一种新型纯化pe类重组毒素的方法

专利名称：一种新型纯化pe类重组毒素的方法
技术领域：
本发明属生物蛋白快速纯化检验领域。
背景技术：
绿脓杆菌外毒素PE为全长613个氨基酸的单链蛋白，可分为三个功能区:1a区(l-252aa)为细胞结合区，II区(253_364aa)负责毒素的跨膜转运，III区(400_613aa)包含ADP核糖基化功能及eEF2失活功能区；Ib区(365_399aa)处于II区与III区之间，含有一个二硫键，功能未知。PE杀细胞机制包括如下步骤:C末端的Lys613残基被胞浆或培养液中的羧肽酶去除，露出REDL (Arg-Glu-Asp-Leu)末端；Ia区结合到动物细胞表面的α -巨球蛋白受体上，内化后经由内涵体到达高尔基体；Furin蛋白酶将II区内的Arg279与Gly280氨基酸残基间的肽键切断；连接两个片段的Cys253与Cys364间的二硫键断裂；REDL结合胞内的KDEL受体,将37kDa的羧基端大片段从高尔基体转运到内质网(ER), lipid sorting to theER may occur ;280_313aa介导毒素转运至细胞质；III区内的ADP-核糖基化酶功能区灭活eEF2，ADP核糖基化涉及到His440和Glu553残基，His440经由腺苷5’ -单磷酸核糖结合至NAD，Glu553的侧链羧基与Tyr481、Glu546形成氢键，环堆积机制使得Tyr481与NAD连接。蛋白合成受到抑制最终引起细胞死亡；PE毒素也可通过其它路径诱导细胞凋亡。PE是构建免疫毒素的优良分子，因为其高杀细胞潜力及细胞毒作用方式已得到详细阐明，变PE的靶向为其它细胞表面受体可以将PE作为药物选择性杀伤特异细胞，新的靶向单元由特异结合受体的抗体或配体构成，通过化学交联或基因工程重组与PE连接。目前针对PE类重组毒素，国外主要采用包涵体复性的方法，该方法耗时长得率低且复性条件难以掌握，其应用受到很大限制；国内有人采用疏水层析、金属亲和层析、离子交换层析等常规方法进行纯化，操作繁琐且得率很低。

发明内容
本发明提供一种新型纯化PE类重组毒素的方法，以解决目前纯化方法耗时长、得率低、操作繁琐的问题。本发明采取的技术方案是:表达PE类重组蛋白的重组菌经诱导后，菌体经超声破碎、离心取上清，加入终饱和度为50%的硫酸铵离心；
沉淀由50mM Tris>600mM NaCl、pH7.9溶液重悬后过抗体亲和层析柱；50mM Tris、600mM NaCl、pH7.9 溶液继续冲洗 5 倍柱体积后，40% 丙二醇、850mM NaCl、50mM Tris、pH7.9洗脱液洗剂，收集洗脱峰，PBS透析后进行SDS-PAGE分析得到高纯度的PE类重组毒素；
所述抗体亲和层析柱所制备过程如下:
(1)抗PE毒素的醇洗脱性抗体的制备；
(2)亲和层析介质制备:
制备螯合缓冲液，0.1M NaHC03、0.5M NaCl pH7，置于冰浴中备用；用等体积4°C的ImMHCl浸泡CNBr actived Sepharose 4 Fast Flow介质5min,弃滤液；重复洗剂3-5次；测量凝胶体积，加入1/2体积的螯合缓冲液，其中抗PE毒素的醇洗脱性抗体的含量为10mg/ml，室温静置4h或4°C过夜；5倍体积的螯合缓冲液洗涤，加入0.1M的Tris-HCl pH8.0或IM乙醇胺，PH8.0，静置2h封闭未结合抗体的活化基团；用I个体积的0.1M乙酸、0.5M NaClρΗ4.0洗剂3次，然后用I体积的0.1M Tris-HCU0.5Μ NaCl ρΗ8.0洗剂3次；重复上述洗剂步骤6次;20%乙醇中保存。本发明所述表达PE类重组蛋白的重组菌株包括如下三株菌株:
Rosetta(pET_rG17PE38)、
Rosetta (pET-MSH-PE38)或BL21(DE3) (pET_20b- GnRH -PE38)。本发明是以切胶纯化的绿脓杆菌外毒素重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体，筛选可在温和条件下进行抗原识别、洗脱的抗体，建立一种快速高效且不影响PE(绿脓杆菌外毒素)类重组毒素活性的亲和层析纯化方法。本发明通过筛选丙二醇洗脱性抗体、制备亲和层析介质，可在温和条件下进行PE类重组毒素的快速纯化。本发明的抗体亲和纯化方法，大大减少了操作步骤，节约了纯化时间。


图1是PE38重组蛋白大肠杆菌表达分布图；在37°〇培养诱导时，目的蛋白以包涵体形式表达，M.低分子量蛋白Marker; 1.对照；2.Rosetta(DE3) (pET_rG17PE38)的IPTG诱导结果；3.胞质表达组分；4.包涵体；
图2是免疫小鼠融合前血清抗体效价图，2次免疫后，3只小鼠的血清效价均达到1:25600以上，可以进行细胞融合实验；
图3是丙二醇洗脱性单克隆抗体筛选图，获得稳定杂交瘤细胞株后，再次进行PR-ELISA洗脱实验；筛选OD值降低50%以上的细胞孔，认为具有较好的丙二醇洗脱反应性；
图4是腹水纯化前后效果图；腹水纯化后，经SDS-PAGE分析可见到清晰重链和轻链，残留的少许杂蛋白不影响亲和层析纯化效率，1，纯化前腹水；2，纯化后的抗体；
图5A是抗体亲和层析洗脱条件筛选图；筛选醇洗脱抗体的最佳洗脱溶剂、最佳洗脱盐离子浓度；图中洗脱条件筛选为甘油、乙二醇、丙二醇；
图5B是抗体亲和层析洗脱条件筛选图；筛选醇洗脱抗体的最佳洗脱溶剂、最佳洗脱盐离子浓度；图中洗脱条件筛选为NaCl ；
图6是免疫亲和层析方法从大肠杆菌裂解液中纯化PE类重组蛋白l.rG17PE38、
2.MSH-PE38、3.GnRH_PE38的效果图；经硫酸铵沉淀去除核酸、脂类及不溶性细胞碎片后、亲和层析纯化即可得到高纯度的PE类免疫毒素，SDS-PAGE分析未见杂蛋白残留。
具体实施方式
表达PE类重组蛋白的重组菌经诱导后，菌体经超声破碎、离心取上清，加入终饱和度为50%的硫酸铵离心；
沉淀由50mM Tris>600mM NaCl、pH7.9溶液重悬后过抗体亲和层析柱；50mM Tris、600mM NaCl、pH7.9 溶液继续冲洗 5 倍柱体积后，40% 丙二醇、850mM NaCl、50mM Tris、pH7.9洗脱液洗剂，收集洗脱峰，PBS透析后进行SDS-PAGE分析得到高纯度的PE类重组毒素；
所述抗体亲和层析柱所制备过程如下:
(1)抗PE毒素的醇洗脱性抗体的制备；
(2)亲和层析介质制备:
制备螯合缓冲液，0.1M NaHC03、0.5M NaCl pH7，置于冰浴中备用；用等体积4°C的ImMHCl浸泡CNBr actived Sepharose 4 Fast Flow介质5min,弃滤液；重复洗剂3-5次；测量凝胶体积，加入1/2体积的螯合缓冲液，其中抗PE毒素的醇洗脱性抗体的含量为10mg/ml，室温静置4h或4°C过夜；5倍体积的螯合缓冲液洗涤，加入0.1M的Tris-HCl pH8.0或IM乙醇胺，PH8.0，静置2h封闭未结合抗体的活化基团；用I个体积的0.1M乙酸、0.5M NaClρΗ4.0洗剂3次，然后用I体积的0.1M Tris-HCU0.5Μ NaCl ρΗ8.0洗剂3次；重复上述洗剂步骤6次;20%乙醇中保存。本发明所述表达PE类重组蛋白的重组菌株包括如下三株菌株:
Rosetta(pET_rG17PE38)、
Rosetta (pET-MSH-PE38)或BL21(DE3) (pET_20b- GnRH -PE38)。下边结合具体实施例对发明做进一步说明。实施例1免疫原的大量制备和切胶回收
参考 rG17PE38, a novel immunotoxin target to gastric cancer withoverexpressed CCK2R, Jie Song, Honglin Ren, Zengshan Liu; J Drug Target, PMID:23311704中的方法构建重组大肠杆菌菌株Rosetta (DE3) (pET_28a_rG17PE38)，以1%接种于LB培养基(50mg/L氨苄青霉素)。37°C剧烈摇荡培养至0D600=0.6时，加入终浓度为lmmol/L的异丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导,220r/min摇培4h。离心收集菌体，PBS悬浮并经超声波裂解，离心分别收集上清和沉淀，通过SDS-PAGE分别检测全菌、上清和沉淀，发现该PE重组蛋白以包涵体的形式大量表达(见图1)。切胶纯化方法,取500 μ L超声后的包涵体沉淀重悬液,加入2M尿素溶解后不插样品梳直接上样，按常规方法进行SDS-PAGE ;将胶浸入2 mol/L KCl溶液中3min，切割下染成银白色的目的蛋白胶来，放在密封透析袋内，以电泳的方法使目的蛋白游离出来，将透析袋中的凝胶取出后，用PEG20000进行浓缩，然后PBS溶液透析去除小分子；经SDS-PAGE分析后分装，放入-80度冰箱备用。实施例2动物免疫
以切胶纯化的PE重组蛋白免疫8周龄Balb/C雌性小鼠，SOyg/只，足垫注射；首次免疫用弗氏完全佐剂(1:1)乳化抗原，间隔I周后，采用弗氏不完全佐剂(1:1)乳化抗原进行第2次免疫。2免后一周测效价如附图2所示，三只小鼠效价均达1:25600以上，可以进行融合实验。实施例3间接ELISA及醇洗脱反应ELISA方法的建立
以纯度达98%以上的重组蛋白GnRH-PE40 (朱平老师惠赠，专利名称:与短肽激素嵌合的靶特异性细胞毒性剂)包被酶标板孔；以未免疫的小鼠血清和SP2/0细胞上清为阴性对照，免疫小鼠血清为阳性对照，酶标仪测定492 nm光吸收值。经过多次ELISA检测，确定最佳工作条件为:抗原的最适合包被浓度为I μ g/ml，4°C包被过夜；细胞上清37°C孵育Ih ；酶标二抗最佳工作浓度为1:4000，37°C孵育Ih。醇洗脱反应ELISA (PR-ELISA):将细胞上清分为两份，在洗脱时分别采用TEbuffer(50mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, ρΗ7.9)和 PR 洗脱 buffer(50mM Tris-HCl, ρΗ7.9，
0.1mM EDTA, 750mM硫酸铵，40%丙二醇)孵育IOmin ;再与HRP标记的羊抗小鼠IgG (购自中杉金桥公司)结合，加入底物溶液显色；测OD值分析两孔数值变化，OD值降低50%以上的为具有醇洗脱反应性。实施例4阳性杂交瘤细胞株的建立和稳定性检测
取二次免疫7d后的小鼠胭细胞与SP2/0细胞以5: I在PEG1450的作用下融合，以建立的间接ELISA及PR-ELISA方法筛选出阳性杂交瘤细胞株；通过多次克隆化和筛选后，获得稳定分泌醇洗脱反应性抗体的杂交瘤细胞(见图3)。实施例5腹水制备及抗体纯化
取10周龄雌性Balb/C小鼠，腹腔注射0.5ml石蜡油(无菌)，7 10天后腹腔注射杂交瘤细胞(5X105)。小鼠腹部明显膨大后，用20号针头于腹部采集腹水，37°C放置lh，4°C放置过夜，3000g，4°C离心15min，收集腹水。采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水:将腹水10000Xg，4°C离心15min，去除油脂等杂质；腹水上清以1:4加入0.06mol/L pH4.0的醋酸钠缓冲液，NaOH调至pH4.5 ;逐滴加入终浓度11 μ /ml的辛酸，室温搅拌30min ;静置2h，IOOOOg离心30min，取上清；加入1/10体积的0.1M PBS, NaOH调pH7.4 ;冷却至4°C，加入终浓度为50%饱和的硫酸铵，搅拌30min ；5000g离心30min，弃上清，1/10原体积的0.0lM PBS重悬沉淀；PBS透析，5000g离心30min，上清定容至原体积，测定蛋白浓度后-80°C保存。将纯化前后的腹水 进行SDS-PAGE分析，如图4所示，纯化后得到的蛋白仅含有极少量杂蛋白，该蛋白即为醇洗脱反应性抗体，少量杂蛋白不影响亲和纯化效果。实施例6亲和层析介质制备
制备螯合缓冲液，0.1M NaHC03、0.5M NaCl pH7，置于冰浴中备用；用等体积4°C的ImMHCl浸泡CNBr actived Sepharose 4 Fast Flow介质(购自通用电气医疗集团)5min,弃滤液；重复洗剂3-5次；测量凝胶体积，加入1/2体积的螯合缓冲液，其中含抗PE毒素的醇洗脱性抗体10mg/ml，室温静置4h或4°C过夜；5倍体积的螯合缓冲液洗涤，加入0.1M的Tris-HCl pH8.0(或IM乙醇胺，pH8.0)，静置2h封闭未结合抗体的活化基团；用1个体积的
0.1M 乙酸、0.5M NaCl ρΗ4.0 洗剂 3 次，然后用 I 体积的 0.1M Tris-HCU0.5Μ NaCl ρΗ8.0洗剂3次；重复上述洗剂步骤6次；20%乙醇中保存。实施例7抗体亲和洗脱条件筛选
分别采用10%、20%、30%、40%、50%和60%浓度的甘油、乙二醇、丙二醇为洗脱溶剂进行ELISA 洗脱试验；在此基础上，分别添加 100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、900mM、lM 和 1.5M 的 NaCl 进行洗脱。得到最佳洗脱条件为:40%丙二醇、800mM NaCl、50mM Tris、pH7.9 (见图 5)。实施例8从重组大肠杆菌裂解液中纯化PE类重组毒素
重组大肠杆菌 Rosetta (pET-rG17PE38)、Rosetta (pET-MSH_PE38)及 BL21(DE3)(pET-20b-GnRH_PE38),参照论文 rG17PE38, a novel immunotoxin target to gastriccancer with overexpressed CCK2R, Jie Song, Honglin Ren, Zengshan Liu; JDrug Target, PMID: 23311704及专利“与短肽激素嵌合的靶特异性细胞毒性剂、专利号99122205.9”、“一种靶向抗肿瘤重组蛋白质及其制备方法、专利号201010620599.0”中的相
关描述构建。各菌株经ImM IPTG诱导后，菌体经超声破碎、离心取上清，加入终饱和度为50%的硫酸铵离心以去除核酸、脂类及部分杂蛋白；沉淀由50mM Tris、600mM NaCl、pH7.9溶液重悬后过抗体亲和层析柱；50mM Tris,600mM NaCl、pH7.9溶液继续冲洗5倍柱体积后，40%丙二醇、850mM NaCl、50mM Tris、pH7.9洗脱液洗剂，收集洗脱峰，PBS透析后进行SDS-PAGE分析得到高纯度的PE类重组毒素(见图6)。表达PE类重组蛋白的重 组菌株包括但不限于本专利所验证的三株菌株: Rosetta(pET_rG17PE38)、
Rosetta (pET-MSH-PE38)和 BL21 (DE3) (pET-20b-LHRH_PE38)，其应该包括所有表达 PE融合蛋白的菌株。
权利要求
1.一种新型纯化PE类重组毒素的方法，表达PE类重组蛋白的重组菌经诱导后，菌体经超声破碎、离心取上清，加入终饱和度为50%的硫酸铵离心； 其特征在于还包括如下方法: 沉淀由50mM Tris>600mM NaCl、pH7.9溶液重悬后过抗体亲和层析柱；50mM Tris、600mM NaCl、pH7.9 溶液继续冲洗 5 倍柱体积后，40% 丙二醇、850mM NaCl、50mM Tris、pH7.9洗脱液洗剂，收集洗脱峰，PBS透析后进行SDS-PAGE分析得到高纯度的PE类重组毒素； 所述抗体亲和层析柱所制备过程如下: (1)抗PE毒素的醇洗脱性抗体的制备； (2)亲和层析介质制备: 制备螯合缓冲液，0.1M NaHC03、0.5M NaCl pH7，置于冰浴中备用；用等体积4°C的ImMHCl浸泡CNBr actived Sepharose 4 Fast Flow介质5min,弃滤液；重复洗剂3-5次；测量凝胶体积，加入1/2体积的螯合缓冲液，其中抗PE毒素的醇洗脱性抗体的含量为10mg/ml，室温静置4h或4°C过夜；5倍体积的螯合缓冲液洗涤，加入0.1M的Tris-HCl pH8.0或IM乙醇胺，PH8.0，静置2h封闭未结合抗体的活化基团；用I个体积的0.1M乙酸、0.5M NaClρΗ4.0洗剂3次，然后用I体积的0.1M Tris-HCU0.5Μ NaCl ρΗ8.0洗剂3次；重复上述洗剂步骤6次;20%乙醇中保存。
2.根据权利要求1所述的一种新型纯化PE类重组毒素的方法，其特征在于:表达PE类重组蛋白的重组 菌株包括如下三株菌株Rosetta (pET-rG17PE38)、Rosetta(pET-MSH-PE38)或BL21(DE3)(pET-20b- GnRH -PE38)。
全文摘要
本发明涉及一种新型纯化PE类重组毒素的方法，属生物蛋白快速纯化检验领域，以切胶纯化的绿脓杆菌外毒素重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体，筛选可在温和条件下进行抗原识别、洗脱的抗体，建立一种快速高效且不影响绿脓杆菌外毒素类重组毒素活性的亲和层析纯化方法。本发明的抗体亲和纯化方法，大大减少了操作步骤，节约了纯化时间。
文档编号C07K14/21GK103087161SQ201310024739
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月23日 优先权日2013年1月23日
发明者柳增善, 宋杰, 任洪林, 卢士英, 李岩松, 周玉, 张茂林, 高世奇, 吴南玄 申请人:吉林大学