免疫方法确定一种代谢 物。在一些方面，一种测定试剂盒也可包括一个或多个适当的阴性对照和/或阳性对照。本 发明的试剂盒可以包括其他试剂，例如缓冲剂，并且实践本发明所需要的溶液也包含在内。 任选地与这样一种或多种容器相关联的可以是通知或印刷的说明书。如在此使用，短语"包 装材料"是指用于储藏该试剂盒内容物的一种或多种物理结构。通过众所周知的方法构建 该包装材料，优选地提供一种无菌的、无污染物的环境。如在此使用，术语"包装"是指一种 固体基质或材料，例如玻璃、塑料、纸、箔片、等，能够在固定限制之内保持一种多肽。本发明 的试剂盒还可以包含使用说明书。使用说明书典型地包括描述试剂浓度的具体表达，或至 少一种测定方法参数，例如试剂和待混合样品的相对量，试剂/样本混合物的维护时间段， 温度，缓冲条件、等。
[0108] 在一些方面，一种试剂盒可以是包装的组合，该组合包括一个第一容器的基本元 素，该第一容器包括处于固体形式的一个特定集的一种或多种经纯化的代谢物，如此处所 述，以及一个第二容器，该第二容器包括用于重悬该特定亚集的经纯化代谢物的生理学上 适合的缓冲液。
[0109] 本发明通过以下实例进行说明。应理解，具体实例、材料、量以及程序应根据如在 此所列出的本发明的范围和精神广义地解释。
[0110] 实例
[0111] 实例 1
[0112] 一种用于发育毒性筛选的新的基于人胚胎干细胞的生物标记物测定的建立和评 估
[0113] 在这个实例的情况下，开发了一种利用人胚胎干（hES)细胞的基于代谢生物标记 物的体外测定，从而以指示致畸性的方式鉴定扰乱细胞代谢的测试化合物的浓度。设计这 个测定是为了有助于可能的人发育毒物的早期发现期检测。在这个研宄中，使用来自hES 细胞培养基的代谢组学数据来评估用于开发一种快速体外致畸性测定的可能生物标记物。 将hES细胞用具有已知人致畸性的药物在相当于其公开的人峰治疗血浆浓度的一个浓度 处进行处理。两种代谢物生物标记物（鸟氨酸和胱氨酸）被鉴定为发育毒性的指示物。然 后使用一种9点剂量响应曲线开发使用这些代谢物的一种基于靶向暴露的生物标记物测 定，连同一个细胞毒性终点一起。使用一个独立集的测试化合物评价该新的测定的预测性。 为了说明该测定可怎样应用到对发育毒性具有未知可能性的化合物，评价了额外的10种 化合物，这些化合物没有关于人孕期暴露的数据，但在动物发育毒性研宄中已显示阳性结 果。该新的测定在该测试集中以77%准确性（57%敏感度，100%特异性）鉴定该可能的发 育毒物。该测定与现有体内模型具有高一致性（多75% )，证明该新的测定可预测新的化 合物的发育毒性可能性，作为发现期测试的部分，并提供关于体内测试中很可能需要的结 果的一个信号。
[0114] 这个实例描述了开发一种快速的、可复制的、基于生物标记物的针对发育毒性测 试的筛选，被设计为以预测发育毒性的方式鉴定如下暴露水平，在此暴露水平下一种测试 化合物扰乱代谢。跨越九个独立实验重复评估两种代谢物即鸟氨酸和胱氨酸响应于该测 试化合物的扰动，以确保跨越多个实验的可重复性和液相色谱高分辨质谱法（LC-HRMS)系 统。使用该鸟氨酸/胱氨酸比率（ο/c比率），我们开发了一种快速靶向测定，其跨越一种 9点剂量响应曲线测量代谢和细胞活力的改变，以确定在何种暴露水平一种测试化合物以 与发育毒性可能性相关的方式扰乱代谢。为了在化合物的训练和测试集中评估该测定对已 知人致畸剂的预测性，将一种化合物被预测为具有发育毒性可能性的暴露水平针对在治疗 给药之后该化合物的人峰血浆体内浓度（C max)进行评分。在这个情况下Cmax值被用作有助 于解释该测定的性能的一个基准暴露水平，因为它是在治疗情况下人通常会暴露的最高浓 度，并且我们期望在这个暴露水平检测发育毒性。
[0115] 然而，在一种化合物的开发的发现阶段应用该测定不需要这个Cmax信息，并且一种 测试化合物的致畸可能性是基于在何种暴露水平一种测试化合物以一种指示致畸性的方 式扰乱代谢。该测定的设计和敏感度通过否定代谢物丰度的变化的混杂影响（严格的讲归 因于细胞毒性），允许在该测试化合物的非细胞毒性水平鉴定致畸可能性。在多个暴露水平 在不存在细胞毒性的情况下鉴定发育毒性的能力是该测定的一个核心力量，并使它与现有 的体外测定区别开。
[0116] 有用的术语和定义
[0117] 致畸性阈值。与针对致畸作用的可能性相关的代谢扰动阈值。以经验为主地，使 用该训练集结果，针对靶向生物标记物测定，该阈值被测定为0.88。这个阈值被应用于使用 该测定评价的所有测试集和未知化合物。
[0118] 鸟氨酸/胱氨酸比率（0/C比率）。鸟氨酸（Orn)针对处理X的倍数改变除以胱氨 酸（Cyss)针对处理X的倍数改变。
[0119]
【主权项】
1. 一种将测试化合物分类为致畸剂或非致畸剂的方法，该方法包括： 在存在该测试化合物的情况下和在不存在该测试化合物的情况下培养未分化的人干 细胞样细胞（hSLC); 测定在存在该测试化合物的情况下培养的未分化的hSLC的培养基中鸟氨酸或其片 段、加合物、减去物或损失物的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况下培养的hSLC 中的情况进行比较； 测定在存在该测试化合物的情况下培养的未分化的hSLC的培养基中胱氨酸或其片 段、加合物、减去物或损失物的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况下培养的hSLC 中的情况进行比较； 测定鸟氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变与胱氨酸或其片段、加合 物、减去物或损失物的倍数改变的比率，其中： 少于或等于约〇. 88的比率指示了该测试化合物的致畸性；并且 大于约0. 88的比率指示了该测试化合物的非致畸性。
2. -种预测测试化合物的致畸性的方法，该方法包括： 在存在该测试化合物的情况下和在不存在该测试化合物的情况下培养未分化的人干 细胞样细胞（hSLC); 测定在存在该测试化合物的情况下培养的未分化的hSLC的培养基中鸟氨酸或其片 段、加合物、减去物或损失物的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况下培养的hSLC 中的情况进行比较； 测定在存在该测试化合物的情况下培养的未分化的hSLC的培养基中胱氨酸或其片 段、加合物、减去物或损失物的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况下培养的hSLC 中的情况进行比较； 测定鸟氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变与胱氨酸或其片段、加合 物、减去物或损失物的倍数改变的比率，其中： 少于或等于约〇. 88的比率指示了该测试化合物的致畸性；并且 大于约0. 88的比率指示了该测试化合物的非致畸性。
3. -种用于将测试化合物确认为致畸剂的方法，该方法包括： 在存在该测试化合物的情况下和在不存在该测试化合物的情况下培养未分化的人干 细胞样细胞（hSLC); 测定在存在该测试化合物的情况下培养的未分化的hSLC的培养基中鸟氨酸或其片 段、加合物、减去物或损失物的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况下培养的hSLC 中的情况进行比较； 测定在存在该测试化合物的情况下培养的未分化的hSLC的培养基中胱氨酸或其片 段、加合物、减去物或损失物的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况下培养的hSLC 中的情况进行比较； 测定鸟氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变与胱氨酸或其片段、加合 物、减去物或损失物的倍数改变的比率，其中： 少于或等于约〇. 88的比率指示了该测试化合物的致畸性；并且 大于约0. 88的比率指示了该测试化合物的非致畸性。
4. 一种用于测定以下暴露浓度的方法，在该暴露浓度下一种测试化合物是致畸的，该 方法包括： 在一系列浓度的该测试化合物中和在不存在该测试化合物的情况下培养未分化的人 干细胞样细胞（hSLC); 测定在每个浓度的该测试化合物中培养的未分化的hSLC的培养基中鸟氨酸或其片 段、加合物、减去物或损失物的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况下培养的hSLC 中的情况进行比较； 测定在每个浓度的该测试化合物中培养的未分化的hSLC的培养基中胱氨酸或其片 段、加合物、减去物或损失物的倍数改变，与在不存在该测试化合物的情况下培养的hSLC 中的情况进行比较； 针对每个浓度的测试化合物，测定鸟氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改 变与胱氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变的比率，其中： 在一个给定浓度的该测试化合物情况下少于或等于约〇. 88的比率指示了该测试化合 物在该给定浓度下的致畸性；并且 在一个给定浓度的该测试化合物情况下大于约〇. 88的比率指示了该测试化合物在该 给定浓度下的非致畸性。
5. 如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中使用一种物理分离方法鉴定该胱氨酸 或其片段、加合物、减去物或损失物，和/或鸟氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物。
6. 如权利要求5所述的方法，其中该物理分离方法包括质谱法。
7. 如权利要求6所述的方法，其中该质谱法包括液相色谱法/电喷射离子化质谱法。
8. 如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中使用一种比色或免疫学测定测量该 胱氨酸或其片段、加合物、减去物或损失物，和/或鸟氨酸或其片段、加合物、减去物或损失 物。
9. 如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中该hSLC包括人胚胎干细胞（hESC)、人 诱导多能性（iPS)细胞、或人胚状体。
10. 如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在一系列浓度的该测试化合物中培养 该hSLC。
11. 如权利要求10所述的方法，其中该系列浓度包括连续稀释。
12. 如权利要求10所述的方法，其中该系列浓度包括九个三倍稀释。
13. 如权利要求10、11、或12所述的方法，其中该系列浓度选自约0.04yM至约 300yM、约 4yM至约 30, 000yM、和约 0? 0001yM至约 10yM。
14. 如权利要求10至13中任一项所述的方法，其中该系列浓度的该测试化合物包括测 试化合物的人治疗Cmax。
15. 如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中在一个浓度的如下测试化合物中培养 该hSLC，所述测试化合物包括测试化合物的人治疗C_。
16. 如权利要求1至4中任一项所述的方法，进一步包括检测一种或多种与在存在该测 试化合物的情况下培养的hSLC相关的额外的代谢物，与在不存在该测试化合物的情况下 培养的hSLC的情况进行比较。
17. 如权利要求16所述的方法，其中一种或多种额外的代谢物包括精氨酸、ADMA、胱硫 醚，和/或其一个片段、加合物、减去物或损失物。
18.如权利要求1至4中任一项所述的方法，进一步包括测定精氨酸或其片段、加合 物、减去物或损失物的倍数改变与ADM或其片段、加合物、减去物或损失物的倍数改变的 比率，其中： 少于至少约0. 9或大于至少约I. 1的比率指示了该测试化合物的致畸性；并且 大于至少约0. 9和少于至少约I. 1的比率指示了该测试化合物的非致畸性。
【专利摘要】本发明提供针对化合物的发育毒性测试的快速的、可再现的、基于生物标记物的筛选方法。这些方法被设计为以预测发育毒性的方式鉴定如下暴露水平，在此暴露水平下一种测试化合物扰乱代谢。具体而言，测量了两种代谢物即鸟氨酸和胱氨酸的扰动，其中鸟氨酸的倍数改变与胱氨酸的倍数改变少于或等于约0.88的比率指示了一种测试化合物的致畸性。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104822843
【申请号】CN201380057328
【发明人】A.史密斯, P.韦斯特, J.帕尔默
【申请人】施特米纳生物标记研发公司
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2013年11月1日
【公告号】CA2888064A1, EP2914748A1, WO2014071137A1