专利名称：一种口蹄疫疫苗新型复合氢氧化铝佐剂以及制备疫苗方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种口蹄疫疫苗新型佐剂的配方以及疫苗制备方法。
背景技术：
口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是危害偶蹄动物的烈性传染病，尤其对主要畜种猪、牛、羊的危害特别严重，能造成畜种生产力下降和不良的社会影响，社会经济损失巨大。因该病传染性极强，世界动物卫生组织(FA0/0IE)将其列为头号必报烈性传染病，国际贸易予以严格限制。我国将该病列为一类动物传染病之首。在世界上许多国家，尤其是非洲、亚洲和南美洲国家，该病发生次数频繁，流行严重。此外，不时出现全球的流行性爆发。
疫苗是预防和控制口蹄疫采取的重要措施。口蹄疫免疫常用疫苗是油佐剂灭活疫苗。该苗的生产采用的是病毒接种细胞、组织培养物，病毒增殖后，收获培养物，加化学灭活剂(如二乙烯亚胺，BEI)使病毒失去感染性，与矿物油佐剂混合乳化制成疫苗。天然免疫应答不仅是机体抵抗病毒和其他病原侵染的第一道防线，也是启动获得性免疫应答的前提。Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)是近年来发现的在宿主抗病原微生物的免疫应答中起重要作用的细胞表面受体分子(Medzhitov R，Preston-Hurlburt P. Janeway CA Jr. A human homologue of the Drosophila Tollprotein signals activation of adaptive immunity. Nature 1997 ;388 :394-397)。迄今为止，在哺乳动物中已发现有10 15种TLR及其相应的配体或激动剂。TLRs广泛表达在各种免疫细胞，尤其是先天免疫细胞的表面，如巨噬细胞和树突状细胞等，主要介导细胞免疫。TLRs通过识别病原微生物及其特殊结构(TLRs激动剂一般是这种结构的类似物)，介导宿主相关细胞因子的分泌和天然免疫应答的产生。TLR3识别具有双链RNA的病毒感染，而单链RNA病毒在复制时能产生双链RNA，也能通过TLRs识别。病毒单链RNA的相应识别受体是TLR7和TLR8。TLR9是识别带有CpG DNA病毒的受体。一些TLRs激动剂，聚肌胞(polyl C)是 TLR3 的激动剂(Kumar H, Kawai T, Akira S. Pathogen recognitionin the innate immune response, Biochem J. 2009,420 (I) :1_16)。Resquimod(R-848)是 TLR7 和 TLR8 的激动剂(Gibson SJ, Lindh JM, Riter TR, Gleason RM, Rogers LM,Fuller AE, et al.Plasmacytoid dendritic cells produce cytokines and maturein response to the TLR7agonists, imiquimod and resiquimod. Cell Tmmunol 2002 ；218(1-2) :74-86)。氢氧化铝免疫佐剂的使用历史已有80多年，比油类佐剂更具有安全性和低反应性，已广泛应用于人兽疫苗，主要是形成抗原储存和缓释效应，刺激的细胞免疫较弱(Iyer S, HogenEsch H, Hem SL. Relationship between the degree of antigenadsorption to aluminum hydroxide adjuvant in interstitial fluid and antibodyproduction. Vaccine 2003 ；21 :1219-1223)。欧洲在2005年已经批准氢氧化铝吸附的LPS的类似物单磷酸酯A(MPL)作为乙肝疫苗的佐剂(Ennio De Gregorio, Elaine Trittoand Rino Rappuoli Alum adjuvanticity Unraveling a century old mystery, Eur.J. Immunol. 2008. 38 :2068-2071)。研究表明，氢氧化铝与CpG或LPS的联合使用免疫效果要优于其单独使用(Vajdy, M. , Selby, Μ.，Medina-Selby，A. , Coit, D. , Hall, J. , Tandeske,L. , Chien, D. et al. , Hepatitis C virus polyprotein vaccine formulations capableof inducing broad antibody and cellular immune responses. J. Gen. Virol. 2006. 87 2253-2262. Wack, A. , Baudner, B.C. , Hilbert, A. K. , Manini, I. , Nuti, S. , Tavarini,S. , Scheffczik, H. et al. , Combination adjuvants for the induction of potent,long-lasting antibody and T—cell re sponses to influenza vaccine in mice. Vaccine2008. 26 :552-561),这是由于氢氧化铝引起Th2效应，而TLRs引起Thl效应(Nemazee,D.，Gavin, A. , Hoebe, K. and Beutler, B. , Immunology Toll-like receptors and antibodyresponses. Nature 2006. 441 E4 ；discussion E4)。由于目前的文献所用的抗原模型均为乙肝、丙肝等人医病毒，用动物病毒做抗原模型少见报道。并且，氢氧化铝作为兽用病毒疫苗的佐剂使用较少，这是因为矿物油佐剂的效果要好于氢氧化铝，但是从动物福利以及肉食品质量的角度看，矿物油引起的疼痛、副反应、注射部位的结节等要远远大于氢氧化铝。并且，氢氧化铝佐剂更容易注射。因此，本研究准备联合使用2种不同的TLR激动剂，提高氢氧化铝的佐剂性，提高其细胞免疫效果，降低油性佐剂所带来的不良反应。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种口蹄疫复合型氢氧化铝佐剂的配方及其疫苗制备方法。本发明的技术方案如下一种口蹄疫疫苗新型复合氢氧化铝佐剂，含20mg/ml氢氧化铝胶体佐剂、200 μ g/ml的免疫增强剂PolyI :C和200 μ g/ml的R848。所述的口蹄疫疫苗的制备方法，包括以下步骤1、常规方法制备氢氧化铝胶体佐剂；2、常规方法制备并灭活口蹄疫抗原；3、在氢氧化铝胶体佐剂中分别加入过滤灭菌的免疫增强剂PolyI:C和R848，浓度均为200 μ g/ml，制得口蹄疫复合型氢氧化铝佐剂，氢氧化铝胶体佐剂浓度为2011^/1111。4、将口蹄疫复合型氢氧化铝佐剂与口蹄疫抗原以体积比I : I混合，置于4°C保存3天 5天，每天上午、下午各振摇2次，每次半小时。用本发明方法得到的疫苗免疫小鼠后，可检测到抗体和细胞水平类似或者优于油佐剂。
图IPolyI :C和R848作为免疫调节剂与氢氧化铝联合免疫小鼠的最佳剂量确定。PolyI = C的注射剂量为O. 2yg 400yg只，R848的注射剂量为O. I μ g 200 μ g只，每个剂量组有三只小鼠。小鼠在注射免疫增强剂后的24小时，72小时，7天，14天进行采血检测细胞因子Y-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-4(IL-4)和肿瘤坏死因子(TNF)的含量。细胞因子的含量通过商品化ELISA试剂盒进行检测。所得到的数据均为几何平均值土标准差。(a)不同时间、不同剂量的PolyI:C诱导的小鼠外周血中的IL-4的含量；(b)不同时间、不同剂量的PolyI C诱导的小鼠外周血中的TNF的含量；(c)不同时间、不同剂量的PolyI :C诱导的小鼠外周血中的IFN-Y的含量；(d)不同时间、不同剂量的R848诱导的小鼠外周血中的IL-4的含量；(e)不同时间、不同剂量的R848诱导的小鼠外周血中的TNF的含量；(f)不同时间、不同剂量的PolyI C诱导的小鼠外周血中的TNF的含量图2按不同配方免疫小鼠后产生的抗体效价在不同时间的动态变化。按照3天、7天、14天、21天、28天和35天的时间共采血6次，ELISA试剂盒检测口蹄疫抗体效价。数值为平均值土标准差。图3免疫21天后小鼠脾淋巴细胞中⑶8+T淋巴细胞检测结果；(a)F+206免疫组中的⑶3⑶8+T淋巴细胞的门内细胞百分比(10. 7% ) ;(b)F+A免疫组中的⑶3⑶8+T淋巴细胞的门内细胞百分比(8.4%) ;(c)F+A+P免疫组中的⑶3⑶8+T淋巴细胞的门内细胞百分比(11. 5% ) ;(d)F+A+R免疫组中的⑶3⑶8+T淋巴细胞的门内细胞百分比(11. 5% ) ； (e)F+A+P+R免疫组中的⑶3⑶8+T淋巴细胞的门内细胞百分比(12. 2% ) 0 图4免疫21天后小鼠脾淋巴细胞中⑶4+T淋巴细胞检测结果；(a)F+206免疫组中的⑶3⑶4+T淋巴细胞的门内细胞百分比(21.6% ) ;(b)F+A免疫组中的⑶3⑶4+T淋巴细胞的门内细胞百分比(17.9%) ;(c)F+A+P免疫组中的⑶3⑶4+T淋巴细胞的门内细胞百分比(19.9% ) ;(d)F+A+R免疫组中的⑶3⑶4+T淋巴细胞的门内细胞百分比(19.0% ) ； (e)F+A+P+R免疫组中的⑶3⑶4+T淋巴细胞的门内细胞百分比(21. 2% )。图5各免疫组的免疫35天的小鼠脾淋巴细胞进行口蹄疫抗原体外刺激产生的2种细胞因子(IFNy和IL-4)的含量。脾脏在无菌条件下分离研磨，利用红细胞裂解液裂解红细胞。然后在25 X 16计数板上计数，制成5 X 106/mL浓度的单细胞悬液。各设三孔重复，每孔加入200微升5106细胞，然后加入100微升口蹄疫抗原(3 μ g/ml)。数据统计取三孔的几何平均数土标准差；(a)体外刺激免疫小鼠脾淋巴细胞的IFN-Y含量；(b)体外刺激免疫小鼠脾淋巴细胞的IFN-Y含量。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。一、PolyI = C和R848作为免疫增强剂与氢氧化铝联合免疫小鼠的最佳剂量确定选18-22g的BALB/c小鼠作为实验动物。在BALB/c小鼠(η = 12/组)左后肢肌注 200 μ I Al(OH) 3+PolyI:C (O. 2，2，20，40，200 或 400 μ g)或 200 μ I Al (OH) 3+R848 (O. 1，1，10，20，100或200 μ g)。随后在注射后的24小时，72小时，7天，14天，对试验小鼠进行采血，分离血清，用商品化试剂盒检测IL-4，TNF, INF- Y ,以确定最佳免疫增强剂剂量。为了选择最佳免疫剂量，我们设计了一系列不同浓度的PolyI = C和R848，以确定在小鼠体内最佳的注射剂量(图I)。不同的细胞因子反应不同的免疫反应。我们选取了IL-4，TNFJP INF-γ三个指标来衡量其免疫增强剂效应。注入小鼠体内的免疫增强剂的含量范围为O. lyg_400yg不等。当PolyI :C含量为20 μ g/只时，IL-4，TNF，INF-Y在不同时间内，产生的含量达到了最大值。当R848为Iyg/只或IOOyg/只时，TNF和INF-γ的含量相对较高；而当R848为20 μ g/只时，细胞因子IL-4的含量是最高的，综合考虑这些数据以及成本因素，确定R-848的免疫最佳剂量也是20g/只。二.比较几种不同配方的免疫效果将BALB/c小鼠随机分成六组，每组12只。口蹄疫灭活抗原浓度为3 μ g/ml。每只口蹄疫灭活抗原免疫剂量均为200μ I。按照以下几组配方在小鼠后肢外侧肌肉进行肌肉注射(1)PBS, (2)F+206、(3)F+A、(4)F+A+P、(5)，F+A+R、(6)F+A+P+R(F 代表口蹄疫灭活抗原，A代表强氧化铝佐剂，206代表ISA206佐剂，P代表PolyIiC, R代表R848)。所有的小鼠在免疫前进行采血，然后再进行免疫。在免疫后的3、7、14、21、28、35天采血。外周血经过4000转离心10分钟，收集血清，并且储存于_20°C，直到进行ELISA检测相应指标。I.抗口蹄疫抗体效价。通过ELISA方法进行检测。从图3中可以看出，F+A组和F+206组在抗体效价数值上差异不大，F+206组的最高抗体效价是1:128，而F+A+P+R组在第14/21天的时候产生了 较高的(分别是1:256，1:512)抗体效价，说明这个组合相对其他组产生的抗体效价更高、更早，2种免疫增强剂PolyI :C和R848在促进抗体产生中起到了很重要的作用。2.用流式细胞仪检测⑶8+T细胞与⑶4+T淋巴细胞。脾脏从处死的小鼠体内无菌分离后，制成单细胞悬液(IO6 107/mL)。在2ml离心管中加入100微升淋巴细胞悬液，加入双标记单克隆抗体⑶3 (ALEXA FLUOR 488) /CD4 (ALEXA FLUOR 647)或 CD3 (ALEXA FLUOR 488) /CD8 (ALEXA FLUOR 647)，室温避光20分钟，然后3000转/分离心5min，弃掉上清。每管加入2ml的PBS缓冲液洗细胞，3000转/分，离心5min，弃掉上清，重复两次。最后每管加入0. 5ml的PBS悬浮细胞，四小时内上机检测。流式细胞仪分析⑶3⑶8+T淋巴细胞在脾脏淋巴细胞中的组成比例结果(图3和图4)显示，F+A+P+R组中其组成比例最高，达到12. 2%，矿物油206的⑶3⑶8+T淋巴细胞的组成比例是10. 7% ；F+A+P和F+A+R的比例分别是11. 5%0而F+A组中，比例最低，只有8. 4%。免疫后21天小鼠脾脏中⑶3⑶4+T淋巴细胞检测结果显示，F+206组中⑶4+T淋巴细胞所占比例最高，达到21. 6%，而F+A+R+P为21. 2%，二者接近，说明该组合与矿物油佐剂的效果接近，并且较F+A+R组或F+A+P组中比例高。说明PolyI :C和R848联合作用在促进T细胞分化中比单独作用效果好。3.体外刺激脾淋巴细胞测细胞因子产生情况分离所有免疫35天的小鼠脾淋巴细胞，制成单细胞悬液。脾淋巴细胞(5X106/ml)在96孔板上培养，每孔0. lmL。然后用灭活的口蹄疫抗原100 μ L刺激免疫小鼠的脾淋巴细胞，然后在37°C、含5%二氧化碳培养箱中孵育48h，最后通过离心96孔培养板，细胞聚集在孔底部，收集上清液，用ELISA方法检测细胞因子(IL-4、IFN- Y )产生情况。免疫小鼠脾淋巴细胞体外刺激试验结果(图5)显示，针对特异性抗原分泌的IFN- Y，F+206组的数值最高，为489. 16，F+A+R+P组的数值是462. 62，二者数值接近。而F+A组的数值为98. 67，F+A+P的数值为144. 15，F+A+R的数值是232. 5。说明复合型氢氧化铝佐剂比单纯使用某一种免疫增强剂的效果要好。IL-4产生量各组差异不明显(P > 0. 05)。其中F+206组的数值最高，为75. 61，F+A+R+P组的数值是65. 83，F+A组的数值为65. 02，F+A+P的数值为60. 95，F+A+R的数值是63. 93。综合上述数据，说明使用新型氢氧化铝组合佐剂(A+R+P)与矿物油206佐剂的效果接近。
权利要求
1.一种口蹄疫疫苗新型复合氢氧化铝佐剂，其特征在于，含20mg/ml氢氧化铝胶体佐剂、200yg/ml 的免疫增强剂 PolyI :C 和 200 μ g/ml 的 R848。
2.根据权利要求I所述口蹄疫疫苗新型复合氢氧化铝佐剂制备口蹄疫疫苗的方法，包括以下步骤在氢氧化铝胶体佐剂中分别加入过滤灭菌的免疫增强剂PolyI:C和R848，浓度均为200 μ g/ml，制得口蹄疫复合型氢氧化铝佐剂，氢氧化铝胶体佐剂浓度为20mg/ml。将口蹄疫复合型氢氧化铝佐剂与口蹄疫抗原以体积比I : I混合，置于4°C保存3天 5天，每天上午、下午各振摇2次，每次半小时。
全文摘要
本发明公开了一种口蹄疫疫苗新型佐剂的配方以及用该佐剂的口蹄疫疫苗制备方法。用氢氧化铝佐剂加上2种免疫增强剂PolyI:C和R848，再和口蹄疫抗原混合后免疫小鼠，发现该疫苗的效力类似甚至优于现行的矿物油进口佐剂ISA206。
文档编号A61K39/39GK102813921SQ20121030287
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月16日 优先权日2012年8月16日
发明者李冬, 刘在新, 周春雪, 卢曾军, 陈应理, 孙普, 谢宝霞, 曹轶梅, 付元芳, 包慧芳, 李平花, 白兴文 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所