使用人干细胞样细胞和代谢组学比率预测药物的人发育毒性的制作方法
【专利说明】使用人干细胞样细胞和代谢组学比率预测药物的人发育毒 性
[0001] 继续申请数据
[0002] 本申请要求2012年11月2日提交的美国临时申请序列号61/721，746和2013年 5月24日提交的序列号61/827, 407的权益，每份申请通过引用结合在此。
[0003] 政府资助
[0004] 本发明是由美国国家科学基金会（National Science Foundation)资助的在批准 号IIP-1058355下由政府支持进行的。政府在本发明中享有某些权利。
[0005] 背景
[0006] 出生缺陷在所有人类出生的大约3%中有报导，并且是美国婴儿死亡率的最大 起因（霍耶特（Hoyert)等人，2006,小儿科（Pediatrics) ;117:168-183)。暴露于有毒 化学品和物理药剂被认为对所有出生缺陷的大约3%负责（国家研宄委员会（National Research Council)，2000，"发育毒理学和风险评估科学前沿（Scientific frontiers in developmental toxicology and risk assessment)"，华盛顿，DC:美国学术出版社（The National Academies Press))。
[0007] 理解的是，发育毒性可引起出生缺陷，并且可产生胚胎致死现象、子宫内的生长 限制（IUGR)、形态发育异常（例如骨骼畸形）和功能性毒性，这可导致认知障碍例如孤 独症。化学品暴露在这些障碍的发作中可发挥的作用受到越来越多关注。确实，估计 所有出生缺陷的5%至10%是由在子宫中暴露于诱导胎儿发育异常的已知致畸剂引起 (贝克曼（Beckman)和布伦特（Brent)，1984,药理学年度评论（Annu Rev Pharmacol); 24:483-500)。对化学品暴露可在产生出生缺陷中发挥的显著和可预防的作用存在关 注（克劳迪奥（Claudio)等人， 2〇01，环境卫生展望（Environm Health Perspect); 109:A254-A261)。
[0008] 然而，这个关注难以评价，归因于缺少用于测试市场上超过80, 000种化学品加 上每年引进的新的2, 000种化合物的发育毒性的稳健和高效的模型（总审计局（General Accounting Office) (GAO)，1994,有毒物质控制法案：对使TSCA更有效的立法变化的初 步观察（Toxic Substances Control Act:Preliminary Observations on Legislative Changes to Make TSCA More Effective)，证言，1994年 7 月 13 日，GA0/T-RCED-94-263) 〇 已经对这些化合物中少于5%进行了生殖结局的测试，并且对甚至更少的进行了发育毒性 测试（环境保护办事处（Environmental Protective Agency) (EPA)，1998,化学危害性数 据可用性研宄（Chemical Hazard Data Availability Study)，污染预防和毒素办公室 (Office of Pollution Prevention and Toxins))。尽管已经在使用动物模型系统以评估 毒性上进行了一些尝试（皮尔斯玛（Piersma)，2004,毒物学通讯（Toxicology Letters); 149:147-53)，在子宫中人的敏感度的内在差异已限制了此种模型的预测有用性。
[0009] 毒性，具体地发育毒性，通过药物发育过程在化合物演进中也是一个主要障碍。当 前，毒性测试是在动物模型上进行的，作为预测化合物暴露的不利影响，具体地对人胚胎和 胎儿中的发育和器官发生的不利影响的一个手段。有助于FDA批准调查中的新的药物的 大部分流行模型是在兔和大鼠上的整体动物研宄（皮尔斯玛（Piersma)，2004,毒物学通讯 (Toxicology Letters) ;149:147-53)。体内研宄依赖于在孕期和胚胎/胎儿发育的不同 阶段（妊娠的第一周、器官发生阶段和整个妊娠期）将化合物给予至怀孕的动物。然而， 归因于生化途径上的不同，这些体内动物模型受在发育过程中对化学品化合物的响应上缺 少动物和人之间生物相关性的限制。在趋势例如剂量敏感性和化合物的药代动力学加工 上常显现物种不同。根据报导的文献，动物模型在预测人对化合物的发育响应上大约60% 是生效的（格里夫斯（Greaves)等人，2004,自然评论：药物发现（Nat Rev Drug Discov); 3:226-36)。因此，存在对人的直接预测体外模型的需要。
[0010] 在I960年代的萨力多胺（thalidomide)悲剧强调了临床前发育毒性测试的重要 性、物种间在对可能致畸化合物的响应上的显著不同、以及此类化合物可如何影响发育中 的胎儿。萨力多胺在啮齿动物模型上的发育毒性测试未指示该化合物在人类中的致畸可 能性。超过10, 〇〇〇个在子宫暴露后出生的儿童具有严重的出生缺陷。当前用于检测发育 毒性的临床前模型在人、大鼠和兔（针对发育毒性测试的最常用物种）上具有不同的观察 到的发育毒性一致性程度，对已知人致畸剂具有大约70% -80%-致性（达斯顿（Daston) GP和努森（Knudsen) TB，2010，"基本概念、当前调控设计和解释（Fundamental concepts， current regulatory design and interpretation) "，于：努森（Knudsen) TB，达斯屯页 (Daston) GP，编辑，综合毒物学（Comprehensive Toxicology)，第12卷，第2版，纽约：爱思 唯尔（Elsevier)，第3-9页）。数十年来这些体内动物模型需要大数目的动物、公斤数量的 测试化合物，并且既耗时又花钱。归因于这些模型的成本和复杂性，对于开发者来说在该化 合物的生活周期中对一个阳性发育毒性信号产生反应的安全性评估常发生太晚，并且可导 致该化合物或化合物系列的研发终止。尽管这些动物模型是并且长久以来被认为是调控黄 金标准，多个物种对一种化合物的响应的不同可导致漏失发育毒性的信号和生物误解。同 样地，需要开发新一代工具，使用人细胞用于评估与化学品暴露相关的可能的发育毒性风 险。适当的测试也将减少产物发育时间，控制成本，并且积极地响应降低动物使用的要求。 [0011] 因此，需要相关的、预测的、准确的低成本以及快速的人体外测试，用于可靠地测 定药剂和其他化学品化合物的发育毒性。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明包括一种将测试化合物分类为致畸剂或非致畸剂的方法，该方法包括：在 存在该测试化合物的情况下和在不存在该测试化合物的情况下培养未分化的人干细胞样 细胞（hSLC);测定在存在该测试化合物的情况下培养的未分化的hSLC的培养基中鸟氨酸 或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况下培养的 hSLC中的情况进行比较；测定胱氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变，在未 分化的hSLC的培养基中在存在该测试化合物的情况下培养，与在hSLC中在不存在该测试 化合物的情况下培养进行比较；并且测定鸟氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍 数改变与胱氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变的比率，其中少于或等于约 0. 88的比率指示了该测试化合物的致畸性并且大于约0. 88的比率指示了该测试化合物的 非致畸性。
[0014] 本发明包括预测一种测试化合物的致畸性的方法，该方法包括：在存在该测试化 合物的情况下和在不存在该测试化合物的情况下培养未分化的人干细胞样细胞（hSLC); 测定在存在该测试化合物的情况下培养的未分化的hSLC的培养基中鸟氨酸或其片段、加 合物、减去物或损失物的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况下培养的hSLC中的情 况进行比较；测定胱氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变，在未分化的hSLC 的培养基中在存在该测试化合物的情况下培养，与在hSLC中在不存在该测试化合物的情 况下培养进行比较；并且测定鸟氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变与胱氨 酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变的比率，其中少于或等于约0.88的比率 指示了该测试化合物的致畸性；并且大于约〇. 88的比率指示了该测试化合物的非致畸性。
[0015] 本发明包括用于将一种测试化合物确认为一种致畸剂的方法，该方法包括：在存 在该测试化合物的情况下和在不存在该测试化合物的情况下培养未分化的人干细胞样细 胞（hSLC);测定在存在该测试化合物的情况下培养的未分化的hSLC的培养基中鸟氨酸或 其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况下培养的 hSLC中的情况进行比较；测定胱氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变，在未 分化的hSLC的培养基中在存在该测试化合物的情况下培养，与在hSLC中在不存在该测试 化合物的情况下培养进行比较；并且测定鸟氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍 数改变与胱氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变的比率，其中少于或等于约 0. 88的比率指示了该测试化合物的致畸性；并且大于约0. 88的比率指示了该测试化合物 的非致畸性。
[0016] 本发明包括用于测定以下暴露浓度的方法，在该暴露浓度下一种测试化合物是致 畸的，该方法包括在一系列浓度的该测试化合物中和在不存在该测试化合物的情况下培 养未分化的人干细胞样细胞（hSLC);测定在每个浓度的该测试化合物中培养的未分化的 hSLC的培养基中鸟氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变，与在不存在该测试 化合物的情况下培养的hSLC中的情况进行比较；测定在每个浓度的该测试化合物中培养 的未分化的hSLC的培养基中胱氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变，与在 不存在该测试化合物的情况下培养的hSLC中的情况进行比较；并且针对每个浓度的测试 化合物，测定鸟氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变与胱氨酸或其片段、加 合物、减去物或损失物的倍数改变的比率，其中在一个给定浓度的该测试化合物情况下少 于或等于约0. 88的比率指示了该测试化合物在该给定浓度下的致畸性；并且在一个给定 浓度的该测试化合物情况下大于约0. 88的比率指示了该测试化合物在该给定浓度下的非 致畸性。
[0017] 在本发明的方法的一些方面，使用一种物理分离方法鉴定该胱氨酸或其片段、加 合物、减去物或损失物，和/或鸟氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物。在一些方面，一 种物理分离方法包括质谱法。在一些方面，质谱法包括液相色谱法/电喷射离子化质谱法。
[0018] 在本发明的方法的一些方面，使用一种比色或免疫学测定测量该胱氨酸或其片 段、加合物、减去物或损失物，和/或鸟氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物。
[0019] 在本发明的方法的一些方面，hSLC包括人胚胎干细胞（hESC)、人诱导多能性 (iPS)细胞、或人胚状体。
[0020] 在本发明的方法的一些方面，在一个浓度的如下测试化合物中培养该hSLC，所述 测试化合物包括测试化合物的人治疗Cmax。
[0021] 在本发明的方法的一些方面，在一系列浓度的该测试化合物中培养该hSLC。在一 些方面，该系列浓度包括连续稀释。在一些方面，该系列浓度包括九个三倍稀释。在一些方 面，该系列浓度包括从约0. 04 μ M至约300 μ M、约4 μ M至约30, OOO μ M、和约0.0 OOl μ M至 约10 μ Μ。在一些方面，该系列浓度的该测试化合物包括测试化合物的人治疗Cmax。
[0022] 在本发明的方法的一些方面，该方法进一步包括检测一种或多种与在存在该测