用于产生单糖的方法
【专利说明】用于产生单糖的方法
[0001] 本发明涉及用于产生单糖、尤其是用于产生L-岩藻糖或其他稀有单糖例如N-乙 酰基神经氨酸的方法，借此在该生产方法中使用微生物。
[0002] 通过在能量储存、结构功能、信号传导、信息存储等中承担关键功能，糖类在所有 形式的生命中是必要的。对于此任务，自然界合成了几种主要单糖如葡萄糖、甘露糖、果糖、 岩藻糖、核糖、唾液酸等，以及用于更加专门应用的若干次要单糖，如例如D-阿洛糖。
[0003] 虽然一些单糖可以大量地并以合理的成本获自自然界（例如葡萄糖和果糖）， 但大多数单糖是相当稀有的并且仅可以少量存在于自然界中，如例如L-岩藻糖（6-脱 氧-L-半乳糖）。
[0004] 对于单糖的商业化生产，几乎仅有获自自然界的寡糖被用作来源。这些寡糖是酸 水解的并且从释放的单糖来纯化单种糖。由于单糖的高化学相似性（彼此之间的差异大部 分仅在于个别羟基的取向），所以以纯形式分离单种单糖是相当费力和昂贵的。
[0005] L-岩藻糖代表这样的稀有糖，其目前是经由复杂寡糖的水解而获自藻类或细菌来 源。为了从复杂的水解产物来纯化单种单糖，经常必须使用有毒化学物质，如例如乙酸铅 和过量的有机溶剂。因此，从寡糖的复杂的水解产物来分离单种单糖具有挑战性（由于释 放的单种单糖的高化学相似性）并且是环境有害的（由于过度使用有毒化学物质，如碳酸 铅）。此外，在自然界中在某些糖中富含的寡糖的可用性可以是相当受限制的并且也是高度 可变的（由于季节变化）。L-岩藻糖代表这样的稀有单糖，其传统上是通过含岩藻糖的多 糖的酸水解来获得的。岩藻糖主要源自多糖岩藻多糖，一种岩藻聚糖单硫酸酯，存在于所有 常见的棕色海草中，其包括鹿角菜科（Fucaceae)和海带科（Laminariaceae)。今天，L-岩 藻糖的大量获得主要是通过采集属于鹿角菜科的棕色海草，其可在全球范围内找到，但大 量存在于大西洋的欧洲海岸。从海岸大规模收获棕色海草起环境关注并且受限于某些环保 法规。
[0006] 例如，JP 2000351790公开了用于提取岩藻多糖和用于从提取的岩藻多糖来获得 和分离含岩藻糖的寡糖的方法。
[0007] 除从棕色海草水解岩藻多糖之外，最近，专利出版物表明，还可以经由包含天然存 在的L-岩藻糖的细菌多糖的水解来获得L-岩藻糖：W0 2012/034996 Al公开了属于肠杆 菌科（Enterobacteriaceae)的菌株，该菌株能够产生包含L-岩藻糖的胞外多糖。为了生 产L-岩藻糖，回收通过上述菌株产生的多糖并对其进行水解，例如通过用硫酸或盐酸加以 处理。
[0008] 除从多或寡糖水解产物提取L-岩藻糖之外，还已经开发了开始于其他单糖如 L-阿拉伯糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、D-甘露糖和D-葡萄糖的用于L-岩藻糖的若干合成途 径。通常，这些化学合成的产率往往相当差并且涉及若干步骤。除涉及若干合成步骤之外， 大量的保护基团化学反应还必须用于L-岩藻糖的化学合成。通常，相比于从自然界提取， 还没有证明单糖的大规模化学合成是经济上可行的。
[0009] 因此，目前，以纯形式制备任何单糖在将其他单糖与目标单糖纯化分开方面需要 显著努力，往往涉及大量的有机溶剂和其他有毒化学物质。因此，单一的所期望的单糖如例 如L-岩藻糖的排他积累会是非常有用的。大多数微生物在它们能够利用的单糖的种类方 面是受限的。此外，在同时可以获得几种单糖作为碳源时，它们对某些单糖经常施加强的偏 好。
[0010] 鉴于上述，本发明的一个目的是提供用于生产游离形式的单一所期望的单糖的新 方法，借此，可以快速和有效地，即大规模和成本有效地获得单糖而没有负面的环境影响。
[0011] 通过用于产生单糖的方法，即大规模地、以游离形式、并利用微生物来实现上述和 其他目的，该方法包括以下步骤：
[0012] a)提供微生物，其具有用于合成单糖的以下酶活性：i)糖基转移酶，其特异性地 能够将单糖从活化的核苷酸单糖转移到受体-底物以形成受体-单糖-底物，以及ii)糖 苷酶，其能够从受体-底物释放单糖；其中微生物不能代谢该单糖；
[0013] b)在适合生长微生物的培养基中培养微生物，借此产生游离形式的单糖，
[0014] c)从培养基回收游离单糖。
[0015] 此外，通过微生物、优选重组宿主微生物解决该目标，以及它在生产游离形式的单 糖中的应用，该微生物包含i)糖基转移酶，其特异性地能够将单糖从活化的核苷酸单糖转 移到受体-底物以形成受体-单糖-底物，以及ii)糖苷酶，其能够从受体-底物释放单糖； 其中微生物不能代谢单糖。
[0016] 以这种方式来完全实现本发明的目的。
[0017] 先前从未描述过申请人的方法，并且使用微生物，该微生物具有两种特定酶活性， 即糖基转移酶和糖苷酶，其中糖基转移酶特异性地能够将单糖从活化的核苷酸单糖（其是 内源性存在的或外部提供的）转移到受体-底物使得形成受体-单糖-底物。在随后的步 骤中，糖苷酶从受体-底物释放单糖使得提供游离单糖。
[0018] 虽然在本发明中可以采用具有上述酶促特点的未修饰的微生物，但根据本发明的 一个方面，微生物是重组微生物，其中重组微生物已被转化以包含以下至少之一 ：i)编码 并不天然存在于微生物中的糖基转移酶的核酸序列，和/或ii)编码并不天然存在于所述 微生物中的糖苷酶的核酸序列。换句话说，可以转化重组微生物以包含编码并不天然存在 于微生物中的糖基转移酶的核酸序列，或编码并不天然存在于所述微生物中的糖苷酶的核 酸序列，或可以转化重组微生物以包含两者，即编码并不天然存在于微生物中的糖基转移 酶的核酸序列和编码并不天然存在于所述微生物中的糖苷酶的核酸序列。
[0019] 借助于新提供的方法和新提供的微生物（重组或未重组的），首次可以以游离形 式并大量地产生所期望的单糖，而不需要化学品或繁复的工艺步骤。根据本发明的方法代 表微生物发酵方法，该方法适合用于工业大规模生产稀有或其他单糖，其可以容易地获取 自在其中培养微生物的培养基。
[0020] 通过使用根据本发明的微生物，即表达糖基转移酶的微生物，可以进行内源的或 外部提供的受体-底物的有效的岩藻糖基化，并且通过同时表达糖苷酶，可以产生在培养 基中大量的游离单糖的前所未有的积累。在存在受体底物的情况下，在游离单糖的合成中， 糖基转移酶和糖苷酶一起协同工作，从而仅需要催化量的适宜受体。因此，通过糖基转移 酶，所提供的受体底物被岩藻糖基化，并且通过接受糖基转移酶反应的糖基化产物的糖苷 酶的作用再循环（recycle)所产生的糖基化产物。
[0021] 如在本文中所使用的以及如在本发明的领域中通常理解的，表述"单糖"是指糖 类（碳水化合物，carbohydrates)的最基本单元。单糖是糖的最简单形式并且通常是无色 的、水溶性的、结晶固体。单糖的实例包括葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖和核糖。单糖是二糖 (disaccharides)如鹿糖以及多糖如纤维素和淀粉的结构单元。如在本文中所使用的以及 如在现有技术状态中通常理解的，"寡糖〃是指包含两个或更多个单糖的糖聚合物。
[0022] 术语〃编码…的核酸序列〃通常是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其 可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰RNA或DNA，并且通常表示编码某些多肽或蛋白的基 因。该术语包括但不限于单链和双链DNA ;为单链和双链区或单链、双链和三链区的混合物 的DNA ;单链和双链RNA ;以及为单链和双链区的混合物的RNA ;包含DNA和RNA的杂合分 子，其可以是单链的，或更通常地是双链、或三链区，或单链和双链区的混合物。该术语还包 括多核苷酸，上述多核苷酸包括单一连续区或不连续区，其编码多肽（例如，由整合的噬菌 体或插入序列或剪切（editing)所中断），连同另外的区，其还可以含有编码和/或非编码 序列。
[0023] 在这种情况下，术语〃多肽〃是指任何肽或蛋白，其包含通过肽键或修饰肽键彼此 连接的两个或更多个氨基酸。"多肽"是指短链以及长链两者，短链通常被称为肽、寡肽和 寡聚物，长链一般被称为蛋白质。多肽可以包含这样的氨基酸，其不同于20种基因编码的 氨基酸。"多肽"包括通过天然过程如加工和其他翻译后修饰以及通过化学修饰技术加以 修饰的那些。应该理解的是，在给定多肽的若干位点处可以以相同或不同程度存在相同类 型的修饰而基本不改变多肽的活性。此外，给定多肽可以包含许多类型的修饰。修饰可发 生在多肽中的任何地方，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。
[0024]目前，以及在整个本发明中，术语"糖基转移酶"表明和包括这样的酶，其负责二 糖、寡糖和多糖的生物合成，并且它们催化单糖部分从活化的核苷酸单糖/糖（〃糖基供 体"）到糖基受体分子的转移。
[0025] 根据本发明的一个方面，特别优选的是，糖基转移酶是细菌岩藻糖基转移酶，并 且优选是由大肠杆菌：0126的wbgL基因（基因库（genebank)登录号ADN43847)编码的 α-1，2-岩藻糖基转移酶。
[0026] 因此，术语〃 α -1，2-岩藻糖基转移酶〃或〃岩藻糖基转移酶〃或编码〃 α -1，2-岩 藻糖基转移酶"或"岩藻糖基转移酶"的核酸/多核苷酸是指这样的糖基转移酶，其催化 岩藻糖从供体底物例如GDP-岩藻糖到受体分子（在α-1,2-键中）的转移。受体分子可 以是糖类、寡糖、蛋白质或糖蛋白、或者脂质或糖脂，并且可以是，例如，N-乙酰基葡糖胺、 N-乙酰基乳糖胺、半乳糖、岩藻糖、唾液酸、葡萄糖、乳糖或它们的任何组合。
[0027] 如在整个本发明中使用的以及如在相关领域中所理解的，"糖苷酶"或"能够从受 体-底物释放单糖的糖苷酶"包含任何糖苷（或糖基）水解酶，其催化糖苷键的水解以释放 较小的糖，如单糖。
[0028] 根据本发明的一个方面，特别优选的是，如果糖苷酶是细菌糖苷酶，则优选细菌 a -L-岩藻糖苷酶。根据本发明的一种实施方式，使用来自两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bif