专利名称：苯甲酰胺类似物，用作parp(adp-核糖基转移酶，adrpt)dna修复酶抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及苯甲酰胺类似物，特别是某些3-取代的苯甲酰胺化合物和相关的喹唑啉酮化合物，这些化合物令人感兴趣的是由于其能够抑制多聚ADP-核糖基转移酶(EC2.4.2.30)的活力，因此至少是潜在的有用的化疗药，多聚ADP-核糖基转移酶还被称作多聚(ADP-核糖)聚合酶，通常称之为ADPRT或PARP。一般来说，后一缩写，PART，将用于本发明说明书始终。
背景技术：
已知多聚ADP-核糖转移酶至少在较高等有机体中催化ADP-核糖基团从烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化型NAD+向核受体蛋白的转移，从而形成同聚ADP-核糖多聚物，并且该过程存在于许多细胞现象中，例如，DNA缺损的修复、细胞分化的进行、致癌基因引起的细胞转化、以及基因表达。许多这些过程中的共同特征是DNA链缺口的形成和修复以及包括PARP酶似乎是DNA连接酶II-介导的链重新连接的酶的阶段。在大部分情况下多聚ADP-核糖基化的作用与使用PARP酶的抑制剂相牵连，由此建议，这样的抑制剂通过干扰细胞内DNA修复机制可具有有用的化疗作用，因为它们将能改变治疗抗性特征并加强或促进化学治疗中的细胞毒药物或放射治疗中的放射的有效作用，而在化疗和放疗中治疗的主要作用是引起靶细胞中DNA缺损，例如在多种抗肿瘤治疗形式中。
与此相关，已知许多类PARP抑制剂，包括苯甲酰胺本身和多种烟酰胺以及苯甲酰胺类似物，特别是带小取代基如3-氨基、3-羟基和3-甲氧基的3-取代苯甲酰胺。EP-A-0305008报道了某些N-取代苯甲酰胺的PARP抑制作用，其中还设想将这些化合物用于医药，促进放射或化疗药的细胞毒作用。
就苯甲酰胺作为化疗药物的该项用途来说，许多对已知表现出PARP抑制作用的这些化合物的研究已经证实它们能强加某些抗肿瘤药在体外的细胞毒作用，例如，博莱霉素和甲基化药物。其它有限资料进一步表明这些苯甲酰胺还能加强细胞毒药物在体内的作用，尽管剂量要求似乎太高(例如3-氨基苯甲酰胺的每次剂量在0.5g kg-1范围内)并且可能存在制备令人满意的药物剂型以及避免毒性限制的相关问题。此外，许多已知的苯甲酰胺也已明确显示出具有作为放射敏化剂的潜力，促进例如体内和体外的离子化放射-诱导的肿瘤细胞伤杀，并且确信在许多情况下该效果是与这些化合物作为PARP抑制剂并干扰DNA修复相关的。
但是，尽管体外和体内研究的现有资料表明PARP抑制剂作为有用的化疗药物具有很大潜力，其具有进一步临床评估的价值，例如在癌症治疗方面，但是不能认为目前已知的PARP抑制剂已经完全适于作为候选药物。因此，需要发现并开发更大的范围的具有潜在的有用的PARP抑制剂性质的化合物。
本发明的公开本发明确认了新的一类或几类具有PARP抑制剂价值的可用于医药的化合物，特别是当与至少某些细胞毒药物或放射治疗结合给药时来促进其细胞毒作用效果。通常，如下面所定义的本发明化合物包括新的3-取代的苯甲酰胺化合物，特别是3-羟基苯甲酰胺化合物，或类似物，其中很多含有相对大的或体积大的3-位取代基或含有与2-位中的取代基在环结构中连接的3-位取代基。这些化合物还包括某些喹唑啉酮，通过相关苯甲酰胺化合物的分子重排可以形成至少某些喹唑啉酮。由于它们的结构，通常这些化合物适于作为PARP酶的NAD+的另一底物。
更具体地说，一方面，本发明提供了新的化合物，其选自(A)，具有通用结构式I的3-取代苯甲酰胺化合物
或其药学上接受的盐，以及(B)，具有通用结构式II的喹唑啉酮化合物 或其药学上可接受的盐。
其特征在于在结构式I中(i)Y为氢，并且X为-CH2-Z其中Z代表烷基、可选择性取代的芳烷基、-CH＝CHR(其中R为H、烷基或选择性取代的苯基基团)、环己基、或具有结构式III的基团 其中R1为选自H、烷氧基、NO2、N3、NH2、NHCOR3(R3为烷基或芳基)、CO2R4(R4为H或烷基)、烷基、羟基烷基、CW3或W(W为卤素)、以及CN，并且其中R2为H，或者其中R1和R2一起代表与相邻环的C桥连的-O-CHR5-O-基团，而R5为H、烷基或选择性取代的芳烷基或芳基；(ii)Y为氢，并且X为-(CH2)n-Z其中n在5至12的范围内，并且Z为卤素或嘌呤-9-基基团；
(iii)Y和X一起形成桥-Y-X-，其代表基团 或- 或- 其中R5如上所述，并且在结构式II中，X′代表羟基、烷基、烷基基或选择性取代的芳基(例如苯基)或芳烷基(例如苯甲基)基团，并且Y′代表氢、烷基或选择性取代的芳基(例如苯基)或芳烷基(例如苯甲基)基团。
当烷基基团作为这里的基团或其它基团如烷氧基中的一部分时，不包括某些情况下上述的亚甲基链-(CH2)n-，将通常含有1-8碳原子，优选1-6碳原子，而更通常是1-4碳原子。
从PARP-抑制活性的角度来看一组非常重要的特别有价值的化合物包括苯并噁唑-4-羧酰胺化合物，即用式IV代表的化合物 其中R5，如不是H，则优选为烷基、苯基或其它芳基基团如萘基或吡啶基。当R5为烷基时则其通常为C1-6烷基，例如甲基、乙基、正-丙基、异丙基、正丁基、叔丁基或环己基。但在某些情况下它可以比较大，例如在金刚烷基的情况下。当R5为苯基基团时其可以被取代，特别是在4(对)位但另一方面也可以在2-位或3-位，被取代基如烷氧基取代。在这组苯并噁唑化合物中特别令人感兴趣的优选化合物包括2-甲基苯并噁唑-4-羧酰胺
2-叔丁基苯并噁唑-4-羧酰胺2-苯基苯并噁唑-4-羧酰胺2-(4-甲苯基)苯并噁唑-4-羧酰胺在上面提到的式IV化合物中，其中有一个富含电子的芳香环，我们认为通过环中的氮原子与羧酰胺基团中的一个氢原子之间的分子内氢链使羧酰胺基团被限制在固定构型中，特别有利于使化合物作为PARP酶的NAD+的另一底物。同样，虽然在其中X和Y取代基形成桥的式I的其它化合物中还可能出现某些微弱影响，如上面(iii)中所定义的桥，含有氧或硫原子，即或IV中苯并噁唑的环中N原子被O或S原子取代。
但是，还发现，在尝试制备式IV的苯并噁唑-4-羧酰胺化合物时，在一些预期能生成目的化合物的制备方法中，产物倾向于进行分子重排(特别是当使用氨水形成羧酰胺时)并得到8-羟基喹唑啉酮衍生物而不是预期的苯并噁唑。意外地发现，至少某些这样的喹唑啉酮衍生物，当然其可通过各种方法制得，具有潜在的非常有用的作为高活性的PARP抑制剂的生物活性。因此，通常符合结构式II的这些喹唑啉酮化合物代表了本发明的另一个非常重要的方面。具有特别重要性的这些化合物包括(a)8-羟基-2-甲基喹唑啉-4-〔3H〕酮；(b)8-羟基喹唑啉-4-〔3H〕酮；(c)8-羟基-2-(4-硝基苯基)-喹唑啉-4-酮；(d)8-甲氧基-2-甲基喹唑啉-4〔3H〕-酮；(e)8-甲氧基-2-苯基喹唑啉-4〔3H〕-酮；(f)8-羟基-2-苯基喹唑啉-4〔3H〕-酮；(g)2，8-二甲基喹唑啉-4〔3H〕-酮。
另一组特别重要的化合物包括3-苄氧基苯甲酰胺(BOB苯甲酰胺类似物)，其中X为苄基或取代的苄基基团。苄基取代基的例子包括2-硝基(或另-个2-取代基)、4-CH3、4-CO2H、4-CO2CH3、4-CONH2、4-CN、4-CH2OH、4-NHCOPh，并且在这组化合物中特别重要的化合物包括3-苄氧基苯甲酰胺，
3-(4-甲氧基苄氧基)苯甲酰胺，3-(4-硝基苄氧基)苯甲酰胺，3-(4-叠氮基苄氧基)苯甲酰胺，3-(4-溴代苄氧基)苯甲酰胺，3-(4-氟代苄氧基)苯甲酰胺，3-(4-氨基苄氧基)苯甲酰胺，3-(4-硝基苄氧基)苯甲酰胺，3-(3，4-亚甲基二氧代苯基甲氧基)苯甲酰胺或3-(胡椒基氧代)苯甲酰胺，3-(N-乙酰基-4-氨基苄氧基)苯甲酰胺，3-(4-三氟甲基苄氧基)苯甲酰胺，3-(4-氰基苄氧基)苯甲酰胺，3-(4-羧基甲基苄氧基)苯甲酰胺，3-(2-硝基苄氧基)苯甲酰胺，3-(4-羧基苄氧基)苯甲酰胺。
在某些情况下，上组BOB类似物的化合物中的苄基部分的芳香环可以被氢化并且仍然显示出一些PARP抑制活性，这类化合物的一个例子是3-(环己基甲基氧代)苯甲酰胺。
根据本发明的另一组重要的化合物包括3-氧代苯甲酰胺，其中有一个5或更多的亚甲基链，该链终止于卤素原子，例如溴，或终止于嘌呤-9-基基团，特别是腺嘌呤或6-氯嘌呤。在这组中特别重要的化合物包括3-(5-溴代戊氧基)苯甲酰胺，3-(8-腺苷-9-基辛氧基)苯甲酰胺，3-〔5-(6-氯嘌呤-9-基)戊氧基〕苯甲酰胺，3-(5-腺苷-9-基戊氧基)苯甲酰胺，3-〔8-(6-氯嘌呤-9-基)辛氧基〕苯甲酰胺，3-〔12-(6-氯嘌呤-9-基)十二烷氧基〕苯甲酰胺，3-(12-腺苷-9-基十二烷氧基)苯甲酰胺。
但是，另外还提供了特别重要的化合物，其中3-位的氧基-取代基包括一个键如烯丙基，例如3-烯丙基氧基苯甲酰胺，或肉桂基，例如3-肉桂基氧基苯甲酰胺。
在另一组优选的化合物中3-位的氧基取代基含有一个具有至少4个碳原子的烷基。典型实例包括3-丁氧基苯甲酰胺，3-戊氧基苯甲酰胺，3-己氧基苯甲酰胺，3-庚氧基苯甲酰胺，3-辛氧基苯甲酰胺。
本发明还包括或延及制备上面定义的化合物(在某些情况下包括中间体)的方法以及这些合化物的治疗用途。这包括用它们生产医用或兽医用制剂或者含有效PARP抑制量的活性化合物的药物配方，这些制剂是用来与细胞毒药物或放疗相结合给予患者，从而提高后者的细胞毒功效。可以按照药学领域中任何已知的方法生产这些以任何适宜方式给药的制剂或配方，例如口服、胃肠外给药(包括皮下、肌内或静脉给药)，或者典型地，给药方式、制剂或配方类型以及剂量一般决定于所促进的相关细胞毒药物化疗或放疗的详细情况。
如所指出的，根据本发明的化合物至少具有作为PARP抑制剂的潜力，并且后面描述的体外实验已经表明了阳性药学活性，我们相信这反映了临床治疗过程中所发现的体内活性。
应当理解，本说明书所指的式I或II(或式IV)化合物应当被认为在适当情况下延及到它们的药学上可接受的盐。并且，当所指的任何化合物可存在一种以上的对映体形式时，所有这些形式、其混合物、以及它们的制剂和用途也在本发明的范围内。
通常，本发明的许多化合物，至少包括苄氧基芳甲酰胺(BOB)和烯丙基3-氧代苯甲酰胺类似物一般是通过碱催化的3-羟基-苯甲酰胺的烷基化反应来制备的，例如使用适宜的烷基化剂(如烷基卤化物R-Hal)在乙腈和碳酸钾存在下反应，如果烷基化剂不能市购，则可以通过一般方法制备。开始，由于3-羟基苯甲酰胺本身不能广泛商购，可首先通过将能市购的3-羟基苯甲酸与三乙胺和氯甲酸乙酯的混合物在二氯甲烷中反应生成混合酐并在氨水中，淬火来制备该化合物，或者通过新开发的高效率高产量的方法来制备，制备路线包括3-羟基苯甲酸的3-位-OH的选择性乙酰化和随后羧基向羧酰胺的转化，如下面所述。
对优选方案的实施例的说明下面实施例和制备各种重要的优选化合物的合成路线的步骤描述是用来进一步说明本发明，但不应对本发明有任何限制。
在第一个实施例(实施例1)中，将描述上述从3-羟基苯甲酸制备3-羟基苯甲酰胺的新方法，因为3-羟基苯甲酰胺是制备此后描述的其它苯甲酰胺类似物的原料。
实施例13-羟基苯甲酰胺(a)第一步——3-乙基苯甲酸向氢氧化钠冷溶液(0.61g；15.2mM溶于2ml水中)加入3-羟基苯甲酸(1g；7.29mM)。将冷乙酸酐(0.81g；7.9mM)与碎冰(2g)加入其中。搅拌混合物一小时，并且6M盐酸(3ml)酸化，生成白色沉淀。将有机物萃取到二氯甲烷(3×30ml)中，并在硫酸镁上方干燥。过滤之后真空除去溶剂，生成白色固体，将其从沸水中重结晶。
薄层层析(T，L，C)的溶剂10％甲醇/90％二氯甲烷NMR200MHzd6DMSOδ＝ 2.4(s；3H；CH3)；7.45(m；1H；Hδ)7.6(t；1H；Hβ)；7.78(m；1H；H)；7.9(t；1H；Hα)；13.1(s；1H；OH)产率86％(b)第二步——3-羟基苯甲酰胺的制备将来自第一步的3-乙酸基苯甲酸(0.5g)溶于亚硫酰氯(1.74ml)中并回流3.5小时。
蒸馏除去多余的亚硫酰氯，生成黄色油状物，将其逐滴加入冷氨溶液(35％水溶液)中，并搅拌30分钟。将混合物煮沸以减少体积(50％)并放冷。收集从溶液结晶出来的3-羟基苯甲酰胺，然后从沸水中重结晶T.L.C10％甲醇/90％二氯甲烷NMR200MHz；d6DMSO；δ7.0(1H；dt；H4)；7.25(m；4H；NH；H2；H5；H6)；8.0(s；1H；NH)；9.77(s；1H；OH).
产率60％实施例23-(4-叠氮基苄氧基)苯甲酰胺(化合物NU1013)(a)第一步——对叠氮基甲苯的制备将对甲苯胺(9.3mM)溶于盐酸(5M；10ml)中，并将混合物冷却到＜0℃。将亚硝酸钠(10.28mM)溶于极少量水中，并将该溶液在30分钟内逐滴加到反应液中。搅拌该溶液20分钟，然后用淀粉/碘化物试纸检测氧化剂的存在。然后在1小时内向反应混合物中缓慢加入叠氮化钠(37.38mM)(因为剧烈泡腾)。当加入所有叠氮化钠后，将反应在水(50ml)中淬火，并与水(50ml)定量转入锥形瓶中。用碳酸钠中和混合物至PH＝6。将有机物萃取到二氯甲烷中(3×30ml)，用水洗涤(2×20ml)，在硫酸镁上方干燥，并在真空下除去多余的溶剂。这样得到的对叠氮基甲苯是油状物并通过层析进行分离(100％石油醚/乙醚40-60)。
1H NMRd6DMSOδ2.37(s；3H；CH3)；7.0(d；2H；H3；H5)；7.3(d；2H；H2；H6)(b)第二步——对叠氮基甲苯的溴化向上面制备的对叠氮基甲苯中加入N-溴丁二酰亚胺(2.48mM)和于无水苯(5ml)中的偶氮-异丁腈(0.214mM)。将其回流5小时，同时用TLC监控反应。将有机物萃取到乙醚中(3×15ml)，并在硫酸镁上方干燥水分，真空除去多余溶剂。用层析技术分离形成的对叠氮基苄基溴。
(c)最后的步骤——对叠氮基苄基-3-氧代苯甲酰胺的制备在氮气氛下向3-羟基苯甲酰胺(2.0mM)中加入无水乙腈(20ml)、碳酸钾(2.0mM)、和对叠氮基苄基溴(2.0mM)。将混合物回流3小时，并用TLC监控反应过程。真空除去多余溶剂直至干燥，并从热二氯甲烷中重结晶标题化合物(极少量)。分离淡黄色结晶固体并干燥。
熔点167-168℃红外数据CM-13341；3155；2121；2094；1631；1583。
质谱M/Z269(M+1)252；223；167；104(100％)；93；77。
1H NMRd6-DMSOδ＝5.5(s；2H；CH2)；7.27(m；3H；H2′；H6′；H4)；7.41-7.6(m6H；H3′；H5′；H2；H6；H5；NH)；8.0(s；1H；NH)13C NMRδ＝69.098；114.049；118.164；119.528；120.359；129.735；129.886；134.188；136.096；139.332158.480；167.889元素分析预计值C62.68％；H4.47％；N20.89％实测值C62.18％；H4.30％；N20.70％实施例33-(4-溴代苄氧基)苯甲酰胺(化合物NU1014)在氮气氛下向3-羟基苯甲酰胺(2.0mM)中加入无水乙腈(20ml)、碳酸钾(2.0mM)、和对溴代苯甲基溴(2.0mM)。将混合物回流3小时，并用TLC监控反应过程。真空除去多余溶剂直至干燥，并从热二氯甲烷中重结晶标题化合物(极少量)。分离淡黄色结晶固体并干燥。
熔点160-161℃红外数据CM-1KB2基质3323；3146；1670；1622。
1H NMRd6DMSOδ＝5.26(s；2H；CH2)；7.3(dd；1H；H4)；7.49-7.75(m，9H；PhBr；NH2；PhO)13C NMRd6DMSOδ＝114.031；118.123；120.402；121.295；129.704；130.107；131.690；136.094；136.723；158.371；167.843.
质谱m/2EI307(M＋1)；262；212；169(100％)；101；90。
元素分析预计值C55.26％；H3.29％；N4.61％实测值C54.61％；H3.66％；N4.47％。
实施例43-(4-氟代苄氧基)苯甲酰胺(化合物NU1015)在氮气氛下向3-羟基苯甲酰胺(2.0mM)中加入无水乙腈(20ml)、碳酸钾(2.0mM)、和对氟代苯甲基溴(2.0mM)。将混合物回流14小时，并且TLC监控反应过程。真空除去多余溶剂直至干燥，并从热二氯甲烷中重结晶标题化合物(极少量)。分离白色结晶固体并干燥。
熔点161-162℃红外数据KBg基质Cm-13366；3171；1H NMRd6DMSOδ＝5.23(s；2H；CH2)；7.26-7.68(m；9H；NH；aromatics)；8.11(s；1H；H4)13C NMRd6DMSOδ＝68.914；113.951；115.405；115.821；118.124；120.329；129，329；130.25 5；130.421；133.487；136.056；158.464；159.692；164.546；167.853.
元素分析预计值C67.2；H4.8N5.6实测值C67.79；H4.81；N5.65实施例5
3-(3-硝基苄氧基)苯甲酰胺(化合物NU1017)在氮气氛下向3-羟基苯甲酰胺(2.0mM)中加入无水乙腈(20ml)、碳酸钾(2.0mM)、和间硝基苯甲基溴(2.0mM)。将混合物回流3小时，并用TLC监控反应过程。真空除去多余溶剂直至干燥，并从热二氯甲烷中重结晶标题化合物(极少量)。分离白色结晶固体并干燥。
熔点162-163℃红外数据Kbr基质3362；3171；1655；1622。
质谱EIm/z272(M+)；136(100％)；105；90；77。
1H NMRd6DMSOδ＝5.42(s；2H；CH2)7.28-7.33(m；1H；Hα)；7.45-7.66(m；4H；NH；H2；H5；H6)；7.8(t；1H；H5′)；8.0(m2H；NH；H6′)；8.3(m1H；H4′)8.4(m；1H；H2′)13C NMRd6DMSOδ＝68.354；114.041；118.124；120.589；122.317；123.120；129.812；130.435；134.406；136.132；139.661；148.185；158.185；167.774.
元素分析预计值C61.76；H4.41；N10.11实测值C61.53；H4.32；N10.01实施例63-(N-乙酰基-4-氨基苄氧基)苯甲酰胺(化合物NU1030)向来自实施例2的化合物NU1013中(100mg；0.375mM)加入硫代乙酸(2ml)，将其于室温下搅拌直至反应完全。反应后进行T.L.C.10％甲醇90％CH2Cl2。然后层析分离产物，从乙酸乙酯和乙醚重结晶，生成白色固体(30％)熔点198-199℃1H NMRδ2.19(s；3H；CH3)；5.2(s；2H；CH2)；7.3(m；1H；H4)；7.4-7.8(m；8H；NH；H2；H5；H6；H2′；H3′；H4′；H6′)8.1(s；1H；NH)；10.1(s；1H；HNCO)
13C NMRδ29.223，74.412，118.899，123.013，124.087，125.108，133.699，134.557，136.463，140.921，144.296，163.685，172.781.
实施例73-(胡椒基氧代)苯甲酰胺(化合物NU1020)第1步——胡椒基氯化物的制备将胡椒基醇(1g；6.57mM)溶于乙醚中(10ml)，向其中缓缓加入浓盐酸(3.81ml)。将其搅拌30分钟。除去多余溶剂得到无色油状物，在4℃结晶(99％)。
1H NMRd4.8(S，2H，CH2)6.2(S，2H，OCH20)；7.0(m，3H，芳香族化合物)。
第2步——胡椒基BOB的制备向3-羟基苯甲酰胺(137mg；1mM)中加入碳酸钾(138mg；1mM)并将其在氮气氛下溶于无水乙腈中。向其中加入胡椒基氯化物(270mg；1mM)，使混合物回流15小时。将有机物萃取到二氯甲烷(3×20ml)中，在硫酸镁上方干燥，并真空除去溶剂。用层析技术分离产物，以20％汽油80％乙酸乙酯作洗脱剂。分离白色固体，将其从热水中重结晶(97％)的。
熔点141-142℃1H NMRd6DMSOδ5.1(s；2H；CH2)；6.1(s，2H；OCH2O)；7.1(m；3H；H2′；H5′；H6′)；7.25(dd；1H；H4)；7.5(m；4H；NH；N2；H5；H6)；8.05(s；1H；NH)13C NMRd6DMSOδ69.02；101.36；108.40；108.80；114.01；118.12；120.20；121.89；129.65；136.00；147.20；146.62；158.53；167.84.
质谱EI271(M+)；135(100％)元素分析预计值C66.42；H4.79；N5.16实测值C66.18；H4.47；N4.94
实施例83-(4-三氟甲基苄氧基)苯甲酰胺(化合物NU1036)在氮气氛下将3-羟基苯甲酰胺(0.137g；1mmol)溶于无水乙腈中(20ml)。向其中加入碳酸钾(0.138g；1mmol)和4-(三氟甲基)苄基溴(0.155ml；1mmol)。将该混合物回流17小时。
反应后进行TLC。反应完全后减压除去乙腈，得到白色固体，将其溶于水中。将有机物萃取到二氯甲烷中(3×30ml)，在硫酸镁上方干燥，过滤并减压除去溶剂，得到白色结晶固体，将其从沸腾的乙酸乙酯和汽油(60-80)中重结晶。M/Z(EI)295(35％；M+)159(100％)1H200MHzd6DMSOδ5.4(2H；s；CH3)；7.3(1H；m；H4)；7.6(4H；m；NH；H2；H5；H6)7.8(ZH；d；H2′；H6′)；7.9(2H；d；H3′；H5′)；8.1(1H；s；NH)13C68.726；114.011；118.125；120.513；125.627；125.693；128.305；129.007；129.774；136.133；142.136；158.296；167.852元素分析预计值C61.02；H4.06；N4.75实测值C61.05/60.91；H3.94/3.96；N5.06/4.86。
实施例93-(4-氰基苄氧基)苯甲酰胺(化合物NU1037)在氮气氛下将3-羟基苯甲酰胺(0.137g；1mmol)溶于无水乙腈中(20ml)。向其中加入碳酸钾(0.138g；1mmol)和4-(氰基)苄基溴(0.155ml；1mmol)。将该混合物回流5小时。
反应后进行TLC。反应完全后减压除去乙腈，得到白色固体，将其溶于水中。将有机物萃取到二氯甲烷中(3×30ml)，在硫酸镁上方干燥，过滤并减压除去溶剂，得到白色结晶固体，将其从沸腾的乙酸乙酯和汽油(68％)中重结晶。
M/Z(EI)252(18％M+)；153；116(75％)；IR cm-13362，3179(amide NH2)；2228(C≡N)1H 200MHzd6DMSOδ5.4(2H；s；CH2)；7.3(1H；m；H4)；7.65(6H；m；H2；H5；H6；NH；H2′；H6′；)；8.0(2H；d；H3′；H5′).
13C68.685；110.848；113.999；118.153；119.089；120.555；128.385；1293792；132.775；136.133；143.080；158.222；167.815.
元素分析预计值C71.43；H4.76；N11.11实测值C71.27；H4.96；N10.67。
实施例103-(4-羧甲基苄氧基)苯甲酰胺(化合物NU1041)向3-羟基苯甲酰胺(1.37g；10mmol)中加入碳酸钾(1.38g10mmol)和4-氯甲基苯甲酸甲酯(1.84g；10mmol)于无水乙腈(50ml)。将该混合物回流加热5小时。
减压除去乙腈将将固体溶于水中。将有机物萃取到二氯甲烷中(3×50ml)并汇集在一起。将溶剂在硫酸镁上方干燥并减压除去。
将固体从沸腾的乙酸乙酯和汽油中重结晶，收集并干燥(65％)。IRcm-1，3331；3154，2959.M/Z；285(48％；M+)，254(38％)；149(100％)121(75％).1Hd6DMSOδ＝3.9；(3H；s；CH3)，5.25(2H；OCH2Ph)，7.25(1H；d，H4)，7.4(5H；m；NH2；H2；H5；H6)，7.6(2H；d；H2′；H6′)，709(2H；d；H3′；H5′).13CS2.418；68.948. 114.016；118.093；120.459；127.792；129.299；129.669；136.097；142.786；158.33；166.312；167.822.
元素分析预计值C67.37％；H5.26％；N4.91％。
实测值C67.19％；H5.16％；N4.78％。
实施例113-(2-硝基苄氧基)苯甲酰胺(化合物NU1042)向3-羟基苯甲酰胺(0.137g；1mmol)中加入碳酸钾(0.138g；1mmol)和2-硝基苯甲基溴(0.216g；1mmol)于无水乙腈中(10ml)。将混合物回流加热5小时。
减压除去乙腈并将固体溶于水中。将有机物萃取到二氯甲烷中(3×20ml)并汇集在一起。将溶剂在硫酸镁上方干燥并减压除去。
将固体从沸腾的乙酸乙酯和汽油中重结晶，收集并干燥。IR cm-13368；3196，M/Z272(3.8％；M+)；248；217；196；181；136(100％)，1Hd6DMSO；δ＝5.5(2H；OCH2Ph)，7.14(1H；d，H4)，7.4(4H；m；NH；H2′；H5′；H6)，7.26(2H；m；H5′；H4′)，8.0(1H；br；NH)；8.02(1H；d；H3′)，13C66.783；113.854；118.172；120.753；125.183；129.490；129.549；132.679；132.339；136.136.；147.786；158.112；167.778.
元素分析要求值C61.76％；H4.41％；N10.29％实测值C61.49％；H4.42％；N10.11％。
实施例123-(4-羧基苄氧基)苯甲酰胺(化合物NU1052)向3-(4-羧甲基苄氧基)苯甲酰胺(化合物NU1041)(0.03g；0.1mmol)中加入甲醇(3ml)和氢氧化钠水溶液(1M；3ml)。将其加热到40℃，监测该反应。当初始物质消失后酸化该溶液(逐滴加入HCl水溶液)，并萃取到乙酸乙酯中(3×30ml)。汇集有机物，在硫酸镁上方干燥，并减压除去溶剂。得到白色结晶固体。
实施例133-(苯乙基)氧代苯甲酰胺(化合物NU1048)将3-羟基苯甲酰胺(500mg；3.6mM)溶于无水乙腈中(36ml)，向其中加入碳酸钾(0.503g；3.6mmol)和2-(溴乙基)苯(0.498ml；3.6mmol)。将混合物回流加热两天。减压除去乙腈得到白色固体。将其溶于水中并萃取到二氯甲烷中(3×30ml)。将有机物汇集在一起，在硫酸镁上方干燥，过滤并减压除去溶剂，得到白色固体。从沸腾的乙酸乙酯和汽油中重结晶(0.459g；12.51％)。MPt132-136℃.1H200MHz CDC133.05(2H，t，H8)；4.2(2H，t，H7)；6.00(1H，br s，NH)；7.04(1H，m，H4)；7.27(9H，m，NH；aromatic).IR cm-13300(NH2)；1666(CO)；2930(C＝C).M/Z(EI)；241(M+；18％)；105(-COHN2；100％).
元素分析预计值％C15H15O2N C74.4，H6.20，N5.79；实测值％C74.7，H6.2，N5.8。
实施例143-烯丙基氧化苯甲酰胺(化合物NU1031)在氮气氛下向3-羟基苯甲酰胺(274mg；2.0mM)中加入碳酸钾(276mg；21.0mM)。将其溶于含烯丙基溴(169μl；2.0mM)的乙腈(20ml)中。将混合物回流5小时，反应后进行T.L.C.10％甲醇90％CH2Cl2。真空除去多余溶剂，将有机物萃取到二氯甲烷中，干燥，除去溶剂，生成白色固体。将其从热水中重结晶，生成白色“长条”固体(63％)，为最终产物。
熔点116-117℃1H NMRδ＝4.7(m；2HHe，Hf)；5.5(m；2H；Hh，Hi)；6.2(m；1H；Hg)；7.2(m；1H；Hd)；7.6m；4H； Ha，Hb，Hc，NH)；8.1(s；1H；NH).
13C NMRδ＝68.580，113.821，117.978，129.661，133.893，136.025，158.371，167.892.
质谱EI177(M+)；41(100％)实施例153-(肉桂基氧基)苯甲酰胺(化合物NU1050)将3-羟基苯甲酰胺(0.5g 3.6mmol)溶于无水乙腈中(50ml)。向其中加入碳酸钾(0.503g；3.6mmol)和肉桂基氯化物(0.5ml；3.6mmol)。将其回流3.5小时。减压除去乙腈生成白色固体，将其溶于水(80ml)。将有机物萃取到二氯甲烷中(3×30ml)，在硫酸镁上干燥，过滤并减压除去溶剂，剩下白色固体。从乙酸乙酯和汽油中使固体重结晶(45％)。MPt131-138℃.M/Z137(36％)；165(100％，cinnamyl+)，94(48％)；77(24％).IR cm-13400&3200(NH2)，1600(C＝O).1H200MHz d6DMSO 4.88(2H，d，H7)；6.65(1H，m，H8)；6.94(1H，m，H4)；7.24(1H，m，H4)；7.5(9H，m，aromatic&NH)；8.1(1H，s，NH).
元素分析预计值C75.9％；H5.9％；N5.5％；实测值C76.07％；H5.85％；N5.56％。
实施例162-甲基苯并噁唑-4-羧酰胺(化合物NU1056)第1步——制备(3-羟基-2-硝基)苯甲酸甲酯将3-羟基-2-硝基苯甲酸(5g；27.32mM)溶于无水甲醇中(200ml)。将无水氯化氢气体鼓入溶液直至饱和。然后将混合物回流20小时(反应后进行T.L.C10％甲醇/90％二氮甲烷)。然后，真空除去溶剂，生成棕色固体。将固体溶于水中(100ml)并加入碳酸氢钠直至泡腾停止。将氯化钠加入水溶液中，将产品萃取到乙酸乙酯中(3×50ml)。将汇集的等分试样在酸硫钠上方干燥并真空除去溶剂，生成棕黄色固体。
T.L.C.(同前)r.f.(比移值)0.53NMR200MHzd6DMSOδ＝3.9(s；3H；OCH3)；7.1(m；1H；H4)；7.35(m；1H；H6)；7.8(t；1H；H5)产率92％。
第2步——(2-氨基-3-羟基)-苯甲酸甲酯的制备在氮气氛下将钯/碳催化剂悬浮在无水甲醇(150ml)中。向该悬浮液中加入来自步骤1的(3-羟基-2-硝基)苯甲酸甲酯(4g；20.3mM)。将混合物在氢气氛下放置4.5小时。通过硅藻土饼过滤除去催化剂，并从滤液中除去溶剂，生成橙/棕色产物。T.L.C.40％乙酸乙酯/60％石油醚60/80。
比移值0.33NMR 200mHzd6DMSOδ3.81(s；3H；OCH3)；6.2(broad；2H；NH2)；6.5(t；1H；H5)；6.9(m；1H；H6)7.3(m；1H；H4)9.8(s；1H；OH)产率83％。
第3步——2-甲基苯并噁唑-4-羧酸甲酯的制备向(2-氨基-3-羟基)-苯甲酸甲酯(3g；18.01mM)于间二甲苯(150ml)的溶液中加入乙酰氯(1.518ml；21.6mM)。形成沉淀，将其搅拌30分钟。加入三乙胺(2.97ml；21.6mM)，则溶液变透明。加入吡啶鎓-对-甲苯磺酸(1.2g；21.6mM)，并将混合物回流34小时。蒸馏(真空)除去溶剂生成棕色固体，将其进行柱层析(50％乙酸乙酯/50％汽油60/80)得到目的产物，为黄色固体。
T.L.C.同上。1HNMR200MHz；CDCl3；δ2.69(3H；s；2-CH3)3.99(3H；s；OMe)；7.33(3H；t；H6)；7.63(1H；dd；H7)7.94(1H；dd；H5)第4步——2-甲基苯并噁唑-4-羧酸的制备将2-甲基苯并噁唑-4-羧酸甲酯(0.1g；0.523mmol)溶于甲醇(3ml)中，向其中加入氢氧化钠水溶液(0.2M，3ml)。将混合物在40℃搅拌4小时并用盐酸(6M)酸化直至PH＝1.0。将混合物用乙酸乙酯(3×20ml)萃取，将合并的有机层用水洗涤(2×20ml)，干燥(MgSO4)并减压去溶剂得到羧酸(0.068g，73％)。
第5步——2-甲基苯并噁唑-4-羧酰胺的制备在氮气氛下搅拌2-甲基苯并噁唑-4-羧酸(0.1g，0.28mmol)于无水THF(10ml)中的溶液，加入亚硫酰氯(0.022ml，0.31mmol)和DMF(0.1m)，将混合物于室温再搅拌5小时。加入氨水(0.5ml)，再搅拌混合物30分钟。减压除去溶剂，将残余固体溶于水(20ml)中，用乙酸乙酯(3×20ml)萃取溶液。合并有机层，用水洗涤(2×20ml)干燥(MgSO4)。减压除去溶剂得到羧酰胺(0.083g，84％)。
1H(200HHz)CDCl3δ＝6.0(brs，1H，NH)，7.4(t，1H，H6)，7.6(dd，1H，H7)，8.15(dd，1H，H5)，8.8(brs，1H.NH).
实施例16a2-甲基苯并噁唑-4-羧酰胺(化合物NU1056)对上述实施例16中描述的方法加以修改，按下述方法直接从第1步中的产物制备2-甲基苯并噁唑-4-羧酸甲酯。
将来自第1步中的3-羟基-2-硝基苯甲酸甲酯(0.1g；0.59mmol)溶于无水乙醇中(20ml)，向其中加入乙酰亚胺乙酯盐酸化物(0.067；059mmol)。将反应混合物回流加热24小时。减压除去乙醇生成棕色结晶固体。将其溶于乙酸乙酯中(3×20ml)，生成过剩的乙酰亚胺乙酯盐酸化物沉淀。滤出过剩的亚胺酯并用氢氧化钠溶液洗涤该溶液(0.1N；3×20ml)，再用水洗涤(3×50ml)。将溶剂在硫酸镁上方干燥并减压除去，余下橙色结晶固体(0.1265g；85％)。
实施例172-叔丁基苯并噁唑-4-羧酰胺(化合物NU1040)将2-氨基-3-羟基苯甲酸酯(0.1g；0.598mmol)溶于间-二甲苯中并加热至70℃。向其中加入新戊酰氯(0.117ml；0.958mmol)，于是发现有棕色沉淀生成。在加入三乙胺(0.099ml；0.958mmol)和吡啶鎓-4-甲苯磺酸酯(0.04g；0.958mmol)之前将混合物搅拌30分钟。然后将混合物回流加热26小时。减压除去间二甲苯生成粘稠的棕色固体。将固体溶于水中(50ml)并将有机物萃取到乙酸乙酯中(3×30ml)，合并，在硫酸镁上方干燥，过滤并减压除去溶剂。
通过硅胶柱层析纯化标题化合物，用1∶1乙酸乙酯∶汽油作洗脱剂，生成黄色固体(69％)。IR cm-13040(3×CH3)，1709(C＝O).M/z；233(63％；M+)；218(50％；-CH3)202(42％；-OCH3)；186(100％)；173(12％；-CH3)；160(33％)；146(62％)；117(43％).1Hd6DMSOδ＝1.17(9H；s；(CCH3)3)；3.99(3H；s，OCH3)；7.31(1H；t；H6J＝8HZ)，7.66(1H；ddH7；J＝7.8，1Hz)，7.95(1H；dd；H5J＝7，1Hz).
(b)第2步——2-叔丁基苯并噁唑-4-羧酰胺的制备将2-叔丁基-4-苯并噁唑羧酸甲酯(0.1g；0.46mmol)溶于甲醇中(5ml)，向其中加入氨水(5ml)。将混合物加热到40℃并在室温下搅拌6小时。反应完全后减压除去溶剂，并从沸腾的乙酸乙酯和汽油中使产物重结晶(73％)。
IR cm-13395；3304(amide NH)；3163(3×CH3)，M/Z；218(96％；M+)；202(43％；-NH2)186(85％；-CONH2)；175(77％)；160(35％)146(79％)；133(23％)；41(100％).
1HCDCl3δ＝1.44(9H；s；(CCH3)3)；5.95(1H；brs；NH)；7.34(1H；t；H6J＝8Hz)，7.6(1H；ddH7；J＝7，&2Hz)8.07(1H；dd；H5J＝6.7，2Hz)；8.88(1H；brs；NH)13C 28.416(3×CH3)，34.372(CCH3)，113.905(Ar)，123.277(Ar)，124.338(Ar)，124.338(Ar)，125.440(Ar)，139.371(O-Ar).150.804(N-Ar)，166.457(Ar)，174.471(C＝O amide).
CHNFoundC65.915％；H6.39％；N12.48％，RequiredC66.038％；H6.465％；N12.835％.
实施例182-苯基苯并噁唑-4-羧酰胺(化合物NU1051)(a)第1步-—苯基亚胺乙酯盐酸化物的制备将苄腈(0.514ml；5mmol)加入无水乙醇中(0.69g)。将无水氯化氢气体鼓入溶液中直至饱和。搅拌混合物20小时。收集白色结晶固体并干燥。mpt125-130℃IRcm-1，2856，1631.M/Z；148(M+，30％)，105(100％)；1Hd6DMSO；δ＝1.5(3H；t，J＝7Hz；CH2CH3)，4.75(2H；q，J＝6.9Hz；CH2CH3)，8.0(5H；m；aromatics).
元素分析预计值C58.25；H6.51；N7.54；实测值C58.13；H6.43；N7.36。
(b)第2步——2-苯基苯并噁唑-4-羧酸甲酯的制备向2-氨基-3-羟基苯甲酸甲酯中(0.10g；0.59mmol)加入于无水乙醇中(20ml)的苯基亚胺乙酯盐酸化物(0.167g；0.998mmol)。将其回流20小时，反应后进行TLC(1∶4乙酸乙酯∶汽油)。
减压下除去乙醇并将固体溶于水中(20ml)，将有机物萃取到乙酸乙酯中(3×20ml)，合并，用氢氧化钠溶液(2×10ml；0.2M)和水(2×10ml)洗涤，然后在硫酸镁上方干燥。减压除去溶剂生成黄色固体。用快速色谱法分离标题化合物(洗脱液进行TLC)，生成灰白色结晶固体(85％)。
5IRcm-1，1714.1Hd6DMSOδ＝4.1(3H；s；OCH3)，7.39(1H；t；J＝6Hz；H6)，7.5(3H；m；H3′；H4′；H5′)，7.78(1H；dd J＝7.0，1.0Hz；H7；)，8.0(1H；dd；J＝6.67&1.14Hz；H5′)，8.3(2H；m；H2′；H6′).
(c)第3步—-2-苯基苯并噁唑-4-羧酰胺的制备向2-苯基苯并噁唑-4-羧基甲酯(0.02g；0.0905mmol)于甲醇(3ml)的溶液中加入氨水(3ml)。将其加热到40℃并搅拌，同时用TLC(1∶4乙酸乙酯∶汽油)监测反应。当所有原料进行反应以后，形成了白色沉淀。除去溶剂生成白色固体，从乙酸乙酯和汽油中使之重结晶(70％)。
熔点199-201℃1HCDCl3δ＝6.02(1H；brsNH)；7.43(1H；t；H6；J＝8Hz)，7.57(3H；mH3′；H4′；H5′)，7.74(1H；dd；H7；J＝1Hz，&7Hz)；8.23(1H；dd；H5；J＝1Hz&7.3Hz)；8.27(2H；m；H2′；H6′)，8.97(1Hbrs；NH).13C；M/z；(EI)；238(m+；100％)；222(-NH268％)；195(-CONH2；98％).IR cm-13383；3165.
元素分析预计值C70.58，H4.23，N11.76。
实测值C70.41，H4.24，N11.77。
实施例192-(4-硝基苯基)苯并噁唑-4-羧酰胺(化合物NU1053)(a)第1步--3-羟基-2-(N-4-硝基苯甲酰基)氨基苯甲酰甲酯的制备将2-氨基-3-羟基苯甲酸甲酯(0.5g；2.99mmol)溶于间-二甲苯(40ml)中并加热至60℃逐滴加入4-硝基苯甲酰氨(0.556ml；2.99lmmol)，将其搅拌4小时。将溶液冷却至室温并减压除去间二甲苯。将固体溶于水中(100ml)，并将有机物萃取到乙酸乙酯中(3×50ml)。合并有机部分，在硫酸镁上方干燥，过滤并减压除去溶剂。
通过柱层析(1∶4乙酸乙酯∶汽油为洗脱剂)纯化标题化合物，生成橙色固体(49％)。IRcm-13443(OH)，2953，1697，1649，1404，M/Z；316(15％M+).1HCDCl3δ＝3.95(3H；s；OCH3)，7.25(1H；t；H5J＝8Hz)，7.31(1H；dd；H4，J＝6，&2Hz)，7.67(1H；dd；H6，)；8.26(2H；dd；H2′；H6′J＝2.3Hz)；8.30(2H；dd；H3′；H5′J＝2.2Hz)；9.81(1H；s；OH)；12.30(1H；s；NH).
(b)第2步——2-(4-硝基苯基)苯并噁唑-4-羧基甲酯的制备将3-羟基-2-(N-4-硝基苯甲酰基)氨基苯甲酸甲酯(0.1g；0.34mmol)溶于间二甲苯(20ml)中，向其中加入三乙胺(0.033ml；0.45mmol)和吡啶鎓-4-甲苯磺酸酯(0.070g；0.28mmol)。将其回流32小时。减压除去间二甲苯并将残余固体溶于水中。将有机物萃取到乙酸乙酯中(3×30ml)，干燥，过滤并减压除去溶剂，生成砖红色固体(74％)。IRcm-1，1726；1522；1556，M/Z；298(84％，M+)267(100％，-OCH3)，240(-CO)1HCDCl3δ＝4.01(3H；s；OCH3)，7.44(1H；t；H6J＝8.1Hz)，7.76(1H；dd；H7，；J＝7.2，&1Hz)，8.04(1H；dd；H5，)，8.35(2H；dd；H2′；H6′J＝2.2Hz)；8.46(2H；d；H3′；H5′J＝2.2Hz).
(c)第3步——2-(4-硝基苯基)苯并噁唑-4-羧酸的制备将2-(4-硝基苯基)苯噁唑-4-羧基甲酯(0.1g，0.335mmol)溶于甲醇中(3ml)，向其中加入氢氧化钠水溶液(0.2M，3ml)。将混合物于40℃搅拌4小时并用盐酸(6M)酸化至PH＝1.0。用乙酸乙酯(3×20ml)萃取混合物，用水(2×20ml)洗涤合并的有机层，干燥(MgSO4)并减压除去溶剂，得到羧酸(0.084g，89％)。
(d)第4步——2-(4-硝基苯基)苯并噁唑-4-羧酰胺的制备在氮气下搅拌2-(4-硝基苯基)和苯并噁唑-4-羧酸(0.084g，0.29mmol)于无水THF(10ml)中的溶液，并加入亚硫酰氯(0.022ml，0.31mmol)和DMF(0.1ml)，将混合物于室温再搅拌5小时。加入氨水(0.5ml)并将混合物再搅抖30分钟。减压除去溶剂，将残余固体溶于水中(20ml)，并用乙酸乙酯萃取溶液(3×20ml)。合并有机层，用水洗涤(2×20ml)并干燥(MgSO4)。减压下除去溶剂得到羧酰胺(0.07g，85％)。
实施例202-(4-甲氧苯基)苯并噁唑-4-羧酰胺(化合物NU1054)(a)第1步——3-羟基-2-(N-4-甲氧基苯甲酰基)氨基苯甲酰甲酯的制备将2-氨基-3-羟基苯甲酸甲酯(0.5g；2.99mmol)溶于间-二甲苯(40ml)中并加热至60℃逐滴加入4-甲氧基苯甲酰氯(0.509g；2.99mmol)，将其搅拌3小时。将溶液冷却至室温并减压除去间二甲苯。将固体溶于水中(100ml)，并将有机物萃取到乙酸乙酯中(3×50ml)。合并有机部分，在硫酸镁上方干燥，过滤并减压除去溶剂。
通过柱层析(1∶4乙酸乙酯∶汽油为洗脱剂)纯化标题产物并从沸腾的乙酸乙酯/汽油中重结晶，生成砖红色固体(33％)。IRcm-13100(OH)2571，1691，1643，1606，M/Z；301(23％，M+)，270(-OCH3)，135(100％，COPHOCH3)1HCHCl3δ＝3.87((3H；s；OCH3)；3.93(3H；s；COOCH3)，7.02(2H；dd；H5′；H3′)； 7.14(1H；t；H5J＝8Hz)，7.29(1H； dd；H4，；J＝6.3，&1.7Hz)，7.63(1H；dd；H6)；8.03(2H；dd；H2′； H6′)；10.38(1H；s；OH)；11.98(1H；s；(b)第2步——2-(4-甲氧基苯基)苯并噁唑-4-羧基甲酯的制备将3-羟基-2-(N-4-甲氧基苯甲酰基)氨基苯甲酸甲酯(0.05g，0.166mmol)溶于间二甲苯(20ml)中，向其中加入三乙胺(0.016ml；0.215mmol)和吡啶鎓-4-甲苯磺酸酯(0.034g；0.13mmol)。将其回流58小时。减压除去间二甲苯并将残余固体溶于水中。将有机物萃取到乙酸乙酯中(3×30ml)，干燥，过滤并减压除去溶剂，生成固体(74％)。IR cm-11718，1614，1502.M/Z；283(45％，M+)252(31％，-OCH3)，225，63(100％).1HCDCl3δ＝3.88(3H；s；COOCH3)；6.9(2H；d；H3′；H5′)；7.35(1H；t；H6)，7.74(1H；dd；H7；)，7.96(1H；dd；H5)；8.2(2H；d；H2′；H6′).
(c)第3步——2-(4-甲氧基苯基)苯并噁唑-4-羧酰胺的制备将2-(4-甲氧基苯基)苯并噁唑-4-羧基甲酯溶于氨水中(30ml)并封闭在高压釜中。将反应混合物置于55℃、20巴，＞20小时，反应结束后除去氨，从沸腾的乙酸乙酯和汽油中使所得固体重结晶。
实施例213-(5-溴代戊氧基)苯甲酰胺(化合物NU1019)将3-羟基苯甲酰胺(0.5g，3.65mmol)、1，5-二溴戊烷(1.82，1.1ml，7.3mmol)和碳酸钾(500mg，3.65mmol)的混合物在乙腈中(18ml)回流(2小时)直至TLC监测反应结束。旋转蒸发除去溶剂，生成白色粘稠固体，将其层析(在硅胶上，10％甲醇于二氯甲烷中的溶液)得到白色固体。将其从汽油与乙酸乙酯的混合物中重结晶，生成白色片状结晶(0.744g，2.6mmol，70％产率)。mp.98-99℃。δH(200MHz，d6-DMSO)8.09(1H，s，NH)，7.49(4H，m，H2，5，6 andNH)，7.1(1H，d，J 7.99，H4)，4.11(2H，t，J 6.2，CH2O)，3.67(2H，t，J 6.6，2H)，1.90(4H，m，CH2CH2CH2)，1.62(2H，m，CH2)；δC(200MHz，d6-DMSO)168(CO)，158.85(C3)，129.63(C2)，120(C4)，117.79(C6)，113.53(C5)，67.73(OCH2)，35.36(CH2Br)，32.30(CH2CH2O)，28.12(CH2CH2Br)，24.63(OCH2CH2CH2)；M/Z(EI)285(M+).
元素分析实测值C50.71％，H5.36％，N4.95％，C15H22NO2Br要求值C50.366％，H5.636％，N4.895％
实施例223-(8-N9-腺嘌呤-辛基氧基)苯甲酰胺(化合物NU1022)在高压反应器中装入3-〔8-N7-(6-氯嘌呤)辛基氧基〕-苯甲酰胺、3-(8-N7(6-氯嘌呤)辛基氧基)苯甲酰胺和氨水的混合物(110mg，0.27mmol)，高压加热(64℃，30巴，16小时)。蒸出氨，剩下黄色固体，将其进行层析(硅胶，15％甲醇/二氯甲烷)得到淡黄色固体，将其从甲醇中重结晶(56mg，0.17mmol，62％产率)。mp 199-199.5℃.ν cm-1；δH(200MHz，d6-DMSO)8.24(1H，s，purine H8)，8.23(1H，s，purine H2)，8.06(1H，s，CONH).7.55-7.39(4H，m，CONHand aromatic H2，5，6)，7.30(2H，s，NH2)，7.17-7.13(1H，m，aromatic H4)，4.23(2H，t，J7，OCH2)，4.07(2H，t，J6.3，CH2N)，1.94-1.76(4H，m，OCH2CH2and CH2CH2N)，1.40(8H.m，alkyl env)；δC(200MHz，d6-DMSO)167.998(CO)，158.847(C3)，152.711(pC8)，141.206(pC2)，136.047(C1)，129.667(C5)，119.967(C6)，117.8 66(C4)，113.592(C2)，67.900(OCH2)，43.221(NCH2)，29，698(OCH2CH2)，28.961(OCH2CH2CH2and NCH2CH2)，26.313(OCH2CH2CH2CH2)，25.762(NCH2CH2CH2CH2)；m/z 338(M+).
元素分析
实测值C62.42，H6.48，N21.89，C20H26N6O2要求值C62.81，H6.85，N21.97％。
实施例233-〔5-(6氯嘌呤-9-基)戊基氧基〕苯甲酰胺(化合物NU1023)将3-(溴代戊基氧基)苯甲酰胺(500mg，1.7mmol)、6-氯嘌呤(270mg，1.7mmol)和碳酸钾(240mg，1.7mmol)于DMF(7.5ml)中的溶液在室温搅拌2天。然后真空(0.001mmHg)除去溶剂，将白色固体(N7与N9异构体的混合物)层析(硅胶，10％甲醇/CH2Cl2)，得到透明的单一产物(N9异构体)。用乙醚(＝5ml)进行研制，得到白色固体，使其从乙酸乙酯中重结晶，得到产物(120mg，0.33mmol，20％产率)mp.132-133℃νcm-1；δH(200MHz，d6-DMSO)8.88(1H，s，purine H8)，8.85(1H，s，purine H2)8.05(1H，s，CONH).7.56(4H，m，NH andaromatic H2，5，6)，7.15-7.10(1H，m，H4)，4.44(2H，t，J7，OCH2)，4.08(2H，t，J6.3，CH2N)，2.12-1.98(2H，m，OCH2CH2)，1.94-1.80(2H，m，NCH2CH2)，1.59-1.43(2H，m，CH2CH2CH2)；δC(200MHz，d6-DMSO)167.925(C0)，158.774(C3)，152.306(pC4)，151.760(pC8)，149.293(pC2)，136.019(C1)，131.175(pC6)，129.596(C5)，119.961(C6)，117.801(C4)，113.458(C2)，67.591(OCH2)，44.033(NCH2)，29.071(OCH2CH2)，28.337(CH2CH2N)，22.890(CH2CH2CH2)；m/z 360(M+).
元素分析实测值C56.73，H5.28，N19.4，C17H18N5O2Cl要求值C56.57％，H5.04％，H19.4％。
实施例243-(5-腺苷-9-基戊基氧基)苯甲酰胺(化合物NU1024)在高压反应器中装入3-〔5-N7-(6-氯嘌呤)戊基氧基〕-苯甲酰胺、3-(5-N9(6-氯嘌呤)戊基氧基)苯甲酰胺和氨水的混合物(392.1mg，1.1mmol)，高压加热(66℃，30巴，16小时)。蒸出氨，剩下黄色固体，将其进行层析(硅胶，甲醇/二氯甲烷)得到淡黄色固体，将其重结晶(203.5mg，0.6mmol，54％产率)。mp 148-149℃νcm-1；δH(200MHz，d6-DMSO)8.25(2H，m，purine H8，2)，8.06(1H，s，CONH)，7.61-7.38(4H，m，CONH and aromatic H2，5，6)，7.31(2H，s，NH2)，7.15-7.11(1H，m，H4)，4.27(2H，t，J＝7Hz，OCH2)，4.07(2H，t，J＝6.3Hz，CH2N)，2.05-1.78(4H，m，OCH2(CH2)3CH2H)，1.56-1.41(2H，m，NCH2CH2)，1.59-1.43(2H，m，CH2CH2CH2)；δC；m/z
实施例253-〔8-N9(6-氯嘌呤)-辛基氧基〕苯甲酰胺(化合物NU1027)将3-(溴代辛基氧基)苯甲酰胺(500mg，1.5mmol)、6-氯嘌呤(236mg，1.5mmol)和碳酸钾(210mg，1.5mmol)于DMF(7.5ml)中的溶液在室温搅拌2天。然后真空(0.001mmHg)除去溶剂，将余下的白色固体(N7与N9异构体的混合物)层析(硅胶，5％汽油/THF)，得到白色固态的单一产物(N9异构体)(74mg)，将其从乙醇中重结晶生成58.7mg(10％产率)。
mp 116-117℃
在递交国际申请时未提供此页干燥(0.001mmHg)生成喹唑啉酮标题化合物(如X-射线结晶学分析所示)1H NMRd6DMSOδ2.14(s；3H；CH3)；6.87(dd；1H；H7)；6.94(t；1H；H6)；7.29(dd；1H；H5)产率52％实施例278-羟基-2-(4-硝基苯基)喹唑啉-4-酮(化合物NU1057)将如实施例19(第2步)中所述获得的2-(4-硝基苯基)苯并噁唑-4-羟基甲酯(0.20g)溶于氨水(30ml)并封闭在高压釜中。将反应混合物于55℃、20巴放置20小时。在此状态下，预期的2-(4-硝基苯基)苯并噁唑衍生物似乎重排生成相应的喹唑啉酮衍生物，反应结束后除去氨，将所得固体从沸腾的乙酸乙酯和汽油中重结晶(84％)。IR cm-1，M/Z；283(38％，M+)267(100％，-NH2)，240(-CO)1HCDCl3δ＝7.35(1H；dd；H5)，7.5(1H；t；H6；)，7.7(1H；dd；H7)；8.45(2H；d；H2.；H6′)；8.79(2H；d；H3′；H5′)，9.98(1H；brs；NH)，12.8(1H；brs；NH).
与此类似，当试图制备苯噁唑-4-羧酰胺时，产物进行分子重排生成8-羟基-喹唑啉-4-〔3H〕酮(化合物NU1026)，其有很强的PARP抑制活性。
下面制备其它喹唑啉酮化合物的进一步的实施例具有特别重要意义。
实施例288-甲氧基-2-甲基喹唑啉-4-〔3H〕-酮(化合物NU1063)方法A(a)第一步——3-甲氧基-2-硝基苯甲酰胺的制备将3-甲氧基-2-硝基苯甲酸(0.1g，5.1mmol)、亚硫酰氯(0.55ml，7.6mmol)和二甲基甲(0.2ml)于THF(10ml)中的溶液在氮气下于25℃搅拌12小时。小心加入氨水(6ml)并将混合物再搅拌15分钟，减压除去溶剂并用冰冷的水洗涤所剩固体，收集固体(0.74g，75％)m.p.219-222℃.δH(200MHz，d6-DMSO)4.01(s，3H，OCH3)；7.41-7.46(dd，1H，Ar-4H)；7.55-7.60(dd，1H，Ar-6H)；7.69 7.77(m，1H，Ar-5H)；7.84(brs，1H，-NH)；8.31(brs，1H，-NH)；m/z196(34.3％，M+)νmax/cm-13350(br)，3180(br)，3000，2970，2920，2820，1675，元素分析实测值C49.03，H3.93，N13.97，C8H8N2O4要求值C48.98，H4.11，N14.28％。
(b)第2步——2-氨基-3-甲氧基苯甲酰胺的制备将3-甲氧基-2-硝基苯甲酰胺(0.5g，2.5mmol)溶于无水甲醇(40ml)中并用钯-碳催化剂(80mg)氢化。通过硅藻土过滤除去催化剂，收集残留产物(0.35g)并干燥。m.p.145-147℃δH(200MHz，d6-DMSO)3.88(s，3H，-OCH3)；6.40(brs，2H，-NH2)；6.54-6.62(t，1H，Ar-5H)；6.96-6.99(dd，1H，Ar-4H)；7.23(brs，1H，-NH)；7.29-7.33(dd，1H，Ar-6H)；7.85(brs，1H，-NH)；m/z166(43.8％.M+)νmax/cm-13480，3370，3330，3150，2970，2850，1680，1620.
元素分析实测值C57.54，H5.99，N16.61，C8H10N2O2要求值C57.82，H6.07，N16.86％。
(c)第3步——2-N-乙酰基氨基-3-甲氧基苯甲酰胺的制备向含吡啶(0.3ml，3.9mmol)的2-氨基-3-甲氧基苯甲酰胺(0.5，3mmol)于无水THF的溶液中逐滴加入于THF(2ml)中的乙酰氯，并将反应混合物在氮气氛下搅拌过夜。真空除去溶剂并用碳酸氢钠水溶液洗涤剩下的白色稀浆，过滤并用水洗涤。收集白色产物(0.19g，31％)并干燥。
m.p.243-246℃δH(200MHz，d6-DMSO)2.05(s，3H，-CH3)；3.88(s，3H，-OCH3)；7.14-7.18(dd，1H，Ar-4H)；7.21-7.25(dd，1H，Ar-6H)；7.33-7.41(m，2H，-NH and Ar-5H；7.53(brs，1H，-NH)；9.27(brs，1H，-NH)；m/z 208(16.6，M+)νmax/cm-13420，3240(br)，3160，3020，2980，2870，1660.
元素分析实测值C56.98，H5.38，N12.78，
C10H12N2O3，要求值C57.68，H5.81，N13.45％。
(d)最后步骤——8-甲氧基-2-甲基喹唑啉-4-〔3H〕-酮的制备将来自第3步的2-N-乙酰基氨基-3-甲氧基苯甲酰胺(0.07g，0.34mmol)溶于氢氧化钠水溶液中(2％w/v，2ml)并将溶液于25℃搅拌12小时。用稀盐酸溶液中和反应混合物，过滤收集生成的淤积沉淀并用水充分洗涤。从乙酸乙酯中重结晶标题化合物(0.043g，67％)m.p.202-204℃(升华)。
实施例28a8-甲氧基-2-甲基喹唑啉-4-〔3H〕-酮(化合物NU1063)另一种方法B在来自实施例28第2步的2-氨基-3-甲氧基苯甲酰胺(1.0g，6mmol)与在无水THF(25ml)中的吡啶(0.6ml，7.8mmol)的混合物中逐滴加入乙酰氯(0.9ml，13mmol)于THF(2ml)中的溶液，在氮气下将混合物搅拌过夜。真空除去溶剂，将残留的白色稀浆重新悬浮在2％氢氧化钠水溶液中并用盐酸水溶液中和，同时形成白色沉淀。过滤收集产物并从甲醇-水中重结晶(0.915g，80％)m.p.202-204℃(升华)。δH(200MHz，d6-DMSO)2.43(s，3H，-CH3)；3.97(s，3H，-OCH3)；7.37-7.50(m，2H，Ar-6/7H)；7.68-7.73(dd，1H，Ar-5H)；δC(d6-DMSO)；21.83(-CH3)；56.05(-OCH3)；114.96，116.99(Ar-67C)；121.95(C-CH3)；126.5(Ar-5C)；140.0(Ar-8AC)；153.26(Ar-8C)；154.33(Ar-4aC)；162.04(C＝O)；m/z190(96.6％，M+)νmax/cm-13171，3034，2903，1676，1620，1574，1483.Elemental analysisfound C62.14，62.36，H5.18，5.29，N14.23，14.36；C10H10N2O2requires C63.15，H5.30，N14.73％.
元素分析实测值C62.14，62，36，H5.18，5.29，N14.23，14，36；C10H10N2O2要求值C63.15，H5.30，N14.73％。
实施例298-羟基-2-甲基喹唑啉-4-〔3H〕-酮(化合物NU1025)(实施例26的另一种方法)在氮气下将于BBr3(1.0M，于CH3Cl2中)中的来自实施例28的8-甲氧基-2-甲基喹唑啉-4-〔3H〕-酮(0.7g，3.7mmol)的溶液回流加热24小时。真空蒸馏除去溶剂，用氢氧化钠溶液(10％w/v)水解所留残余物。用盐酸水溶液酸化生成白色沉淀，将其除去。用乙酸乙酯(3×30ml)萃取滤液，干燥(MgSO4)并真空除去溶剂。从丙-2-醇-水中重结晶，得到目标化合物(65％)m.p.253-258℃。δH(200MHz，d6-DMSO)2.48(s，3H，-CH3)； 7.22-7.41(m，2H，Ar＝6/7H)；7.57-7.62(dd，1H，Ar-5H)；9.57(s，1H，-OH)；12.26(s，1H，-NH)；δC(d6-DMSO)；21.72(-CH3)；115.78，118.42(Ar-6/7C)；121.76(C-CH3)；126.54(Ar-5C)；138.27(Ar-8aC)152.58(Ar-8C)；152.87(Ar-4aC)；162.05(C＝O)；m/z176(100％，M+)；νmax/cm-13320，3175，3030，2900，2800，1670.
元素分析实测值C61.39，H4.54，N15.88，C9H8N2O2要求值C61.36，H4.58，N15.94％。
实施例308-甲氧基-2-苯基喹唑啉-4-〔3H〕-酮(化合物NU1065)方法A(a)第1步——2-N-苯甲酰基氨基-3-甲氧基苯甲酰胺的制备向含有吡啶(0.3ml，3.0mmol)的来自实施例28第2步的2-氨基-3-甲氧基苯甲酰胺(0.5g，3mmol)于无水THF(15ml)的搅拌下的溶液中逐滴加入于THF(2ml)中的苯甲酰氯(0.4ml，3.3mmol)。将反应混合物在氮气下于25℃搅拌。真空下除去溶剂，得到白色稀浆，用碳酸氢钠溶液洗涤之，过滤并用水洗涤。从甲醇-水中重结晶，生成标题化合物(0.2g，41％)。
m.p.176-180℃。δH(200MHz，d6-DMSO)3.88(s，3H，-OCH3)；7.24-7.32(m，2H，Ar-4/6H)；7.41-7.49(m，2H，-NH，Ar-5H)；7.59-7.73(m，4H，-NH，Ph-3′/4′H)；8.04-8.08(dd，2H，Ph-2′H)；9.85(s，1H，-NH)；mlz270(74.6％，M+).
(b)第2步——8-甲氧基-2-苯基喹唑啉-4-〔3H〕-酮的制备将2-N-苯甲酰基氨基-3-甲氧基苯甲酰胺(0.2g，0.74mmol)溶于氢氧化钠水溶液中(2％w/v，2ml)，将溶液于室温搅拌12小时。用盐酸中和反应混合物，过滤收集形成的白色沉淀，从甲醇/水中重结晶(0.12g，65％)m.p.252-256℃。
实施例30a8-甲氧基-2-苯基喹唑啉-4-〔3H〕-酮(化合物NU1065)另一种方法B向2-氨基-3-甲氧基苯甲酰胺(1.0g，6mmol)(来自实施例28第2步)和吡啶(0.6ml，7.8mmol)于无水THF(25ml)的溶液中逐滴加入苯甲酰氯(0.8ml，6.6mmol)于THF(2ml)中的溶液，并将混合物于氮气下搅拌过夜。真空除去溶剂，将残留的白色稀浆重新悬浮在2％氢氧化钠水溶液中并用盐酸水溶液中和，同时形成白色沉淀。过滤收集产物并从甲醇-水中重结晶(1.1g，75％)m.p.252-256℃；δH(200MHz，d6-DMSO)4.06(s，3H，-OCH3)；7.47-7.61(m，2H，Ar-4/6H)；7.63-7.69(m，3H，Ph-3′/4′H)；7.80-7.85(dd，1H，Ar-5H)；8.27-8.32(m，2H，Ph-2′H)；12.70(s，1H，-NH)；m/z252(100％，M+)；νmax/cm-13330，3190，3170，3120，3070，2950，2890，2830，1660.
元素分析实测值C71.38，H4.39，N11.17，C15H12N2O2要求值C71.42，H4.79，N11.10％。
实施例318-羟基-2-苯基喹唑啉-4-〔3H〕-酮(化合物NU1068)将来自实施例30或30a的8-甲氧基-2-苯基喹唑啉-4-〔3H〕-酮(0.5g，2mmol)于BBr3(1.0M，于CH2Cl2中)的溶液(6ml，6mmol)在氮气下回流加热24小时。减压蒸馏除去溶剂并用氢氧化钠溶液(10％w/v)水解余下的残余物。用盐酸水溶液酸化得到白色沉淀，将其除去。用乙酸乙酯萃取滤液(3×30ml)，干燥(MgSO4)并减压除去溶剂。从丙-2-醇重结晶，得到目标产物(0.187mg，67％)m.p.280-284℃；δH(200MHz)，d6-DMSO)7.73-7.50(m，2H，Ar-6/7H)；7.66-7.72(m，4H，Ar-5H.Ph-3′/4′H)；8.51-8.54(dd，2H，Ph-2H)；9.75(bs，1H，-OH)；12.60(bs，1H，-NH)；δC(d6-DMSO)；116.01，118.68(Ar-6/7C)；122.03(C-Ph)；127.43-128.76(Ph-1′/2′/3′/4′C)；137.98(Ar 8aC)；150.72(Ar-8C)；153.31(Ar-4aC)；162.62(C＝O)；m/z238(100％，M+)；νmax/cm-1(approx.values)3380(br)，3180，3120，3050，2940，1640.
元素分析实测值C69.54，H4.05，N11.46，C14H10N2O2要求值C70.58，H4.23，N11.76％。
实施例32
2，8-二甲基喹唑啉-4-〔3H〕-酮(化合物NU1069)向2-氨基-3-甲基苯甲酰胺(0.5g，3.3mmol)(按-般方法制得)和吡啶(0.35ml，4.3mmol)于无水THF(15ml)的溶液中逐滴加入乙酰氯(0.36ml，5.0mmol)于THF(2ml)中的溶液，并在氮气下将混合物搅拌过夜。真空除去溶剂并将残余的白色稀浆重新悬浮在2％的氢氧化钠水溶液中，用盐酸水溶液中和，同时生成白色沉淀。收集固体，从甲醇-水中重结晶，得到所需的喹唑啉酮(0.47g，81％)m.p.217-220℃；δH(200MHz，d6-DMSO)2.44(s，3H，-CH3)；2.57(s，3H，-CH3)；7.36-7.44(t，1H，Ar-6H)；7.68-7.72(dd，1H，Ar-7H)；7.97-8.01(dd，1H，Ar-5H)；12.25(brs，1H，-NH)；m/z174(100％，M+)；νmax/cm-13325，3180，3040，2990，2910，2880，2795，1680，1620.
元素分析实测值C68.76，H5.57，N15.90，C10H10N2O要求值C68.94，H5.76，N16.08％。
PARP抑制活性的测定本发明的化合物，特别是那些在前述实施例中详细描述的，已用下列方法和材料在体外测定了其作为PARP抑制剂的活性。
原则上说，PARP的测定依赖于活化含外源〔33P〕-NAD+的细胞中的内源性PARP(如下文所述，这些外源性〔32P〕-NAD+是在开始的预处理步骤中将细胞悬浮在〔32P〕-NAD+溶液中并使之透过细胞而引入的。由酶合成的多聚(ADP-核糖)可用三氯乙酸(TCA)沉淀，并测定其中结合的放射性标记32P。例如，在特定的实验条件下使用闪烁计数器测定PARP活性。在各种待测化合物的存在下，在同种条件下，以相同步骤重复实验。从而可以通过测定TCA沉淀的多聚(ADP-核糖)中〔32P〕的减少量来确定酶的活性，酶活性的降低程度代表待测化合物的抑制效果。
测定结果可用一种待测物的一个或多个，浓度对活性抑制或降低的百分率来表示，也可用降低酶活性50％的待测化合物浓度，即IC50值来表示。因此，用一系列不同的化合物可以获得一系列可比较的抑制活性的值。
事实上，常用鼠白血病细胞L1210作为PARP酶的来源。这些鼠白血病L1210细胞经过低渗缓冲液和骤冷处理从而对外源性〔32P〕NAD+具有通透性。在提出的优选技术中，将一定量的合成的小寡聚核苷酸，尤其是带有回文序列CGGAATTCCG的单链寡核苷酸引入细胞悬液中可以激活PARP酶，使测定结果更具精确性和重现性。这种寡聚核苷酸序列自身回折形成带有单链平整末端的双链分子并为PARP的活性提供了有效的底物。其作为酶强力激动剂的过程在进行的实验中已得到证实。
在所采用的实验方案中，引入了作为特定的PARP抑制剂的如上述的合成寡聚核苷酸来区分细胞中PARP和其它单聚-ADP-核糖基转移酶。因此，这种合成寡聚核苷酸的引入导致了对结合的放射性活性的5-6倍的刺激，并且这些完全归因于PARP的活性。
更详细的测定细节如下材料
所用材料如下DDT(二巯基丁二醇)配制100mM(15.4mg/ml)的DTT液(作为抗氧化剂)，分装成每管500微升，贮存于-20℃。
低渗缓冲液9mM Hepes (214mg/100ml)4.5％葡聚糖(4.58/100ml)4.5mM MgCl2(92mg/100ml)以上各组分溶于大约80ml蒸馏水中，调pH至7.8(NaOH/HCl)，用蒸馏水定容至100ml，贮存于冰箱中，使用前加入DTT至5mM(50微升/ml)等渗缓冲液40mM Hepes (1.9g/200ml)130mM Kcl (1.94g/200ml)4％葡聚糖 (8g/200ml)2mMEGTA(152mg/200ml)2.3mM MgCl2(94mg/200ml)225mM蔗糖 (15.39g/200ml)将上述组分溶解在大约150ml蒸馏水中，调pH至7.8(NaOH/HCl)，用蒸馏水定容至200ml，贮存于冰箱中，临使用前加入DTT至2.5mM(25微升/ml)。
NAD预先称量的等分试样固体NAD贮存于20℃。测定前临时将其配制成大约6mM(4-4.5mg/ml)的溶液，于260mm测定光密度(O.D)以精确摩尔浓度。由水稀释原液至浓度为600微摩尔/升并加入少许32P标记的NAD(如2-5微升/ml)。
寡聚核苷酸带有回文序列CGGAATTCCG的寡聚核苷酸用常规方法合成，真空干燥并以块状贮存于冰箱中。使用前用10mMTris/HCl配成200微克/ml，pH7.8，使每块核苷酸彻底溶解在50ml缓冲液中。将溶液于水浴中加热至60℃，15分钟，然后慢慢冷却确保其正确退火。加入9.5ml缓冲液后，用一稀释样品在260mM测光密度来确定浓度。再将主体溶液稀释成200微克/毫升，分装成500微升/管，置冰箱，备用。
TCA将TCA(三氯乙酸)溶液配成两种浓度10％TCA＋10％焦磷酸钠；1％TCA＋1％焦磷酸钠。
细胞作为PARP酶来源的L1210细胞是保存在RPMA培养基＋10％小牛血清＋谷氨酰胺和抗菌素(青霉素和链霉素)中的悬浮培养物，再加入HEPES和碳酸氢钠细胞接种于100ml培养基中，使之在取出测定时浓度达到大约8×105/ml。
方法一般是将待测化合物配制成在DMSO(二甲基亚砜)中的浓缩液。这些化合物的溶解度测定方法如下加入一定量的二甲基亚砜溶液于一定量的等渗缓冲液中，采用最终用于测定操作中的比例，稍许后，用显微镜检查看溶液中是否有任何晶状物形成的迹象。
然后将所需量的已用血球计数器计数的细胞悬液离心(在Europa 24M中离心1500转/分，5分钟)，除去上清液，将得到的沉淀块重新悬浮在20ml 4℃的DulA溶液中，再在4℃离心1500转/分。除去上清液，将细胞重新以冰冷的低渗缓冲液以3×107细胞/ml的浓度悬浮，置冰上30分钟，然后加入九倍体积的冰冷等渗缓冲液，此刻这种已对外源性NAD+具有可渗透性的细胞可在一小时内进行测定试验。在这段时间内，细胞的通透性可通过如下方法测定加入双倍量的细胞到一等体积的台盼蓝溶液中，放置5分钟，再在血球计数器下计数。
测定操作可方便地在15ml的锥形底塑料管中进行，此管放置于此酶的最适温度--26℃的振荡水浴中。一典型的测定操作如下所用的寡聚核苷酸液浓度为5微克/毫升，而待测化合物/DMSO溶液的浓度为2％，试验一式四份平行进行。在每一测定管中加入5微升寡聚核苷酸液，50微升的500微摩尔/升NAD+〔32P〕-NAD溶液，8微升待测化合物DMSO溶液和37微升水。在开始实验前，这些“鸡尾酒”般的溶液需在26℃预热7分钟，细胞悬液也要如此。在混合液中加入300微升细胞悬液后反应开始，终止反应时需加2ml 10％TCA＋10％焦磷酸钠溶液。
此外，通常还另需6支测定管作为空白对照，它们含有同样的上述组分，但在加入细胞悬液前，加TCA溶液以阻止任何反应的发生。这可以校正标记物对所用滤器的任何非特异性吸附(如下述)。
分别间隔一定时间加入细胞悬液于各测定管后恰5分钟时，分别加入4℃的10％TCA＋10％焦磷酸钠。将各管置于冰上，至少1小时，将每个试管的内容物通过各个漏斗滤器分别过滤，抽滤器皿使用事先用10％TCA湿润的GF/C过滤元件(粗面朝上)。过滤每管的内容物并用1％TCA＋1％焦磷酸钠液轻轻洗涤，将滤器小心移去，干燥，放置于各个闪烁瓶中。另备4个含有10微升600微摩尔/NAD+〔32P〕-NAD液的闪烁瓶作为参比标准，在每一瓶中加入10ml闪烁体。在-β计数器上计数2分钟，以获得32P的存在量，进而得到多聚(ADP-核糖)的量和PARP酶的活性。
体外PARP抑制研究的结果上面简述的PARP酶测定的标准步骤除了用于根据本发明的一系列化合物外，出于比较的考虑，它也适用于某些已被证明有一定PARP抑制活性的苯甲酰胺类化合物，特别是对3-羟基苯甲酰胺，3-甲氧基苯甲酰胺和3-氨基苯甲酰胺。一系列已制得和/或研究过的化合物连同使用上述方法测定不同浓度化合物的不同实验中所得到的PARP抑制分析结果已列成表如下述表III所示。
考察此表，已知的PARP抑制剂3-氨基苯甲酰胺，3-甲氧基苯甲酰胺和3-羟基苯甲酰胺可看作为参照化合物。虽然在活性上有相当大的不同，且在某些情况下由于低溶解度的缘故，至少不能得到高浓度的待测化合物水溶液，但总的说来，所测的本发明化合物显示了具有前景的活性，物别有意义的是苯并噁唑类似物，尤其是已提到的NU1056，NU1040，NU1051以及NU1054化合物即使在低浓度下也显示出相对高的抑制活性。作为强力PARP抑制剂，那些已特别提及的NU1025，NU1057，NU1063，NU1068和NU1069喹唑啉酮衍生物也是有同样重要的意义。
在相似的浓度且用同样方法的测定中，本发明化合物在很多的情况下显示出的PARP酶抑制活性要比其它已知的苯酰胺类PARP抑制剂的平均抑制值高得多，或至少相当，如果不是相当好的话，研究的多种烟酰胺类似物表现出没有抑制活性或仅表现出很低的抑制活性。
进一步的生物学活性研究利用鼠白血病L1210细胞系培养物进行生长抑制实验以评价化合物的细胞抑制效果，进行克隆存活测定实验以估价其细胞毒性，特别是与DNA损伤性细胞毒剂如细胞毒性抗肿瘤药剂或者高能量的放射结合使用的化合物的细胞毒性。DNA损伤以及PARP抑制剂在DNA链断裂和修复过程中的作用也可通过DNA链断裂分析并按照已发表的碱性洗脱技术进行监测来评价。
通过实施例给出一些进一步的细节，使用上述NU1025和NU1057的喹唑啉化合物(由相应的苯并噁唑类化合物经分子重排衍生而来)作为抑制PARP的本发明化合物的典型例进行下述研究，也作为与已知的PARP抑制剂3-氨基苯甲酰胺(3AB)以及苯甲酰胺(BZ)的对照比较。还报道了使用烷基化剂temozolomide(TM)的实验结果，将其作为细胞毒DNA损伤抗肿瘤药的一个有说服力的例子，并且在某些研究中使用γ-射线照射损伤细胞。
在生长抑制测定中，典型的操作是将L1210细胞以1×104/ml一式三份接种于24孔培养板，24小时后加入选择性结合和浓度的待测化合物或者药物。此时，取一系列样品用库尔特计数器计数(N0)，48小时后余下样品再进行计数(N1)，从而确定药物处理过的样品的生长抑制百分率(％)。在药物组合实验中寻找那些对细胞生长或克隆形成有协同作用的证据，一个单一的固定浓度的细胞毒性药物如TM作为参比值。
作为得到的一个具有说明力的结果，从生长抑制实验测定的单独使用以及与一固定浓度(100微摩尔/升)的TM联合使用上述PARP抑制剂的Ic50值示于本说明书最后的表I中。虽未明确指出，但可以看出单独将细胞置于TM中引起细胞生长抑制的IC50值为361±25微摩尔/升。而且表1证实了将细胞置于100μM TM与浓度不断增加的PARP抑制剂中，则在一定浓度范围内对生长抑制起到了协同作用。
从表1还可看出，单独使用NU1025化合物抑制细胞活性所需浓度要比与100微摩尔/升TM结合使用所需浓度高10-20倍。例如，单独使用NU1025化合物其IC50为0.41mM，而有TM存在时则降至0.04mM。与此相比，这种差异在3AB和BZ中只有2-3倍，这是由于该化合物本身的生长抑制作用及其与TM联合使用的作用之间存在着相当大的重迭。当比较该化合物作为PARP抑制剂的有效性和其抑制细胞生长的能力时发现它们处于同一水平，这至少说明PARP的功能是细胞生长所必需的。
在克降存活测定实验中，典型的操作是将L1210细胞置不同浓度的TM±一固定浓度的PARP抑制剂溶液中16小时，然后计数并接种，在无药物的0.12-0.15％的琼脂糖培养基中使克隆形成。7-10天后，将克隆用0.5mg/ml的MTT染色并在光栅盒上用肉眼计数。绘制存活曲线并将得到的典型的DEF10值列于下述表II中(DEF10定义为将存活率降至10％所需的TM浓度除以在固定浓度的PARP抑制剂存在下将存活率降至10％的TM浓度的值。)表II中每个DEF10值代表平均比值±S.E.(标准误差)。这个比率±S.E.是使克隆的平均存活率降至10％时所需的单独使用的TM的浓度(675±31微摩尔/升，它是从22条独立的存活曲线中得出的)除以至少从三条独立存活曲线中得出的在固定浓度的抑制剂存在下每个使细胞存活率降为10％的TM的浓度而来的。
单独使用TM的IC50和LD50值分别为361±25微摩尔/升和251±13微摩尔/升，发现了细胞生长抑制效应和细胞毒性效应间的相关性，而无论暴露时间长短(生长抑制48小时和细胞毒性16小时)。在培养物中，TM的半衰期为约40分钟，所以在每一实验的极短的暴露时间前它都将充分地发挥作用。所有的化合物均对TM的细胞毒性有增强效应，但NU1025化合物却在比3AB和BZ低得多的浓度下表现出了相同的DEF10值。比如，50微摩尔/升的NU1025化合物和5mM的3AB的DEF10值都约为4。NU1025化合物对细胞毒性的最大增强效果达到0.7％。还发现3AB和NU1025化合物均阻断这种修复作用。
本发明还研究了单独抑制PARP活性的化合物的细胞毒性效应。在一组实验中将L1210细胞置于待测化合物中24小时，测得的LD50分别为14±1.0mM(3AB)；6.0±1.5mM(BZ)和1.6±0.1mM(Nu1025化合物)。它们的LD50值比IC50值差＜3倍，但作为PARP抑制剂的效力来说却维持在相同的水准。与生长抑制实验的数据相一致，促使TM达到最大细胞毒性效应所需的Nu1025的浓度与其自身产生细胞毒性所需的浓度之间的差别＞10倍以上。
在有关DNA断裂测定实验中发现经过TM处理一小时引起了洗脱率的浓度依赖性增长，这为DNA链的断裂程度提供了一个量度。在TM浓度水平低到的150微摩尔/升的程度时，DNA链的断裂水平依然能检测到该浓度，使存活率降低了30％。检定了所有化合物在单独使用的情况下致DNA链断裂的能力。用1mM的NU1025化合物和2mM3AB或BZ经过24小时培养，与未被处理的细胞相比，对DNA链断裂水平没有显著的作用，然而，用固定浓度的TM(150微摩尔/升)和递增浓度的所有待测PARP抑制剂保温1小时处理样品的洗脱率(链断裂程度)要比单独使用TM处理的样品有逐步增长。
用绘图参数值概括上述三个代表性的化合物的实验结果，这个参数跟链断裂程度和抑制剂浓度相关。对所有的化合物来说，链断裂的增长和浓度的增长线性相关，但该值在NU1025化合物浓度为100微摩尔/升时开始显著性增长，而对于BZ和3AB该值却分别需要在3mM和5mM时方才出现显著性增长。而且，这些化合物在DNA链断裂测定中的水平和效价证明跟体外实验中的PARP抑制效价呈极好的相关性。
总而言之，进行的研究工作表明本发明化合物的PARP抑制特性反映了这些化合物能促进某些细胞毒性抗肿瘤药剂和放疗中使用的射线等DNA损伤剂的细胞毒性的能力。相应地，这些化合物特别适于与这些细胞毒性药物或放疗联合使用，并促进它们在如前述的医学治疗中的效果。
总结固然，从总体上看本发明应看作是包括每一个新颖性的特征或者说是在本文中描述的特征的结合体，但从广义的但并非排它的角度来说本发明的主要方面包括(i)这里定义的新的式(I)，(II)或者(IV)的化合物；(ii)如前述的带有取代基的式(I)，(II)或(IV)的化合物(包括它们的盐)作为治疗或用于医学和医药制剂生产中的用途，比如作为PARP抑制剂与细胞毒性药物或放疗联合使用增强后者在肿瘤治疗中的效果；(iii)这里所定义的新的式(I)，(II)或(IV)的化合物的制备方法，包括在这些过程中产生的所有的新中间体化合物；(iv)包括这里所定义的式(I)，(II)或者(IV)的化合物以及药用载体的药物制剂；(v)一个如(iv)所述的药物制剂的制备过程，比如这里所涉及的方法；(vi)如这里所公开的可能代表式(iv)的分子重排化合物的式(II)的喹唑啉酮化合物作为治疗或者应用于医学或医药制剂生产中的用途，比如作为PARP抑制剂与细胞毒性药物或放疗联合使用来提高后者在肿瘤治疗中的效果，并且药物中包括所说的喹唑啉酮化合物。
表I
表II
表III
表III(续)
表III(续)
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权利要求
1.一种化合物，其选自(A)具有通用结构式I的3-取代苯甲酰胺化合物 或其药学上可接受的盐，以及(B)具有通用结构式II的喹唑啉酮化合物 或其药学上可接受的盐。其特征在于在结构式I中(i)Y为氢，并且X为-CH2-Z其中Z代表烷基、可选择性取代的芳烷基、-CH＝CHR(其中R为H、烷基或选择性取代的苯基基团)、环己基、或具有结构式III的基团 其中R1为选自H、烷氧基、NO2、N3、NH2、NHCOR3(R3为烷基或芳基)、CO2R4(R4为H或烷基)、烷基、羟基烷基、CW3或W(W为卤素)、以及CN，并且其中R2为H，或者其中R1和R2一起代表与相邻环的C桥连的-O-CHR5-O-基团，而R5为H、烷基或选择性取代的芳烷基或芳基；(ii)Y为氢，并且X为-(CH2)n-Z其中n在5至12的范围内，并且Z为卤素或嘌呤-9-基基团；(iii)Y和X一起形成桥-Y-X-，其代表基团 或- 或 其中R5如上所述，并且在结构式II中X′代表羟基、烷基、烷基基或选择性取代的芳基(例如苯基)或芳烷基(例如苯甲基)基团。并且Y′代表氢、烷基或选择性取代的芳基(例如苯基)或芳烷基(例如苯甲基)基团。
2.如权利要求1中所要求的化合物，其中烷基或每个烷基基团，作为基团或者作为烷氧基或其它基团的一部分，当化合物具有结构式I时在基团Z和/或基团R5中，或者当化合物形成结构式II时在基团X′和Y′中，烷基或每个烷基基团含有1-6个碳原子。
3.如权利要求1中所要求的化合物，它是具有结构式IV的苯噁唑-4-羧酰胺化合物
4.如权利要求3中所要求的化合物，其中R5为选自烷自烷基、苯基、萘基和吡啶基。
5.如权利要求3中所要求的化合物，其中R5为C1-6烷基基团。
6.如权利要求3中所要求的化合物，它是下面的化合物中的一个(a)2-甲基苯并噁唑-4-羧酰胺；(b)2-叔丁基苯异噁唑-4-羧酰胺；(c)2-苯基苯并噁唑-4-羧酰胺；(d)2-(4-甲氧基苯基)苯并噁唑-4-羧酰胺；或者是上述化合物(a)至(d)中任-个的药学上可接受的盐。
7.如权利要求1或2所要求的具有通式I的化合物，其中X为苯甲基或取代的苯甲基基团。
8.如权利要求1或2所要求的具有通式I的化合物，其中X为具有选自2-NO2、4-CH3、4-CO2H、4-CO2CH3、4-CONH2、4-CN、4-CH2OH和4-NHCOPh的取代基的苯甲基基团。
9.如权利要求1中所要求的化合物，它是下面的化合物中的-个(a)3-苄氧基苯甲酰胺，(b)3-(4-甲氧基苄氧基)苯甲酰胺，(c)3-(4-硝基苄氧基)苯甲酰胺，(d)3-(4-叠氮基苄氧基)苯甲酰胺，(e)3-(4-溴代苄氧基)苯甲酰胺，(f)3-(4-氟代苄氧基)苯甲酰胺，(g)3-(4-氨代苄氧基)苯甲酰胺，(h)3-(3-硝基苄氧基)苯甲酰胺，(i)3-(3，4-亚甲基二氧代苯基甲基氧基)苯甲酰胺或3-(胡椒基氧代)苯甲酰胺，(j)3-(N-乙酰基-4-氨基苄氧基)苯甲酰胺，(k)3-(4-三氟甲基苄氧基)苯甲酰胺，(l)3-(4-氰基苄氧基)苯甲酰胺，(m)3-(4-羧基甲基苄氧基)苯甲酰胺，(n)3-(2-硝基苄氧基)苯甲酰胺，(o)3-(4-羧基苄氧基)苯甲酰胺。或者是上述化合物(a)至(o)中任-个的药学上可接受的盐。
10.如权利要求1中要求的化合物，它是下面的化合物中的-个(a)3-(5-溴代戊氧基)苯甲酰胺，(b)3-(8-腺苷-9-基辛氧基)苯甲酰胺，(c)3-〔5-(6-氯代嘌呤-9-基)戊氧基〕苯甲酰胺，(d)3-(5-腺苷-9-基戊氧基)苯甲酰胺，(e)3-〔8-(6-氯代嘌呤-9-基)辛氧基〕苯甲酰胺，(f)3-〔12-(6-氯代嘌呤-9-基)十二烷氧基〕苯甲酰胺，(g)3-(12-腺苷-9-基十二烷氧基)苯甲酰胺。或者是上述化合物(a)至(g)中任一个的药学上可接受的盐。
11.如权利要求1中所要求的化合物，其为3-烯丙基-氧基苯甲酰胺、3-肉桂基氧基苯甲酰胺，或其药学上可接受的盐。
12.如权利要求1中所要求的化合物，它是下面的化合物的-个(a)3-丁氧基苯甲酰胺，(b)3-戊氧基苯甲酰胺，(c)3-己氧基苯甲酰胺，(d)3-庚氧基苯甲酰胺，(e)3-辛氧基苯甲酰胺，或者其药学上可接受的盐。
13.如权利要求1或2中所要求的化合物，它是具有通用结构式II的喹唑啉酮化合物，其中Y′为苯基或具有选自-NO2、-NH2、-OH或烷基的取代基的苯基基团。
14.如权利要求13中所要求的化合物，其中X′为羟基。
15.如权利要求1或2中所要求的化合物，它是具有通用结构式II的喹唑啉酮化合物，其中X′为羟基而Y′为烷基。
16.如权利要求13至15中任意一项要求的化合物，它是通过苯并噁唑-4-羧酰胺化合物的分子重排生产的。
17.通过权利要求3中要求的化合物苯并噁唑-4-羧酰胺的分子重排生产的喹唑酮衍生物。
18.如权利要求1中要求的喹唑啉酮化合物，它是选自下列化合物中的一个(a)8-羟基-2-甲基喹唑啉-4-〔3H〕酮；(b)8-羟基喹唑啉-4-〔3H〕酮；(c)8-羟基-2-(4-硝基苯基)-喹唑啉-4-酮；(d)8-甲氧基-2-甲基喹唑啉-4-〔3H〕-酮；(e)8-甲氧基-2-苯基喹唑啉-4-〔3H〕-酮；(f)8-羟基-2-苯基喹唑啉-4〔3H〕-酮；(g)2，8-二甲基喹唑啉-4-〔3H〕-酮。
19.一种制备如权利要求1中所要求的化合物的方法，该方法包括在碱催化反应条件下将3-羟基苯甲酰胺化合物与烷基化剂进行反应的步骤。
20.权利要求1至18中任意一项中所要求的化合物其作为活性的PARP-抑制物质的治疗中的应用。
21.一种含有权利要求20中所要求的化合物的单位剂型的药物制剂或组合物，它是为了给予需要PARP-抑制剂治疗的哺乳动物。
22.一种用于医药用途的药物制剂或组合物，其含有有效PARP-抑制量的如权利要求1至18中任意一项所要求的化合物。
23.如权利要求21或22中所要求的药物制剂或组合物，其在抗肿瘤治疗中与细胞毒药物结合使用。
24.如权利要求1至18的任意一项中所要求的化合物生产医药或兽医用制剂的用途，用于抑制PARP活性并促进与之结合使用的细胞毒药物或放射治疗的细胞毒性效果，从而治疗哺乳动物中的肿瘤。
全文摘要
本发明公开了一类3-氧基苯甲酰胺化合物(I)以及相关的喹唑啉酮化合物(II)，其可以作为强力的DNA修复酶多聚(ADP-核糖)聚合酶或PARP酶(EC2.4.2.30)的抑制剂，并且因此其可提供有用的治疗化合物，用于与DNA-损伤细胞毒药物或放射治疗结合使用以增强后者的效果。公开的化合物包括3-苄氧基苯甲酰胺、3-氧基苯甲酰胺，其中5个或更多的亚甲基基团的链终止于卤素原子或嘌呤-9-基基团、某些苯并噁唑-4-羧酰胺化合物以及某些喹唑啉酮化合物。在式(I)中X和Y可一起形成桥-X-Y-来代表(a)、(b)或(c)，其中R
文档编号A61K31/505GK1143358SQ9519201
公开日1997年2月19日 申请日期1995年3月9日 优先权日1994年3月9日
发明者R·J·格里菲, A·H·卡拉尔特, N·J·库尔蒂, D·R·纽维尔, B·T·高尔丁 申请人:钮卡斯尔大学风险投资有限公司