调节细胞程序死亡的药物组合物的制作方法

专利名称：调节细胞程序死亡的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明的工业领域本发明涉及一种调节细胞程序死亡的药物组合物，和用所述药物组合物治疗与细胞程序死亡相关疾病的方法。
相关技术通式(I)代表的2，3-二氢-1H-茚衍生物和其盐是已知化合物。 (其中R1、R2、R3和R4相同或不同，为低级烷基；R5是低级烷氧基；及A为低级亚烷基)，它们公开于例如日本专利申请平-4-77740和US-A-4,895,847中。
这些2，3-二氢-1H-茚衍生物和其盐具有改善由缺氧引起的症状和其伴随的综合症的活性。因此，2，3-二氢-1H-茚衍生物和其盐已知是改善缺氧的药剂，更具体讲它们有效地用作活化大脑、治疗遗忘、治疗老年性痴呆、改善与氰化钾中毒和缺氧伴随的呼吸停止、以及防止由缺氧引起的心律不齐和心力衰竭的药剂。
含有所述2，3-二氢-1H-茚衍生物用于其他药学目的的脂肪乳液制剂公开于EP-A-483854，其他药物制剂公开于日本专利公开平-3-112928中，用于制备所述茚衍生物的中间体公开于US-A-4792628和J.Med.Chem.，34，2004-2013(1991)中。所述茚衍生物的化学合成公开于J.Med.Chem.，34，2014-2023(1991)中。
另外，所述茚衍生物的药理效应(除调节细胞程序死亡活性外)公开于Drugs of the Future，18，(8)，707-710(1993)、Neuropathol.，11，89-104(1991)、Journal of the Neurological Sciences，109，107-110(1992)和Free Rad.Res.Comms.，15，(4)，223-230(1991)中。
本发明的背景技术迄今认为细胞死亡由两类机制引起。一类细胞死亡机制是所谓的“坏死”，这是经典的细胞死亡。从形态学角度看，坏死的特征是细胞的相继变化，即产生线粒体的显著膨胀、胞浆膨胀、细胞核变性，随后细胞崩溃和整个细胞自体溶解。这些相继的事件在细胞中被动地和意外地发生。一般认为这种细胞(组织)坏死可能由物理损伤(损害)和化学毒物造成。
另一类细胞死亡机制称为“apoptosis”(编程细胞死亡或细胞程序死亡)(Kerr，J.F.R.和Wyllie，A.H.，Br.J.Cancer，26，239(1972))。认为细胞程序死亡是在各种生理条件下产生的。将要编程性死亡的细胞的形态学特征是例如与周围细胞缺乏接触、胞浆凝聚倾向、染色质凝聚和细胞核凝聚，由于内切核酸酶的活性，细胞核有节段化倾向。另外还观察到细胞表面的微绒毛消失、细胞表面光滑(细胞表面形成水疱(brister)，即细胞膜上起疱)等。而且由于内切核酸酶的活性，观察到了DNA中核小体单位被分割成180-200碱基对片段的现象，因而有人讨论细胞程序死亡体的最终片段被相邻细胞所吞噬的机制(Duvall，E.and Wyllie A.H.，Immunology Today，7，(4)，115-119(1986)；Idem，Science，245，301-305(1989))。上述作者之一Wyllie还报道糖皮质激素诱发的胸腺细胞的编程死亡中涉及细胞中内切核酸酶的活化(Wyllie，A.H.，Nature，284，555-556(1980))。由内切核酸酶活性引起的采取编程死亡的细胞中，DNA被切成一定寡核苷酸水平范围的片段，其大小通过进行琼脂糖凝胶电泳易于证实。
上述细胞程序死亡见于组织的发生、分化和转化(turnover)中，因此认为这是编程性细胞死亡(Wyllle，A.H.等Int.Rev.Cytol.，68，251-306(1980))。
当钙离子载体中钙浓度升高或胸腺细胞中c-AMP浓度升高，则促进DNA的裂解(这是上述细胞程序死亡的特征)。(Wyllie，A，H.等，J.Pathol，142，67-77(1984))。因此猜测钙浓度和c-AMP浓度都与细胞程序死亡机制有关。而且，已报导HL-60细胞的程序死亡是上述猜想的一个实例，由视黄酸或钙离子载体分化诱导。(Martin，S.J.等，J.Immunol.，145-1859-1867(1990)；Martin，S.J.等，Clin.Exp.Immunol.，79，448-453(1990))。
有些现有技术文献报道，从种质遗传过程或正常细胞的剧烈转变(version)过程中观察到细胞(如肝、肾上腺皮质和前列腺细胞)中显示出生理性细胞死亡，鉴于此，上述细胞程序死亡可能通过用糖皮质激素、细胞毒性T-细胞引起的细胞毒性、激素依赖性组织的萎缩、放射性照射、NK细胞(自然杀伤细胞)、杀伤细胞、肿瘤坏死因子(TNF)、和细胞因子如淋巴细胞毒素(LT)等处理而被诱发。(Wyllie，A.H.，etal.，Int.Rev.Cytol.，68，251(1980)；Duvall，E.and Wyllie，A.H.，ImmunologyToday7，115-119(1986)；Sellins，K.S.，et al.，J.Immunol.，139，3199(1987)；Yamada，T.，et al.，Int.J.Radiat.Biol.，53，65(1988)；Wyllie，A.H.，Nature，284，555(1980)；Schmid，D.S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，83，1881-1885(1986)；John，C.et al.，J.Immunol，129，(4)，1782-1787(1982)；Howell，D.M..et al.，J.Immunol.，140，689-692(1988)；Gillian，B.，et al.，Eur.J.Immunol.，17，689-693(1987))。另外还有报道说甚至某些抗体如抗CB3抗体、抗Apo-I抗体、抗Fas抗体等也能够诱导细胞程序死亡。(Trauth，B.C.，et al.，Science，245，301-305(1989)；Smith，C.A.，et al.，Nature，337，181-184(1989)；and Tadakuma，T.，et al.，Eur.J.Immunol.，20，779(1990)，甚至还在恶性肿瘤的自动退化中证实了细胞程序死亡。(Nakamura Yasuo，et al.，RINSHO-HIFUKA(临床皮肤病学)35，(4)，289-295(1981))。
据报道RNA合成抑制剂放线菌素D、蛋白合成抑制剂放线菌酮以及钙离子(Ca2+)络合剂等是抑制上述细胞程序死亡的药剂。还报道免疫抑制剂环孢菌素A、造血细胞因子(IL-3(白细胞介素-3)、GM-CSF(粒巨细胞集落刺激因子)、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)等)、IL-2(白细胞介素-2)、bcl-2基因产物等抑制细胞程序死亡。(Cohen，J.J.，J.Immunol.，132，38(1984)；Wyllie，A.H.，et al.，J.Pathol，142，67(1984)；Shi，Y.，et al.，Nature，339，625(1989)；Willams，G.T.，et al.，Nature，343，76(1990)；Nielo，M.A.，J.Immunol.，143，4166(1989)；Vaux，D.L.，et al.，Nature，335，440(1988))。但也有报道说上述放线菌酮诱导急性白血病细胞的编程死亡，放线菌素D诱导肠腺管细胞编程死亡，放线菌酮和放线菌素都分别诱导HL-60细胞的编程死亡。(Martin S.J.等，J.Immunol.，145，1859-1867(1990))。相反，有报道说放线菌酮抑制X-线照射前存在的淋巴样肿瘤细胞的程序死亡，而在X-线照射后死亡数目增加。还有报道说放线菌素D增加上述细胞程序死亡。因此这提示根据细胞的类型、各种条件和其他机制可产生对细胞程序死亡的抑制或促进作用。(Igarashi Tadahiko等，NIHON-KETSUEKI-GAKUKAISHI(日本血液学协会杂志)，51，(2)，144(1988))。无论如何，认为细胞的分化、增殖和成熟与细胞程序死亡密切相关。因而任何对细胞分化、增殖等有生物活性的物质可以认为与细胞程序死亡相关。
最近，用抗Apo-I抗体治疗癌是与细胞程序死亡相关治疗方法的一种偿试。在脊髓发育不良综合症(MDS)如主要由各类血细胞减少造成的顽固性贫血(RA)和铁粒幼红细胞贫血(RARS)中，可能优选使用视黄酸作为诱导造血细胞分化的药剂，活化型维生素D3以及与GM-CSF和IL-3联合使用作为抑制产血小板细胞过度编程死亡的调节药剂。而且，在脊髓发良不良综合症(MDS)中，当RAEB中胚细胞的分化占优势而且所述RAEB在过渡阶段(RAEB-t)时，上述视黄酸和活化型维生素D3可用作诱导造血细胞分化的药剂以形成胚细胞。抑制胚细胞增殖的表鬼毒素吡喃糖苷和阿柔比星也可作为调节细胞程序死亡的药剂，即促进细胞程序死亡。(Shibuya，T.，J.Clinical andExperimental Medicine160，(5)，319-323(1992))。
另外，Murakami等发现约半数表达抗红细胞自身抗体的转基因小鼠由于其自身耐受性丧失而出现自身免疫疾病，他们报道这种自身免疫病可能由于缺乏消除自身抗体生产细胞的能力而引起，这种缺乏是由于象正常小鼠中那样自身抗原与自身抗体生产细胞反应引起细胞程序死亡而造成的。(Murakami，M等，Nature，357，77-80(1992))。
Watanabe-Fukunaga提示当MRL 1pr/1pr小鼠中与程序死亡相关的Fas抗原有异常，而胸腺自身敏化T-细胞(自身免疫T-细胞)中负选择机制(细胞程序死亡)没有正确行动时，结果就产生了自身免疫疾病。(Watanabe-Fukunaga，R.等，Nature，356，314-317(1992))。
Montagnier等报道在HIV感染病人的T淋巴细胞提取物中观察到DNA的编程死亡带，在90％的无症状HIV感染者和100％的艾滋病人和ARC(艾滋相关综合症)病人中观察到了这一现象，这一现象可理解为甚至在HIV感染者体内也促进了对细胞程序死亡的诱导。(Montagnier，L.等，Sixieme Colloque des Cent Gardes，9-17(1991))。
有人报道，在观察发育阶段鸡(avian)细胞死亡时，如果预先向鸡胚中注入NGF(神经生长因子一种促进神经细胞的神经节神经元肥大和神经纤维延长的蛋白，则在发育期神经细胞死亡被完全抑制。(Hamburger，V.等，J.Neurosci.，1，60(1981))。相反，有人报道当向鸡胚中注入抗NGF抗体时，损失了约90％的幼交感神经细胞。(Levi-Montalchini，R.and Booker，B.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，46，384(1960))。
Clark提出自然中发生的神经细胞死亡现象可分为三类，对于这些分类的细胞死亡，他总结道第I类的形态特征与细胞程序死亡相同，而且由生长因子贫乏造成的细胞死亡形成这种I类细胞死亡，也发生DNA节段化，他认为这种I类细胞死亡可以称为细胞程序死亡。(ClarkP.G.H.，Anat.Embryol.，181，195(1990)；J.Neurosei.，1，60(1981)；Proc.Natl.Acad.Sci.，U.S.A.，46，384(1960)；Rawson，C.L.等，J.Cell Biol.，113，671(1991))。
Edwards等报道编程性交感神经细胞死亡可被NGF(神经生长因子)抑制，他得出的结论是可用NGF抑制细胞程序死亡。(Edwards，S.N等，J.Neuro-Chemistry，57，(6)，2140-2143(1991))。
根据Fischer等的报道，当给予由于老化而有学习障碍的大鼠NGF时，所述NGF影响前脑基底区的胆碱能神经细胞，已知该区是能够受阿尔茨海默病干扰的区域，并观察到所述学习障碍能够恢复。(Fischer，W.等，Nature，329，65(1987)；Barde Y-A，Neuron，2，1525(1989)；Hatanaka，H.，Develop.Brain Res.，30，47(1986)；Hatanaka，H.等，Develop.BrainRes.，39，85(1988))。Hatanaka等报道上述NGF对分化、成熟、保持存活和防止老化有效，因而Hatanaka提示NGF对神经细胞紊乱有保护和恢复作用的能力，对涉及脑老化的神经疾病有预防作用，尤其具有防止阿尔茨海默病中神经细胞死亡的能力。(Hatanaka Hiroshi，TAISHA(代谢)，28，891-899(1991))。
已有人提示β-淀粉样蛋白这一对阿尔茨海默病发生机制的因果关系要考虑的主要物质、神经递质之一谷氨酸、由1-甲基-4-苯基-吡啶鎓离子(MPP+)引起的神经元死亡(这是帕金森氏病的一种已知模型)、以及由肮病素蛋白引起的神经疾病都与细胞程序死亡有关。(Enokido，Y.and Hatanaka，H.，GAN-TO-KAGAKU RYOHO(癌症与化疗)，21(5)，615-620(1994)；Gianluigi Forloni等，Neuro.Report，4，(5)，523-526(1993))。另外，有报道说诸如肌萎缩性侧索硬化(ALS)、帕金森氏病、阿尔茨海默病等的神经退化性疾病，有多种因素与其主因有关，但这些神经退化性疾病的次要原因可能是由神经生长因子功能减低造成的细胞程序死亡。(Andrew Eisen and CharlesKrieger，Can.J.Neurol.Sci.，20，(4)，286-296(1993))。
有报道说帕金森氏病中出现的黑神经元变性可能与多巴胺诱发的细胞程序死亡有关。(Ilan Ziv等，Neuroscience Letters，170，136-140(1994))。进而在萎缩性侧索硬化(ALS)中注意到了氧应力与神经元紊乱之间的关系，因而提示由氧诱导的神经元死亡通过细胞内固有的自杀机制以类似于细胞程序死亡的机制进行。(Enokido，Y，andNatanaka，H.，GAN-TO-KAGAKU RYOHO(癌症与化疗)，21(5)，615-620(1994))。
有人认为在药物耐受性病毒性肝素这样的肝病中，通过药物或病毒感染直接发生的、或通过免疫学机制发生的加速细胞程序死亡可能与此肝病有关。(Bursh，W.等，TiPS，13，245-251(1992))。
另一方面，已知肝细胞可用有丝分裂原增殖，这使肝处于增生状态，这种状态可通过肝细胞的脱膜坏死恢复到正常状态，即通过细胞程序死亡。(Kerr，J.F.等，Br.J.Cancer，26，239-257(1972))。这种细胞程序死亡现象见于增生肝、肝中增生性节结和肝癌中。(Columbano.A.等，Lab.Invest，52，670-675(1985)；Columbano，A.等，Am.J.Pathol.，116，441-446(1984))。Kerr等报道说细胞程序死亡不引起炎症或纤维化。(Kerr，J.F.等，Lancet，2，827-828(1979))。
鉴于这些事实，如果能够调节与急性和慢性肝炎有关的细胞程序死亡，那么可以认为这些肝炎可以被治愈。在慢性肝炎向肝硬变及向肝癌的转变过程中，上述细胞程序死亡处于抑制状态，认为这种状态使肝细胞在由细胞毒性T细胞引起的炎症之后能形成纤维组织，然后纤维化发展为肝硬变，因而可以认为如果能将细胞程序死亡变到促进态，则可以认为抑制肝炎并防止向肝硬变发展是可能的。
本发明的目的和简述本发明者已对上述通式(I)代表的2，3-二氢-1H-茚衍生物和其盐进行了广泛的研究工作，结果我们发现这些2，3-二氢-1H-茚衍生物和其盐具有调节(即抑制和促进活性)细胞程序死亡的活性，这从其以前的药理活性是预料不到的。在此基础上成功地完成了本发明。
本发明涉及一种调节细胞程序死亡的药物组合物，其含有选自通式(I)代表的2，3-二氢-1H-茚衍生物和其盐的至少一种活性成分 (其中R1、R2、R3和R4相同或不同，为低级烷基；R5为低级烷氧基；及A为低级亚烷基)，还涉及用所述药物组合物治疗和预防与细胞程序死亡相关疾病的方法。
本发明的详细描述本发明提供一种调节细胞程序死亡的药物组合物，其含有选自通式(I)代表的2，3-二氢-1H-茚衍生物和其盐的至少一种活性成分。
本发明的药物组合物具有调节细胞程序死亡的活性，在此活性基础上所述组合物可用于治疗和预防如前述的各种疾病。更具体地讲，本发明药物组合物优选用于治疗和预防下列各种疾病，例如癌；HIV或HTLV-1相关综合症如艾滋病，ARC(艾滋病相关综合症)，ATL(成人T-细胞白血病)，多毛细胞白血病，脊髓病(HAM/TSP)，呼吸器官失调(HAB/HABA)，关节病(HAAP)，眼色素层炎(HAU)等；逆转录病毒相关疾病，如丙型肝炎等；自身免疫病，如胶原疾病SLE(全身性红斑狼疮)和慢性风湿性关节炎(RA)等，溃疡性结肠炎，斯耶格伦综合症，原发性胆汁性肝硬变，特发性血小板减少性紫癜(ITP)，自身免疫溶血性贫血，重症肌无力，桥本氏病，胰岛素依赖性(I型)糖尿病等；伴随血小板减少的各种疾病，如脊髓营养不良综合症(MDS)，周期性血小板减少症，再生不良性贫血，特发性血小板减少性弥散性血管内血凝固病等；肝病，如丙型、甲型、乙型、己型病毒性肝炎等，药物诱发的肝炎，肝硬变等；阿尔茨海默病和阿尔茨海默型老年性痴呆；帕金森氏病；杭廷顿氏病；朊病毒病；心肌炎；ARDS(成人急性呼吸病)；萎缩性侧索硬化(ALS)；传染性疾病；前列腺肥大；子宫肌瘤；支气管哮喘；动脉硬化；各种先天畸形；肾病；老年内障；慢性疲劳综合症(CFS)和肌强直性营养不良；记忆障碍如HIV相关的记忆障碍等。因而本发明调节细胞程序死亡的药物组合物在各种药物领域中都有效。
以下具体描述上述通式(I)中所示的各个取代基。
低级烷基指含1-6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基丙基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2，2-二甲基丙基、2，3-二甲基丙基、1-甲基戊基、1，1-二甲基丁基和1-乙基丁基等。
低级烷氧基指含1-6个碳原子的直链或支链烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、叔丁氧基、戊氧基和己氧基等。
低级亚烷基指含1-6个碳原子的直链或支链亚烷基，例如亚甲基，1，2-亚乙基、1，3-亚丙基、2-甲基-1，3-亚丙基、2，2-二甲基-1，3-亚丙基、1-甲基-1，3-亚丙基、甲基亚甲基、乙基亚甲基、1，4-亚丁基、1，5-亚戊基和1，6-亚己基等。
含于本发明调节细胞程序死亡的药物组合物中的活性成分。特别优选1-〔4-(3-甲氧基苯基)-1-哌嗪基〕乙酰氨基-2，3-二氢-7-羟基-2，2，4，6-四甲基-1H-茚或其盐。
除调节细胞程序死亡的能力外，本发明调节细胞程序死亡的药物组合物还具有诱导细胞分化的活性、抑制癌细胞增殖的活性、制癌活性、抗逆转录病素活性、改善记忆障碍的活性、抑制细胞因子产生的活性等，因而所述组合物可优选用作制癌剂、癌转移的抑制剂、改善记忆障碍如与HIV相关记忆障碍的药剂、治疗和防止阿尔茨海默病的药剂、抗逆转录病毒剂、抑制细胞因子产生的药剂等。
例如在癌细胞分化后或未分化时直接应用本发明调节细胞程序死亡之药物组合物作为制癌剂时，可以促进或抑制细胞程序死亡，则显示出该药物组合物的制癌活性。
此时无论药物制剂形式和给药途径如何，本发明的药物组合物可与例如已知为化疗剂的各种其他制癌剂或放射治疗联合使用。
因为本发明活性成分化合物显示极佳的制癌效果，它们能进一步促进与之合用的其他制癌剂的效果，从而可望取得协同效应。因此，当其他制癌剂与本发明药物组合物合用时，即使所述制癌剂的用量大大低于普通应用的用量，也可在癌症治疗中达到足够的治疗效果，从而降低与之共用的制癌剂的付作用。化疗药的例子有5-氟尿嘧啶(5-FU，由Kyowa Hakko Kogyo公司生产)、丝裂霉素C(由Kyowa Hakko Kogyo公司生产)、替加氟(喃氟啶，由Taibo药物公司生产)、环磷酰胺(Endoxan，由Shionogi&Co.公司生产)和阿布拉霉素A3(色霉素A3，由Takeda化学工业公司生产)。
本发明调节细胞程序死亡的药物组合物还可用作治疗或预防杭廷顿氏病、帕金森氏病和ALS的药剂。治疗和预防上述疾病的效应可通过本发明药物组合物的抑制细胞程序死亡效应来达到。
本发明的细胞程序死亡调节剂还可用作治疗和预防阿尔茨海默病的药剂。此时，对于例如经典的阿尔茨海默病和阿尔茨海默型老年性痴呆，对于抑制细胞程序死亡的效果，本发明的调节细胞程序死亡的药物组合物显示与NGF(神经生长因子)相似的效果。可用本发明的药物组合物取得治疗和预防上述疾病的效果。除此之外，本发明调节细胞程序死亡的药物组合物可与本领域以前已知用于治疗阿尔茨海默病的药物联合应用，这种药物例如为改善脑血流循环的药剂和改善大脑代谢的药剂等，所述药物组合物对这些已知药物的效果有帮助，有时可降低这些已知药剂的付作用。
本发明调节细胞程序死亡的药物组合物具有抗逆转录病毒活性，因而可优选用作治疗和预防逆转录病毒相关疾病的药剂，如上述各种HIV或HTLV-1相关疾病和丙型肝炎等。
本发明调节细胞程序死亡的药物组合物可用作治疗和预防记忆障碍的药剂，这涉及HIV-相关的记忆障碍。
本发明调节细胞程序死亡的药物组合物具有抑制细胞因子产生的活性，因而所述药物组合物可优选地用作抑制细胞因子产生的药剂，以治疗伴有细胞因子产生异常的各种疾病，尤其是由各种细菌和寄生虫引起的传染病(IGAKU-NO-AYUMI(医学进展)，159，(8)，467-470，471-474(1991))；RA(风湿性关节炎)(ArthriticRheum.，31，1041(1988)；Ibid.34，1125(1991)；J.Immunol.，145，4154(1990)；Ibid.22，1907(1992)；Bri.J.Rheum.，31，293(1992)；Eur.J.Immunol.，18，1797(1989))；ARDS(成人急性呼吸病)(Nature，324，73(1986))；病毒性肝炎的暴发(Lancet，ii，72(1986))；CSF(集落刺激因子)(NIHON-RINSHO(日本临床医学)，50，(11)，51-55(1992)；J.InfectiousDiseases，165，994-1000(1992))；高γ-球蛋白血症，伴有急相蛋白升高的动脉内粘液瘤，和Castleman综合症(Blood，74，1360(1989)；EurJ.Immunol.，18，1797(1989))；肾小球膜增殖性肾小球肾炎(PGN)(CHIRYO-GAKU(治疗医学)，24，(1)，49(1990))和上述各种自身免疫病及HIV或HTLV相关综合症。
本发明的上述通式(I)代表的2，3-二氢-1H-茚衍生物必然包括它们的光学异构体。
上述通式(I)代表的2，3-二氢-1H-茚衍生物与药学上可接受的酸反应易于转变成其酸加合盐。药学上可接受酸的例子有无机酸如盐酸、硫酸、磷酸和氢溴酸；有机酸如乙酸、草酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、丙二酸、甲磺酸和苯甲酸。与通式(I)代表的游离形式2，3-二氢-1H-茚衍生物相似，这些酸加合盐可在本发明中用作活性成分。
式(I)2，3-二氢-1H茚或其盐一般可以以任何常规药物制剂形式使用。用稀释剂或赋形剂如填充剂、稀释剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂等制备药物制剂。对于药物制剂，可根据医疗目的选择各种形式的制剂，典型例子有片剂、丸剂、粉剂、液体、悬剂、乳剂、粒剂、胶囊、栓剂、注射剂(液体、悬液等)、软膏等。
在将该调节药剂制成片剂形式时，可以使用本领域中广为人知的载体，例如赋形剂如乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、脲、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素、硅酸等；粘合剂如水、乙醇、丙醇、单纯糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明胶溶液、羧甲基纤维素、虫胶、甲基纤维素、磷酸钾和聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂如干淀粉、藻酸钠、琼脂-琼脂粉、昆布(laminalia)粉、碳酸氢钠、碳酸钙、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯、月桂基硫酸钠、甘油单硬脂酸酯、淀粉、乳糖等；崩解抑制剂如白糖、硬脂精、可可脂、氢化油等；吸收促进剂如季铵碱、月桂基硫酸钠等；润湿剂如甘油、淀粉等；吸附剂如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土、胶态硅酸等；和润滑剂如纯化滑石、硬脂酸盐、硼酸粉、聚乙二醇等。如果需要这些片剂可进一步用常规包衣材料包衣形成包衣片剂，例如糖衣片剂、明胶膜衣片剂、肠衣层包衣片剂、膜衣片剂或双层片剂以及多层片剂。
在将该调节药剂制成丸剂形式时，可以使用本领域中广为人知的载体，例如可举出赋形剂如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、高岭土、滑石等；粘合剂如阿拉伯胶粉、黄蓍胶粉、明胶、乙醇等；和崩解剂如昆布多糖、琼脂-琼脂等。
在将该调节药剂制成栓剂形式时，可以使用本领域内广为人知的载体，例如可举出聚乙二醇、可可脂、高级醇、高级醇酯、明胶、半合成甘油酯等。
按常规方法制备胶囊制剂，将活性成分与上述各种载体混合，将所得混合物装入硬明胶胶囊、软明胶囊等中。
在制备注射制剂时，将制得的溶液和悬液再进行灭菌，优选与血液等渗。为制备溶液、乳液和悬液形式的注射制剂，可使用本领域已知的任何载体，例如可举出水、乙醇、丙二醇、乙氧基化异硬脂醇、多烃氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯等。此时可向注射制剂中加入足量的氯化钠、葡萄糖或甘油，以使其等渗。还可加入常规的溶解添加剂、缓冲剂、止痛药。如需要还可向适当的药物制剂中加入着色剂、防腐剂、香料、调味剂、甜味剂和其他药物。
在制备糊剂、霜剂和凝胶形式的制剂时，可加入这样的稀释剂，如白凡士林、石蜡、甘油、纤维素衍生物、聚乙二醇、聚硅氧烷、膨润土等。
含于本发明的调节细胞程序死亡之药物组合物中的式(I)2，3-二氢-1H-茚衍生物或其盐的量没有特别限制，可以在宽范围内适当地选择，一般其中可含有组合物重量的1-70％。
对上述药物组合物用于调节细胞程序死亡的给药方法没有特别限制，根据患者年龄、性别、症状程度和其他条件，可以以各种形式给药。例如，片剂、丸剂、溶液、悬液、乳液、粒剂和胶囊可口服给药。注射剂单独静脉内给药，或与常规可注射输液如葡萄糖溶液、氨基酸溶液等一起给药；必要时该注射剂单独经肌肉内、皮下、真皮内或腹膜内给药。栓剂在直肠给药。软膏剂则涂于皮肤上。
可以根据患者的年龄、性别和其他条件以及症状程度来适当选择上述调节细胞程序死亡的药物组合物的剂量。一般可用约0.2-200mg/kg体重/天的通式(I)2，3-二氢-1H-茚或其盐作为活性成分。
本发明的实施例下面是药物制剂和药理试验的实施例。
药物制剂实施例-11-〔4-(3-甲氧苯基)-1-哌嗪基〕乙酰氨基-2，3-二氢-7-羟基-2，2，4，6-四甲基-1H-茚200mg葡萄糖 250mg
注射用蒸馏水 足量总量5ml将1-〔4-(3-甲氧苯基)-1-哌嗪基〕-乙酰氨基-2，3-二氢-7-羟基-2，2，4，6-四甲基-1H-茚(活性成分)和葡萄糖溶于注射用蒸馏水中，然后将此溶液装入5ml体积的安瓿中。装满的安瓿中的空气用氮气置换后，将此安瓿在121℃和压力下用热蒸汽灭菌15分钟，获得具有以上配方的注射制剂。
药物制剂实施例-21-〔4-(3-甲氧苯基)-1-哌嗪基〕乙酰氨基-2，3-二氢-7-羟基-2，2，4，6-四甲基-1H-茚 100gAvicel(微晶纤维素的商标，由Asahi化学工业公司生产) 40g玉米淀粉 30g硬脂酸镁 2gTC-5(羟丙基甲基纤维素的商标，由Shin-Etsu化学公司生产)10g聚乙二醇-6000 3g蓖麻油40g甲醇 40g将1-〔4-(3-甲氧苯基)-1-哌嗪基〕-乙酰氨基-2，3-二氢-7-羟基-2，2，4，6-四甲基-1H-茚(活性成分)、Aricel、玉米淀粉和硬脂酸镁一起混合并研磨，然后用制片机将此混合物制成片剂(R＝10mm)。所得片剂用由TC-5、聚乙二醇-6000、蓖麻油和甲醇组成的膜衣包衣，制备具有上述配方的膜包衣片剂。
药理试验实施例用1-〔4-(3-甲氧苯基)-1-哌嗪基〕乙酰氨基-2，3-二氢-7-羟基-2，2，4，6-四甲基-1H-茚(以下称为“试验化合物1”)作为试验化合物进行了下列药理试验。
药理试验-1(抑制人骨髓性白血病细胞株HL-60增殖的活性)
将通过连续培养获得的细胞株HL-60在25℃1200rpm离心5分钟(离心分离器05PR-22型，由Hitachi公司制造)，然后将细胞悬于RPMI-1640培养液(由Gibco公司生产)，其中含有10％FBS(胎牛血清Lot.41K1295，由Gibco公司生产)。用0.2％台盼蓝(由Wako纯化学工业公司生产)将活细胞染色，用光学显微镜(BH-2型，由Olympus光学公司制造)对染色细胞计数，稀释细胞悬液以调节细胞数到1.2×105细胞/ml。
向96孔微培养板(编号25860，Corning Glass Works制造)的每个孔中滴加0.1ml培养液(含10％FBS的RPMI-1640培养液)。然后向微板A列的每个孔中加入含40μ/ml浓度试验化合物的0.1ml稀释溶液，然后将此稀释溶液重复二倍稀释至H列(7次)。向含系列试验化合物稀释溶液(从A列到H列)的96孔板所有孔中，滴加0.1ml HL-60细胞悬液(1.2×105细胞/ml)。将所述微板保持在37℃CO2孵箱(由Napco公司制造)中，在5％CO2条件培养3天。培养后向微板的每个孔中滴加0.01ml PBS(-)溶液(由Nissui药物公司生产)，其中含有2.5mg/ml MTT(MTT(3-(4，5-二甲基-2-三唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓溴化物)(由Wako纯化学工业公司生产))，再将该微板在5％CO2下37℃培养3小时。
然后向此微板的每孔中滴加0.1ml溶解溶液(0.01N盐酸，含10％SDS(十二烷基硫酸钠)，由Wako纯化学工业公司生产)，用仪器(型号Titertech-Multiscan MMC，由Flow Laboratories公司制造)测定580nm处的光密度。从光密度(吸光度)确定活细胞吸收的染料量，按下式计算对细胞增殖的抑制率(％)细胞增殖抑制率(％)＝(1－M/C)×100其中M是使用试验化合物的试验组细胞吸收的染料量；C是不用试验化合物的对照组细胞吸收的染料量。
结果示于下表1中。
表1
药理试验-2(抑制细胞株Hep 3B(人)增殖的活性)通过连续培养获得的Hep3(人)细胞用PBS(-)溶液(Nissui药物公司生产)洗涤两次，用0.05％胰蛋白酶溶液(Flow Laboratories生产)分离细胞后，将细胞悬浮在Dulbecco MEM培养液(Flowlaboratories生产)、1％非必需氨基酸溶液(Flow Laboratories生产)和2mM L-谷氨酰胺溶液(Flow Laboratories生产)中。通过在25℃、1200rpm离心(离心分离器型号05PR-22，Hitachi公司制造)5分钟洗涤细胞两次，然后再悬浮在所述培养液中。活细胞用0.2％台盼蓝(Wako纯化学工业公司生产)染色，用光学显微镜(型号BH-2，Olympus光学公司制造)对染色细胞计数，稀释细胞悬液以调节细胞数至3×104细胞/ml。向96孔微板(编号25860，Corning Glass Works制造)的每个孔中滴加0.1ml Hep 3B细胞悬液(3×104细胞/ml)，将此微板在5％CO2和37℃条件下培养24小时。向96孔板的每孔中滴加0.1ml每种试验化合物溶液，其终浓度分别为0μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml。然后将此微板在孵箱(Napco公司制造)中37℃、5％CO2条件下培养48小时。培养后，向微板的每孔中滴加0.01mlPBS(-)溶液(Nissui药物公司生产)，其中含有2.5mg/ml MTT(MTT(3-(4，5-二甲基-2-三唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓溴化物)(Wako纯化学工业公司生产))，然后微板再在37℃、5％CO2条件下培养3小时。
然后向微板的每个孔中滴加0.1ml溶解溶液(0.01N盐酸，含10％SDS(十二烷基硫酸钠)，Wako纯化学工业公司生产)，用仪器(型号Titertech Multiscan MMC，Flow Laboratories制造)测定580nm处的光密度。由光密度(吸光度)确定活细胞吸收的染料量，并按下式计算对细胞增殖的抑制率(％)。参比对照组所得结果按Studentt检验对结果进行统计处理。
对细胞增殖的抑制率(％)＝(1－M/C)×100其中M为使用试验化合物的试验组中细胞吸收的染料量；C为不用试验化合物的对照组中细胞吸收的染料量。
结果示于表2中表2
从以上药理试验-1和-2中所得结果可以看出，作为本发明调节药剂活性成分的2，3-二氢-1H-茚衍生物对各种细胞株的增殖显示抑制活性，因而可认为所述调节药剂具有诱导细胞程序的死亡的活性。
药理试验-3(对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶诱导的多巴胺能神经退化的抑制活性)在此试验中，用ICR系雄性小鼠(10周龄)作为试验动物，用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶盐酸盐(MPTP，Funakoshi Kabushiki Kaisha生产)作为神经退化的诱导剂。将MPTP溶于生理盐水(作为溶剂)中，将此溶液制成10ml/kg的剂量体积，然后腹膜内注射。另外将试验化合物1悬浮在5％阿拉伯胶-生理盐水溶液(作为载体)中，将此悬液制成10ml/kg的剂量体积，口服给药。
将试验动物分成如下4组(每组含10只小鼠)(a)对照组(溶剂，i.p＋载体，p.o)；(b)只用MPTP的组(MPTP 20mg/kg，i.p＋载体p.o)；(c)试验化合物1＋MPTP组(试验化合物30mg/kg p.o.＋MPTP 20mg/kg i.p.)；及(d)仅用试验化合物1的组(试验化合物30mg/kg p.o.＋溶剂，i.p.)。
腹膜内注射MPTP(20mg/kg)，每天一次连续进行7天，在给予MPTP前30分钟口服给予试验化合物1(30mg/kg)，每天一次。最后一次给药后的第二天，微波照射处死小鼠。小鼠冷却后，从头部摘出脑，在冰冷却条件下切下纹状体。立即称取纹状体的重量，加入0.1N高氯酸水溶液，然后用超声匀化器在冰冷却条件下匀化。所得匀浆在4℃、20000g下离心分离15分钟得到上清液。通过装有电化学检测器的HPLC仪(高效液相色谱)，从上清液分别测定纹状体中多巴胺(DA)、3，4-二羟基苯基乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA)的含量。用双侧t检验对4个试验组的结果进行显著性检验。
结果示于下表3中。
表3
注上述数据是以均值±S.E.的形式显示，浓度单位以纳摩尔/克组织重显示。
* p＜0.05；***p＜0.001vs(a)；##P＜0.01vs(b)；NS对(a)不显著。
从表3所示的结果可以看出本发明的2，3-二氢-1H-茚衍生物或其盐几乎完全抑制MPTP诱导的纹状体中DA、DOPAC和HVA含量降低；在只给予本发明的2，3-二氢-1H-茚衍生物或其盐时，对纹状体中DA、DOPAC和HVA含量没有任何显著影响。这些结果提示本发明的2，3-二氢-1H茚衍生物或其盐抑制MPTP诱导的多巴胺能神经退化。因而本发明的2，3-二氢-1H-茚衍生物或其盐能够抑制帕金森氏病的进展(加重)。
药理试验-4(对产生γ-干扰素的抑制活性)以下研究对正常健康人外周血受脂多糖(LPS)刺激时释放产生γ-干扰素的影响。
将1-〔4-(3-甲氧苯基)-1-哌嗪基〕-乙酰氨基-2，3-二氢-7-羟基-2，2，4，6-四甲基-1H-茚(试验化合物1)溶于二甲基亚砜中，进一步用RPMI-1640培养液稀释至预定浓度。作为对照，仅用以RPMI-1640培养液相似稀的二甲基亚砜。
向RPMI-1640培养液(含100单位/ml青霉素和0.1μg/ml链霉素)中加入10％正常健康人的外周血(加了肝素)、试验化合物和LPS(大肠杆菌055B5，1g/ml)，然后将所述混合物在5％CO2孵箱中37℃培养8-24小时。通过离心操作回收该培养物的上清液，得培养物的上清样品。用酶联免疫吸附分析(ELISA)方法测定该上清样品中的γ-干扰素浓度，从γ-干扰素的标准曲线得到样品中γ-干扰素的量。注意，检测限为20pg/ml。
按下式计算γ-干扰素的释放抑制率。
γ-干扰素释放抑制率(％)＝(1－T/C)×100其中T为加试验化合物时释放的γ-干扰素量；C为不加试验化合物时释放的γ-干扰素量；结果，当试验化合物(试验化合物1)的终浓度为30μg/ml时，γ-干扰素的释放抑制率为69％。
权利要求
1.通过调节细胞程序死亡治疗和预防疾病的方法，其中使用含有选自通式(I)2，3-二氢-1H-茚衍生物和其盐的至少一种活性成分的药物组合物 其中R1、R2、R3和R4相同或不同，为低级烷基；R5为低级烷氧基；A为低级亚烷基。
2.治疗和预防杭廷顿氏病的方法，其中使用含有选自通式(I)2，3-二氢-1H-茚衍生物和其盐的至少一种活性成分的药物组合物 其中R1、R2、R3、R4、R5和A如权利要求1中所定义。
3.治疗和预防帕金森氏病的方法，其中使用含有选自通式(I)2，3-二氢-1H-茚衍生物和其盐的至少一种活性成分的药物组合物 其中R1、R2、R3、R4、R5和A如权利要求1中所定义。
4.治疗和预防萎缩性侧索硬化(ALS)的方法，其中使用含有选自通式(I)2，3-二氢-1H-茚衍生物和其盐的至少一种活性成分的药物组合物 其中R1、R2、R3、R4、R5和A如权利要求1甲所定义。
5.治疗和预防HIV相关的记忆障碍的方法，其中使用含有选自通式(I)2，3-二氢-1H-茚衍生物和其盐的至少一种活性成分的药物组合物 其中R1、R2、R3、R4、R5和A如权利要求1中所定义。
6.通过抑制细胞因子的产生治疗和预防疾病的方法，其中使用含有选自通式(I)2，3-二氢-1H-茚衍生物和其盐的至少一种活性成分的药物组合物 其中R1、R2、R3、R4、R5和A如权利要求1中所定义。
7.按权利要求1用药物组合物通过调节细胞程序死亡治疗和预防疾病的方法，其中活性成分是1-〔4-(3-甲氧苯基)-1-哌嗪基〕乙酰氨基-2，3-二氢-7-羟基-2，2，4，6-四甲基-1H-茚。
8.按权利要求2用药物组合物治疗和预防杭廷顿氏病的方法，其中活性成分是1-〔4-(3-甲氧苯基)-1-哌嗪基〕乙酰氨基-2，3-二氢-7-羟基-2，2，4，6-四甲基-1H-茚。
9.按权利要求3用药物组合物治疗和预防帕金森氏病的方法，其中活性成分是1-〔4-(3-甲氧苯基)-1-哌嗪基〕乙酰氨基-2，3-二氢-7-羟基-2，2，4，6-四甲基-1H-茚。
10.按权利要求4用药物组合物治疗和预防萎缩性侧索硬化(ALS)的方法，其中活性成分是1-〔4-(3-甲氧苯基)-1-哌嗪基〕乙酰氨基-2，3-二氢-7-羟基-2，2，4，6-四甲基-1H-茚。
11.按权利要求5用药物组合物治疗和预防HIV相关性记忆障碍的方法，其中活性成分是1-〔4-(3-甲氧苯基)-1-哌嗪基〕乙酰氨基-2，3-二氢-7-羟基-2，2，4，6-四甲基-1H-茚。
12.按权利要求6用药物组合物通过抑制细胞因子的产生治疗和预防疾病的方法，其中活性成分是1-〔4-(3-甲氧苯基)-1-哌嗪基〕乙酰氨基-2，3-二氢-7-羟基-2，2，4，6--四甲基-1H-茚。
13.通式(I)的2，3-二氢-1H-茚衍生物或其盐在制备通过调节细胞程序死亡治疗和预防疾病的药物中的用途，其中通过使用含有选自通式(I)2，3-二氢-1H-茚衍生物和其盐的至少一种活性成分的药物组合物来调节细胞程序死亡， 其中R1、R2、R3、R4、R5和A如权利要求1中所定义。
全文摘要
本发明提供一种调节细胞程序死亡的药物组合物，其中含有选自通式(I)2，3-二氢-1H-茚衍生物和其盐的至少一种活性成分，其中R
文档编号A61K31/4965GK1143322SQ9519201
公开日1997年2月19日 申请日期1995年12月15日 优先权日1995年1月11日
发明者菊地哲朗, 鸟取桂, 上程康文, 田中英男, 市川弘之, 小野幸久, 中井哲 申请人:大冢制药株式会社