专利名称：从植物芜青中提取纯化分离制备一种天然吡咯衍生物的方法
技术领域：
本发明涉及从植物芜青(Ara1S1Sica rapa L.)中提取、分离纯化制备一种天然批咯衍生物即4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸的方法，属于天然产物提取领域。
背景技术：
关着{Brassica rapa L.)为十字花科芸苔属植物(《中国植物志》,33卷)。芜青在我国传统医学和民族医学上有着悠久的使用历史。芜青古名葑，始载于《诗经》，药用始载于《名医别注》。目前我国芜青被广泛栽培，在北方主要被称为“蔓菁”，在东南沿海地区称为“盘菜”，在青藏高原地区称为“圆根”，在新疆称为“恰玛古”，仅在四川凉山州就有超过80万吨的年产量，但目前主要作为蔬菜和饲料，经济附加值不高。现代药理实验表明，4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸具有保护月干脏(Young-Won Chin etc, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol.13(I),2003, p79~81)和增加外周血流量(Miwa Matsui etc.，Natural Medicines,vol.52(3)，1998，p232-235)等生物活性。目前，从天然产物中获得的4-(甲酰基_5_ 羟甲基-1氢-卩比咯-1-基)丁酸仅在枸杞chinense Miller)干燥果实(含量约为
0.18mg/kg)、拟鳶尾(Zris spuria L.)新鲜根(含量约为2.lmg/kg)和日本乌头japonicum Thunb.)干燥根(含量约为3.lmg/kg)中被报道发现,而此前在十字花植物中未见报道。但是，天然来源的4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸的方法都存在原材料成本较高，目标成分含量低，提取分离纯化方法繁琐复杂等不足之处。传统中医将芜青的干燥或新鲜的块根和叶入药，始载于《别录》，列为上品，主治消食下气，解毒消肿，主宿食不化，心腹冷痛，咳嗽，疔疮痈肿。目前，国内外尚无从植物芜青中提取4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸的研究报道。本发明首次在芜青中发现了其含有较高含量的4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸，作为一种大规模种植的高产量植物，相比上述其它天然提取4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸的原料植物，芜青中提取4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸具有更好的经济性。4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸除自少量植物中提取外，4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸也可以由单糖和Y -氨基丁酸在高温高压下通过发生美拉德反应生成。此外本发明人所提出个另一项发明专利申请《一种吡咯衍生物的化学合成方法》中也提出了一种新途径有机合成4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸方法。需要指出的是，从植物中提取和有机合成4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸方法属于不同的领域，同有机合成的生物活性物质比较，天然提取的相同产物往往在市场上具有更高的价格，但有着较低的产量。相比有机合成，植物中提取的4_(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸提取物和粗制品中具有复杂的糖类、糖苷类化合物和有机酸类化合物组成，且往往存在很多性质与目标化合物相似的物质，所以其分离纯化4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸工艺途径是完全不同的。
发明内容
本发明目的在于提供从芜青中提取、分离纯化制备获得天然吡咯衍生物(即4_(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸)的方法。1、4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸的提取
使用粉碎机将干燥的芜青粉碎，加入PH=2.(T6.8酸化后的溶剂，按1(T30倍料液比(m/V)提取f 4次，过滤。合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩至浸膏状，得含4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸成分的提取物浸膏。在上述的提取方法中，可以采用包括但不限于浸出法、渗滤法、回流法、超声波辅助提取等方法提取，所述提取溶剂也可以是纯水、其它有机溶剂或其含水溶液。调节PH值时可以采用包括但不限于磷酸、盐酸、乙酸、甲酸、磷酸二氢钠等其它有机酸、无机酸或者盐。2、4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸的分离纯化
将上述的提取物浸膏溶于蒸馏水中，等体积加入乙酸乙酯萃取2 20次，合并乙酸乙酯萃取相脱去溶剂分离得粗制品。将粗制品溶于水中，使用制备高效液相色谱进行分离，以PH=2 7的缓冲水溶液作为流动相A相，有机溶剂甲醇或者乙腈作为流动相B相，将AB两相按一定梯度程序洗脱，检测波长范围20(T400nm，根据计算机实时采集的色谱图收集4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸色谱峰流出片段，脱去溶剂后得精制4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸(纯度98 99.5%)。上述梯度程序为(T60min内，将A相:B相按0:10(Tl00:0的比例进行梯度混合。制备高效液相色谱固定相包括但不限于C18、CS填料，流动相B相可采用包括但不限于乙腈、甲醇或者其含水溶液。调节PH配置缓冲水溶液时可以采用包括但不限于磷酸、盐酸、乙酸、甲酸、磷酸二氢钠等其它有机酸、无机酸或者盐。所述的4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸，通过高分辨质谱得[M-1] =210.07730，确定其分子式为 CltlH13NO4,分子量:211。核磁共振数据为1HNMR (600 MHz, DMS0_d6) 8 9.44 (s, 1H)，6.96 (d, J = 4.0Hz, 1H), 6.20 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.52 (s, 2H), 4.28 (m, 3H), 2.23 (t, J = 7.5Hz, 3H),1.88 (p, J = 7.4 Hz, 3H)。13C NMR (150MHz, DMS0_d6) 8 179.80，174.29，143.85，132.03，124.44，110.13，55.19，44.64，31.16，26.77。结合1H-13CHmbC^1H-13CHMQC, 1H-1H COSY^1H-1H NOSEY谱图分析确定其化学结构为4-(甲酰基_5_羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸。按上述方法从干燥的芜青材料中提取4_ (甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸得率为303.2 506.4mg/kg,即从干燥的芜青中可获得0.03、.05%质量分数的4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸。
图1为4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸HPLC色谱图，纵坐标为mAU(吸光值)，横坐标为min (保留时间)
图2为4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸高分辨质谱图，纵坐标为相对丰度，横坐标为m/z (质荷比)
具体实施例方式下面给出的实施例对本发明作进一步的说明，以下实施例不能理解为对本发明保护范围的限制。实施例1
1.取干燥芜青全株500g,粉碎后过60目筛；
2.加入5000ml用冰乙酸调节PH值为3.2的75%体积分数乙醇水溶液浸泡30min后，超声波(180w、25°C、40kHz)超声提取30min，过滤，滤渣加入5000ml75%体积分数乙醇水溶液后超声波(180w、25°C、40kHz)超声提取30min，过滤，弃去滤渣，合并两次提取滤液，用旋转蒸发仪浓缩滤液至粘稠浸膏状，得提取物浸膏；
3.提取物浸膏用500ml蒸馏水溶解，等体积加入乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯萃取相，减压蒸发脱去乙酸乙酯溶剂，得粗制品2.55g ；
4.将步骤3中所述的粗制品200mg溶于5ml水中，使用制备闻效液相色谱进彳丁精制； 色谱柱填料:C18键合硅胶柱(250mm*30mm)
流动相A相为:PH=3的冰乙酸水溶液
流动相B相为:甲醇
梯度程序为:0 5min，A:5%，B:95%
5"35min, A:25%, B:75%
35 40min, A:5%, B:95%
流速:30ml/min 柱温:25°C 检测波长:290nm
5.根据计算机实时采集的色谱图收集4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸色谱峰流出片段；
6.按步骤5中所述方法，重复制备步骤3中所述的粗制品，合并4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸色谱峰流出片段，减压浓缩脱去溶剂得精制4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸151.6mg (纯度经HPLC分析为99.5%)。实施例2
1.取干燥芜青块根500g,粉碎后过80目筛；
2.加入15000mlPH=5.0的盐酸水溶液浸泡7天后，过滤，弃去滤渣，滤液用旋转蒸发仪浓缩滤液至粘稠浸膏状，得提取物浸膏；
3.提取物浸膏用IOOOml蒸馏水溶解，，等体积加入乙酸乙酯萃取8次，合并乙酸乙酯萃取相，减压蒸发脱去乙酸乙酯溶剂，得粗制品7.1g ；
4.将步骤3中所述的粗制品300mg溶于5ml水中，使用制备闻效液相色谱进彳丁精制； 色谱柱填料:C8键合硅胶柱(250mm*30mm) 流动相A相为:PH=6.4的20mmol/L的甲酸铵水溶液流动相B相为:乙腈
梯度程序为:0 5min，A:2%，B:98%
5"l5min, A:15%, B:85%
15 20min, A:2%, B:98%
流速:40ml/min 柱温:30°C 检测波长:280nm
5.根据计算机实时采集的色谱图收集4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸色谱峰流出片段；
6.按步骤5中所述方法，重复制备步骤3中所述的粗制品，合并4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸色谱峰流出片段减压浓缩脱去溶剂，得纯度经HPLC分析为98%的精制4-(甲酰基-5-羟甲基 -1氢-吡咯-1-基)丁酸253.2mg。
权利要求
1.一种从植物芜青(Ara1S1Sica rapa L.)中提取、分离纯化制备一种天然批咯衍生物即4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸的方法。
2.如权利I所述的提取、分离纯化制备4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸的方法其主要步骤如下: (1)使用酸化的PH值为2.(T6.8的溶剂，按10 30倍料液比(m/V)从干燥芜青材料中提取4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸成分广4次，脱去溶剂浓缩后获得含4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸成分的提取物浸膏； (2)提取物浸膏溶于水，使用等体积的乙酸乙酯从其水溶液中萃取2 20次，合并乙酸乙酯相脱去溶剂浓缩后获得4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸粗制品； (3)粗制品溶于水中，使用制备高效液相色谱进行分离，以PH=2 7的缓冲水溶液作为流动相A相，有机相作为流动相B相，将AB两相按一定梯度程序洗脱，检测波长范围20(T400nm，柱温2(T30°C，根据计算机实时采集的色谱图收集4-(甲酰基_5_羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸色谱峰流出片段，浓缩除去溶剂后得4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸单体化合物。
3.在权利2所述的步骤(I)中，提取方法可以采用包括但不限于浸出法、渗滤法、回流法、超声波辅助提取等方法提取，所述提取溶剂可以是纯水、其它有机溶剂或其含水溶液；调节PH值进行酸化时可以采用包括但不限于磷酸、盐酸、乙酸、甲酸、磷酸二氢钠等其它有机酸、无机酸或者盐。
4.在权利2所述的步骤(3)中，制备高效液相色谱柱包括但不限于C18、C8填料，有机相指包括但不限于乙腈、甲醇或者其含水溶液；一定梯度程序指(TeOmin内，将A相:B相按0=100^100:0的 比例进行梯度混合；调节PH配置缓冲水溶液时可以采用包括但不限于磷酸、盐酸、乙酸、甲酸、磷酸二氢钠等其它有机酸、无机酸或者盐。
全文摘要
本发明涉及从植物芜青(BrassicarapaL.)中提取、分离纯化制备一种天然吡咯衍生物即4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸的方法，属于天然产物提取领域。目前国内外天然提取4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸的方法都存在得率低，方法繁琐复杂，成本较高等不足之处。本发明提供了一种从植物芜青中提取、分离纯化获得纯度高于98%的4-(甲酰基-5-羟甲基-1氢-吡咯-1-基)丁酸的方法。本发明对芜青的深加工，提升其附加值具有意义，提取方法操作简便、产品得率和纯度高、成本较低。
文档编号C07D207/333GK103073479SQ20131002463
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月23日 优先权日2013年1月23日
发明者陈放, 彭彤, 郭亦然, 唐琳 申请人:四川大学