems》，作者Ansel，H.C.等,第7版，ISBN 0-683305-72-7,其全部内容 因在此以引用的方式并入本文。
药物组合物如上文所述，本发明延伸为一种药物组合物用于癌症或恶性疾病和/或传染病的治疗，尤其用于Thl免疫应答的诱导和Treg免疫应答的阻遏或 抑制。根据本发明的药物组合物及其使用除包括活性成分外，还可包括药 学上可接受的赋形剂、载体、緩沖液、稳定剂或其它本领域技术人员熟知 的材料。这些材料应无毒，且不干扰活性成分的效价。载体或其它材料的 具体性质取决于给药途径，例如可为口腔、静脉内、鼻内或通过口腔或鼻 腔吸入。制剂可能为液体，例如生理盐水，其含pH为6.8-7.6的无磷緩 冲液，或为冻千或冷冻干燥的粉。剂量此组合物优选地以"治疗有效量"或"期望的剂量"向个体施药，即 足以显示对个体有益。如此处所定义，术语"有效量"意为治疗某特定疾病可至少部分获得 期望的反应，或延迟发作或阻遏发展，或完全阻止发作或发展所必需的剂 量。剂量可根据接受治疗者的健康和生理状况、接受治疗者所属类群、所 期望的保护程度、组合物的配方、医疗形势的评估和其它有关因素而改变。 期望将剂量定在一个相对较宽的范围内，其可通过常规试验确定。治疗处方如剂量的确定的责任和决定权最终属于一般从业者、医师或 其他医学医生， 一般需考虑所治疗的失调状态、受治疗者的个体条件、给 药方法和从业者所知的其它因素。优化剂量可由医师基于一系列参数确定，包括例如年龄、性别、体重、 所治疗疾病的严重性、所用活性成分和给药途径。可应用一较宽范围剂量。例如针对受治疗者，可每天用大约O.l亳克 到约1毫克每千克体重药物。可调整剂量方案以取得优化的治疗反应。例 如，可以在每天、星期、月份或其它合适的时间间隔用数个不同剂量，或 根据情况需要相应减少剂量。除另有规定之处外，本发明所用的所有科学和技术术语具有本领域技
术人员普遍理解的意义。除上下文另有需要外，术语"含(comprise)"或"包括(include)"或 其变化形式如"comprises"或"comprising" 、 "includes"或"including" 理解为包括申明的整体或群体，但不排除其它任何整体或群体。本发明将通过参考下文的例子和附图加以描述，这些例子是作为例证 提供的，不可论释为本发明的局限。


图1示CT26肿瘤细胞抑制T细胞增殖和旁》见者抗原引起的IFN-y产生；图2示CT26肿瘤细胞体外分泌TGF-|3，体内分泌IL-10;图3示IL-IO、 TGF-P和Foxp3 mRNA在浸润T细胞的肿瘤中表达增强；图4示肿瘤位点的CD4+和CD8+ T细胞、巨噬细胞和树突状细胞的 IL-10产生；图5示肿瘤上清诱导Cox-2在树突状细胞和巨噬细胞中的表达； 图6示CpG在DC和腹腔巨噬细胞中诱导Cox-2的表达； 图7示促Thl的TLR配体也诸导分泌IL-10的T细胞； 图8示TLR配体促进调节性T细胞的诱导； 图9示TLR配体刺激DC产生IL-10和IL-12;图10示TLR配体i秀导的DC中IL-10的产生通过ERK和p38 MAP 激酶的激活而介导；图11示单独的p38抑制剂单独或联合ERK抑制剂阻遏CpG诱导的 IL-10而增加IL-12产生；图12示将p38抑制剂单独或与ERK抑制剂一同加入外源抗原和CpG 刺激的树突状细胞可使之诱导Thl的能力增强并阻遏分泌IL-10的T细胞
的诱导；
图13示将p38、 ERK和Cox-2抑制剂加入外源抗原和CpG刺激的树 突状细胞可使之诱导Thl的能力增强并阻遏分泌IL-10的T细胞的诱导；图14示体内Cox-2的抑制可阻遏CpG诱导的IL-10和TGF-p;
图15示在引流淋巴结中抑制Cox-2增加了 CpG诱导的IL-27 mRNA 而减少了 IL-10 mRNA;
图16示Cox-2的抑制阻遏了 DC中CpG诱导的IL-10而增强了 IL-12p40的产生；
图17示Cox-2的抑制增加了 DC中CpGi秀导的IL-27 mRNA而减少 了了 IL-10 mRNA的表达；
图18示Cox-2的抑制增加了 DC中CpG诱导的IL-12p35和IL-12p40 mRNA而减少了 IL-10 mRNA的表达；图19示Cox-2抑制剂和CpG联合用药减弱了肿瘤生长；
图20示Cox-2抑制剂增强了 CpG对肿瘤生长的治疗效果；
图21示Cox-2抑制剂和CpG联合用药增加了肺瘤攻击的小鼠的成活率；图22示Cox-2或ERK抑制剂增强了树突状细胞肿瘤疫苗的治疗效果；
图23示Cox-2抑制剂增强了树突状细胞HSP-70疫苗的治疗效果；
图24示Cox-2抑制剂和HSP70疫苗联合用药增强了 DC中CD80的 表达；
图25示ERK的抑制在树突状细胞中阻遏TLR激动剂诱导的PGE2;
图26示Cox-2抑制剂阻遏树突状细胞中TLR激动剂诱导的PGEa和 IL-10产生；图27示p38的抑制减少CpG诱导的PGE2产生；
图28示p38的抑制阻遏肿瘤疫苗和TLR激动剂刺激的树突状细胞中 IL-10产生并增强了 IL-12产生；
图29示p38的抑制增强了树突状细胞疫苗的治疗效果；图30示p38的抑制增强了肿瘤疫苗和CpG沖激的树突状细胞的治疗 效杲；图31示在存在p38抑制剂下，肿瘤细胞疫苗沖激的树突状细胞的治 疗学给药增加了小鼠的存活率；图32示用全肿瘤疫苗和CpG沖激的树突状细胞治疗增加了肿瘤中T 细月包IFN-y产生；图33示用B16疫苗、CpG和p38抑制剂处理的树突状细胞治疗增加 了肿瘤块中CD4+T细胞的频率但减少了调节性T细胞的频率；图34示瘤周(pertumoural)注射CpG和p38抑制剂增加成活率；图35示pI3K抑制剂增强了肿瘤疫苗和CpG沖激的树突状细胞的治疗 效果；图36示移植肺瘤疫苗、CpG和pI3激酶抑制剂冲激的树突状细胞增加 了患有生长肿瘤的小鼠的成活率；图37示以CpG为佐剂的p38抑制剂增强了无细胞百日咳疫苗的保护 效果；图38示p38抑制剂对以CpG为佐剂的无细胞百日咳疫苗的反应增加 了 IFN-y而减少IL-10;图39示p38抑制剂对以CpG为佐剂的无细胞百日咳疫苗的反应减少 了 IL-10;图40示在以CpG为佐剂的非细胞性百日咳疫苗中加p38抑制剂增加 小鼠受百日咳杆菌攻击后的局部IL-l卩；图41以肿瘤疫苗、TLR激动剂和p38抑制剂对小鼠治疗性免疫化后 减少了 B16肿瘤生长，和图42示在IL-10缺陷型小鼠中肿瘤生长未显著恶化。
小鼠BALB/c和C57BL/6小鼠购于Harlan UK公司(Bicester, Oxon， U.K.)。 DO.11.10OVAT细胞受体(TCR)转基因(Tg)小鼠于室内飼养。所有小 鼠按照爱尔兰卫生部的规定和指导保持特定的无病原状态。肿瘤系CT26结肠癌来源的细胞系保持于加10%热灭活的FCS的RPMI 1640 中，皮下注射(s.c.)攻击时在BALB/c小鼠中形成实体瘤。B16F10肿瘤 细胞系保持于加10%热灭活的FCS的DMEM中，皮下攻击时在C57BL/6 小鼠中形成实体瘤。除另有申明外，两个实验it型中均向小鼠注射了 2xl05 个肺瘤细月包。腹腔巨噬细胞用5毫升温暖培养基洗涤腹腔。将细胞置培^中，2小时后移除非 黏附细胞。黏附细胞以106每毫升浓度放置。热激-辐射的B16肿瘤细月包B16肿瘤细胞于43。C孵育一^J、时。然后于20KGy辐射细胞，后于37 。C孵育4小时。将细胞以1: 1比例加入BMDC。肿瘤对增殖和细胞因子反应对不相关抗原的影响D011.10小鼠于腋下皮下单独注射200吗OVA或与2xl()S个CT26细 胞一同注射。7天后以200吗OVA注射小鼠，14天后制备淋巴结细胞悬 浮系并于96孔圆底板、37°C、 5%C02、 2xl()6/ml浓度与OVA(50、 100和 500pg/ml)共同培养。3天后移除上清，用双位点ELISA检测IFN-y浓度。 4天培养后，每孔加入2pC"H标记的胸苷(Amersham)。 96孔板再孵育 6小时，之后收集细胞(Tomtec Harvester 96 March III M)至Filtermat喷 雾千燥器，用P计数仪(1450MicroTrilux，Wallac)确定每分钟闪烁计数(cpm) 值。疫苗
小鼠皮下注射钥孔血蓝蛋白(KLH; 5吗)、KLH和CpG-ODN (25 jxg)、 脂多糖(20吗)、PolylC(25吗)、灭活的百日咳杆菌(lxlO"或霍乱毒素(CT) (10ng)使之免疫化。间接体内细胞因子反应C57BL/6小鼠腋下注射100 pl的CpG(lO吗)或Cox-2抑制剂 Celecoxib(100吗)。2小时和6小时后移出引流腹股沟淋巴结，过筛并重悬 于1 ml PBS。 ELISA法测上清中IL-10和TGF-(3的S/N，从细胞中提取 mRNA，用RT-PCR测IL-10和IL-27p28。抗原特异性细胞因子的产生将免疫7天后移出的淋巴结或脾脏细胞(2xl06/ml )培养于含KLH (50 Hg/ml)、超声粉碎的百日咳杆菌(5|ig/ml)或仅培养基中。72小时后移出 上清，ELISA方法4企测IL-4、 IL-10和IFN-Y的浓度。抗原特异性T细胞系KLH特异性CD4+T细胞系建立自免疫了 KLH和CpG-ODN的小鼠脾 脏或、淋巴结，脾脏或、淋巴结通过抗原(10 pg/mlKLH)和抗原呈递细胞的 刺激而免疫化。特定情形下于培养起始时加抗IFN-y或IL-12和抗IL-IO。 抗原再刺激2-3轮后建立的T细胞系培养于KLH (10 ng/ml)和APC; 3 天后用ELISA测上清中IFN-y、 IL-4和IL-10的浓度。淋巴结细胞与抗原 (KLH或在一些实验中为百日咳杆菌抗原)共同培养，6天后用于细胞内 染色。阻遏物检测免疫了 KLH和CpG-ODN的小鼠脾脏细胞培养于加IL-12的KLH，以 产生KLH特异性Thl型T细胞系。通过抗IFN-y存在下进行初代培养， 从自免疫了 KLH和CpG的小鼠中建立分泌IL-10且分泌少量或不分泌 IFN- Y或IL-4的Trl型细胞系。通过培养来自免疫了 KLH、带抗原的CpG 和APC且未加细胞因子或抗体的小鼠脾脏细胞，建立表达IFN-y和IL-10 的Thl Tr型T细胞系。Thl细胞系(lxloVml)仅与APC (受辐射的脾脏 细胞；2xl09ml)和KLH共培养或在Trl或ThlTr细胞存在下以1: 3、 1:l或3: 1的比例培养。3天后移除上清，ELISA检测IFN-y浓度。结果表 示为与对单独Thl细胞的反应的相对值。DC激活骨髓来源的未成熟DC (BMDC)通过用GM-CSF(40 ng/ml)培养提取 的骨髓细胞10天产生。来自BALB/c或C57BL/6小鼠的BMDC用1 ng/ml -10iig/ml的TLR激动剂、Pam3CSK4、酵母多糖、脂多糖、鞭毛蛋白、 PolyIC、 CpG-ODN或仅培养基孵育。在抑制试验中，活化的细胞用或未用 MEK1/2(ERK)抑制剂U0126(1.25-5 ^M)、 Cox-2抑制剂NS-398 (0.1-10 ^M) 或p38抑制剂SB203580(0.1-10nM)预处理(1小时)。也用各种浓度的B16 上清(S/N)处理BMDC 24小时。通过培养5xl05 B16细胞/ml —周并移 除消耗的培养基制备B16S/N。 6或24小时后移出上清，用ELISA检测细 胞因子浓度，或匀浆化细胞，RT-PCR分析所得mRNA。DC转化实验活化的C57BL/6小鼠BMDC用CpG(5吗)和KLH(5吗)孵育，用 Cox-2(NS-398:5 pM)、 p38 ( SB203580: 1 一)和ERK(U0126: 5 pM)的抑 制剂组合预处理。将2.5xl()S个处理的细胞注射到每足垫中。5天后移出胭 窝淋巴结和脾脏，单细胞悬液用KLH(2、 10、 50 pg/ml)再刺激。3天后移 出S/N， ELISA测等份试样的IFN-y和IL-10。为进行肿瘤实验，用2.5xl(^个B16肿瘤细胞皮下注射攻击C57BL/6 小鼠，从第三天开始，以一周为间隔向肿瘤位点皮下注射3次处理的 BMDC(l-5x105)。用加CpG(5 pg/ml)或Cox-2抑制剂Celecoxib(5 nM)和 ERK抑制剂U0126(5 nM)之一的热激的-辐射的B16肿瘤细胞加载到 BMDC中24小时。小鼠进行常规管理以生长肺瘤。受调节的DC对T细胞的体外激活来自BALB/c的DC用OVA CLASS II肽(5昭)孵育。细胞兼用CpG(10 吗)或p38抑制剂SB203580(1或5 ^M)之一和ERK抑制剂U0126(5 pM)刺 激24小时。然后将D011.10VA-TCRT细胞加入BMDC中(10: 1)。 3天 和11天后移出上清，ELISA才企测等份试样的IL-10和IFN-y。
肿瘤直接治疗用2xl()S个肿瘤细胞皮下注射攻击C57BL/6小鼠，在第3、 5、 7天时 用CpG(lO或20 pg)、 Cox-2抑制剂Celecoxib(100或500吗)或两者的组合 皮下注射肿瘤位点。小鼠进行常少见管理以生长肿瘤和^f吏之存活。用卡尺测 量肿瘤的二维尺寸并用以下公式计算大小(宽、长)x兀/6,此处宽指较小 测量值。当肿瘤的测量长度大于15mm时将小鼠杀死。Western印迹分析DC于lxl06/ml浓度与TLR配体一起培养15分钟至8小时。在特定 实验中，于TLR配体前1小时加入ERK或p38抑制剂。细胞裂解物用 SDS-PAGE重新溶解，转到硝酸纤维素膜并用磷酸化p38 (pp38; Cell Signal Technology,MA， USA)或石粦酸化ERK (pERK; Santa Cruz Biotechnologies, USA)的特异性抗体和连接辣根过氧化物酶的二抗印迹。剥离硝酸纤维素并 用总p38或总ERK特异性的抗体为探针杂交。利用磁性细胞分选纯化T细胞从淋巴结、肺或手术移出的肿瘤制备细胞悬浮系。用培养基洗涤组织 样品，用解剖刀片充分切碎，在加0.1 。/。胶原酶D (Sigma)的Hanks平衡 液中于37。C孵育30分钟。细胞悬浮物通过70 urn细胞滤网裂解红细胞。 将细胞洗涤、计数后重悬于加10 pl抗CD4或抗CD8磁珠(Miltenyi Biotech) 的90 ^ MACS緩冲液中，于4 - 8'C孵育15分钟。将MACS緩沖液(2 ml) 加入每个样品中，然后于300xg离心10分钟。然后将每个样品重悬于500 pi的MACS緩冲液中，利用AutoMacs(Miltenyi Biotech)分选。流式细胞仪分析和细胞内细胞因子染色自淋巴结、肺或肿瘤制备单细胞悬浮系。在加0.1 。/o胶原酶D( Sigma) 的Hanks平衡液中消化肺或肿瘤。用PMA(10 ng/ml)和离子霉素(1 pg/ml) 刺激细胞1小时，然后加入布雷菲德菌素A (10 pg/ml),于37°C4小时。 用CD4 (Caltag )、 CD8(BD Pharmingen)、 CDllc(BD Pharmingen)或F4/80 (Caltag )特异性抗体重悬细胞。然后用50^1固定培养基A( Fix&Perm细 胞渗透试剂盒，Caltag Laboratories)固定细胞。用50 pi固定培养基B (Fix&Perm细月包透4匕试剂盒，Caltag Laboratories )和5 (il抗IL-10或抗 IFN-y抗体(BD Pharmingen)孵育细胞，并在FACScalibur 上用 CELLQuestTM软件(Becton-Dickson, San Jose， CA)进行免疫荧光分析。反转录酶-PCR利用TriReagent(SigmaAldrich)从脾、肺、淋巴结或肿瘤细胞或纯化的 CD4+和CD8+ T细胞中提取RNA，用Superscript II RT(Invitrogen)和 01igodT(n-i8)引物(Invitrogen)反转录。利用鼠TGF-(3(有义AGACGGAATACAGGGCTTTCGATTCA CTTGGGCTTGCGACCCACGTAGTA) 、 CTGGACAACATACTGCTAACCGAC , TTCATTCATGGCCTTGTAGACACC) 、 CAGCTGCCTACAGTGCCCCTA，反义反 义IL-IO( 有 义反 义Foxp3( 有 义Cox誦2( 有 反. IP画IO(反义 义有 义 义CATTTGCCAGCAGTGGGTAG) 、 GTATCAGAACCGCATTGCCTCTGA CGGCTTCCAGTATTGAGGAGAACAGAT) CGCACCTCCACATAGCTTACAG CCTATCCTGCCCACGTGTTGAG) 、 IL-23pl9( 有 义TCTCGGAATATATGCATGC，反义CTGGAGGAGTTGGCTGAGTQ 、 IL-15( 有 义CATATGGAATCCAACTGGATAGATGTAAGATA， 反 义CATATGCTCGAGGGACGTGTTGATGAACAT)和肌动蛋白(有义 GGACTCCTATGTGGGTGACGGG，反义TGCCAATAGTGATGACTTGGC)特异性引物与2吗样品cDNA，以及Taq 聚合酶(Promega)和Peltier热循环仪扩增。热激蛋白(HSP)涉及较多产自蛋白降解过程的细胞肽。任何细胞(例 如肿瘤细胞)来源的HSP制备物都含该细胞的一个肽谦系。用HSP肽复 合物接种可产生抗此肽的T细胞反应。
HSP70-肺瘤肽复合体的纯化将B16月中瘤细胞(lx106)注射到C57BL/6小鼠中，14天后将小鼠杀 死，移出肿瘤。在4倍体积低渗緩沖液(2 mM NaHC03， PMSF pH 7.1 )中 匀浆化肿瘤，于100，000g离心后回收上清。将样品转移到PD10柱中的緩 冲液D中(20 mM Tris-乙酸，20 mM NaCl， 15 mM P-巯基乙醇，3 mM MgCl2, 0.5 mM PMSF, pH 7.5 )。将样品直接上样于緩冲液D平衡的ADP-琼脂糖柱 (5ml)。用含0.5MNaCl的緩沖液D洗柱，之后单独用緩冲液D洗，直 到用蛋白分析检测不到蛋白为止。最后用含3mMADP的緩冲液D于室温 下孵育柱子30分钟，之后用相同緩冲液(25 ml)洗脱。用Bradford蛋白 才企测方法对HSP70定量。制备物的纯度用银染胶估测，其特异性用Western 印迹和特异性抗体检测。实施例1-CT26肿瘤生长抑制T细胞对无关抗体的响应 才才料和方法用OVA (200昭)单独或与2x 105个CT26细胞皮下注射DO.11.10 小鼠。7天后注射200 p g OVA且14天后用OVA再刺激淋巴结细胞，4天 后检查增殖情况(图1A),并在3天后测定移出的上清液中的IFN-y的浓 度(图1B)。结果为每组5只小鼠的平均值土SD且一式三份进行化验。 OVA对比OVA + CT26 ,方差分析"PO.Ol, ***P<0.001。结果为了测验这种可能性，即在肿瘤生长期间不能生成有效的获得性免疫 应答可能是由于肿瘤生长产生了免疫抑制性环境，我们检查了生长着的胂 瘤对T细胞应答无关抗原的影响。OVA-TCRTg小鼠在存在或不存在CT26 细胞时于皮下注射OVA，且在7天后，给小鼠注射OVA,并在14天后杀 死小鼠。移出引流淋巴结并检验OVA特异的T细胞增殖和IFN-y的产量。 与仅用OVA注射的小鼠比较，用CT26细胞和OVA攻击的小鼠中OVA特 异性T细胞增殖显著减少(图1A)。与CT-26细胞的联合给药也显著减少 了淋巴结中ova-特异性IFN-y的产量(图ib ),证实生长着的ct26胂瘤
阻遏对其它抗原的免疫应答，特别是在注射的位点。实施例2-生长着的肿瘤诱导的免疫抑制性细胞因子的产生 才才泮+和方法从培养的CT-26细胞提取RNA,用对IL-IO、 TGF-卩、IL-23pl9、 IL-15 和IP-10特异的引物进行RT-PCR (图2A )。培养的CT26细胞的上清液中 的TGF-P蛋白质用ELISA定量(图2B )。从体外培养的CT26细胞或者从 携带皮下CT26肿瘤的小鼠上切下的实体CT26肿瘤的匀浆中提取RNA(集 合5只小鼠的RNA),用对IL-10和(3-肌动蛋白特异性引物进行RT-PCR (图2C )。结果代表3次试验。用CT26细胞静脉(图3A)或者皮下(图3B )注射BALB/c小鼠(每 组5只)。肿瘤攻击后14天，从原态(N)和荷瘤小鼠(T)中取得淋巴结 (LN)和皮下肿瘤块(T)或肺。用》兹性细胞分选法分离CD4+和CD8+细 胞，用IL-10和TGF-p特异性引物进行RT-PCR。结果为了检测在胂瘤生长过程中免疫抑制的可能介质，我们测定了体外培 养的肿瘤和间接体内生长着的肿瘤中的促进和抗炎性细胞因子的mRNA 的表达。对培养的CT26肿瘤细胞中细胞因子mRNA表达的检测证实了抗 炎性细胞因子、TGF-(3的mRNA的表达(图2A)。而且，在生长着的肿瘤 上清液中检测到TGF-p蛋白质(图2B)。在CT26细胞中也有Cox-2、 IL-23pl9、 IL-15和IP-10 mRNA的表达(图2A )，但我们没能检测到IL-ip、 IL-2、 IL-5、 IL-6、 IL画IO、 IL-12p35、 IL-12p40、 IL-13、 IL画18、 IL-27p28、 IL-27EB13、 TNF-a和IFN々的mRNA的表达(数据未显示)。虽然在体外 培养的肿瘤中不能检测到IL-10 mRNA (图2A),甚至在用PMA刺激细胞 后也不能(数据未显示)，但是在间接体内的肿瘤细胞块中探测到(图2C )， 表明细I包体内浸润肿瘤的细月包分泌IL-IO。于是我们用RT-PCR法检测了肿瘤细胞块、肺中和引流淋巴结中的T 细胞IL-10和TGF-P mRNA的表达。从CT26肺转移小鼠的肺和颈淋巴结及皮下注射CT26细胞小鼠的实体瘤和腹股沟淋巴结中纯化CD4+和CD8+ T细胞。与原态小鼠的淋巴结相比，肺CD4+T细胞中IL-10mRNA的组成 性表达高。与原态小鼠的肺T细胞中发现的相比，荷瘤小鼠的肺的004+ 和CD8+T细胞两者中IL-10的表达都大量的提高了 ，但是在肺转移小鼠的 颈淋巴结中IL-10 mRNA表达变化小(图3A)。此外，与原态小鼠相比， 从CT26肺转移瘤携带的小鼠的肺纯化出的CD4+和CD8+T细胞中TGF-(3 mRNA的表达都急剧增高，淋巴结变化小(图3C)。从皮下注射CT26的 小鼠的实体瘤纯化出的CD4+和CD8+中都检测到高的IL-10的表达(图 3B )。用CD26细胞皮下攻击14天后的小鼠的腹股沟淋巴结的CD4+T细胞 中IL-10 mRNA表达和CD8+T细胞中TGF-|3 mRNA表达都有少量增加(图 3B)。然而，在腹股沟淋巴结中TGF-P表达为高的组成性表达。这些结果 表明CT26肿瘤的生长增强了肺中已具免疫抑制性的环境和促进表达IL-IO 和TGF-P的CD4+和CD8+T细月包对肿瘤位点的浸润。实施例3- CD26肿瘤块内CD4+T细胞中Foxp3的表达增强 才才料和方法BALB/c小鼠(每组5只)静脉(i.v.)(图3A)或皮下(s.c.)(图3B ) 注射CT26细胞。肿瘤攻击后14天从原态(N)和荷瘤小鼠(T)中取得 淋巴结(LN)和皮下肿瘤块(T)或肺。用磁性细胞分选法分离CD4+和 CD8+T细胞，分离RNA且用Foxp3特异性引物进行RT-PCR。结果已证实生长期间T细胞表达IL-10和TGF-p在生长胂瘤中积累后，我 们检测了天然Treg细胞募集到肿瘤位点的可能性。CD4+和CD8+T细胞从 皮下模型的腹股沟淋巴结及实体瘤和肺转移模型的腹股沟淋巴结及肺中 纯化出来，且用Foxp3特异性引物进行RT-PCR。与原态小鼠的相同组织 相比，在肺转移模型中，从荷瘤小鼠的肺和引流淋巴结纯化出的CD4+T细 胞中Foxp3的表达急剧增加(图3A)。在浸润的皮下肿块的CD4+T细胞中 也检测到Foxp3的表达(图3B)。与肺模型不一样，Foxp3的表达在具皮下肺瘤的小鼠的引流淋巴结中未增强。在来自原态或者荷瘤小鼠的任何组织的CD8+T细胞中未检测到Foxp3的表达。实施例4-高频率的分泌IL-10的CD4和CD8 T细胞和低频率的分泌IFN-y 的T细胞"浸润生长肿瘤材料与方法分别用2 x 105或3 x 105个CT26结肠癌细胞皮下或静脉注射BALB/c 小鼠。按指示的天数切除实体皮下肿瘤或肺。用PMA和离子霉素刺激细 胞且用表面CD4、 CD8和细胞内IL-10和IFN-Y特异性抗体标记，然后进 行了免疫荧光分析(图4A)。结果已证实了在生长着的肿瘤中存在分泌IL-10和Foxp3+的T细胞后， 我们运用细胞内细胞因子染色法检测肿瘤生长期间效应T细胞和募集到肺 或胂瘤块的调节性T细胞的相对频率。用CT26细胞皮下或静脉攻击小鼠， 在3或14天后取下肿瘤，且进行细胞内细胞因子染色以检测标记了表面 CD4或CD8的T细胞上的IL-10和IFN-y。在荷CT26转移的小鼠的肺和 皮下注射CT26细胞的小鼠的肿瘤块中探测到分泌IL-10的CD4+和CD8+ T 细胞为高频率(24-37%)(图4A)。相比之下，仅有6-7%CD4+ T细胞和 9-27%的CD8+ T细胞分泌IFN-y (图4A )。实施例5-分泌IL-10的巨噬细胞和DC浸润生长肺瘤 材料和方法用3 x 105个CT26结肠癌细胞静脉注射BALB/c小鼠，取下原态小鼠 (第0天)或者肿瘤攻击后3和14天的小鼠的肺。用表面CDllc及F4/80 和细胞内IL-10特异性抗体标记细胞并进行免疫荧光分析(图4B)。结果已才艮道巨噬细胞和DC分泌的天然的IL-10,在来自外周原态T细胞 的可诱导Treg细胞的分化中起关键作用。已证实在CT-26转移瘤发展过程 中，分泌IL-10 T细胞募集到肺，于是我们检验了这可能涉及募集和肺中 产生IL-10的巨噬细胞或DC的激活的可能性。用CT26细胞静脉攻击小鼠， 且在3或14天后取下肺和颈淋巴结，并对用表面CDllc或F4/80标记的 细胞进行细胞内细胞因子染色。肺中CT26肿瘤的发育与巨噬细胞和DC 到肺上的募集相关，且这些天然细胞中有高比例的细胞分泌IL-IO(图4B)。 在肿瘤攻击3天和14天后，原态小鼠的肺中CDllc+细胞的百分率从11% 分别增加到17%和34%,而在肿瘤攻击14天后，原态小鼠的肺中F4/80+ 细胞的百分率从原态小鼠的12%增加到27%。并且肿瘤攻击后14天，79% 的浸润巨噬细胞和38%的浸润DC分泌IL-IO。相比之下，肺瘤攻击后3 和14天，淋巴结中CDllc+和F4/80+细胞的百分率低于原态对照小鼠。而 且，这些细胞分泌IL-10的频率很低且在肿瘤攻击后不发生显著改变。实施例6-B16肿瘤诱导树突状细胞和巨噬细胞中Cox-2的表达 材料和方法骨髓来源的树突状细胞或C57BL/6小鼠的腹膜巨噬细胞与多种B16 上清液的稀释液温育24小时。匀浆细胞，用Cox-2特异性引物RT-PCR分 析生成的mRNA，并与J3-肌动蛋白表勤目比。通过培养5 x 105个B16细 胞/ml—个星期，制备B16上清液，然后去掉消耗的培养基。结果Cox-2抑制剂多次成功地用于治疗癌症。已表明Cox-2和Cox-2诱导 的PGE2可促ii^达Foxp-3的调节性T细胞。我们已经显示CT26肿瘤表 达Cox-2mRNA。在此我们用B16肿瘤细胞系检验了肿瘤细胞也可能诱导 Cox-2在巨噬细胞和树突状细胞中的表达的可能性。用来自生长着的B16 细胞的上清液刺激骨髓来源的DC或腹膜巨噬细胞，诱导DC和巨嗟细胞 中Cox-2 mRNA表达(图5 )。因此肿瘤细胞不^J^达Cox-2，也诱导Cox-2 在先天性免疫系统的细胞中的表达。
实施例7-CpG-ODN诱导树突状细胞和巨噬细胞中Cox-2的表达 材料和方法C57BL/6小鼠的骨髓来源的DC和IIJ^巨噬细胞与多种浓度的CpG温 育24小时。匀浆细胞，用Cox-2特异性引物进行RT-PCR分析生成的 mRNA，并与(3-肌动蛋白表达对比。结果CpG-ODG作为胂瘤的治疗物和传染性疾病疫苗的佐剂而被测试。它 们的潜力基于它们能增强先天性免疫应答，特别是IL-12和通过在先天性 免疫细胞如树突状细胞和巨噬细胞中与TLR9相互作用，从而得到的获得 性免疫力。然而TLR信号转导不局限于炎性细胞因子的诱导，如IL-12的 产生，其它介质也被激活。我们检测了在先天性免疫细胞中CpG对Cox-2 诱导的影响。在树突状细胞和巨噬细胞中，CpG剂量依赖性诱导树突状细 胞和巨噬细胞中Cox-2 mRNA的表达(图6 )。既然Cox-2可能有助于血管 生成和抗炎反应，这是肿瘤治疗或者作为癌症或传染性疾病疫苗的佐剂时 需要避免的。实施例8-TLR配体谦导具调节活性的分泌IL-10 T细胞，也诱导分泌IFN-y 的Thl细胞^材料和方法用仅PBS、 KLH ( 5吗)或KLH和CpG-ODN ( 25 pg)、 LPS(1吗)、 PloylC(25 )Lig)、灭活的百日咳杆菌全细胞疫苗(Pw)或CT (10ng)免 疫BALB/c小鼠。7天后用KLH ( 50 pg/ml)和IFN-y刺激小鼠引流淋巴结 细胞，3天后ELISA法测定IL-4和IL-10浓度(图7 )。CD4+ T细胞系通过KLH免疫小鼠建立，且CpG-ODN用KLH (10 pg/ml)和APC剌激(图8A )。在存在抗-IFN-y时，林系6和7最初用抗 原刺激，其在模拟培养时加入(在多个重培养步骤中通过沖洗取得)以防 止分泌IFN-y T细胞的过度生长。检测T细胞系中通过用抗原和APC刺激 产生的IFN國y和IL-10 (图8a )。 PBS (对照)或KLH和CpG-ODN免疫的小鼠的淋巴结细胞用KLH (50ng/ml)刺激，6天后用PMA和离子霉素再刺激6小时(图8B)。最 后4小时加入布雷菲德菌素A ( 10 pg/ml)。对CD4+细胞门控后进行免疫 焚光分4斤测定细月包内IL-10和IFN-y (图8B )。在存在IL-12和抗IL-10时，通过培养T细胞，从KLH和CpG-ODN 免疫的小鼠建立了分泌高浓度IFN-y和低或无IL-4和IL-10的Thl细胞系 (图8C)。在存在抗-IFN-y时，通过初始培养建立一种Trl型细胞系，其 分泌IL-10且低水平或不分泌IFN-y或IL-4，且在不加细胞因子或抗体时， 通过与抗原和APC培养建立混合分泌IFNi和IL-10的T细胞系(称为 ThlTr)。 Thl细胞系与APC和单独的抗原或在存在比率为1: 3、 1: l或 3: 1的Trl或Thl细胞时培养。3天后移去上清液，ELISA法测定IFN-丫 的浓度(图8C)。结果以相对于单独Thl细胞的反应表示。结果已有大量的报道认为TLR配体，如CpG或LPS选择性诱导Thl应答， 或者在有某些TLR-2激动剂的情况下，诱导Th2应答。我们测定了 TLR 配体在指导T细胞对模型旁观抗原KLH的应答时的作用。单独用KLH免 疫产生分泌IL-10和低浓度的IL-4但无IFN-y的T细胞。联合应用TLR配 体、CpG-ODN、 LPS或PolyIC,产生分泌高浓度IFN个但分泌低或检测 不到IL-4的T细胞，细胞因子表达镨与Thl细胞诱导的一致(图7 )。然而，除了 IFN-y,在存在TLR配体时，从来自KLH免疫小鼠的抗 原刺激的淋巴结细胞的上清液中，在也检测到显著的IL-10 (但不是IL-4) (图6 )。灭活的百日咳杆菌和百日咳全细胞疫苗具有有效的佐剂活性。在 此我们发现灭活的百日咳杆菌促进了抗原特异性T细胞的谦导，其分泌 IL-10和IFN-y到联合应用的抗原KLH上。相比之下，我们先前已经显示 了 ，用CT免疫诱导Trl和Th2细胞，增强KLH-特异性IL4和IL-10的产 生。KLH特异性CD4+ T细胞系从免疫小鼠产生，表明用KLH和CpG-ODN (图8A)免疫产生仅分泌IFN-y或IFN-y和IL-10的T细胞。当T细胞系 产生自用抗原和CpG-ODN或者百日咳杆菌免疫的小鼠，在存在抗-IFN-y (其后来通过多个清洗步骤和再培养步骤取得)时，通过体外初始培养淋巴细胞产生，这些T细胞分泌IL-10,但不分泌IFN-7和IL-4 (图8A)。 这些结果表明促进Thl佐剂也产生分泌IL-10的Trl型T细胞和分泌IL-10 和IFN-Y的T细胞，其叫4故Thl Tr细胞。对来自KLH和CpG-ODN免疫 的小鼠的CD4+ T细胞上进4亍细胞内细胞因子染色，也显示有明显的单独 分泌IFN-y或IL-10或分泌IFN-y和IL-10的细胞群(图8B ),证实这种 TLR激动剂促进Thl及Trl细胞和分泌两种细胞因子的独特细胞群的诱 导。接着我们检测了由KLH和CpG-ODN免疫诱导的抗原特异的IL-10或 分泌IL-10和IFN-y的T细胞对建立的KLH特异性CD4+ Thl细胞系的阻 遏功能。这种Thl细胞系从KLH和CpG-ODN免疫小鼠上建立且在当应 答抗原和APC刺激时，分泌高浓度的IFN-y。在存在中和抗-IFN-y抗体时， 通过初始培养，也从KLH和CpG-ODN免疫的小鼠的脾细胞，扩增分泌 IL-IO，但不分泌IFN-y或IL-4的Trl细胞。以3: 1、 1: 1和1: 3的比率， 这些Trl细胞显著的阻遏Thl细胞中IFN-y产生，在Trl细胞数量最高时 观察到的阻遏最高(图8C)。 Thl 'Tr细胞，其分泌IFlSPy和IL-10,也阻 遏IFN-y的分泌，但仅在l: l和3: 1的比率。这些结果表明除了诱导效 应IFN-y分泌型细胞，CpG-ODG凭其抑制活性可同时促进T细胞的诱导。实施例9-TLR配体通过激活ERK和p38诱导DC IL-10产生 材泮+和方法将DC与1 n/ml-10 pg/ml Pam3CSK4( Pam3 )、酵母多糖(Zym )、 PolyIC、 LPS、鞭毛蛋白(Flag)、 CpG-ODN或仅培养基温育。24小时后，移去上 清液，用ELISA法测定IL-IO、 IL-12p40和IL-12p70的浓度。NT表示未 才全测(图9 )。将DC与MEK 1/2抑制剂(U0126)预温育1小时，然后〗又与培养基 或与Pam3Cys、酵母多糖、LPS、鞭毛蛋白或CpG-ODN (1或5 pg/ml) 温育15分钟。裂解细胞并用pERKl和pERK2特异性抗体进行Western杂
交(图IOA)。仅用培养基(0)或与LPS ( 100ng/ml) —起刺激DC0.5、 1、 2、 4、 8或12小时。用pERK或p38特异性抗体进行Western杂交(图 IOB)。杂交洗脱后用总ERK或p38特异性抗体再检测。在加入CpG-ODN(5 pg/ml )、 LPS (100 ng/ml)或4义培养基之前，DC仅与培养基(对照)、 U0126C 1.25-5 pM)(图10C)或p38抑制剂、SB203580 ( SB; 0.1-10 一)(图10D)预温育1小时，24小时后，用ELISA法测定IL-10浓度。用 DMSO处理的细胞用作阴性对照。来自BALB/c小鼠的骨髓来源的DC单独与CpG (10 pg)或与p38抑 制剂SB203580 (Io: 1 pM， hi: 5 )，或与ERK抑制剂U0126 (5 nM) 温育24小时。移去上清液，等分液用ELISA测定IL-IO、 IL-12p70和IL-6 (图11)。结果已证实TLR配体和灭活的百日咳杆菌，其包含TLR配体，诱导Tr细 胞和Thl细胞后，我们检测了这表明DC同时诱导IL-10和IL-12的可能 性。我们发现每种检测的TLR配体Pam3CSK4( TLR-2 )、酵母聚糖(TLR-2 )、 PolyIC( TLR-3 )、 LPS( TLR-4 )、鞭毛蛋白和CpG-ODN( TLR-9 )诱导IL-10 的产生，也诱导IL-12p40和IL-12p70从不成熟的骨髓来源的DC产生(图 9)。 IL-10和IL-12的诱导分别与ERK和p38的信号传导相关，于是我们 检测了这些MAP激酶在TLR诱导的细胞因子产生中的作用。我们发现每 种测定的TLR配体诱导DC中ERK的磷酸化(图10A )。 LPS-诱导的ERK 在第30分钟最高，但在共8小时内仍然显著(图IOB)。与MEKl/2抑制 剂U0126预温育后，抑制IL-10从CpG-ODN-或LPS-刺激的DC的产生(图 IOC)， U0126抑制TLR-配体诱导的ERK磷酸化(图IOA)。 MEK 1/2抑 制剂增强IL-12p70的产生且这一效应在来自IL-10+小鼠的DC中保留，表 明它对于IL-10产生的减少不是次要的(数据未显示)。TLR配体也诱导 DC中p38的磷酸化。DC与p38特异性抑制剂SB203580预温育，在对于 LPS或CpG-ODN反应时，抑制IL-10且增强IL-12p70产生(图10D和图 11 )。我们也发现p38和ERK抑制剂的结合进一步抑制CpG诱导的IL-10 的产生且增强IL-12p35,但对IL-6没有影响(图11)。以前曾推测ERK 和p38可能差异性的调节IL-10和IL-12产生，ERK促进IL-10而p38促 进IL-12。然而我们的发现，与近来的运用可探测IRF-5的小鼠(Takaoka， A., H. Yanai， S. Kondo, G. Duncan, H. Negishi， T. Mizutani， S丄Kano, K. Honda, Y. Ohaba， T. W. Mak，和T. Taniguchi. 2005. Integral role of IRF-5 in the gene induction programme activated by Toll-like receptors. Atowe)和 NF-k抑制剂(Kabashima， K.， T. Honda, Y. Nunokawa,和Y Miyachi. 2004. A new NF-kappaB inhibitor attenuates a THl type immune response in a murine model. 578: 36-40)的报道结合，表明TLR配体通过MAP激酶、ERK和p38激活IL-10,而IL-12p70利用IRF-5和NF-k B途径。实施例10-加入p38、 ERK和Cox-2抑制剂到用外源抗原和CpG刺激的树 突状细胞增强它们诱导Thl的能力且阻遏分泌IL-10的T细胞的诱导材料和方法来自BALB/c的骨髓来源的DC与OVAII型肽(5昭)温育。同时， 细胞或单独用CpG (lOpg)，或与p38抑制剂SB203580 (Io: 1 jjM， hi: 5pM)或P38抑制剂和ERK抑制剂UO-126 (5pM) —起温育24小时。 来自D011.10 OVA-TCR Tg小鼠的纯化的CD4+ T细胞用DC (10: 1)刺 激，且在抗原刺激3天后移去上清液且用ELISA法对IL-10和IFN-y定量 (图12)。来自C57BL/6小鼠的骨髓来源的DC与仅培养基(-)、KLH (5吗) 和CpG ( 5吗)和标明的Cox-2抑制剂(NS-398: 5 )、 p38 ( SB203580: 1 和ERK (UO-126: 5 |nM)的混合物温育。将2.5 x 10 5个处理的细 胞注射到57BL-6小鼠的每只爪垫。在5天后取下腦窝淋巴结和脾，且单 个细胞悬浮液用KLH再刺激(2、 10、 50ng/ml)。 3天后移去上清液，ELISA 法对IFN-y和IL-10的浓度定量(图13 )。结果TLR配体增强IL-10和IL-12从树突状细胞和巨谨细胞的产生。而且， 从先天性免疫细胞中产生的IL-12和IL-10分别促进Thl和Treg细胞的诱
导。这解释了将TLR激动剂作为佐剂时，同时诱导了 Thl和Treg细胞。 在此我们显示了 p38或ERK抑制剂或两者的组合物与CpG共同作用，增 强Thl和阻遏Tr对外源抗原的体外和体内诱导。DC用单独的OVA肽或 与CpG —起或在存在p38抑制剂或p38和ERK抑制剂时用CpG刺激，接 着用于刺激从DO11.10OVA-T细胞受体(TCR)转基因(Tg)小鼠的脾纯 化出的CD4+T细胞。在用抗原进行一轮或两轮刺激后，检测T细胞细胞 因子的产生。结果表明在存在CpG时，OVA冲激DC诱导分泌IL-10和IFN-Y T细胞，这与体内诱导Thl和Treg细胞一致(图12 )。加入p38抑制剂阻 遏分泌IL-10的T细胞的诱导且增加分泌IFN-y的T细胞。这在加入ERK 抑制剂后进一步增强。我们接着4企测了 p38、ERK和Cox-2抑制剂对CpG-激活的树突状细胞 体内诱导T细胞应答的能力。骨髓来源的DC用单独的KLH或单独的CpG 或p38、 ERK和Cox-2抑制剂的组合物一起刺激，然后皮下注射到小鼠中。 5天后取下引流淋巴结和脾，用抗原(KLH)刺激细胞且评估细胞因子产 生。数据显示，在存在CpG时用抗原沖激的DC在体内诱导分泌IL-10和 IFN-Y的T细胞(图13)。在注射入小鼠前，用CpG和抗原刺激时，加入 p38或Cox-2抑制剂到DC增强DC诱导分泌IFN-y的T细胞的能力，而 阻遏分泌IL-10的T细胞。ERK抑制剂阻遏分泌IL-10的T细胞的诱导， 但也阻遏Thl细胞。ERK、p38和Cox-2抑制剂的组合物完全阻遏产生IL-10 的T细胞，但也减少分泌IFN-y的T细胞。这一发现证实，将TLR激动 剂作为佐剂时，p38和Cox-2抑制剂增强Thl和阻遏Treg细胞对外源抗原 的感应。ERK抑制剂也阻遏产生IL-10的T细胞。实施例ll-Cox-2抑制剂阻遏TLR激动剂诱导的IL-10和TGF-P的产生且 增强内源IL-12和IL-27的产生材料和方法用CpG (10吗)或用CpG和CoxJ抑制剂塞来昔布(100吗)侧腹 注射C57BL/6小鼠。2和6小时后，取下引流区腹股沟淋巴结，过筛并在 1 ml的PBS中重悬。移取细胞，且用ELISA法对上清液中的IL-10和TGF-卩 的浓度进行定量(图14)。用单独的CpG (10吗)或用不同浓度的Cox-2抑制剂塞来昔布(5、 50或500吗)侧腹注射C57BL/6小鼠。6小时后，取下引流区腹股沟淋巴 结，制备单个细胞的悬浮液。匀浆细胞，且生成的mRNA通过RT-PCR分 析IL-27和IL-10的表达，且与p-肌动蛋白表勤目比较(图15 )。来自C57BL/6小鼠的骨髓来源的DC与具不同浓度Cox-2抑制剂 NS-398的CpG( 10吗)温育24小时。移去上清液且用ELISA法测定IL-10 和IL-12p40的浓度(图16)。来自C57BL/6小鼠的骨髓来源的DC与具不同浓度的Cox-2抑制剂 NS-398的CpG ( 10 pg)温育24小时。匀浆细胞，且用IL-10和IL-27p38 特异性引物进行RT-PCR分析生成的mRNA，且与P-肌动蛋白表W目对比 (图17)。来自C57BL/6小鼠的骨髓来源的DC与CpG(10吗)或与1或10 的Cox-2抑制剂NS-398的温育24小时。匀浆细胞，且用IL-10、 IL-12p35 或IL-12p40特异性引物进行RT-PCR分析生成的mRNA,且与|3-肌动蛋白 表勤目对比(图18)。结果因为发现肿瘤细胞表达Cox-2且胂瘤上清液和CpG诱导Cox-2在先天 性免疫细胞中的表达，所以我们检测了 Cox-2抑制剂对树突状细胞中TLR 激动剂诱导的细胞因子体内或体外的表达的影响。用单独的CpG或在存在 Cox-2抑制剂时皮下注射小鼠，6小时后取下淋巴结且评估细胞因子的产 生。注射CpG诱导IL-10和TGF-p的产生，其在与Cox-2抑制剂共同给药 时被阻遏(图14)。 CpG-诱导的小鼠中IL-10 mRNA的表达也被与Cox-2 抑制剂的共同给药所阻遏，而IL-27 mRNA的表达被增强(图15)。 CpG 体外刺激DC诱导IL-10和IL-12p40的产生。加入一种Cox-2抑制剂到培 养基中阻遏IL-10且增强IL-12产生(图16)。 CpG也诱导IL-12pG40、 IL-12p35和IL-27p28 mRNA的表达，其在加入Cox-2抑制剂时4皮增强(图 17和18)。相比之下，CpG诱导的IL-10 mRNA的表达被此Cox-2抑制剂
阻遏。这些发现证实两种不同的Cox-2抑制剂在增强引导Thl细胞诱导的 调节性细胞因子时，具有阻遏抗炎性和Treg促进细胞因子的作用。因此 TLR激动剂和Cox-2抑制剂的组合物为有效的启动体内对外源和肿瘤抗原 的天然和获得性效应应答的方法。实施例12-用Cox-2抑制剂和CpG的组合物治疗阻遏肿瘤生长 材料和方法C57BL/6小鼠用2x 1()S个B16肺瘤细胞皮下攻击，且在第3、 5和7 天，用CpG (10吗)、Cox-2抑制剂塞来昔布(100吗)或两者的组合物在 肿瘤位点皮下注射。常规性的监测小鼠肿瘤的生长(图19)。C57BL/6小鼠用2 x 105个B16肿瘤细胞皮下激发，且在第3、 5和7 天，用CpG ( 20吗)、Cox-2抑制剂塞来昔布(500 jxg)或两者的组合物在 肿瘤位点皮下注射。常规性的监测小鼠肿瘤的生长(图20)。C57BL/6小鼠用2x 105个肿瘤细胞皮下攻击，且在第3、 5和7天， 用CpG ( 20吗)、Cox-2抑制剂塞来昔布(500吗)或两者的组合物在肿瘤 位点皮下注射。常规性的监测小鼠肿瘤和存活情况(图21)。结果我们用鼠科肿瘤模型评价与Cox-2抑制剂结合的TLR激动剂的治疗疗 效。用B16肺瘤皮下攻击小鼠，在第3、 5和7天不处理或通过在肿瘤位 点皮下注射CpG(10吗)，与或不与Cox-2抑制剂(塞来昔布100吗)，或 仅以Cox-2抑制剂处理小鼠。用单独的Cox-2抑制剂处理增强了肿瘤的生 长而单独的CpG效果很小(图19)。然而CpG和Cox-2抑制剂的组合导 致肿瘤生长完全降低。用高剂量的CpG ( 20吗)和Cox-2抑制剂(500吗) 重复了这些研究。高剂量的CpG确实降低肿瘤的生长，但是当与Cox-2 抑制剂组合治疗时保护疗效显著的增强(图20)。 CpG和Cox-2抑制剂超 过单独CpG或单独的Cox-2抑制剂的保护效果，在幸存曲线和无瘤小鼠的 数量上也非常显著(图21 )。所有的未处理的小鼠在45天内死亡，而所有 的CpG处理的小鼠仅在55天内死亡。20%的用Cox-2抑制剂处理的小鼠
幸存，而用CpG和Cox-2抑制剂处理的小鼠，有40%存活。实施例13-Cox-2或ERK抑制剂增强树突状细胞接种疫苗对肿瘤的治疗疗 效材料和方法C57BL/6小鼠用2x 1()S个B16肿瘤细胞皮下攻击，且用处理的DC( 1-5 x 105)在第3天开始每隔一周皮下注射到肿瘤位点处理小鼠3次。用热激 /辐射的B16肿瘤细胞和单独的CpG (5 ng/ml)或与Cox-2抑制剂塞莱昔 布(5^M)或ERK抑制剂U0126 (5mM)冲激DC24小时。常规性的监 测小鼠肿瘤的生长(图22)。 11只C57BL/6小鼠组用2xl()4个B16肿瘤 细胞皮下攻击，且在肿瘤攻击后第3、 10和17天，用处理的DC( l-5x 105) 注射小鼠3次(皮下注射到肿瘤位点)。DC单独与或与具Cox-2抑制剂 NS398 (5 pM)的HSP-70 (5pg/ml)温育24小时。常规性的监测小鼠肿 瘤生长和存活情况。括号中的数字为卡方(log rank)检验的显著性值(图 23 )。骨髓来源的DC与仅培养基(对照)、HSP70疫苗(5 mg/ml )、 Cox-2 抑制剂NS398 ( 5 mM )、 HSP70和Cox-2抑制剂或LPS ( 10 ng/ml)温育。 24小时后细胞用抗CD80和CD11C抗体标记，且进行细胞荧光分析。结 果以CDllc+的DC群体细胞上的平均荧光强度(MFI)显示(图24)。结果除了潜在的治疗癌的疗效外，TLR激动剂也具有佐剂特性且增强病原 体或肿瘤抗原诱导的免疫应答。已显示TLR激动剂CpG可增强天然细胞 中IL-10的产生且由此诱导Treg细胞，其可对癌或传染性疾病疫苗不利。 本发明惊人地显示，通过与Cox-2或ERK抑制剂联合应用，他们可增强 肿瘤疫苗的疗效。我们的方式是在存在CpG和有或无抑制剂时，使用抗原 冲激的树突状细胞，而不是用肿瘤抗原和佐剂直接免疫，其会被肿瘤的免 疫抑制性环境影响(如图1显示)。我们运用热激的和辐射的B16细胞作 为全细胞瘤疫苗，其在存在或无Cox-2或ERK抑制剂时与DC和CpG温
育。在存在CpG时，用肿瘤抗原冲激的树突状细胞治疗性免疫，不影响肿 瘤生长(图22 )。然而在存在Cox-2或ERK抑制剂时，用B16抗原和CpG 冲激的DC免疫，显著减緩了肿瘤生长速率。我们也检测了 Cox-2抑制剂对用热激蛋白疫(HSP) -70疫苗治疗性免 疫的疗效。HSP-70疫苗通过从B16肿瘤纯化制备，已显示对小鼠B16肿 瘤具预防性免疫的疗效，但当将其治疗用给药于具生长着的肿瘤的小鼠 时，效果甚孩i。在此，在存在或不存在Cox-2抑制剂时，我们用HSP-70 疫苗冲激树突状细胞，然后在B16肿瘤攻击后3、 10和17天，将细胞转 移。Cox-2抑制剂沖激的DC单独给药，无保护效果(图23)。而且，相比 用未沖激的DC给药观察到的结果，单独用HSP-70疫苗沖激的DC免疫不 增强存活率或无瘤小鼠的数量。然而，在存在Cox-2抑制剂时用HSP-70 疫苗冲激的DC治疗性免疫小鼠，使我们观察到最多数量的无瘤小鼠(77%) 和最高百分率的幸存率(77%)。这些发现证实，相比于单独用一种治疗， 联合应用Cox-2抑制剂和HSP-70疫苗具有惊人的增强治疗癌的疗效。对Cox-2和HSP70对DC活化的效果的枱r验揭示，单独用Cox-2或 HSP70不能增强CD80的表达，然而联合应用显著增强CD80平均荧光强 度，达到用LPS的水平(图24 )。这些结果表明联合用HSP70和Cox-2抑 制剂使树突状细胞成熟，此影响在单独用一种分子时不能观察到。实施例14-ERK、 Cox-2或p38的抑制阻遏树突状细胞中TLR激动剂诱导 的PGE2材料和方法在体外用CpG (5吗)或ERK抑制剂、U0126 (5 pM)，或两者一起 刺激骨髓来源的树突状细胞(DC) 24小时。移去上清液且用ELISA法测 定PGE2的浓度。方差分析"PO.Ol, CpG + p38对比CpG (图25)。单独用CpG (5吗)或与Cox-2抑制剂NS-398 —起存在时，刺激骨 髓来源的DC。 24小时后移去上清IE用ELISA法测定PGE2的浓度(图 26(a))。方差分析承P〈0.05， CpG + p38对比CpG。 用热激的或辐射的B16肺瘤细胞处理骨髓来源的DC 4小时，然后用 CpG(5吗)、p38抑制剂SB 203580 (5 mM),或两者一起刺激24小时。 移去上清液且用ELISA法测定PGE2的浓度。方差分析* <0.05， CpG + p38 对比CpG (图27)。结果图25显示对ERK活化的阻遏逆转CpG诱导的树突状细胞中PGE2的 产生。图26 (a)显示对Cox-2的产生的阻遏逆转CpG诱导的树突状细胞中 PGE2的产生。图27显示对p38 MAP激酶活化的阻遏逆转CpG诱导的树突状细胞中 PGE2的产生。实施例15-Cox-2抑制剂阻遏TLR激动剂诱导的树突状细胞中IL-10的产 生才才料和方法单独用CpG (5吗)或与Cox-2抑制剂NS-398 —起存在时，刺激骨 髓来源的DC。 24小时后移去上清液且用ELISA法测定IL-IO的浓度(图 26(b))。方差分析承P〈0.05， CpG + p38对比CpG。方差分析*卩<0.05， CpG 十p38对比CpG。结果图26( b )显示对Cox-2产生的阻遏逆转CpG诱导的树突状细胞中IL-10 的产生。实施例16-对p38的抑制在肿瘤疫苗和TLR激动剂刺激的树突状细胞中阻 遏IL-10且增强IL-12的产生材料和方法将骨髓来源的DC与热激过的B16肺瘤细胞一起孵育4小时，与辐射 过的B16肿瘤细胞孵育4小时，然后用CpG( 5 jig )、 p38抑制剂SB 203580 (5^M)或两者刺激。24小时后移去上清液，且采用ELISA法测定IL-IO、 IL-12p40、 IL-12p70和IL-23的浓度。方差分析承P0.05， ***P<0.0001, CpG 十p38对比CpG。结果图28显示对p38 MAP激酶活化的阻遏逆转CpG诱导的树突细胞中的 IL-10,而增强IL-12的产生。IL-23的产生不被p38抑制剂影响。实施例17-对p38的抑制增强树突状细胞疫苗和用肿瘤疫苗和CpG冲激的 树突状细胞的治疗效果材料和方法将骨髓来源的DC与热激过的B16胂瘤细胞处理4小时，和辐射过的 B16肿瘤细胞处理4小时，然后用仅培养基或p38抑制剂SB 203580( 5 ) 刺激24小时。用2 x 105个B16肿瘤细胞皮下(s.c.)攻击C57BL/6小鼠且 在攻击后3、 10和17天通过注射5xl()S个DC到肿瘤位点进行处理。常 规性的监测肿瘤生长。结果以单个小鼠的肺瘤体积表示(图29)。将骨髓来源的dc用热激过的b16肿瘤细胞处理4小时，和辐射过的 B16肿瘤细胞处理4小时，然后用单独的CpG (5吗)或在存在p38抑制 剂sb 203580 ( 5 mM )时刺激24小时。用2 x 105个b16肿瘤细胞皮下攻 击C57BL/6小鼠且在攻击后3、 10和17天通过注射5 x 105个DC到肺瘤 位点进行处理。常规性的监测肿瘤生长。结果以单个小鼠的肿瘤体积表示 (图30)。将骨髓来源的DC与热'^L/辐射的B16肿瘤细胞处理4小时，然后用仅 培养基、CpG ( 5 pg )、 CpG和p38抑制剂SB 203580 ( 5 yM)或仅p38抑 制剂刺激24小时。用2x 1()S个B16胂瘤细胞皮下攻击C57BL/6小鼠且在 攻击后3、 10和17天通过注射5 x 105个DC到肿瘤位点进行处理。常规 性的监测小鼠的存活率。括号中的数字表示相对对照组具统计学差异(图 31)。
结果图29显示p38抑制剂增强肿瘤疫苗的保护效果，该疫苗包含灭活的 全瘤细胞激活的树突状细胞。图30显示p38抑制剂增强肿瘤疫苗的保护效果，该疫苗包含在存在 TLR激动剂CpG时灭活的全瘤细胞激活的树突状细胞。图31显示在用包含用单独的灭活的全瘤细胞或在存在TLR激动剂 CpG时激活的树突状细胞的疫苗给药治疗后，p38抑制剂增强小鼠的存活 率。实施例18-用全瘤疫苗和CpG沖激的树突状细胞治疗增加肿瘤中T细胞 IFN-y的产生材料和方法骨髓来源的DC用与热^t/辐射的B16肿瘤细胞处理4小时，然后用仅 培养基或CpG (5 jig)刺激24小时。用2x 1()S个B16肿瘤细胞皮下攻击 C57BL/6小鼠且在攻击后3和10天通过注射5 x 105个DC到肿瘤位点进 行处理。在第15天提取肿瘤，CD4+和CD8+细胞内的IL-17和IFN-y用FACS 通过免疫荧光方法测定。结果图32显示将用灭活的肺瘤细胞和CpG沖激的树突状细胞给药，治疗 具皮下肿瘤的小鼠，增加生长着的肿瘤中CD4+和CD8+ T细胞产生IFN-y 的频率。实施例19-用B16疫苗、CpG和p38抑制剂处理过的树突状细胞治疗增加 CD4+细胞的频率，但是减小肺瘤块中调节性T细胞的频率材料和方法将骨髓来源的DC与热'^L/辐射的B16肿瘤细胞处理4小时，然后用仅
培养基、CpG ( 5 jxg )、 CpG和p38抑制剂SB 203580 ( 5 |iM)或仅p38抑 制剂刺激24小时。用2x 1()S个B16肿瘤细胞皮下攻击C57BL/6小鼠，且 在攻击后3和10天通过注射5 x 105个DC到肿瘤位点进行处理。在第15 天提取肿瘤，肿瘤块中CD4+细胞(A)和CD4+CD25+Foxp3+细胞(B) 的百分率用FACS通过特异性抗体免疫荧光方法测定。结果图33显示用灭活的胂瘤细胞和CpG冲激的树突状细胞给药，治疗具 皮下肺瘤的小鼠，增强CD4+ T细胞到生长着的肿瘤的募集且阻遏表达 Foxp3的调节性T细胞的募集。实施例20-瘤体注射CpG和p38抑制剂增加存活率 材料和方法用2x 1(^个B16肺瘤细胞皮下攻击C57BL/6小鼠且在攻击后3、 5和 7天通过将CpG ( 25吗)、p38抑制剂SB204580 ( 50昭)或两者同时注射 到肿瘤位点进行处理。常规性的监测小鼠存活率。结果图34显示相比单独用CpG或p38抑制剂治疗后观察到的情况，在存 在p38抑制剂时将CpG治疗性给药，能增加具皮下B16肿瘤的小鼠的存 活率。实施例21-pl3K抑制剂增强肿瘤疫苗和CpG沖激过的树突状细胞的治疗效 果，增加具生长肿瘤的小鼠的存活率材料和方法骨髓来源的DC首先体外用热激和辐射过的B16肿瘤细胞沖激4小时， 然后单独用CpG (5 pg/ml)或与pl3K抑制剂渥曼青霉素(2.5 ^M)刺激 24小时。用2 x 105个B16肿瘤细胞皮下攻击C57BL/6小鼠，且在攻击后 3、 10和17天，通过将2x 1()S个处理过的DC注射到肿瘤位点进行处理。
常规性的监测肺瘤生长且将每组的平均值绘制成图(图35)。骨髓来源的DC首先体外用热激和辐射过的B16肿瘤细胞沖激4小时， 然后单独用CpG ( 5 pg/ml)或与p13激酶(pl3K)抑制剂渥曼青霉素(2.5 pM)刺激24小时。用2 x 105个B16肺瘤细胞皮下攻击C57BL/6小鼠， 且在攻击后3、 10和17天，通过将5xl()S个处理过的DC注射到肿瘤位 点进行处理。常规性的监测肿瘤生长以得到生存率(图36)。结果结果显示在存在p13激酶时，用灭活的肿瘤细胞和CpG沖激的DC治 疗性给药比用肿瘤细胞和单独的CpG或pl3K抑制剂沖激过的DC具更好 的治疗效果(图35)。而且，在存在p13激酶抑制剂时，用灭活的肿瘤细 胞和CpG冲激的DC治疗性给药，相比用肿瘤细胞和单独的CpG或pl3K 抑制剂冲激过的DC治疗后观察到的情况，增加了具皮下B16肿瘤小鼠的 存活率(图36)。实施例22- CpG作为佐剂时用p38抑制剂增加了无细胞百日咳疫苗的保护 效果材料和方法单独用0.02人用量的无细胞百日咳疫苗(JNIH-3，包括FHA和脱毒 百曰咳毒素)或在存在CpG( 5吗)或CpG和p38抑制剂SB20358(K 50 mM ) 时腹腔(i. p.)免疫小鼠两次(0和4周)。2周后，用百日咳杆菌气雾攻 击小鼠。经过百日咳杆菌感染后，在攻击后的0、 3、 7、 14和21天，对 来自四个为一组的小鼠肺上的CFU (菌落形成单位)进行计数。在无菌条 件下取下肺并于冰上在1 ml的含1%的酪蛋白的无菌生理盐水中匀浆。未 稀释的和连续稀释的来自个体的肺的匀浆(100 nl) —式三份的点涂布在 Bordet-Gengou琼脂糖平板上，于37。C温育5天后计算CFU数。适合的检 出限制为每个肺0.6 log1()CFU。结果图37显示低剂量的无细胞百日咳疫苗，甚至加有CpG作为佐剂时，
对小鼠的保护弱，但是与p38抑制剂共同给药显著增强保护效果。在存在 CpG和p38抑制剂时，用疫苗免疫过的小鼠肺中百日咳杆菌CFU数显著 低一些。
实施例23-对加有CpG作为佐剂的无细胞百日咳疫苗的应答时，p38抑制 剂增强IFN-y且减少IL-10
材料和方法
单独用0.02人用量的无细胞百日咳疫苗(JNIH-3包括FHA和脱毒的 百日咳毒素)或在存在CpG ( 5吗)或CpG和p38抑制剂SB203580 ( 50 )肠外免疫小鼠两次(0和4周)。2周后小鼠用百日咳杆菌气雾攻击小 鼠。在攻击前或攻击后取得脾单核细胞(2x 106/ml)，于37。C在5% C02 中培养，其含从百日咳杆菌纯化的丝状血凝素(FHA )或含PMA( 250 ng/ml， Sigma)和抗鼠CD3 (1 pg/ml; Pharmingen，圣地亚哥，美国)或仅培养 基作为阴性对照。72小时后移去上清且通过双位点ELISA法测定IL-10和 IFN-y的浓度(图38)。
单独用无细胞百日咳疫苗(JNIH-3包括FHA和脱毒的百日咳毒素) 或在存在CpG ( 5吗)或CpG和p38抑制剂SB203580 ( 50 一 )时腹腔免 疫小鼠两次(0和4周)。2周后小鼠用百日咳杆菌气雾攻击小鼠。在攻击 后14天取得脾单核细胞(2x l06/ml)，在存在布雷菲德菌素A时，于37 。C在5。/。C02中培养，其含PMA( 250 ng/ml, Sigma)和离子霉素(1 pg/ml) 或仅培养基作为阴性对照。4小时后用特异性抗体通过免疫荧光分析测定 且用FACS分析细胞内IL-10 (图39 )。
结果
结果表明用CpG作为佐剂的无细胞百日咳疫苗免疫后，p38抑制剂增 强IFN-y且减少IL-10的响应(图38和图39 )。
实施例24-在用百日咳杆菌攻击小鼠后，加入p38抑制剂到CpG作为佐剂 的无细力包百日咳疫苗增加局部的IL-ip
才才料禾口方法
单独用无细胞百日咳疫苗(JNIH-3包括FHA和脱毒的百日咳毒素) 或在存在CpG ( 5吗)或CpG和p38抑制剂SB203580 ( 50 pM)时腹腔免 疫小鼠两次(0和4周)。2周后小鼠用百曰咳杆菌气雾攻击小鼠。在攻击 4小时后取下肺，匀浆，且用ELISA法测定IL-(3的浓度。
结果
图40显示在接种疫苗时，用百日咳杆菌攻击免疫过的小鼠后，p38抑 制剂增强局部炎症反应。在百日咳杆菌攻击后，加p38抑制剂到CpG作为 佐剂的无细胞百日咳疫苗中，增加肺中局部的IL-ip。
实施例25-用肺瘤疫苗、TLR激动剂和p38抑制剂治疗性免疫能减小小鼠 中B16肿瘤的生长
用2 x 105个B16肿瘤细胞皮下攻击C57BL/6小鼠，且在攻击后3、 5 和7天，将仅赋形剂(未处理的)热激和辐射过的B16肿瘤细胞(1 x 106) 单独注射或与CpG (10吗)或与CpG和p38抑制剂SB203580 (50吗) 一起注射到小鼠肿瘤位点。常规性地监测肿瘤的生长。
结果
结果(图41)显示相比单独用B16肿瘤或B16疫苗和CpG治疗后观 察到的情况，在存在p38抑制剂时将CpG作为佐剂用灭活的肿瘤疫苗治疗 性免疫增加了具皮下B16肿瘤的小鼠的存活率。
实施例26-在IL-10缺陷的小鼠中肿瘤生长未显著性的加剧
用2x 105个B16胂瘤细胞皮下攻击C57BL/6或IL-10缺陷的小鼠且 17天后估计肿瘤的大小。结果为5只一组的小鼠的平均肿瘤体积。
结果
结果(图42)显示在IL-10缺陷的小鼠中，胂瘤生长未显著性的加剧。 因此显示IL-10不是介导抗炎反应的唯一介质。
涉及本说明书的所有的文献在此引为参考。对本发明所描述的实施例 的各种修饰和变化不偏离本发明的范围，对本领域的技术人员来说容易理
解。虽然本发明连同特殊的优选的实施例已被描述，应了解被要求;t又利的 本发明不受到这些特殊的实施例的不适当的限制。实际上，对本领域的技 术人员来说，显而易见地本发明涵盖本发明
具体实施例方式
权利要求
1. 一种用于治疗需要增强Th1介导的免疫应答的疾病的组合物，所述的组合物包括:(i)至少一种Toll样受体(TLR)激动剂；和(ii)至少一种免疫调节剂，其抑制对免疫应答的阻遏，其中所述阻遏源于选择性的抑制调节性T细胞的功能或源于对细胞因子表达的调节以致至少一种抗炎性细胞因子被阻遏且至少一种促炎细胞因子被上调。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述免疫调节剂抑制免疫应 答的下游介质的功能，其中所述下游介质选自包括下列组成的组肌醇磷 脂3激酶、环氧合酶2、 p38、 ERK、 MEK1或MEK2。
3. 根据权利要求2所述的组合物，其中所述免疫调节剂为肌醇磷脂3 激酶抑制剂。
4. 根据权利要求3所述的组合物，其中所述肌醇磷脂3激酶抑制剂为 LY294002或渥曼青霉素(WMN)。
5. 根据权利要求2所述的组合物，其中所述免疫调节剂为环氧合酶2 抑制剂。
6. 根据权利要求5所述的组合物，其中所述环氧合酶2抑制剂为塞来 昔布(NS-398)或罗非可昔。
7. 根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述免疫调节剂抑制MAP 激酶蛋白的功能。
8. 根据权利要求7所述的组合物，其中所述免疫调节剂选自包括下列 组成的组p38激酶抑制剂、ERK抑制剂、MEK 1抑制剂和MEK 2抑制 剂。
9. 根据权利要求8所迷的组合物，其中所述p38激酶抑制剂选自包括 下列组成的组SB203580、 SB220025或SB239063。
10. 根据权利要求8所述的组合物，其中所述ERK (胞外调节激酶) 抑制剂为U0126或PD98059。
11. 根据权利要求8所述的组合物，其中所述肌醇磷脂3激酶抑制剂 为LY294002或渥曼青霉素(WMN)。
12. 根据权利要求1至11中的任一权利要求所述的组合物，其中所述 免疫调节剂抑制IL-10和/或TGF-P的产生和/或上调IL-12的产生。
13. 根据权利要求1至12中的任一权利要求所述的组合物，其中所述 Toll样受体激动剂选自包括下列组成的组Pam3CSK4、酵母聚糖、PolyIC、 dsRNA、 LPS(脂多糖)、单磷酰脂质A( MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN( CpG-寡聚脱氧核苷酸)、咪查莫特、R838、 R83、百日咳杆菌和结核分枝杆菌。
14. 根据权利要求1至13中任一权利要求所述的组合物，其进一步包 括至少 一种肿瘤特异性抗原。
15. 根据权利要求1至14中任一权利要求所述的组合物，其进一步包 括调节性化合物，其抑制具有增强肿瘤细胞存活功能的肿瘤细胞产物。
16. 根据权利要求15所述的组合物，其中该调节性化合物为肿瘤生长 抑制性产物。
17. 根据权利要求15所述的组合物，其中所述调节性的组合物促进凋 亡发生。
18. —种用于治疗需要增强Thl-介导的免疫应答的疾病的药物组合 物，其中该组合物包4舌-至少一种Toll样受体激动剂，和-至少一种免疫调节化合物，及药物可接受的赋形剂、稀释剂或载体， 所述免疫调节化合物抑制免疫应答的阻遏，其中所述阻遏源于对调节性T 细胞功能的选择性抑制或源于调节细胞因子表达以致至少 一种抗炎性细 胞因子被阻遏且至少一种促炎细胞因子被上调。
19. 根据权利要求18所述的药物组合物，其中所述免疫调节剂抑制免 疫应答下游介质的功能。
20. 根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述下游介质选自包括 下列组成的组肌醇^粦脂3激酶、环氧合酶2、 p38、 ERK、 MEK 1或MEK 2。
21. 根据权利要求18至20中任一权利要求所述的药物组合物，其中 所述Toll样受体激动剂选自包括下列组成的组Pam3CSK4、酵母聚糖、 PolyIC、 dsRNA、 LPS(脂多糖)、单磷酰脂质A( MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN(GPG-寡聚脱氧核苷酸)、咪喹莫特、R838、 R83、百日咳杆菌和结核分 枝杆菌。
22. —种用于治疗或预防需要增强Thl介导的免疫应答的疾病的方 法，该方法包括以下步骤-将治疗有用量的至少一种Toll样受体激动剂给药；和-给药治疗有用量的至少 一种免疫调节剂，其抑制对免疫应答的阻遏， 其中所述阻遏源于对调节性T细胞功能的选择性抑制或源于细胞因子表达 的调节，以致至少一种抗炎性细胞因子被阻遏且至少一种促炎细胞因子被 上调。
23. 至少一种Toll样受体激动剂和免疫调节剂在治疗需要增强Thl介 导的免疫应答的疾病中的应用，其中所述免疫调节剂抑制对免疫应答的阻 遏，该阻遏通过对调节性T细胞的功能的选择性抑制或源于对细胞因子表 达的调节以致至少一种抗炎性细胞因子被阻遏且至少一种促炎细胞因子 被上调。
24. 至少一种Toll样受体激动剂和免疫调节剂在制备用于治疗需要增 强Thl介导或其他效应因子的免疫应答疾病的药物中的应用，其中所述免 疫调节剂抑制对免疫应答的阻遏，该阻遏通过对调节性T细胞的功能的选 择性抑制或源于对细胞因子表达的调节，以致至少 一种抗炎性细胞因子被 阻遏且至少 一种促炎细胞因子被上调。
25. —种用于治疗癌症和恶性疾病的组合物，其包括(i )包括至少一种可引发免疫应答的肿瘤特异性抗原的组合物，所 述的应答对所述癌症或恶性疾病特异，(ii )至少一种Toll样受体激动剂；和(iii)免疫调节剂，其抑制对免疫应答的阻遏，该阻遏通过对调节性 T细胞的功能选择性抑制或源于对细胞因子表达的调节，以致至少一种抗 炎性细胞因子被阻遏且至少一种促炎细胞因子被上调。
26. 根据权利要求25所述的组合物，其中所述肿瘤特异性的抗原来源 于热激蛋白与来自癌细胞或患癌性疾病个体的抗原性肽的复合体。
27. 根据权利要求25所述的组合物，其中所述免疫调节剂抑制免疫应 答下游介质的功能。
28. 根据权利要求27所述的组合物，其中所述下游介质选自包括下列 组成的组肌醇磷脂3激酶、环氧合酶2、 p38、 ERK、 MEK1或MEK2。
29. 根据权利要求27所述的组合物，其中所述免疫调节剂选自包括下 列组成的组肌醇磷脂3激酶抑制剂、环氧合酶2抑制剂、p38激酶抑制 剂、ERK抑制剂、MEK 1抑制剂或MEK2抑制剂。
30. 根据权利要求25至29中任一权利要求所述的组合物，其中所述 免疫调节剂抑制IL-10和/或TGF-P的产生和/或上调IL-12的产生。
31. 根据权利要求25至30中任一权利要求所述的组合物，其中所述 Toll样受体激动剂选自包括下列组成的组Pam3CSK4、酵母聚糖、PolyIC、 dsRNA、 LPS(脂多糖)、单磷酰脂质A( MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN( GPG-寡聚脱氧核苷酸)、咪喹莫特、R838、 R83、百日咳杆菌和结核分枝杆菌。
32. 根据权利要求25至31中任一权利要求所述的组合物，其进一步 包括调节性化合物，其抑制有效增强肿瘤细胞存活的肿瘤细胞的产物。
33. —种治疗癌症或恶性疾病的方法，所述方法包括以下步骤-将抗癌疫苗或包括至少一种肿瘤特异性抗原的其抗原部分或抗原决 定簇给药；-将至少一种Toll样受体激动剂给药，且-将治疗有用量的免疫调节剂给药于需要它的受治疗者，所述调节剂抑 制对免疫应答的阻遏，该阻遏通过对调节性T细胞功能的选择性抑制或源于细胞因子表达的调节，以致至少一种抗炎性细胞因子被阻遏且至少一种促炎细胞因子^:上调。
34. 包括至少一种肿瘤特异性抗原、至少一种Toll样受体激动剂和免 疫调节化合物的组合物在制备用于治疗癌症或恶性疾病的药物中的应用， 其中所述免疫调节化合物抑制对免疫应答阻遏，该阻遏通过选择性抑制调 节性T细胞的功能或源于细胞因子表达的调节，以致至少 一种抗炎性细胞 因子被阻遏且至少一种促炎细胞因子被上调。
35. —种用于治疗癌性疾病的疫苗组合物，其包括 -树突状细胞，-至少一种肺瘤细胞抗原， -至少一种Toll样受体激动剂，和-免疫调节化合物，其抑制对免疫应答的阻遏，该阻遏通过选择性抑制 调节性T细胞的功能或源于调节细胞因子的表达，以致至少一种抗炎性细 胞因子被阻遏且至少一种促炎细胞因子被上调。
36. 根据权利要求35所述的组合物，其中该免疫调节剂抑制免疫应答 的下游介质的功能。
37. 根据权利要求36所述的组合物，其中该下游介质选自包括下列组 成的组肌醇磷脂3激酶、环氧合酶2、 p38、 ERK、 MEK1或MEK2。
38. 根据权利要求36所述的组合物，其中该免疫调节剂选自包括下列 组成的组肌醇磷脂3激酶抑制剂、环氧合酶2抑制剂、p38激酶抑制剂、 ERK抑制剂、MEK1抑制剂或MEK2抑制剂。
39. 根据权利要求35至38中任一权利要求所述的组合物，其中该免 疫调节剂抑制IL-10和/或TGF-j3的产生和/或上调IL-12的产生。
40. 根据权利要求35至39中任一权利要求所述的组合物，其中该Toll 样受体激动剂选自包括下列组成的组Pam3CSK4、酵母聚糖、PolyIC、 dsRNA、 LPS(脂多糖)、单磷酰脂质A( MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN( GPG-寡聚脱氧核苷酸)、咪喹莫特、R838、 R83、百日咳杆菌和结核分枝杆菌。
41. 根据权利要求35至40中任一权利要求所述的组合物，其进一步 包括调节性化合物，该化合物抑制有效增强肿瘤细胞存活的肿瘤细胞的产 物。
42. 树突状细胞、至少一种肿瘤特异性抗原、至少一种Toll样受体激 动剂和免疫调节化合物在治疗癌性疾病中的应用，其中所述免疫调节化合 物抑制对免疫应答阻遏，该阻遏通过选择性抑制调节性T细胞的功能或源 于细胞因子表达的调节，以致至少一种抗炎性细胞因子被阻遏且至少一种 促炎细胞因子被上调。
43. 树突状细胞、至少一种肿瘤特异性抗原、至少一种Toll样受体激 动剂和免疫调节化合物在制备用于治疗癌性疾病的疫苗组合物中的应用， 其中所述免疫调节化合物抑制对免疫应答阻遏，该阻遏通过选择性抑制调 节性T细胞的功能或源于细胞因子表达的调节，以致至少一种抗炎性细胞 因子被阻遏且至少一种促炎细胞因子被上调。
44. 一种用于治疗癌性疾病的疫苗组合物，其包括 -树突状细胞，-至少一种Toll样受体激动剂，和-免疫调节化合物，其抑制对免疫应答的阻遏，该阻遏通iM"调节性T 细胞的功能的选择性抑制或源于调节细胞因子表达，以致至少 一种抗炎性 细胞因子被阻遏且至少一种促炎细胞因子被上调。
45. 根据权利要求44所述的组合物，其中该免疫调节剂抑制免疫应答 的下游介质的功能。
46. 根据权利要求45所述的组合物，其中该下游介质选自包括下列组 成的组肌醇磷脂3激酶、环氧合酶2、 p38、 ERK、 MEK1或MEK2。
47. 根绝权利要求45所述的组合物，其中该免疫调节剂选自包括下列 组成的组肌醇磷脂3激酶抑制剂、环氧合酶2抑制剂、p38激酶抑制剂、 ERK抑制剂、MEK 1抑制剂或MEK 2抑制剂。
48. 根据权利要求44至47中任一权利要求所述的组合物，其中该免疫调节剂抑制IL-10和/或TGF-p的产生和/或上调IL-12的产生。
49. 根据权利要求44至48中任一权利要求所述的组合物，其中该Toll 样受体激动剂选自包括下列组成的组Pam3CSK4、酵母聚糖、PolyIC、 dsRNA、 LPS(脂多糖)、单磷酰脂质A( MPL )、鞭毛蛋白、CpG-ODN( GPG-寡聚脱氧核苷酸)、咪喹莫特、R838、 R83、百日咳杆菌和结核分枝杆菌。
50. 根据权利要求44至49中任一权利要求所述的组合物，其进一步 包括调节性化合物，其抑制有效增强肿瘤细胞存活的肿瘤细胞的产物。
51. 树突状细胞、至少一种Toll样受体激动剂和免疫调节化合物在治 疗癌性疾病中的应用，其中所述免疫调节化合物抑制对免疫应答的阻遏， 该阻遏通过选择性抑制调节性T细胞的功能或源于调节细胞因子表达，以 致至少 一种抗炎性细胞因子^皮抑制和至少 一种促炎细胞因子被上调。
52. 树突状细胞、至少一种Toll样受体激动剂和免疫调节化合物在制 备用于治疗癌性疾病的疫苗组合物中的应用，其中所述免疫调节化合物抑 制对免疫应答的阻遏，该阻遏通过选择性抑制调节性T细胞的功能或源于 对细胞因子表达的调节，以致至少一种抗炎性细胞因子被阻遏且至少一种 促炎细胞因子被上调。
53. —种诱导受治疗者中的Thl应答以治疗癌症或传染性疾病的方 法，该方法包括以下步骤-在疫苗或TLR激动剂和免疫调节化合物存在下，其中该免疫调节化 合物抑制先天性免疫系统的细胞中IL-10和/或TGF-P的产生和/或上调 IL-12的产生，使分离的树突状细胞间接体内暴露于疾病特异性抗原，以 便使所述树突状细胞成熟为促进效应细胞功能的表型，-将所述树突状细胞给药到受治疗者，由此在受治疗者中产生的免疫应 答足以阻止癌症的发病或发展，或阻止病原微生物的感染且由此阻止传染 寸生疾病。
全文摘要
本发明通过施用一种组合物，提供了一种调节免疫应答的方法，该组合物包括Toll样受体激动剂和能够下调抗炎性细胞因子IL-10的表达和上调促炎性细胞因子IL-12的表达的免疫介质。此方法可用于提供癌性疾病和传染病的治疗性治疗。
文档编号A61K39/39GK101394865SQ200680051686
公开日2009年3月25日 申请日期2006年12月1日 优先权日2005年12月1日
发明者安德鲁·亚尼克, 迪尔德丽·托米, 金斯敦·米尔斯 申请人:都柏林伊丽莎白女皇神学院院长、研究员及专家协会