专利名称：miRNA-34c化合物作为脑胶质瘤标志物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种小分子RNA，即miR-34c的用途，属于生物医学材料技术领域。
技术背景
自从1993年Lee等采用经典克隆方法在线虫中首次克隆了 lin_4基因，通过点突 变的方法证实小分子RNA的存在以来，目前在Sanger miRNA数据库注释的miRNA共计有 14197条。根据生物信息学方法的预测，脊椎动物体内约1/3的基因受到miRNA的调控。寻 找miRNA靶基因、揭示其作用机制是目前研究的重点，也是后基因组时代需要解决的问题之一。
miRNA基因首先被II类聚合酶转录形成初级转录本(pri_miRNA)，核内转录形成 pi-mi RNA, pi-mi RNA最长有几kb，会有许多茎环二级结构。pri_miRNA在核内被Drosha以 及共同作用因子DGCR8识别并切割形成长约70nt的miRNA前体(pre-miRNA)。前体miRNA 会被核转运因子Exportin-5以Ran-GTP依赖型的方式运送到胞质中。Dicer是一种III 类RNA内切酶，会在胞质中识别pre-miRNA的茎环，切割形成长约22nt的双链RNA，其中一 条链被降解，而另一条链则成为成熟体，成熟的miRNA会同Ago2形成沉默复合体导向到基 因的特定区域进行调控。已有的研究表明miRNAs参与了生物体的许多重要的过程，包括 细胞增殖、凋亡、生长、分化和代谢等。此外，大量研究证实miRNA突变或者异位表达与多种 人类癌症相关，一些miRNA可以起到肿瘤抑制基因或者癌基因的功能，因而有望用于癌症 的诊断和治疗。
miR-34 家族包括 miR-34a、miR-34b、miR-34c。研究发现 miR-34a 会受到 p53 的调 控，而P53在许多肿瘤中是缺失或被突变的，这也就使得mil^Ma表达异常。同时也有研 究发现miR-34a的CpG也出现了甲基化的情况。miR_34b/c在人类中是共同转录，此前已 有研究表明miR-3k在喉癌及前列腺癌中呈低表达。同时，miR-34c也受到p53基因的调 控在卵巢癌中抑制细胞的增殖和分化，继而发现miR-3k在多种癌症中呈低表达，包括结 肠癌和肺癌等。尽管不少研究都表明mil^Mc是抑癌基因，但亦有研究指出在早期胃癌中 miR-34c过表达。因此人们对miR-3k的真正角色仍然有争议。
脑胶质瘤是浸润性的恶性肿瘤，在成人脑肿瘤中发病率最高。患者在确诊后的平 均生存时间少于1年。最近有研究表明多个miRNA在脑胶质瘤表达异常，包括miR-21， miR-10b, miR-221/222, miR-26a, and miR_34a。miR_34a 受到 p53 基因的调控，同时又 靶向多个p53信号通路下游基因，说明其在p53信号通路中起着十分关键的作用。有关 miR-34c在脑胶质瘤中的表达及功能研究目前尚未见报道。发明内容
本发明旨在提供miRNA_3k作为脑胶质瘤临床诊断标志物的应用。
本发明旨在提供miRNA_3k作为制备治疗脑肿瘤药物的应用。
首先在脑胶质瘤组织和细胞系中检测了 miR-34c的表达情况。如图IA所示，mir-34c在人脑胶质瘤组织中表达显著降低，而在6个脑胶质瘤细胞系(SW1783，U138, U251, U87, U373, TJ905)和1个神经母细胞瘤细胞系(SK-N-SH)中，也同样显著低表达。 为了探索引起miR-3k低表达的机制，我们采用亚硫酸氢盐转化测序的方法研究了人脑胶 质瘤组织和细胞系中CpG岛的甲基化状态。如图IB脑胶质瘤组织GlO和G17及细胞系U251 和U87在此区域有很多CpG岛被甲基化，而在正常的脑DNA中，只有很少一部分散在的甲基 化位点。此外，甲基化抑制剂AZA处理脑胶质瘤细胞系miR-34c的表达水平更高。因此甲 基化可能是导致miR-3k在脑胶质瘤中低表达的主要原因。
进一步研究了 miR-3k对脑胶质瘤细胞系生长和浸润的影响。细胞周期分布分析 表明在miR-3k转染后48小时发生了显著的Gl延滞(图2A)。此外，转染了 miR-3k的U87 和U251细胞同对照组相比基质胶侵袭更弱(图2B)。因此，miR-3k扮演着抑制脑胶质瘤细 胞生长和浸润的角色。
为了探讨miR-3k在脑胶质瘤形成中的作用机制，我们研究了其可能的作用靶基 因。如图3A所示为miR-3k对Rafl可能的作用位点及其保守性。我们构建了 miR-3k过 表达的U251稳定细胞株(图2B)。miR-3k的稳定转染可以显著抑制Raf-I和磷酸化Erkl/2 的表达(图3C)。最后，我们构建了 miR-3k对Rafl作用位点的荧光素酶报告载体，其荧光表 达在miR-3k过表达U251稳定细胞株中显著下调(图3D)。上述数据提示Raf-I是miR-34c 的直接靶标。
进一步研究了 miR-3k和Raf-I在脑胶质瘤组织和细胞系中的表达情况。图4A病 理切片所示脑胶质瘤组织组织学特征，Raf-I和磷酸化Erkl/2表达上调，具有相似的表达 模式(图4B)。此外，miR-3k的过表达会在U251和U87细胞系抑制Raf-I和磷酸化Erkl/2 的表达(图4C)。因此，在脑胶质瘤中Raf-I同miR-3k表达负相关。
最后，在37个临床样品中检测了 miR_34c的表达情况，包括正常组8例，II期7 例，III期7例，IV期8例。图5A表明，与正常组比较miR-3k在脑胶质瘤的不同临床时 期的表达水平均显著下调。而Rafl在脑胶质瘤临床样品中则显著上调，进一步证实了 Rafl 同miRj9a的相互关系。
本发明首次证明miR-3k在脑胶质瘤中表达均显著下调，原因是其启动子上游 CpG岛的甲基化所致。结合靶基因的预测方法我们发现miR-3k在RAFl gene中有作用 位点，荧光素酶报告实验及免疫印迹证实了 RAFl是miR-34c的可能靶标。为进一步研究 miR-34c在脑胶质瘤发生过程中的分子机制，我们构建了能分别稳定表达miR-3k的脑胶 质瘤细胞株。在此基础上，进一步证实了 RAFl是miR-3k的直接靶标，而RAFl的激活则可 促进脑胶质瘤细胞的增殖，诱导癌细胞恶化。为探讨miR-3k在脑胶质瘤早期诊断中的意 义，对脑胶质瘤临床各期标本进行了定量研究。结果证实miR-34c的表达水平各个时期的 表达均显著下调，故它们都有作为脑胶质瘤的标志物用于临床诊断等。迄今，尚无miR-34c 作为脑胶质瘤一种抑癌基因和一种潜在生物标志物的文献报道。
图1，甲基化导致miR-3k在脑胶质瘤中表达下调。
A)实时定量PCR分析miR-3k在人脑胶质瘤组织样品以及细胞系SW1783、U138、 U251、U87、U373、TJ905、SK-N-SH 中的表达情况。
B)亚硫酸氢盐转化测序分析miR-3k上游18个CpG岛在脑胶质瘤及细胞系中的 甲基化状态。■甲基化CpG岛；□未甲基化CpG岛。
C)实时定量PCR分析miR-3k在DNA甲基转移酶抑制剂(AZA，5-氮杂-2 ‘-脱氧 胞嘧啶核)处理前后的脑胶质瘤细胞系中的表达差异。
图2，miR-34c抑制脑胶质瘤细胞的生长和浸润。
A)脑胶质瘤细胞系U87和U251转染mil^Mc后的细胞周期分布，在转染48小时 后Gl期细胞数目比对照组显著增加(mean士S. E，n=3)。
B)脑胶质瘤细胞系U87和U251转染mil^Mc及miR_C的基质胶侵袭实验分析 (X200)。
图3，miR-34c直接靶向作用RAF-1。
A)图示miR-3k对RAFl的预测位点及其在不同物种中的保守情况。首先通过 MiRanda vl. Ob (Enright et al. 2003)预测软件针对miR_34c可能作用靴基因的3，UTR 和CDS区域进行搜索，然后在UCSC的基因组窗口浏览器中分析预测位点的保守型情况 (NCBI36/hgl8, http://genome, ucsc. edu/,红色框标示相应预测位点)。
B)慢病毒miR-3k及阴性对照转染U251后的表达情况。红色荧光标示慢病毒成 功转染(上图)。半定量RT-PCR表明转染后的细胞显著表达miR-34c，2%DNA琼脂糖电泳结 果见下图。
C) RAF-I及其下游基因在U87和U251中的蛋白印迹结果。
miR-34c转染48h后RAF-I呈显著下调，磷酸化的ERK1/2受到间接抑制。
D)RAF-1的荧光素酶报告实验。过表达mil^Mc显著抑制了 RAF-I载体的荧光表 达。(n=3, *p < 0.05)。
图4，在脑胶质瘤组织中miR_34c同Raf-I的表达相关A)HE染色脑胶质瘤组织的病理检测。晚期肿瘤组织的组织学特征包含退行性病灶，微 血管增值以及坏疽。
B) Rafl, Erkl/2和磷酸化Erkl/2在脑胶质瘤组织及细胞系中的免疫印迹分析。 Rafl和磷酸化的Erkl/2在脑胶质瘤组织中都呈上调表达。C1-6代表SW1783，U138, U351, U87, U373, and SK-N-SH0 Beta-actin 作为对照。
ORafl, Erkl/2，磷酸化Erkl/2在mil^Mc过表达的脑胶质瘤细胞系中的表 达情况。miR-34c的过表达会同时抑制Rafl和磷酸化Erkl/2在U251和U87中的表达， Beta-actin作为对照。
图5，mir-34c在人脑胶质瘤中的表达同恶性程度负相关。
A)实时定量PCR分析mir-3k在脑胶质瘤组织中的表达。正常组织(n=7) ；II期 (n=7) ；III期(n=5) ；IV期(n=8)。U6 rRNA作为对照。Cl和C2分别为淋巴瘤和肺癌脑转移癌症样品。
B)A)实时定量PCR分析mir-34b在脑胶质瘤组织中的表达。正常组织(n=7) ；II 期(n=5) ；III期(n=6) ；IV期(n=8)。U6 rRNA作为对照。Cl和C2分别为淋巴瘤和肺癌脑转移癌症样品。
具体实施方式
1.脑胶质瘤临床样品采集正常脑组织样品及脑胶质瘤组织样品从复旦大学附属华山医院取得。手术取出后，组 织块以PBS或生理盐水清洗干净，迅速将组织切成小块，部分样品放入2ml冻存管中于液氮 中保存备用。其他用多聚甲醛固定后用于组织切片分析。用于分子分析的样本在液氮中研 磨为粉末后分别提取RNA或蛋白质。
2. RNA抽提每100 mg组织加入1 mL Trizol，用液氮研磨充分研碎组织块。加 入约1/5体积的氯仿，上下颠倒充分混勻1分钟左右，室温下静置5分钟。4°C，12，000 rpm 离心15分钟后小心转移上清液入新的1. 5ml离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混勻， 室温静置10分钟。4°C，12000 rpm离心10分钟后，去上清，向沉淀中加入2/5体积的70% 乙醇，4°C，12000 rpm离心洗涤沉淀5分钟。去上清，将沉淀室温晾干后加入适量无RNA酶 的水充分溶解，测定0D260和0D280值。采用无RNA酶的DNA酶I处理，QIAGEN RNeasy试 剂盒纯化总RNA，详细操作原理和方法见试剂盒说明书。琼脂糖胶电泳评价总RNA质量，在 凝胶成像仪上观测、拍照，保存图像，一般认为> 2可以初步判定总RNA质量较好。
3. QR-PCR检测方法miRNA 的 qPCR检测使用 invitrogen 的 Trizol 抽提总 RNA，定 量并质检。取50-100ng总RNA为模板，使用针对特定miRNA的逆转录引物及invitrogen的 superscript III First-Strand Synthesis System 试剂盒合成 cDNA。以 cDNA 为模板，使 用针对目标miRNA的PCR引物及Takara的SYBR(R) Premix Ex TaqTM荧光定量PCR体系， 在stratagen MX3000P定量PCR仪上进行扩增，并测得样品的Ct值。将所得Ct值通过代入 测定标准曲线得出的公式，采用绝对定量的计算方法得出样品中的目标miRNA的含量。U6 基因作为内照对miRNA qPCR检测结果进行标准化校正。对于预测中的目标基因的qPCR检 测使用invitrogen的Trizol抽提总RNA，定量并质检。取3 μ g总RNA为模板，以随机寡核 苷酸为弓I物，使用 invitrogen 的 SuperScript III First-Strand Synthesis System试剂 盒合成cDNA。以cDNA为模板，使用针对目标基因的特异引物及Takara的STOR(R) Premix Ex TaqTM荧光定量PCR体系，在stratagen MX3000P定量PCR仪上进行扩增，并测得样品 的Ct值。同时测定待测样品中的看家基因(如β -肌动蛋白、GAPDH)的Ct值，以此来校正 各组样品之间上样量差别。
4.细胞培养人脑胶质瘤细胞株SW1783、U138、U251、U87、U373和人源神经母 细胞株SK-N-SH购自ATCC (Manassas, VA)，人源胎儿肾细胞株购自hvitrogen (Carlsbad, CA) SW1783、U138、U87、U373 和 SK-N-SH 细胞培养在 MEM 培养基(Gibco, CA) 中，U251细胞培养在RPIM 1640培养基(Gibco)中，上述培养基都含有10%的FBS (PAA Laboratories, Linz, Austria)、青霉素(100 单位/mL)和链霉素(100 ng/mL)。细胞 培养在含有10% FBS,2 mM L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液(Gibco)和青霉素/链霉素 的DMEM培养基中。所有细胞置37°C培养箱、5%C02，每天传代一次。
5.细胞转染甲氧基寡核苷酸由上海吉玛公司化学合成，microRNA前体购自美 国 Ambion 公司(Ambion Pre-mir miRNA precursor CaU No. 17100)，转染另设正常对照 组，miRNA前体组和miRNA前体通用阴性对照组。细胞于铺板18_24h后至70%_80%融合开 始转染，所用试剂为Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 0转染按本室常规方法并参照说 明书进行。细胞于铺板18_24h后约有70%-80%融合开始转染，所用试剂为Lipofectamine2000 (Invitrogen).具体转染方法参照说明书进行，寡核苷酸及siRNA的工作浓度均为 1OOnmol/L。
6.体外侵润实验细胞U87分别用miRNA_3k和R-Ras siRNA转染48 h，用寡居 核苷酸设阴性对照组。转染后的细胞(5X104个)悬浮于含5% BSA的MEM培养基中，接种于 铺有胶原膜的M孔培养板中，置于培养箱上层培养M h，未吸附的细胞用棉签小心移除。 侵入胶原膜下表面的细胞用细胞染色剂染色，继而计数，最终用微孔板读取器于560 nm处定量测定。
7.流式细胞周期分析细胞U87以30%密度接种于12孔培养板中培养M h。分 别与miRNA-3k及其前体(100 nM)转染M h后，用诺考达唑(nocodazole)处理18 h。接 着收集所得细胞并用70%的乙醇于4°C下固定M h。固定后的细胞用PBS洗涤后再分散于 含有10 mg/mL碘化丙锭和50 mg/mL RNase的PBS溶液中(500 mL)，室温下培养30 min。 所得细胞用流式细胞仪进行分析测定(BD FACSaria cell sorter, BD Bioscences, San Jose, CA, USA)。
8.蛋白印迹实验将miRNA-3k (100 nM)与U87和SK-N-SH细胞、阴性对照细胞 接种于12孔培养板中培养48 h，收集细胞，利用SDS-PAGE凝胶进行蛋白质抽取(25μ g)，所 得产物转移至 PVDF 膜。多克隆抗体 R-RAS (Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ) 和 CCNDl (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)按照使用说明进行稀释并于 4° C下培养过夜。接着与AP-标记的兔抗山羊IgG 二级抗体室温下培养2 h。β-肌动蛋 白表达水平用兔源多克隆抗肌动蛋白抗体进行测定。色带用BCIP/NBT (Ameresco)显色并 用 Labworks Instrument software (UVP LLC, Upland, CA)进行定量分析。
9.荧光素酶报告实验人源Rafl基因3’ UTR用下列引物进行PCR扩增 RAF1-3UTR-F: 5' - GGTACCGTCCCAGCACTACCTTCTT -3，，RAF1-3UTR-R: 5' - TCTAGACCATTCCCTGAGCCGTCTG -3，，PCR扩增产物克隆到pmd-19t载体(TaKaRa)，继而克隆到pGL3_Control vector (Promega)荧光素下游。核苷酸替换突变基于PCR的方法(KOD-Plus-Mutagenesis Kit, T0Y0B0) ο 引物为Mut 3' UTR of RAFl 5' - GGACGGTGTGGACAGCAGGATGATT -3'禾口 5' - GTGGTGCTGACCATGTGGACATTAG -3，。
上述质粒载体采用Lipofectamine 2000 Qnvitrogen)分别与mil^Mc前体共转 染U87细胞，48小时后按Promega提供的方法处理细胞，在多功能酶标仪(BioTek)读取荧 光值。所有实验结果重复三次。
10.组合亚硫酸氢钠限制分析实验(COBRA)和亚硫酸氢钠测序实验采用 California Santa Cruz (UCSC)大学数据库测定 CpG 岛(CGI)跨越 miRNA_34c 基因。用 于CGI的组合亚硫酸氢钠限制分析(COBRA)采用Methprimer 6软件设计。亚硫酸钠转换 的基因组(只能将非甲基化的胞嘧啶转化为脲嘧啶)用引物的特定链进行扩增，继而用甲基 化敏感酶进行消化。PCR测序所用引物序列为miR-34c -CG-BSFl 5‘ -AGTTGATTGTATTGTGGTGGTTATAATTAT-3‘禾Π miR-34c -CG-BSRl 5， -CCTCCAAAAATTTTACTTTCCTAAC-3，。
11.慢病毒制备和滴度测定在10厘米的组织培养板，QygWpLemir - 3 质粒(Openbiosystems)及包装混合物 26ul(Openbiosystems)共转染的 187. 5 微升 Arrest-In transfection reagent (Openbiosystems)感染 6 X IO6 HEI^93T。转染 48 和 72 小时后 收集含有该病毒培养上清，用0.45微米的过滤器filted和病毒储存分装。病毒滴定于转 染前一天在M孔组织培养板培养HEK293T细胞(5 X 104)，稀释后的病毒液分别用于感染 细胞，感染后48小时后，统计每毫升RFP表达细胞数，计算病毒滴度。
12.统计学分析所有tag取平均值t S. Ε.禾Ij用Microsoft Excel中的Durnett，s法进行 觀分析。取双尾P<0.05认为具有统计学意义。
权利要求
1.miRNA-34c化合物作为脑胶质瘤临床诊断标志物的应用。
2.miRNA-34c化合物作为制备治疗脑肿瘤药物的应用。
全文摘要
本发明属生物技术和医学领域，涉及一种人脑胶质瘤新的标志物miR-34c的用途。首次证实了miR-34c在人脑胶质瘤组织和细胞中表达均显著下调，究其原因是miR-34c基因启动子CpG岛的甲基化所致。同时，也首次证实了脑胶质瘤中RAF致癌因子1是miR-34c的直接作用靶标，过表达miR-34c能显著抑制脑胶质瘤细胞的增殖和浸润。进一步对不同级别的脑胶质瘤临床标本进行定量分析表明miR-34c能作为脑胶质瘤检测的标志物。
文档编号A61K48/00GK102031309SQ20101056479
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者刘顺英, 戚艳婷, 李丹, 赖立辉, 赵宇岚, 邹超 申请人:华东师范大学