试 化合物的情况下培养的hSLC相关的额外的代谢物，与在不存在该测试化合物的情况下培 养的hSLC的情况进行比较。在一些方面，一种或多种额外的代谢物包括精氨酸、ADMA、胱硫 醚，和/或其一个片段、加合物、减去物或损失物。在一些方面，使用一种物理分离方法鉴定 一种或多种额外的代谢物。在一些方面，一种物理分离方法包括质谱法。在一些方面，质谱 法包括液相色谱法/电喷射离子化质谱法。在一些方面，使用一种比色或免疫学测定测量 一种或多种额外的代谢物。
[0023] 在本发明的方法的一些方面，该方法进一步包括测定精氨酸或其片段、加合物、减 去物或损失物的倍数改变与ADM或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变的比率， 其中少于至少约0. 9或大于至少约I. 1的比率指示了该测试化合物的致畸性；并且大于至 少约0. 9和少于至少约I. 1的比率指示了该测试化合物的非致畸性。
[0024] 术语"和/或"意指所列举的要素的一个或所有或所列举的要素的任何两个或更 多个的组合。
[0025] 词语"优选的"和"优选地"是指本发明的在某些情况下可以提供某些益处的实施 例。然而，在相同或其他情况下，其他实施例也可以是优选的。此外，一个或多个优选实施 例的叙述不意味着其他实施例是无用的，并且不旨在将其他实施例排除在本发明的范围之 外。所述的一个或多个实施例和说明书中对"一个实施例（one embodiment) "、"本发明的 一个实施例"、"一个实施例（an embodiment) "、"一个实例实施例"等的提及意指所述的一 个或多个实施例可包括一个具体的特点、结构或特征，但每个实施例可以不必须包括该具 体的特点、结构或特征。此外，此类短语不必须参考相同的实施例。进一步，当一个具体的 特点、结构或特征是与一个实施例相关地描述的，应理解它在本领域的普通技术人员的知 识范围内影响与其他实施例相关的此类特点、结构或特征，无论是否明确描述。
[0026] 术语"包含"及其变体，在这些术语在本说明书和权利要求中出现的情况下，不具 有限制性含义。应当理解，当用语言"包含"来说明实施例时，还提供了就"由……组成"和 /或"主要由……组成"而言所说明的其他类似实施例。
[0027] 除非另外说明，"一个（或一种）"、"该（the)"、和"至少一个（或一种）"可互换 地使用并且意指一个（或一种）或多于一个（或一种）。
[0028] 在以下说明中，为了解释的目的，列出特定数目、参数和试剂是为了提供对本发明 的深入了解。然而，应理解，可以在没有这些具体细节的情况下实践本发明。在一些情况下， 可省略或简化众所周知的特点以使本发明明显。
[0029] 而且在此，通过端点叙述的数值范围包括该范围内所包括的所有数值（例如，1至 5 包括 1、1· 5、2、2· 75、3、3· 80、4、5 等）。
[0030] 除非另外指明，本说明书和权利要求书中使用的表达组分的量、分子量等等的所 有数值应被理解为在所有情况中被术语"约"修饰。因此，除非另外相反地指明，在本说明 书和权利要求书中列出的数值参数是近似值，这些近似值可以取决于本发明所寻求获得的 所希望的特性而不同。
[0031] 对于在此所披露的包括不连续的步骤的任何方法来说，可以按任何可行的顺序来 进行这些步骤。并且，在适当时，可以同时进行两个或更多个步骤的任何组合。
[0032] 本发明的以上概述不旨在说明本发明的每个披露的实施例或每个实现方式。下面 的说明更具体地举例说明示意性实施例。在本申请全文的几处，通过实例的列举提供了指 导，这些实例能以不同组合使用。在每个例子中，所叙述的列表仅作为代表性组并且不应被 解释为排他性列表。
[0033] 附图简要说明
[0034] 图IA和1B.针对以下项的板设计：在1期实验使用的单个暴露水平处理的非靶 向的代谢组学（图1A)和在2期实验使用的多个暴露水平处理的靶向生物标记物实验（图 1B)。两个板都合并有一种参照设计，其中实验对照或参照处理（0. 1% DMS0)存在于每个板 上。使用仅有培养基（缺少细胞）的对照以评估该测试化合物对样本基质的影响。将每个 孔作为一个个体样本进行分析。实心圆表示细胞样本，并且实心正方形描述了培养基对照 样本。
[0035] 图2.靶向生物标记物测定的图形表示。将人胚胎干（hES)细胞暴露于跨距四个 对数单位的九个浓度的一种测试化合物。鸟氨酸/胱氨酸比率（ο/c比率；灰色曲线）和 细胞活力（黑色曲线）的剂量响应曲线是使用一种四参数对数逻辑模型拟合的。通过其中 ο/c比率的剂量响应曲线与致畸阈值（0. 88 ;灰色线）相交的内插点预测的浓度表示如下的 暴露水平，在该暴露水平处一种代谢扰动具有致畸可能性（即，致畸性可能性：〇/c比率，空 心圆）。来自细胞活力（实心圆）的致畸性可能浓度是如下内插点，在该内插点处该细胞 活力剂量响应曲线超过该致畸性阈值。该致畸性可能性创建了一个基于暴露的双面毒性模 型：一个中暴露未以与致畸性相关方式扰乱代谢（浅阴影框），并且另一个中暴露可在代谢 中引起一个可能地致畸转变（深阴影框）。X轴是该化合物的浓度（μΜ)。细胞活力测量和 o/c比率测量两者都以由y轴上的Δ表示的相同比例存在。ο/c比率的y轴值是参照处理 标准化（倍数改变）值的比率（鸟氨酸/胱氨酸）。活力测量的y轴值是标准化为参照处 理细胞活力RFU的处理细胞活力RFU。
[0036] 图3A和3B.针对已知的人致畸剂和非致畸剂的分类方案的图形表示，利用治疗 Cmax浓度来设置该分类窗。针对o/c比率（灰色曲线）的剂量响应曲线是使用一种四参数 对数逻辑模型拟合的，并且被用以插入如下浓度，在此浓度处ο/c比率与该致畸性阈值（致 畸性可能性，空心圆）相交。当该致畸性可能浓度高于该人治疗C max时，一种测试化合物被 预测为一种非致畸剂（图3A)。当该致畸性可能浓度低于该人治疗Cmax时，一种测试化合物 被预测为一种致畸剂（图3B)。此处概述的相同逻辑也适用于活力测量。X轴是该化合物 的浓度（μ M)。o/c比率的y轴值是参照处理标准化（倍数改变）值的比率（鸟氨酸/胱 氨酸）。
[0037] 图4A、4B、和4C.在实验1期时测量的鸟氨酸（图4A)、胱氨酸（图4B)的代谢扰 动和o/c比率（图4C)。每个点表示这9个独立实验区组的平均值。实心点指示致畸剂， 并且空心点指示非致畸剂。误差条是平均值的标准差。垂直灰色线表示该致畸性阈值。X 轴是每个代谢物（图A和4B)的参照标准化倍数改变或鸟氨酸/胱氨酸参照标准化值（图 4C)的比率。7轴是按非致畸剂和致畸剂排序的处理。空心箭头指示如下的范围，在此范围 处一种化合物将被分类为一种非致畸剂。实心箭头指示如下的范围，在此范围处一种化合 物将被分类为一种致畸剂。
[0038] 图5A和5B.化合物针对在2期中测定的o/c比率（TP)的致畸性可能浓度和来自 革巴向生物标记物测定的针对训练集（training set，图5A)和测试集（test set，图5B)的 Cmax值之间的差异的可视化。实心点对应于致畸剂，并且空心点对应于非致畸剂。TP和Cmax 之间的差异少于〇的处理被分类为致畸剂，并且TP和Cmax之间的差异大于0的处理被分类 为非致畸剂。X轴是对数底10转化的致畸剂可能性浓度值减去对数底10转化的C max浓度 值（参见表6和7)。y轴是按非致畸剂和致畸剂排序的处理。空心箭头指示如下的范围， 在此范围处一种化合物将被分类为一种非致畸剂。实心箭头指示如下的范围，在此范围处 一种化合物将被分类为一种致畸剂。 1依维莫司（everolimus)的Cmax低于该测定中使用的 最低暴露水平，这种化合物的ο/c比率以低于该致畸性阈值起始，所以它被分类为一种致 畸剂。
[0039] 图6A至6F.训练集化合物的代表性子集的靶向生物标记物测定结果（表6)。显 示了针对4种已知的人致畸剂：萨力多胺（图6A)、全反式视黄酸（图6B)、丙戊酸（图6C)、 5-氟尿嘧啶（图6D)以及2种非致畸剂：视黄醇（图6E)和糖精（图6F)的活力分析（黑 色曲线）和o/c比率（灰色曲线）的剂量响应曲线。X轴是该化合物的浓度（μM)。细胞 活力测量和ο/c比率测量两者都以由y轴上的Λ表示的相同比例存在。ο/c比率的 y轴 值是参照处理标准化（倍数改变）值的比率（鸟氨酸/胱氨酸）。针对活力测量的y轴值 是标准化为参照处理细胞活力RFU的处理细胞活力RFU。垂直黑色虚线指示化合物特异性 Cmax，并且水平灰色线指示致畸性阈值（〇. 88)。空心圆表示针对o/c比率的致畸剂可能性浓 度（TP)。浅色和深色阴影区表示如下浓度，在此浓度处该化合物分别被预测为非致畸或致 畸。这些点是平均值，并且误差条是平均值的标准差。这些图的解释概述在图2和3中。
[0040] 图7A和7B.针对两种测试集化合物（表7):洛伐他汀（图7A)和拉帕替尼（图 7B)，靶向生物标记物测定结果与大鼠体内发育毒性结果的比较。显示了靶向生物标记物测 定针对活力分析（黑色线）和o/c比率（灰色线）的剂量响应曲线。X轴是该化合物的浓 度UM)。细胞活力测量和o/c比率测量两者都以由y轴上的△表示的相同比例存在。〇/ c比率的y轴值是参照处理标准化（倍数改变）值的比率（鸟氨酸/胱氨酸）。针对活力 测量的y轴值是标准化为参照处理细胞活力RFU的处理细胞活力RFU。垂直黑色虚线指示 化合物特异性C max，并且水平灰色线指示致畸性阈值（0. 88)。空心圆表示针对o/c比率的 致畸剂可能性浓度（TP)。浅色和深色阴影区表示如下浓度，在此浓度处该化合物分别被预 测为非致畸或致畸。灰色虚线表示如下浓度，在此浓度处在该大鼠体内发育毒性测试中观 察到一个阳性结果。这些点是平均值，并且误差条是平均值的标准差。这些图的解释概述 在图2和3中。
[0041] 图8.概述了该靶向生物标记物测定的发育的图形，与使用未知化合物时相比较。
[0042] 图9显示针对每种训练集药剂，ADMA和胱氨酸的参照处理标准化比率的比率。
[0043] 图10显示针对每种训练集药剂，胱硫醚和胱氨酸的参照处理标准化比率的比率。
[0044] 示意性实施方式的详细说明
[0045] 本发明提供人-特异性体外测定毒性的方法，特别是使用人干细胞样细胞（hSLC) 测定发育毒性以及药物和其他非-药物化合物致畸性的方法。本发明利用hSLC和代谢组 学以提供一种预测的、定量的、所有-人的体外筛选以预测化合物的人发育毒性的方法。本 方法克服了与种间动物模型相关的限制，并提供了创新和稳健的替代体外模型系统以预测 化学品的发育毒性。更多预测性发育毒性筛选的应用会减少出生缺陷的流行并增加药物和 化学品安全性。
[0046] 通过在培养基中测量代谢扰动，本发明提供了基于暴露的体外测定，该代谢扰动 可被用作针对发育毒性的可能性的早期信号。
[0047] 在本发明的这些方法的情况下，可以使用多种人干细胞样细胞（hSLC)中的任何 一种，以预测化学品实体的发育毒性。人干细胞样细胞包括但不限制于多能性未分化的人 胚胎干细胞（hESC)、人诱导多能性（iPS)细胞、人胚状体和hSLC衍生的谱系特异性细胞。
[0048] hESC是直接从胚胎植入前的人胚胎分离的多能性自我更新的细胞，这些细胞重演 了体外器官发生。谱系特异性前体细胞衍生自hESC，并已进入一个特定的细胞谱系，但相 对于该特异性谱系内的细胞类型仍保留了多能性。例如，神经前体细胞已定向神经分化， 但就其神经细胞类型而言仍保留不受限性。如此处使用的，术语"人胚胎干细胞（hESC)" 意在包括最初衍生自正发育的胚泡的内细胞团的未分化的干细胞，并且特别包括多能性 未分化的人干细胞及其部分分化的细胞类型（例如，正分化的hESC的下游祖细胞）。如 此处提供的，hESC的体外培养是多能性的并且未被永生化，并且使用本领域中良好建立 的方法可被诱导以产生谱系特异性细胞和分化的细胞类型。在实践本发明的方法中有用 的