采用非编码rna表达分析的方法

专利名称：采用非编码rna表达分析的方法
技术领域：
本发明涉及采用非编码RNA表达分析的方法。本发明的实施方案着手解决的问题包括但不限于确定在通过两种或更多种干预影响生物系统的机制方面的相似性，鉴定测试剂的候选治疗应用以及鉴定治疗剂的新应用，它们以前已经是关于一种或多种适应症的临床试验的主题。
背景技术：
关于微小RNA(miRNA)表达分析的应用，现在将讨论本发明涉及的问题，然而，本发明可以采用涉及其它非编码RNA分子的表达分析。miRNA是具有大约21至23个核苷酸长度的单链RNA分子。miRNA是由Victor Ambros在1993年首先描述的并且从那时起已经发表了 2000篇以上关于miRNA主题的论文。据预测在人类中存在有大约1000种miRNA，其中迄今为止已经描述并且实验确认了大约600种，虽然据估计这个数字在几万。然而，一篇最近的寻求产生一个不同的人类和啮齿动物组织和细胞系中的miRNA的表达谱的报道，报道了大约300种miRNA，占所有已检测的 miRNA 的 97%。miRNA并不被翻译成蛋白质而是代替地调控一种或多种其它基因的表达。已知的生物学目前显示微小RNA靶向特定个体的信使RNA(mRNA)或mRNA群，由此阻止它们的翻译或较少地加速mRNA的降解。成熟的单链miRNA分子与RNA诱导的沉默复合体(RISC)蛋白络合并且结合到一个来自其靶基因的蛋白质编码mRNA的3’非翻译区(3’ -UTR)之内的部分互补序列上。另外的蛋白质被募集以形成一种沉默复合体并且通过阻止mRNA翻译的机制而抑制靶基因产物的表达。虽然许多关于miRNA的生物学以及沉默复合体的组成和机制有待发现，很明显 miRNA涉及许多基因的调控。miRNA被认为在翻译水平上调控多达所有基因的30% (Xie et al，2005)。一种miRNA可以调控多种基因并且每种基因可以通过多种miRNA进行调控。 miRNA的组织特异性表达被认为引导细胞定型(commitment)以分化和/或积极维持组织的个性特征。这种不同miRNA之间的广泛影响与互相作用表明，单个的miRNA或miRNA的一个小子集的解除管制的表达(deregulated expression)可能导致复杂疾病性状(Lim et al, 2005,Nature) 0超过50%的已知人类miRNA驻留在在癌细胞中的易于改变的基因组区域(Calin et al，2004 PNAS, 101, 299-3004) 并不出人意料的是，miRNA的表达谱在癌症和其它疾病状态中在变化。通过允许癌症干细胞中的特异性miRNA表达谱的定义，这个信息已经开始被用于对癌症进行分类和分期、揭示用于预后和反应的生物标记以及提供一种指导治疗干预的关键决定因素、解释化学敏感性、以及告知化学抗性的机制。对于可能的新的治疗剂的研究和开发，miRNA的应用已经典型地产生自对于繁琐且耗时的机制的分析，这些机制是通过其调控miRNA的表达和加工的机制以及通过特异性 miRNA调控mRNA翻译的机制。已经鉴定了一些特异性药物靶标并且与这些药物靶标有关的研究正在进行中。然而，虽然是彻底的，这个研究范式是耗时的并且昂贵的。因此，本发明的目的是提供用于发现干预措施的实际应用(如一种治疗剂的给药)的可替代的方法，该方法不需要详细理解该干预措施的作用机制或特异性药物靶标的鉴定。本发明的一些实施方案着手解决的问题是，确定对于已知治疗实体的新的适应症或预测测试剂的药理学性质，如它们的毒理学特性(toxicological profile)的一些方面。发明概述根据本发明提供了一种方法，该方法包括以下步骤(1)进行多种表达分析，每种表达分析包括以下步骤在一种生物系统上进行一种干预，测量由该干预产生的在该生物系统中的非编码RNA的一个表达谱，并且存储源于该测量的表达谱的一个表达数据集，所述这些表达分析涉及多种不同的干预和多种不同的生物系统的两者之一或两者；(2)分析生成的表达数据集以确定在两种或更多种表达分析组中对对应的干预的非编码RNA表达谱的作用之间的相关，这些表达分析涉及不同的干预或不同的生物系统的两者之一或两者。通过分析表达数据集以确定在两种或更多种表达分析的组中一种干预对非编码 RNA表达谱的作用之间的相似性，这些相似性根据被进行的干预以及在其上进行该干预的生物系统的两者之一或两者而不同，在没有必要确定机制(一种或多种干预通过该机制影响在一种或多种生物系统中的非编码RNA的表达谱)的情况下可以确定这些相关。因此，其中发现一种第二干预对非编码RNA的表达谱具有作用，该作用与一种具有已知的治疗关联性的第一干预的作用是相关的，该第二干预可以被视为用于相同或相似的治疗应用的候选物。至少有一定的可能性，即该第一和第二干预将具有相同的、相似的或相关的作用机制。本方法与用于发现治疗干预的已知策略形成了直接对比，在本方法中鉴定并且分析了一种特异性靶标(例如一种蛋白质、核酸或液体分子)，深入研究了该靶标的生物学，并且通过合理的和/或组合的方法开发了适用于调节该靶标的一种或多种活性的治疗干预。一种或多种(以及任选地所有)所述干预可以包括同时地或顺序地将一种或多种测试剂应用到一种生物系统中。该一种或多种测试剂可以是一种化学实体，例如，具有分子量小于2000道尔顿、小于1000道尔顿或小于500道尔顿的一种分子。该化学实体可以是非聚合的。该一种或多种测试实体可以是一种生物实体，例如一种生物大分子，如脂类、寡核苷酸或蛋白质(例如酶、抗体、或抗体片段、人源化抗体或抗体片段、或展示蛋白质片段的噬菌体或核糖体、或朊病毒)。该生物实体可以是一种病毒或细菌。因此，一些或每种表达分析可以量度一种测试剂对一种生物系统中的非编码RNA的表达谱的作用。一种或多种所述测试剂可以是一种治疗剂。一种或多种所述测试剂可以是一种治疗剂，该治疗剂具有针对一种已知病症的治疗或预防的已知应用。一种或多种所述测试剂可以是一种治疗剂，该治疗剂已经是与一种或多种适应症有关的临床试验(不管是否成功)的主题。然而，一种或多种(以及任选地所有)所述干预可以包括将一个或多个组应用到一种生物系统中，这个或这些组包括电离辐射、连续发射或脉冲电磁辐射(例如可见光、紫外光、红外光)、声能(通过空气或通过一种液体介质递送的)、机械干预(例如施加压力)、电、温度的变化、渗透性以及一种生长介质的渗透强度(tonicity)或pH值的变化、 磁场、流体动力学的变化、以及机械化学的信号转导。因此，至少一些干预可以是已知对该生物系统是有害的干预。由这些有害的干预产生的表达谱可能对鉴定逆转或防止这些有害作用的药剂是有用的。一种或多种所述生物系统可以包括细胞，如哺乳动物细胞，例如人类细胞、兔细胞、或啮齿动物(例如小鼠或大鼠)细胞、或培养的昆虫细胞、两栖动物细胞或鱼细胞系。一种或多种所述生物系统可以包括多种细胞类型的混合物。该干预典型地在培养的哺乳动物细胞上进行。这些哺乳动物细胞可以是干细胞或祖细胞。对于干细胞我们提及能够自我更新并且分化成至少一种另外的专门的细胞类型的细胞。然而，一种或多种所述生物系统可以是一个完整的生物体、离体组织、一个合成系统或转化的细胞。一种或多种所述生物系统可以是转基因的。培养的细胞可以具有同步的或异步的细胞周期。一种或多种所述干预可以是这样一种干预该干预改变干细胞或祖细胞的分化状态或去分化状态，或者引起干细胞或祖细胞专门化或复制，同时维持一个细胞谱系或分化状态的特性。这些表达分析可以重复并且可以根据一些或所有的重复试验编辑被分析的这些实验数据集，这些实验在等效的生物系统上使用等效的干预。在非编码RNA的一个子集的表达之间典型地具有相关性，与之相关的表达数据存储在该表达数据集中。在两种或更多种表达分析之间的一个或一个小数目(例如两个、三个、五个或少于五个、或十个或少于十个)的非编码RNA的表达的变化中，在非编码RNA表达谱的作用之间的相关典型地可以是正相关或负相关。正相关可以包括在两种表达分析的每一种中一种或多种非编码RNA的表达的增加。正相关可以包括在两种表达分析中的每一种中的一种或多种非编码RNA的表达的减少。负相关可以包括在一个第一表达分析中的一种或多种非编码RNA的表达的增加以及在一个第二表达分析中相同的一种或多种非编码 RNA的表达的减少。为了确定对一个对应的干预的非编码RNA表达谱的作用之间的相关，该方法可以进一步包括在一个适合的对照分析中测量非编码RNA的表达谱，该对照分析例如是在其中不进行对应的干预的一个对照分析或包括在进行对应的干预之前测量一种生物系统中的非编码RNA表达谱的对照分析。可以确定表达分析以及相应的对照分析中的非编码RNA表达谱之间的差异。可以从一个测量的表达谱以及一个相应的对照分析的表达谱得到该存储的表达数据集。分析生成的表达数据的步骤可以包括考虑来自对照分析的表达谱。然而， 在一些应用中进行对照分析将是没有必要的。例如，如果在等效的生物系统上进行了多种干预，只分析单独地由每种表达分析产生的表达谱得到的数据集可能是有必要的，以确定对对应的干预的非编码RNA的表达谱的作用之间的相关。有可能的是至少一些所述相关是正相关，例如在两种或更多种表达分析的组中对对应的干预的非编码RNA的表达的作用之间的相似性。分析生成的表达数据集以确定相关的步骤可以包括基于由表达分析产生的表达数据集之间的相似性对表达分析进行分类 (例如聚类或分组)的步骤。有利的是，这可以允许在机制方面的相似性，两种或更多种不同的干预通过该机制对有待鉴定的非编码RNA(典型地在相同的或等效的生物系统上)的表达谱直接或间接具有作用，而不要求有待了解的共享机制的性质。因此，该方法可以是确定两种或更多种干预对一种或多种非编码RNA的表达具有相似作用的一种方法。一种第一干预可以是一个第一治疗实体的应用，具有至少一个已知的第一治疗应用，并且该方法可以是确定对一种第二干预的非编码RNA表达的作用之间存在正相关的一种方法，包括一个第二治疗实体的应用。因此，该方法可以是确定用于一个已知治疗实体(第二治疗实体)的一种可能的新治疗应用(第一治疗应用)的一种方法。该方法可以进一步包括测试一种第二干预是否可应用于一种所述已知的第一治疗应用的治疗的试验。该第一干预可以是一个实体(没有一种已知的第一治疗应用)的应用，但是已知具有适合于部署为一种疗法的药理学以及毒理学特性。因此，该方法可以是确定用于一种治疗实体的可能的新治疗应用的一种方法，该治疗实体已经通过了毒理学试验但是未能在临床试验中发现是有效的或者比一个对照治疗实体是更有效的。有可能的是至少一些所述的相关是负相关，例如可以确定的是在两种或更多种干预对一种或多种非编码RNA的表达具有相反的作用。有利的是，对一种第一干预和一种第二干预的非编码RNA表达谱的作用之间的负相关可能表明在治疗中该第二干预可能对逆转一种或多种该第二干预的作用是有用的。因此，该第一干预可以是已知的对该生物系统具有有害作用的一种干预，例如该第一干预可以是一种毒素的应用。在这种情况下，该方法可以包括鉴定该第二干预，作为用于已知将由该第一干预引起的病症的治疗或预防的一种候选物。因此，多种干预可以包括给予对生物系统有害的一种毒素或一种处理。因此，该方法可以是确定候选干预(例如候选治疗实体)的一种方法的一部分，这些候选干预可以治疗或预防已知可由一种或多种其他的干预引起的病症。该方法可以是确定候选物以治疗或预防已知治疗干预的副作用(例如一种治疗实体或一种放射疗法的应用)的一种方法的一部分。该方法可以是预测一种测试剂的毒性的一个或多个方面的一种方法，例如通过检测由一种第一干预产生的非编码RNA的表达谱与已知对该生物系统具有有害作用的一种干预的表达谱是正相关的，或者与包括给予一种其毒理学的一个或多个方面是已知的药剂的一种干预的表达谱是正相关的。通过确定对对应地在第一测试剂和第二测试剂(或是一种已知的该靶标分子的拮抗剂或拮抗剂的测试剂)的非编码RNA表达谱的作用之间的相关，该方法可以是确定一种第一测试剂是一种第二测试剂或一种特异性目标大分子的候选激动剂或拮抗剂的一种方法。该方法可以包括将对非编码RNA的表达具有相似作用的干预进行分组的步骤。这些生成的表达谱是对于进一步的研究是有用的出发点，以鉴定进一步的治疗实体。该方法可以是确定在与一组干预(例如，一组治疗实体)相关的非编码RNA表达谱的变化方面的一种方法。因此，该方法可以是确定一个化学或生物实体具有对一种生物系统的作用机制的一种方法，该作用机制与生物系统上的另一个化学或生物实体的作用机制是有关的。可以按层次对这些组进行排序。其中一种干预是将一种第二测试剂应用到该生物系统上，并且发现就非编码RNA 表达谱而言应用该第二测试剂的作用与在该生物系统上应用另一种第一测试剂的作用是相关的(正相关或负相关)，该第一测试剂已知对于一个第一病症的治疗或预防是有用的， 可以测试该第二测试剂或通过修饰该第二测试剂获得的测试剂在该第一病症(或与该第一病症相关的病症)的治疗或预防中的效能。可以根据有关病症的治疗或预防对被发现对该第一病症(或与该第一病症相关的病症)的治疗或预防是有效的测试剂进行部署。
在一些实施方案中，进行了在其中同一干预或一组干预在多种不同的生物系统上进行的表达分析。因此，该方法可以使得能够发现仅仅在一些多种不同的生物系统中出现的干预作用之间的相关。在某些实施方案中，该多种不同的生物系统是处于不同的分化或去分化状态(例如不同的发育阶段)的干细胞。因此该方法可以使得能够发现对处于特异性分化或去分化状态的干细胞的干预的作用之间的相关。这个信息对研究发育机制以及干细胞或祖细胞的分化和去分化的机制是有用的。该多种不同的生物系统可以包括处于不同疾病状态的哺乳动物细胞。一种干预可以是引起干细胞或祖细胞分化和去分化、或驱动达到一个特异分化状态或维持处于一个特定的分化状态的干细胞或祖细胞的稳定性的一种干预。该表达谱是与至少一种以及典型地多种非编码RNA (优选地是至少10种，或者更优选地是至少100种非编码RNA)的表达有关的。该表达谱可以是与一种或多种作为标记物起作用的转基因非编码RNA的表达有关的。一个表达谱可以包括一种或多种非编码RNA 的表达水平的定量或定性测量。通过测量一种报道构建体的激活量或激活水平，可以间接确定一种或多种所述非编码RNA的表达水平，该构建体例如是，参入到该生物系统的基因组中或一种特殊的生物系统中以游离基因方式保持(maintenance episomally)的一种转基因报道构建体。该表达谱典型地是与在该生物系统中的在至少一些情况下(例如一种或多种非编码RNA的稳定状态或高峰量)所表达的一种或多种非编码RNA的量有关的。然而， 该表达谱可以，例如与一种或多种非编码RNA的表达的变化率有关。在一些实施方案中，这些表达谱是使用微阵列芯片而获得的。这些非编码RNA典型地包括微小RNA(miRNA)并且可以包括miRNA前体和成熟 miRNA的两者之一或两者。这些非编码RNA可以包括一种或多种小干扰RNA(siRNA)、piwi 蛋白相互作用RNA(piRNA)、核RNA(snRNA)、以及短发夹RNA(shRNA)。这些非编码RNA可以是转基因的。这些RNA的一些或全部可以，例如是转基因RNA，这些RNA作为非编码RNA表达的报道基因而起作用。这些非编码RNA可以是游离基因的，并且该方法可以包括将游离基因的DNA引入该生物系统中的步骤(例如通过用一种病毒感染一种生物系统)，其中可以转录该游离基因的DNA以产生构成绘制图谱的(profiled)非编码RNA的全部或一部分的非编码RNA。可以对一组非编码RNA中的每种非编码RNA测量表达谱，并且该方法可以包括鉴定单独的非编码RNA或该非编码RNA组的一个亚组，这些非编码RNA具有在其上多种干预具有相关作用的表达图谱。可以通过本发明的方法鉴定具有相关作用的多种干预，因此使得在一个非编码 RNA组和单独的非编码RNA或在该组之内的非编码RNA亚组的表达谱上具有相关作用的干预两者成为可能，该组具有受多种有待鉴定的干预影响的表达水平。具有相关作用的多种干预可以是以前已知具有相关作用机制的干预，例如多种干预可以包括已知或被认为具有相同的或相似的作用机制的药剂(例如一类药物)的给予。 因此，本发明提供了鉴定具有受多种干预影响的表达水平的单独的非编码RNA或一个非编码RNA亚组的一种方法。然后可以选择该生成的鉴定的单独的非编码RNA或鉴定的非编码RNA亚组，用于在进一步的表达分析中使用，在这些分析中测量了一个减少的非编码RNA组的表达谱，该减少的非编码RNA组包括仅仅一些非编码RNA组、包括或任选地其组成为至少该鉴定的单独的非编码RNA或鉴定的非编码RNA亚组。由此，可以确定进一步的干预对该减少的非编码 RNA组的表达谱的作用、以及进一步的干预对该减少的非编码RNA组的表达谱的作用与所述多种干预对该减少的非编码RNA组的表达谱的作用之间的相关。因此，随后的分析以及试验可以采用较少的非编码RNA，这样减少了成本并且增加了生产量。例如，具有在其上一类治疗剂具有相关作用的表达水平的一个减少的非编码RNA组可以被用于筛选候选药剂、 或者用于发现新颖的在治疗上有用的药剂、抑或用于针对已知的治疗剂鉴定新的适应症。可以确定一个非编码RNA组或一个非编码RNA亚组的表达水平与生物干预的作用之间的区分的关联性。该方法可以包括对该组或该亚组之内的非编码RNA进行分级的步骤 (依赖于它们与生物干预的作用之间的区分的关联性)。该方法可以包括对一种生物干预 (或对非编码RNA的表达具有相关作用的一组生物干预)的非编码RNA组或亚组中的非编码RNA的表达的作用进行分级的步骤。由此产生的等级可以用来鉴定生物干预的作用之间的相关可以通过统计数学方法(例如主成分分析)来鉴定相关。可以将一组编码的一个指定给一种生物干预对多种特异性非编码RNA的每一种的表达的作用，这些编码指示该生物干预对对应的非编码RNA的表达的作用的特性。可以分析这些生成的编码来鉴定相关。本发明还扩展到具有非编码RNA的分析装置(例如一种试剂盒或一种具有固定在其中的非编码RNA的固相载体)，这些非编码RNA由通过本发明的方法所获得的所述减少的非编码RNA组组成。


参照以下图形，现在将展示本发明一个示例实施方案，其中图1是一个根据本发明的一种方法的流程图；图2是来自针对一种生物干预(a)以及针对一个变量(b)的主成分分析的结果的绘图；图3是给出了 11个miRNA就它们的ρ值以及q值而言的统计等级的一个表格；以及图4是来自显示(a)标记的辨别性miRNA亚组的主成分分析的数据、以及(b)来自显示来自不同干预类型的表达数据如何聚类的四个干预类型的数据的绘图。一个示例实施方案的详细说明在本发明的一个实例应用中，准备了一个miRNA表达数据集(是源于一个测量的非编码RNA表达谱的一个表达数据集的一个实例)的数据库。参见图1，通过已知的方法培养了适合的人类细胞2并且对这些培养的细胞给予一种测试剂4。然后使用处理过的细胞的样品在做出干预之后的一个或多个时期测量了一个miRNA表达谱6，以确定在处理过的细胞中许多miRNA的每一种的表达水平。下面展示了用于测量这些miRNA表达谱的两种可替代的方法，微阵列芯片分析和定性实时PCR分析。(l)miRNA微阵列芯片和数据分析使用一种来自丹麦Exiqon A/S of Vedbaek的基于柱的试剂盒分离了药物处理(η=3)与对照处理细胞(n = 3)的总RNA。通过miRNA微阵列芯片分析了两微克的来自每个样品的总RNA。包括标记、杂交、扫描、归一化以及数据分析的miRNA微阵列芯片分析从许多来源(例如从Exiqon A/S)是可商购的。简言之，使用Bioanalyser 2100微流体平台进行了 RNA质量控制(Bioanalyser是Agilent科技公司的一个商标)。遵照所提供的说明，使用来自Agilent的完整标记Hyb试剂盒(Complete Labelling Hyb Kit)来标记样品。(2)定量实时PCR正如以上选项(1)，使用来自Exiqon的一种基于柱的试剂盒并且遵照制造商的说明提取了所有细胞RNA。如由制造商(美国加利福尼亚州福斯特市的Applied Biosystems) 所描述，通过iTaqMan实时PCR进行了 miRNA的定量。(TaqMan是罗氏分子系统公司的一个商标)。简言之，使用了 10微克的RNA作为用于逆转录(RT)的模板，该逆转录使用TaqMan 微小RNA逆转录试剂盒以及miRNA特异性茎环引物(Applied Biosystems)。将RT产物的一个等分部分(1. 5微升)引入到20微升的PCR反应混合物中，在96孔板内在ABI 7900HT 热循环仪(Applied Biosystems)上在95°C下孵育10分钟，然后在95°C下进行40个循环， 每个循环进行15秒，并且在60°C下进行1分钟。基于U48 RNA(—种小的、非编码RNA)表达(或GAPDH，如果发现U48随药物处理而变化)的值在不同样品之间将靶基因表达归一化。在每种情况下，将该生成的miRNA表达水平存储为表达数据集8。优选地进行了大量的表达分析。典型地，以这种方式将许多(例如数百或数千)测试剂引入到细胞培养物中并且进行了分析，以创建一个miRNA表达数据的数据库。一旦可以获得miRNA表达数据集的一个适当大的数据库，就分析这些表达数据集 10来确定每一测试剂对miRNA表达的作用之间的相关并且产生测试剂的分层聚类，这些测试剂对miRNA表达谱具有相似的作用。用于确定核酸表达数据集之间的相关的方法对本领域的普通技术人员来说是熟知的。例如，一种方法是将从Exiqon A/S获得的GI5R格式的微阵列芯片数据输入到一个电子表格中。(GI^R是Gen印ix6软件使用的数据格式，可以从美国加利福尼亚州尤宁城的Molecular Devices公司获得。Gen印ix是Molecular Devices公司的一个商标)。对照miRNA芯片(由Gem5Pixe软件指示为阴性标志)上提供的质量控制以及校准点对每一 miRNA的斑点强度进行了分析。信号强度50以下的值被提出为0。对用于每一 miRNA捕获探针种类的四个重复点的每个，计算了背景校正斑点强度的中位值并且将其输入到TMeV 微阵列芯片分析软件中，该软件进行分层聚类和/或本领域的普通技术人员熟悉的其它统计分析。(TMeV由Dana-Farber癌症研究所在www. tm4. org提供)。可替代地，可以将GPR格式的表达数据输入到Genespring GX软件(从Agilent Technologies 公司可获得)中。(Genespring GX 是 Agilent Technologies 公司的一个商标)，可以将GI^R格式的表达数据归一化到第75个百分位数进而使用分层聚类以及内置于 Genespring GX中的其它统计工具进行处理。其中在两种或更多种测试剂对一种或多种miRNA的表达的作用之间发现了正相关，这可能指示这些测试剂共享相同的、或有关联的作用机制。因此，发现了对miRNA表达谱具有相似作用的这些测试剂(已知作为用于一种病症的治疗的药剂)可以被鉴定12，作为用于治疗相同的、或有关联的病症的候选物。这可能对促进已经被鉴定为对一种治疗应用是潜在有用的药物的重新定位是有用的。可以对这些候选测试剂进行测试以确定它们对于相同的或有关联的病症的治疗是否可能是有用的、或者是否可以被用作进一步研究的出发点。例如，可能使用理性的或组合的设计方法学对它们进行修改，可能制备并且测试一种模拟化合物等等。可以对候选测试剂进行测试14以确定它们是否适合于用作治疗实体，并且如果是适合的，则将它们部署为治疗实体16。对一种或多种miRNA的表达具有相似作用的一些测试剂进行分组是特别有用的， 因为根据对miRNA表达的作用的这种分类可以被反映在相似或相关的作用机制中，不论在 miRNA的表达水平上是直接的或间接的。在其中鉴定出负相关的一种测试剂可以被鉴定为一种候选物，用于防止、减轻或避免一种另外的测试剂或其他干预的一种或多种不希望的影响。因此，相对于具有不希望的作用的另一种测试剂，已知对一种或多种miRNA的表达具有相反作用的一种测试剂可以被考虑为用于治疗或预防这种不希望的作用的一种候选实体。有利的是，进行了 miRNA表达分析以评定一系列干预(包括除了给予化学或生物实体之外的干预)的作用。例如，可以用对细胞有害的紫外光、电离辐射、声波以及其他干预处理细胞。当能够鉴定出一种测试剂对一种或多种miRNA的表达具有与这样的干预的作用是负相关的作用时，该测试剂可能是用于治疗或预防由相应的体内干预导致的不希望的作用的一种候选物。这可能对于鉴定用于预防由紫外光或来自放射疗法的副作用引起的损害的药剂是有用的。该方法可以应用于许多测试剂(例如，小化学实体、肽、模拟肽或聚核苷酸的组合文库)的高通量筛选。随着进行新的表达分析，可以将生成的表达数据集与以前存储的表达数据集进行比较，以寻找筛选的测试剂以及以前已经分析的药剂的作用之间的相关。通过使用miRNA表达数据集的一个大型数据库，典型地最好地使用了该方法然而，对于一些特殊的应用，可能仅仅必需具有少量的miRNA表达数据集或甚至一个miRNA表达数据集，可用于与新的分析产生的miRNA表达数据集进行比较。这在发现对miRNA的表达具有作用的药剂的高通量筛选中可以是有关联的，该作用与一个特定的鉴定的作用正相关或负相关，例如是已知或被怀疑为对miRNA表达具有显著作用的一种药剂的作用。因而，本发明是基于在作用机制方面的相似性的原理，因此可以通过它们对 miRNA(以及可能地其它非编码RNA)表达的作用的比较分析而发现测试剂(如化学实体以及生物制品)的实际应用，而不必了解这些测试剂影响miRNA表达谱的机制。这与传统的药物发现以及药物重新定位策略形成直接对比，在这些策略中深入研究了一种作用机制来鉴定用于筛选分析的药物靶标以发现与该药物靶标具有所希望的相互作用的药剂。实验发现以及它们的含义采用描述的这些方法，基于miRNA表达数据的分组，我们已经确定的是，有可能确定干预的治疗应用的潜在模式。此外，可以采用该方法来鉴定某些miRNA，这些miRNA具有指示被筛选的干预的某些治疗应用的表达水平。这些指示性miRNA将使得将来的干预筛选能够分析较小组的miRNA表达水平，以鉴定被筛选的这些干预的潜在治疗应用，而不是整个miRNA文库。下面给出了使用选择的一个miRNA小组来确定对于一种干预的潜在治疗用途的一个实例。
在此描述的实验过程中，作为对照，用一种包括二甲基亚砜(或DMS0)以及磷酸盐缓冲盐水的药物溶剂混合物对一群细胞进行处理。假定该药物溶剂混合物对miRNA的表达将不会有作用，而如果它确实有作用，则它与被测试的药物相关的表达谱中的任何一个将不会是一致的。然而，发现了该药物溶剂混合物具有与HDAC抑制剂一致的miRNA表达谱。 随后，从一篇文献综述发现DMSO已经显示为一种HDAC抑制剂，证实了使用本发明的这些方法可以确定药物的未知的潜在治疗特性。材料与方法使用标准方法培养了 HeLa细胞。将这些细胞分散到DMEM培养基中。对培养基进行抽吸并且用适当量的磷酸盐缓冲盐水(PBS，溶解在800毫升蒸馏水中的8克NaCUO. 2克KCl、1· 44克Na2HPO4以及0. 24克KH2PO4)洗涤细胞单层。对PBS进行抽吸。将所讨论的测试剂施用到这些细胞上并且孵育48小时。RNA 提取在以下的步骤中使用来自Exiqon的基于柱的试剂盒分离和纯化了来自这些细胞的 RNA。对这些细胞在其上生长的培养基进行抽吸并且用一个适当量的PBS洗涤该细胞单层。进一步抽吸PBS。将350 μ L的溶解液直接添加到一个培养皿上。通过轻拍该培养皿并且使缓冲液在该培养皿的表面涡旋五分钟而使这些细胞溶解。然后将该溶解产物转移到一个微型离心管中。将200 μ L的95% -100%的乙醇添加到该溶解产物中并且通过涡旋混合10秒。使用该试剂盒中所提供的这些离心管之一组装了一个柱子。将600 μ L的溶解产物/乙醇施加到该柱子上并且在14000Xg下离心1分钟。丢弃流动物(flow-through)并且用它的收集管重新组装旋转柱。将所提供的400 μ L的洗液施加到该柱子上并且在14000 Xg下离心1分钟。丢弃流动物并且用它的收集管重新组装旋转柱。通过添加另一个400 μ L的洗液对该柱子洗涤两次并且在14000 Xg下离心1分
钟。丢弃流动物并且用它的收集管重新组装旋转柱。使该柱子在14000 Xg下旋转两分钟以彻底对树脂进行干燥并且丢弃该采集管。将该柱子组装在由试剂盒提供的一个1. 7毫升的洗脱管中。将50 μ L的洗脱缓冲剂添加到该柱子中并且在200 Xg下离心两分钟，之后在14000Xg下离心一分钟。该生成的纯化RNA样品可以在-20°C下储存几天。为了样品的长期储存，将样品储存在_70°C。(l)miRNA微阵列芯片和数据分析标记使用来自Agilent的一种标记试剂盒对纯化的RNA样品进行标记。在Ix TE (PH 7. 5)中将总RNA样品稀释到50ng/ μ L。将2 μ L的稀释的总RNA添加到一个1.5mL的微型离心管中并且置于冰上。刚好在使用之前，将0.4yL IOX小牛肠磷酸酶缓冲液、1. 1 μ L无核酸酶水以及0. 5 μ L小牛肠磷酸酶轻轻混合以制备一种小牛肠碱性磷酸酶母料混合物。将2微升的该小牛肠碱性磷酸酶母料混合物添加到每一个样品管中，达到4 μ L的总反应体积，并且通过移液管轻轻混合。将该反应体积在一个循环水浴中在37°C下孵育30 分钟。将2. 8μ L的100% DMSO添加到每一个样品中。将样品在一个循环水浴中在100°C 下孵育5-10分钟并且然后立即转移到一个冰浴中。将10XT4 RNA连接酶缓冲液加热到37°C并且旋转直到所有沉淀物已经溶解。刚好在使用之前，将1 μ L的10 X "Γ4 RNA连接酶缓冲液、3 μ L的菁蓝3_pCp以及0. 5 μ L的"Γ4 RNA连接酶轻轻混合以制成一种连接母料混合物并且置于冰上。将4. 5μ L的该连接母料混合物添加到每个样品管中，达到11. 3μ L的总反应体积。通过移液管轻轻地混合样品并且旋转减慢。然后在一个循环水浴中16°C下孵育这些样品两小时。然后在45°C _55°C使用一个真空浓缩器干燥这些样品，并且如果当轻拍该管这些沉淀物没有移动或扩散时则确定这些样品是干燥的。^将125 μ L的无核酸酶水添加到含有冷冻干燥的由Agilent Kit提供的10XGE阻断剂的管形瓶中并且进行混合。该干燥的样品被再悬浮在18 μ L的无核酸酶水中将4. 5 μ L的该10XGE阻断剂添加到每一个样品中。将22. 5μ L的2XHi-RPM杂交缓冲液添加到每一个样品中并且混合均勻。将这些生成的样品在100°C孵育5分钟，并且然后立即转移到一个冰水浴中保持另外的 5分钟。将一个干净的滑动垫圈(gasket slide)装载到Agilent SureHyb室底部并确保该滑动垫圈与该室底部平齐。将该杂交样品适当地分配到该垫圈上以确保没有气泡存在。将一个芯片的活性面朝下放置到SureHyb滑动垫圈上并且与SureHyb室的盖进行组装以形成一个组装的室。将该组装的室放入设置在的一个杂交箱中并且在该温度以及20rpm下旋转20小时。随后使用提供的GE洗涤缓冲液在扫描之前冲洗这些芯片。(2)定量实时PCR制备RT反应物母料混合物将这些组分从冰上的冻结状态解冻。通过混合0. 15 μ L的dNIPs (IOOmM)、1 μ L的 MultiScribe 逆转录酶(MultiScribe 是 Applera 公司的一个商标)(50U/μ L)、1. 5 μ L 的 IOX逆转录缓冲液、0. 19 μ L的RNA酶抑制剂(20U/ μ L)、4. 16 μ L的无核酸酶水制备了 RT 反应物母料混合物，并且然后在冰上储存。值得注意的是上面举例的这些体积是基于15 μ L 的RT反应物的并且按照有待进行的RT反应的量而成比例地增加。制备RT反应物对于每15 μ L的RT反应物，将7 μ L的RT母料混合物与5 μ L的总RNA合并。将 RT引物在冰上解冻并且将3 μ L的RT引物添加到在一个96孔板的孔中的12 μ L的RT母料混合物/总RNA中。将该板保持在冰上直到被加满进而将其放入热循环仪中。热循环仪中的步骤在16 °C下持续30分钟
在42°C下持续30分钟在85 °C下持续5分钟只要方便，可维持在4°CPCR 扩增对于每个孔，将10 μ L的Taqman 2Χ通用PCR母料混合物与7. 67 μ L的无核酸酶水、1 μ L的20 X Taqman微小RNA分析混合物以及1. 33 μ L的来自前面步骤的RT产物进行混合。当所有的孔被加满时，将该板用一个光学粘性罩密封并且进行离心以除去任何气泡。然后将该板载入一个能够实时的热循环仪/PCR仪中并且然后进行以下程序在95°C下持续 10 分钟(AmpliTaq Gold Enzyme 的活化)40 X (95 °C 持续 15 秒，60 "C 持续 6O 秒)。数据分析对于每个板，对照掺加miRNA斑点将来自这两种技术的数据归一化，允许比较来自分开的芯片的数据。使用主成分分析(一种本领域的普通技术人员十分理解的标准技术)对归一化的数据进行了分析以鉴定miRNA表达谱之间的相关，并且任何观察到的数据的分组被确定是施用于原始细胞上的特定测试剂的作用的结果(根据单独的miRNA的表达)。图1是一个用于获得微小RNA的表达谱的一种方法的流程图。图2显示了在主成分分析之后的一个表达谱的实例。部分(a)显示了 miRNA表达的总的多维表达数据集的三个主要组分的三维投影图并且展示了对于一个处理类型的 miRNA表达数据的聚类。部分(b)显示了用于单一 miRNA表达的数据散布(data spread) 0图3显示了用从hsa-miR-1到hsa-miR-11标记的有差别的miRNA的统计分级11。 P值是一个结果是否是统计学显著的或可能性的结果的标准统计测试值(通常给定的一个 P值为< 0. 05)，并且q值是针对多重测试进行校正的ρ值并提供了错误发现率的一种度量。所有显示的P值都远远小于0.05。图4(a)显示了对于多种miRNA的miRNA表达的多维数据集的三个主要组分的一个投影图并且miRNA的聚类指示了潜在的治疗应用。(b)显示了对于多种miRNA的miRNA 表达的多维数据集的三个主要组分的一个投影图，其中这些单独的miRNA被涂暗色调以指示使用了在它们的表达中施加了生物干预的治疗应用。可以看出，这些结果被清晰地分组并且这种分组的根据是施加到在其中表达这些 miRNA的细胞的生物干预的治疗用途。换句话说，有可能确定的是，这些分组的生物干预对于它们被施加到其上的细胞具有相似的作用机制，并且该共享的机制导致了对miRNA表达水平的相似作用。具有相似作用机制的生物干预可能还具有相似的治疗特性并且因此它们可能具有相似的治疗应用。图3以及图4中呈现的数据证明，对于这些测试的生物干预，用于相似治疗应用的生物干预(例如抗代谢剂)的miRNA表达的三维数据集的三个主要组分的投影图确实在一起分组，并且证明具有不同治疗用途的生物干预(例如表观遗传学修饰剂)的分组是分开地进行分组的通过进行许多生物干预以及分析miRNA表达谱中的这些作为结果的变化可以建立一个miRNA表达谱的数据库。这样一个数据库将使一种未检验的生物干预的治疗用途或潜在的将来的治疗用途的鉴定成为可能(通过对所述的未检验的生物干预的一个miRNA表达谱与该数据库中的未检验的生物干预的一个miRNA表达谱进行比较并且确定所述表达谱是否落入这些治疗应用分组之一)。如果出现这样一种相关，则对于该特异性治疗应用可以考虑该未检验的生物干预。 此外，建立一个miRNA表达数据的数据库可以揭示一个指示某一治疗应用的某些 miRNA的子集。一旦鉴定了所述指示性miRNA的子集，可以通过看该指示性miRNA表达谱的子集的表达图谱而不是这些细胞产生的全范围的miRNA来进行测试，包括用来发现潜在治疗应用的新的生物干预的将来的测试、或者用于新的治疗应用的已知的生物干预的测试。还可以采用miRNA表达数据的数据库来确定某些miRNA的子集，这些miRNA的表达水平用于在这些生物干预之间或这些生物干预的组之间进行区分是最有用的，这些生物干预是已知的或被假设具有相似的作用模式。可以对miRNA进行分级(按照用于在这些生物干预之间或这些生物干预的组之间进行区分的它们的表达水平的关联性的顺序)，这些生物干预是已知的或被假设具有相似的作用模式。可以对这些miRNA指定一个数值，该数值指示了用于在这些生物干预之间或生物干预的组之间进行区分的它们的表达水平的关联性，这些生物干预是已知的或被假设具有相似的作用模式。例如，该数值可以与一种 miRNA的表达水平对主要成分的变化的贡献有关。作为一个替代方案，或除此之外，使用统计方法(如主成分分析)的miRNA表达谱的比较、一种生物干预对一个有限的miRNA(例如10-50)的组的每种miRNA的表达的作用可以被鉴定并且被用于将一个编码(选自一组编码)指定给该生物干预对每个对应的 miRNA的表达的作用。可以对这些生成的编码进行比较以鉴定在作用方面的相似性。例如，对于每种生物干预(例如对于每种筛选的化合物)可以指定一个3位二进制数，作为对每种分级的miRNA的一个编码，这是基于1.如果该miRNA的表达响应于该生物干预而没有变化(在实验性变异性的正常范围之内)，则将第一个位设为0。如果表达已经显著变化，则将第一个位设为1。2.如果鉴定出一个在表达水平方面的变化并且该变化是增加，则将第二位设为 1。如果由该生物干预导致的变化是减少，则将第二位设为0。3.如果在表达水平方面的变化大于4倍，则将第三位设为1，否则将其设为0。因此，一种生物干预水平对miRNA表达的作用被指定了一个具有五个可能值之一的编码1.在表达方面没有变化-0002.在表达方面有大的增加-1113.在表达方面有小的增加-1104.在表达方面有大的减少-1015.在表达方面有小的减少-100一种生物干预(例如一种特定化合物的给予)对一组miRNA的表达水平的作用可以通过有关编码进行表征，允许不是立即从主成分分析中看出表达水平方面的变化的鉴定，允许对这些生物干预的相似性进行评分并且使生成的表达数据通过目测可理解的替代方法。对一种生物干预的作用进行表征并且确定对不同生物干预的miRNA表达的作用之间的相关的另一种方法是进行一种表达分析以确定一种生物干预对一组miRNA(典型地是10到50)中的每一种的表达的作用并且按照在这个组中的作用的顺序对这些miRNA 进行分级，例如，按照从在该组中在表达方面具有最大增加的miRNA到在该组中在表达方面具有最大减少的miRNA的顺序，或反之亦然。这些生成的等级指示了这些特定的生物干预的作用。因此，可以测量其他的生物干预对该组miRNA的作用并且按该作用的顺序对该组中的这些miRNA进行分级。可以对生成的等级进行比较以使有待鉴定的生物干预的作用之间的相关成为可能。可以提供包括对测试这些指示性miRNA的子集可操作的板的一种试剂盒，以显著地增加效率和速度，用这样的效率和速度可以筛选生物干预(针对潜在的新颖的治疗应用)。在此处揭露的本发明的范围之内可以做进一步的变更以及修改。参考文献1. Xie, X. , et al. , Systematic discovery of regulatoty motifs in human promoters and 3' -UTRs by comparison of several mammals. Nature,2005. 434(7031) p.338-452. Lim, L. P. , et al. , Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature,2005. 433 (7072) :p. 769-733. Calin, G. A. , et al. , MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc Natl Acad Aci USA,2004. 101 (32) p. 11755-60。
权利要求
1.一种包括以下步骤的方法(1)进行多种表达分析，每种表达分析包括以下步骤在一种生物系统上进行一种干预，测量由该干预产生的在该生物系统中的非编码RNA的一个表达谱，并且存储源于该测量的表达谱的一个表达数据集，所述这些表达分析涉及多种不同的干预和多种不同的生物系统的两者之一或两者；以及(2)分析生成的表达数据集以确定在两种或更多种表达分析的组中对对应的干预的非编码RNA表达谱的作用之间的相关，这些表达分析涉及不同的干预或不同的生物系统的两者之一或两者。
2.根据权利要求1所述的一种方法，其中一种或多种所述干预包括将一种测试剂施用到一种生物系统中。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的一种方法，其中一种干预包括将多种测试剂施用到一种生物系统中。
4.根据权利要求1至权利要求3任一项所述的一种方法，其中一种或多种所述生物系统包括培养的细胞。
5.根据以上权利要求的任一项所述的一种方法，其中至少一些所述相关是正相关。
6.根据权利要求5所述的一种方法，进一步包括基于由表达分析生成的表达数据集之间的相似性对表达分析进行分类的步骤。
7.根据权利要求6所述的一种方法，进一步包括确定两种或更多种不同干预通过一种相似的机制对非编码RNA的表达谱具有直接或间接作用的步骤。
8.根据权利要求5至权利要求7的任一项所述的一种方法，其中一种第一干预是将一个第一治疗实体施用到一种生物系统中，该治疗实体具有至少一种已知的第一治疗应用， 并且该方法包括确定对一种第二干预的非编码RNA表达的作用之间存在正相关的步骤，包括一个第二治疗实体的应用。
9.根据权利要求8所述的一种方法，进一步包括测试该第二治疗实体是否可应用于所述第一治疗应用。
10.根据以上权利要求的任一项所述的一种方法，其中至少一些所述相关是负相关。
11.根据权利要求10所述的一种方法，其中一种第一干预可以是对该生物系统具有有害作用的一种干预，并且一种第二干预被确定为对非编码RNA的表达谱具有与该第一干预的作用是负相关的作用，该第二干预被鉴定为一种用于治疗或预防已知由该第一干预引起的一种病症的候选物。
12.根据以上权利要求的任一项所述的一种方法，该方法包括确定一组非编码RNA的表达水平与在生物干预的作用之间的区分的关联性。
13.根据权利要求12所述的一种方法，该方法包括，对于多种生物干预的每一种，根据对应的生物干预对对应的非编码RNA的表达的作用将一组非编码RNA内的这些非编码RNA 进行分级，并且比较这些生成的等级以鉴定生物干预对非编码RNA的表达的作用之间的相关。
14.一种确定用于治疗或预防已知的治疗干预的副作用的候选治疗实体的方法，包括以上权利要求的任一项所述的方法。
15.一种预测一种测试剂的毒理学的一个或多个方面的方法，包括权利要求1至14的任一项所述的方法。
16.一种确定第一测试剂是第二测试剂或特异性靶标大分子的一种候选激动剂或拮抗剂的方法，包括权利要求1至14的任一项所述的方法。
17.一种根据以上权利要求的任一项所述的方法，其中进行了多种表达分析，在这些表达分析中在多种不同的生物系统上进行了相同的干预或一组干预
18.根据权利要求17所述的一种方法，其中这些不同的生物系统包括处于分化或去分化的不同阶段的哺乳动物干细胞。
19.根据以上权利要求的任一项所述的一种方法，其中表达谱与多种非编码RNA的表达是相关的。
20.根据以上权利要求的任一项所述的一种方法，其中这些非编码RNA是miRNA。
21.根据以上权利要求的任一项所述的一种方法，其中这些所述的表达谱是针对一组非编码RNA中的每种非编码RNA进行测量的，并且该方法包括鉴定单独的非编码RNA或该非编码RNA组的一个亚组，这些非编码RNA具有在其上多种干预具有相关作用的表达图谱。
22.根据权利要求21所述的一种方法，其中对在一个非编码RNA组和单独的非编码 RNA或在该组之内的非编码RNA亚组的表达谱上具有相关作用的干预两者都进行了鉴定， 该非编码RNA组具有受所述多种干预影响的表达水平。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的一种方法，其中具有相关作用的多种干预是以前已知具有一种有关的作用机制的干预，并且该方法是鉴定具有受所述多种干预影响的表达水平的单独的非编码RNA或一个非编码RNA亚组的一种方法。
24.根据权利要求21至23的任一项所述的一种方法，其中该生成的鉴定的单独的非编码RNA或鉴定的非编码RNA亚组被选择用于在进一步的表达分析中使用，在这些进一步的表达分析中测量了一个减少的非编码RNA组的表达谱，该减少的非编码RNA组仅仅包括该非编码RNA组的一些，至少包括这些鉴定的单独的非编码RNA或鉴定的非编码RNA亚组。
25.根据权利要求M所述的一种方法，其中所选择的减少的非编码RNA组被采用来进行筛选候选实体，以发现新颖的在治疗上有用的实体或针对已知的治疗实体鉴定新的适应症。
26.具有非编码RNA的分析装置，包括一个通过权利要求25所述的方法而获得的所述的减少的非编码RNA组。
全文摘要
在此披露了一种方法，该方法包括以下步骤进行多种表达分析，每种表达分析包括以下步骤在一种生物系统上进行一种干预，测量由该干预产生的在该生物系统中的非编码RNA的一个表达谱，并且存储源于该测量的表达谱的一个表达数据集，所述这些表达分析涉及多种不同的干预和多种不同的生物系统的两者之一或两者；以及分析生成的表达数据集以确定在两种或更多种表达分析的组中对对应的干预的非编码RNA表达谱的作用之间的相关，这些表达分析涉及不同的干预或不同的生物系统的两者之一或两者。
文档编号C12Q1/68GK102356163SQ201080012901
公开日2012年2月15日 申请日期2010年1月19日 优先权日2009年1月19日
发明者C·R·希利尔, J·F·戈登, J·P·埃斯蒂贝罗, V·奥布赖恩 申请人:西斯特米克苏格兰有限公司